Nghiên cứu phân lập hợp chất β sitosterol glucoside từ phân đoạn dịch chiết chloroform và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết nước của hoa đu đủ đực thu hái tại quảng nạm đà nẵng

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC .... Trong dân gian lá cây đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán… Đã có nhiều c

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019

Tác giả

Nguyễn Thị Kim Ánh

Để có thể hoàn thành đề tài luận văn cử nhân một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự

nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô, cũng như sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Cô ThS Đỗ Thị Thúy Vân đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể quý thầy cô trong khoa Hóa học – Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến khi thực hiện đề tài luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến các bạn đồng nghiệp trong nhóm Nghiên cứu khoa học cùng đề tài hoa đu đủ đực đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn cử nhân một cách hoàn chỉnh

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

4.1 hư ng pháp nghiên cứu l thuyết 2

4.2 Phư ng pháp nghiên cứu thực nghiệm 2

5 Bố cục của luận văn 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ 4

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC 5

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC 6

1.4 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ 8

1.4.1 Tác dụng trị giun sán 8

1.4.2 Tác dụng hạ huyết áp 9

1.4.3 Tác dụng kháng sinh, kháng nấm 9

1.4.4 Tác dụng trị u bướu, ung thư 9

1.4.5 Tác dụng chống oxi hóa 10

1.4.6 Các tác dụng dược l khác 11

1.4.7 Công dụng trong dân gian 11

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO 11

1.5.1 hư ng pháp MTT 12

1.5.2 hư ng pháp SRB 12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 13

2.1.1 Nguyên liệu 13

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 13

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.2.2 hư ng pháp tách và tinh chế chất 14

2.2.3 hư ng pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 14

2.3 ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 14

2.3.1 Alkaloid 14

2.3.2 Flavonoid 15

2.3.3 Coumarin 15

2.3.4 Saponin 15

2.3.5 Đường khử 16

2.3.6 Polyphenol 16

2.3.7 Steroid 16

2.3.8 Acid hữu c 16

2.3.9 Chất béo 16

2.3.10 Carotene 16

2.3.11 Polysaccairid 17

2.3.12 Iridoid 17

2.4 SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC CAO CHIẾT 17

2.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT CHLOROFORM 18

2.6 CHẠY CỘT SẮC KÝ PHẦN CAO CHLOROFORM 19

2.7 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT NƯỚC 21

2.7.1 Chiết xuất cao chế ph m 21

2.7.2 Mô tả 21

2.7.3 C n không tan trong nước 21

2.7.4 Mất khối lượng do làm khô 21

2.7.5 Tro toàn phần 22

2.7.6 Kim loại nặng 22

2.7.8 Định tính lớp chất hóa học trong cao nước 22

2.7.9 Hoạt tính kháng vi sinh vật 22

2.7.10 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao chiết nước hoa đu đủ đực 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 24

CHLOROFORM TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 24

3.3 PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CHLOROFORM 25

3.4 KẾT QUẢ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT NƯỚC 30

3.4.1 Chiết xuất cao dược liệu 30

3.4.2 Mô tả 30

3.4.3 C n không tan trong nước 30

3.4.4 Mất khối lượng do làm khô 30

3.4.5 Tro toàn phần 31

3.4.6 Kim loại nặng 31

3.4.7 Độ pH 31

3.4.8 Định tính 32

3.4.9 Hoạt tính kháng vi sinh vật 33

3.4.10 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

1 KẾT LUẬN 35

2 KIẾN NGHỊ 35

TÀI LI U THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC

DMSO : Dimethyl sunfoxide

DEPT : Distortionless enhancement by polarisation transfer

EtOAc : Ethyl acetate

EtOH : Ethanol

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Corelation

MeOH : Methanol

MMT : 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide NMR : Nuclear magnetic resonance

D : Tên hợp chất phân lập đƣợc

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Số hiệu

3.2 Hoạt tính độc tế bào của phân đoạn dịch chiết chloroform 25 3.3 Số liệu phổ 1

3.7 Kết quả hàm lƣợng một số kim loại nặng trong cao đặc

3.10 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

3.11 Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của cao

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Số hiệu

2.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn dịch chiết chloroform

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng

nhiệt đới châu Mỹ Hiện nay, đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới, những nơi

có nhiệt độ bình quân trong năm không thấp hơn 150C Sản lượng đu đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm

Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam Tuy nhiên, chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa Các tỉnh trồng nhiều đu đủ như: Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên,… Diện tích trồng đu đủ của cả nước ước khoảng 10000 – 17000 hecta với sản lượng khoảng 200 – 350 nghìn tấn quả Cây đu đủ có lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau Ngoài việc lấy quả tươi, dùng làm nguyên liệu cho chế biến, đu đủ còn được trồng để lấy nhựa, dùng làm thức

ăn chăn nuôi

Trong dân gian lá cây đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán… Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ Lá đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh Hoạt tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra Lá đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm Ngoài ra, lá đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau

Ở nước ta, cao chiết với cồn từ lá đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng Người dân nước Úc đã dùng lá đu đủ chữa trị bệnh ung thư Đầu năm 2010, một nhóm nghiên cứu Nhật Bản

và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây đu đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu,… Ngoài ra, dịch chiết từ lá đu đủ còn có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine này có khả năng chống lại khối u

Gần đây, người dân địa phương ở Quảng Nam – Đà Nẵng còn sử dụng hoa cây

đu đủ đực để điều trị các bệnh về đường hô hấp như viêm họng, ho… Ngoài ra, hoa đu

đủ đực còn được coi như thần dược để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư như: ung thư phổi, ưng thư vú và ung thư gan,…

Chính bởi công dụng chữa bệnh của cây đu đủ như trên, có rất nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này Thế nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu về bộ phận hoa của chúng

Việc sử dụng hoa đủ đực hiện nay vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của hoa đu đủ đực là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị các căn bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư Trong điều kiện cho phép của luận văn cử nhân, tôi chọn đề tài

“Nghi n u ph n p hợp hất β-sitosterol glucoside t ph n o n ị h hi t chloroform và x y ựng ti u huẩn ơ sở ao hi t nướ a hoa Đu ự thu h i t i

u ng Nam – Đà N ng làm đề tài luận văn của mình

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập hợp chất hoá học từ phân đoạn dịch chiết chloroform, xác định cấu trúc hoá học, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết nước của hoa đu đủ đực nhằm góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hóa học của chúng, nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Hoa đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng

- Phân đoạn dịch chiết từ loài hoa trên với dung môi chloroform

- Hợp chất phân lập từ dịch chiết nghiên cứu

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 hương ph p nghi n u thuy t

- Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên

- Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài cây này

- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng

dụng của các bộ phận của cây đu đủ

4.2 Phương ph p nghi n u thự nghiệm

- Các phương pháp xử lý mẫu thực nghiệm

- Các phương pháp chiết mẫu, phân lập các hợp chất hữu cơ

- Các phương pháp phân tích sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột

- Các phương pháp nghiên cứu cấu tạo hợp chất hóa học: kết hợp các phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H-NMR, 13C-NMR, phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV) và các phương pháp khác

5 Bố cục của luận văn

Luận văn gồm 40 trang, 11 bảng, 9 hình, ảnh, 45 tài liệu tham khảo và 11 phụ lục Với:

Phần mở đầu (3 trang)

Chương 1- Tổng quan (9 trang)

Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm (11 trang)

Chương 3 – Kết quả và thảo luận (11 trang)

Kết luận và kiến nghị (1 trang)

Tài liệu tham khảo (5 trang)

Phụ lục (6 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 GIỚI THI U VỀ CÂY ĐU ĐỦ

Đu đủ (Carica Papaya L), thuộc họ đu đủ (Caricaceae), nguồn gốc Châu Mỹ

được trồng khắp nơi ở nước ta Họ đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45

loài [16] Cây đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ

2 - 4 mét, thân thẳng, không phân nhánh Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn Cuống lá rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1] Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái) Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi nhiệt độ [7] Ở Việt Nam, một số giống đu đủ hiện nay đang được trồng bao gồm:

* Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống đu đủ có từ lâu đời ở nước ta Đặc tính chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp

* Giống đu đủ Mêhico: là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ 20 Quả dài, tương đối đặc ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao Lá xanh đậm, phiến lá dày, cuống lá to, màu xanh

* Giống đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là đu đủ Mỹ, thân cây cao trung bình, sinh trưởng khỏe Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lượng tốt, năng suất cao,

là giống yêu cầu nhiệt cao nên được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam

* Giống đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày

* Giống đu đủ Thái Lan: là giống được nhập trồng trong thời gian gần đây Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lượng tốt Tuy nhiên giống này dễ

bị nhiễm bệnh khảm lá

* Giống đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60 – 70 kg quả/ cây Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận chuyển Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [11]

D: trái của cây cái E: trái lưỡng tính F: cây đực

H nh 1.1 H nh ảnh Đu đủ 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC

Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được alkaloid carpaine trong lá đu đủ [13]

Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá đu đủ Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tương ứng

là 57,05 và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopene [9]

Năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết n-hexan của lá đu đủ Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol, cycloart -23-ene-3β,25-diol (sterculin

A) và 3β,24 (R/S)-diol Trong đó, sterculin A và 3β,24 (R/S)- diol là 2 tritecpen lần đầu tiên phân lập từ lá đu đủ [4]

cycloart-25-ene-Theo nghiên cứu Nguyễn Văn Rư, Vũ Quang Thái đã tách chiết chymopapain từ nhựa quả đu đủ xanh và chế thử thành dạng bột pha tiêm [10]

Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần hóa học của hoa đu đủ đực Kết quả cho thấy sự có mặt của alkaloid, este, acid béo, một số sterol trong hoa đu đủ đực thu hái tại Đà Nẵng [6]

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC

Trên thế giới, năm 1965, Govindachari Go, Nagarajan và Viswanathan đã xác định được cấu trúc của carpaine và pseudocarpaine là alkaloid được chiết xuất từ lá đu

đủ [27]

(3) Carpaine (6) Pseudocarpaine

Năm 1979, Chung – Shih Tang đã phân lập đƣợc 2 alkaloid piperideine là

dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá đu đủ [22] Cấu trúc của chúng

(7) Dehydrocarpaine I (8) Dehydrocarpaine II

Năm 2002, David và cộng sự đã xác định đƣợc glycosid là prunasin và sambunigrin trong lá và thân đu đủ [23]

(9) Prunasin (10) Sambunigrin

Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol trong lá

đu đủ cho kết quả các hợp chất nhƣ sau: acid caffeic: acid p-coumari; acid protocatechuic; kaempferol; quercetin và 5,7- dimethoxycoumair Cấu trúc phân tử của một số phenolic trong lá đu đủ nhƣ sau [19]

O

O

OH OH COOH

OH OH OH

(11) 5,7-dimethoxycoumair (12) Acid protocatechuic (13) Acid chlorogenic Năm 2008 Krishna K.L và cộng sự đã tổng hợp các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học các bộ phân cây đu đủ [30]

 Quả: protein, chất béo, xenluloza, carbohydrate, chất khoáng, Ca, P, Fe, vitamin

C, B, B2, niacin và carotene, amino acid, acit citric, acid malic(quả xanh), linalool,

benzylisothiocyanate, cis và trans 2,6-dimethyl -3,6 epoxy-7 octen-2-ol, alkaloid,

carpain, benzy–β-D-glucoside, 2-phenylethyl–β-D-glucoside, 4-hydroxyphenyl-2 ethyl –β-D-glucoside và 4 đồng phân benzyl-β-D-glucoside

 Nước ép quả: N-butyric, n-haxanoic và n-octanoic acid, lipid, các acid myristic,

palmatic, stearic, lioleic, linolenic, cis-vaccenic và oleic

 Hạt: acid fatty, protein, chất xơ, dầu, carpaine, benzylisothiocyanate, benzylglucosinolate, glucotropacolin, benzylthiourea, hentriacontane, β-sitosterol, caricin và enzym myrosin

 Rễ: carposide và enzym myrosin

 Lá: alkaloid carpain, pseudocarpain và dehydrocarpain I và II, choline, carposide, vitamin C, E

 Vỏ cây: β-sitosterol, glucose, fructose, sucrose, galactose và xylitol

 Nhựa mủ: enzym proteolytic, papain và chemopapain, glutamine cyclotransferase, chymopapain A, B và C, peptid A và B và lysozyme

Năm 2015, Stephen Chinwendu và cộng sự công bố “Nghiên cứu thành phần hóa học của hoa đu đủ ở Nigeria Cho kết quả trong hoa chứa saponin (0.07%), alkaloid (0.05%), tannin (0.002%) và flavonoid (2.8%) Ngoài ra còn chứa các nguyên tố vô cơ

Na, Ca, Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [40]

Cũng trong năm 2015, Marline Nainggolan, Kasmirulcông bố kết quả trong hoa

đu đủ đực có chứa các thành phần gồm triterpenoids/steroid, flavonoid, tannin, và glycosides, saponin [33]

1.4 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ

Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vậy được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2], [3], [18], [29] Hoạt tính sinh học của các bộ phận của cây đu đủ như lá, quả, nhựa được các nhà khoa học trên thế giới công bố khá

phong phú

1.4.1 T ng t ị giun s n

Năm 1994, Satrija và cộng sự nghiên cứu tác dụng trị giun sán của nhựa đu đủ đã được thử nghiệm để diệt giun sán ở súc vật [40]

Năm 2001, Kermanshai và cộng sự nghiên cứu dịch chiết từ hạt đu đủ được thử

nghiệm để trị sán Caenorhabdi tiselegans Kết quả cho thấy trong hạt có benzyl

isothiocynat (BITC) là hoạt chất chính có tác dụng diệt giun sán Các phần khác nhau của cây cũng đã được thử nghiệm về hoạt tính diệt giun Ascaridia galli nhiễm ở gia cầm [31]

Năm 1997, Giordani và cộng sự nghiên cứu tác dụng của nhựa đu đủ ức chế sự

tăng trưởng của nấm Candida albicans khi thêm vào môi trường cấy nấm [26]

Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá đu đủ có

tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T rubrum và Staphylococcus aureus Cao chiết từ vỏ và hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Shigella flexneri Benzyl isothiocyanate phân lập từ đu đủ, ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm như Escherichia coli, Penicillium notatum

và Shigella Rễ đu đủ có tác dụng kháng khuẩn yếu [1]

Năm 2011, Rahman và cộng sự nghiên cứu dịch chiết bằng ethanol 95% của lá

và thân đu đủ được thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm và gram dương tại nồng độ 5 và 10 mg/mL [38]

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine có khả năng

kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/mL, không thể

hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác ở nồng

độ chất thử cao nhất là 128 µg/mL (với IC50 > 128 µg/mL) [5]

1.4.4 T ng t ị u ướu ung thư

Năm 2001, Tác giả Phạm Kim Mãn và cộng sự đã chứng minh cao chiết với cồn

từ lá đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng, làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [8]

Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/mL, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7 Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [12] Năm 2002, Rahmat và cộng sự đã kiểm tra khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú, ung thư gan bằng lycopene tinh khiết, lycopene tách chiết từ quả đu đủ

và dưa hấu, và nước ép quả đu đủ [17]

Năm 2006, Rumiyati và cộng sự đã chứng minh trong lá đu đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs) Các kết quả nghiên cứu cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư [39]

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định được phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ

có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/mL), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/mL) và ung thư vú MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/mL) Đồng thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ cặn CH2Cl2 của lá đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL) [5]

Năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmiru công bố nghiên cứu dịch chiết ethanol của hoa đu đủ đực có tác dụng gây độc tế bào trên MCF-7 dòng tế bào ung thư vú [20]

1.4.5 T ng h ng oxi h a

Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh trong

cơ thể, trong đó có ung thư Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách khác nhau như: ô nhiễm môi trường, chất phóng xạ, thuốc, hóa chất, căng thẳng thần kinh…

Năm 2010, Srikanth và cộng sự dùng nước để chiết các chất có trong lá đu đủ Chất chiết thu được đem thử hoạt tính chống oxy hóa bằng các phương pháp khác nhau [40]

Năm 2013, Maisarah và cộng sự nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa từ các bộ phận khác nhau của cây đu đủ bao gồm: quả chín, quả xanh, hạt và lá non Hai tác nhân được sử dụng để đánh giá là DPPH và β - carotene Kết quả cho thấy hoạt tính

chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín → hạt Tuy nhiên, các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập [35]

1.4.6 t ng ượ h

Ngoài những hoạt tính sinh học trên, các bộ phận khác nhau của cây đu đủ cũng

đã được chứng minh có tác dụng như kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng giảm thời gian đông máu, kháng viêm…

Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm của dịch chiết cồn từ lá cây đu đủ [21] Năm 2013, Swati Patil và cộng sự đã công bố chất chiết

lá đu đủ bằng nước làm tăng số lượng tiểu cầu và làm giảm thời gian đông máu ở chuột [46]

Năm 2014, Hồ Thị Hà lần đầu tiên được chứng minh khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine (tương ứng là 386,5 và 778 RFU) ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30 µg/mL) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/mL) [5]

1.4.7 ng ng t ong n gian

- Quả đu đủ chín là món ăn bồi bổ và giúp sự tiêu hóa các chất thịt, các chất lòng trắng trứng

- Đu đủ xanh được nấu kỹ với thịt gà chữa viêm loét dạ dày

- Nhựa đu đủ được dùng làm thuốc giun

- Lá đu đủ được sử dụng làm mềm thịt khi nấu

- Trong dân gian hoa đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn, nhất là ở trẻ

em Ngoài ra, hoa đu đủ đực được dùng để chữa sỏi thận hiệu quả [2], [7], [11], [16]

Nhận xét chung: Như vậy, hoạt tính dược lý và thành phần hóa học của cây đu

đủ đã được nghiên cứu Tuy nhiên các công trình nghiên cứu chủ yếu là lá và quả đu

đủ, các công trình nghiên cứu hoa đu đủ đực hầu như rất ít

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO

Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A và cộng

sự [41] Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia

(NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

Trong những năm gần đây, một số phương pháp so màu nhanh đã được miêu tả

trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay hai phương

pháp thường được sử dụng là: phương pháp MTT và phương pháp SRB Trong đó,

phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến

1.5.1 hương ph p MTT

Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [14] Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của

tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào

1.5.2 hương ph p SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở quy mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm

Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein Dưới các điều kiện môi trường acid nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng base yếu như Tris-base để hòa tan và

đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LI U, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguy n iệu

Nguyên liệu hoa của cây đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam  Đà Nẵng vào tháng 01 năm 2017 Hoa đu đủ đực – đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu Bột hoa đu

đủ đực hơi thô, màu vàng nhạt, được bảo quản trong bình hút ẩm

Hình 2.1 Hoa đu đủ đực và Bột hoa đu đủ đực

2.1.2 H a hất và thi t ị nghi n u

Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ dày 0,2mm Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel

cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck và silicagel pha đảo RP-18

Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H – NMR, 13C – NMR, HSQC và HMBC đo trên máy Bruker Avance – 500 MHz, chất chuẩn nội là TMS cho 1H – NMR và tín hiệu dung môi (CDCl3) cho 13C – NMR Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm và 365nm dùng để soi bản mỏng

Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không, máy sấy, máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc, cột sắc ký,…

Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng dung dịch H2SO4 10%, sau đó sấy ở nhiệt độ khoảng 110o

C Dung môi dùng để chạy cột và triển khai sắc ký lớp mỏng bao gồm n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, MeOH và BuOH loại tinh khiết đã được cất lại qua cột Vigereux trước khi sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.2 hương ph p t h và tinh ch chất

Các cao chiết trong các dung môi khác nhau thu được được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường sử dụng silicagel pha thuận và pha đảo Đối với các chất có khối lượng phân tử khác nhau có thể sử dụng sắc ký cột Sephadex LH–18 Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp

2.2.3 hương ph p x ịnh cấu trúc hóa học c a các hợp chất

Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc

đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như 1H–NMR, 13C–NMR, DEPT, HSQC, HMBC Các loại phổ được đo tại Viện Hoá học – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

2.3 ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC

2.3.1 Alkaloid

Cân 5g bột hoa đu đủ đực ngâm trong dung dịch là hỗn hợp gồm chloroform: ethanol 95 độ: NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ là 8:8:1, môi trường phải có tính base Ngâm nguội trong 24 tiếng, để ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng lắc trộn

Sau khi ngâm, đem lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan phần cặn trong dung dịch HCl 1%, Đun ấm cho dễ tan Lọc, lấy dịch lọc để thử với 2 loại thuốc thử Mayer, Wagner

Sau khi thử dịch chiết với:

Thuốc thử Mayer: Xuất hiện kết tủa vàng, phản ứng dương tính

Thuốc thử Wagner: Xuất hiện kết tủa nâu, phản ứng dương tính

Phản ứng với dung dịch NaOH 1% Thêm vài giọt dung dich NaOH 1% vào ống nghiệm chứa dịch lọc Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng Flavonol cho màu từ vàng đến cam Auron cho màu tím đến đỏ tím

Cân 1g bột hoa đu đủ đực, cho vào cốc và 5mL ethanol đun cách thủy 5 phút, lọc

lấy dung dịch ancol để thử nghiệm trong 2 ống nghiệm có kích thước bằng nhau

Ống 1: 5mL HCl 0,1N (pH=1) + 3 giọt dung dịch ancol chứa mẫu thử

Ống 2: 5mL NaOH 0,1N (pH=13) + 3 giọt dung dịch ancol chứa mẫu thử

Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả 2 ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bọt bong bóng ở cả 2 ống nghiệm:

Nếu cột bọt trong cả 2 ống nghiệm cao bằng nhau và bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid

Nếu ống 2 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống 1 thì có saponin steroid

2.3.7 Steroid

Phản ứng Libermann-Burchard

Cho vào ống nghiệm 1mL anhidric axetic, 1mL chloroform làm lạnh ống nghiệm

và thêm vài giọt H2SO4 đậm đặc, sau đó cho dịch lọc ngâm trong chloroform, nếu sung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu bền không đổi thì có sterol

Phản ứng Salkowski

Ngâm 2g bột hoa đu đủ trong chloroform Lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm

và nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc, phản ứng dương tính làm dung dịch chuyển thành màu đỏ đậm, xanh, xanh-tím

2.3.8 Acid hữu ơ

Cân 3g hoa đu đủ đực cho vào cốc, thêm 10mL nước cất đem đun sôi 10 phút

Để nguội, đem lọc lấy dịch Cho 2-3 mL dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 1 ít tinh thể

Na2CO3 Quan sát hiện tượng, nếu có bọt khí thoát ra có acid hữu cơ

 Ống 1: 2mL dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol

 Ống 2: 2mL nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol

có Iridoid

2.4 SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC CAO CHIẾT

Quá trình điều chế các loại cao chiết được mô tả theo Hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ điều chế các cao chiết

 Điều chế cao tổng

Nguyên liệu là hoa đu đủ đực sau khi thu hái, rửa sạch, phơi, sấy khô, rồi đem xay nhỏ thì được 4500g bột

Nguyên liệu Hoa Đu đủ đực sấy khô, xay nhỏ (4500g)

Cao tổng 300g

- Chiết lần lượt với các dung môi: n-hexan,

chloroform, ethyl acetate, n-butanol

- Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

Cao n- hexan

70g

Cao CHCl352g

Cao Nước 80g

Cao EtOAc 19g

Cao BuOH 60g

- Ngâm chiết trong EtOH/H2O (80/20), 3 lần

- Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

- Lần 1: Cho 4500g bột nguyên liệu vào bình cầu, cho 12 lít dung dịch EtOH/H2O (80:20), ngâm khoảng 12 giờ Cho vào máy siêu âm sử dụng tần số 40kHz khoảng 2 giờ Sau đó lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi đến gần kiệt thì được dịch đặc

- Lần 2: Cho 12 lít dung dịch EtOH/H2O (80:20) vào bã nguyên liệu đã chiết lần

1, ngâm khoảng 12 giờ Cho vào máy siêu âm sử dụng tần số 40kHz khoảng 2 giờ Sau đó lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi đến gần kiệt, thu được dịch đặc

- Lần 3: Cho 12 lít dung dịch vào bã nguyên liệu EtOH/H2O (80:20) đã chiết lần

2, ngâm khoảng 12 giờ Cho vào máy siêu âm sử dụng tần số 40kHz khoảng 2 giờ Sau

đó lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi thu được dịch đặc

 Điều chế cao n-hexan, chloroform, EtOAc và cao BuOH

Dồn dịch đặc sau 3 lần chiết và cất loại bớt dung môi, phân lớp lần lượt với hexan, CHCl3, EtOAc và BuOH

n-Phân lớp với n-hexan, chiết 3 lần, với khoảng 15 lít n-hexan Tổng dịch chiết khoảng 14000mL, cất loại dung môi thu được 70g cao n-hexan

Phân lớp với chloroform, chiết 3 lần, với khoảng 15 lít chloroform Tổng dịch chiết khoảng 14000mL, cất loại dung môi thu được 52g cao chloroform

Phân lớp với EtOAc, chiết 3 lần, với khoảng 12 lít EtOAc Tổng dịch chiết khoảng 12000mL, cất loại dung môi thu được 19g cao EtOAc

Phân lớp với BuOH, chiết 3 lần, với khoảng 18 lít BuOH Tổng dịch chiết 18000mL, cất loại dung môi thu được 60g cao BuOH

2.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT CHLOROFORM

Phân đoạn dịch chiết chloroform thu được từ 3 cao tổng nước, ethanol, methanol được xác định hoạt tính độc tế bào tại Phòng thử hoạt tính sinh học-Viện hóa sinh biển-Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

Các dòng tế bào: Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC

gồm: Phổi (A549), Gan (Hep3B), Vú (MCF-7)

Phương pháp: Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc

gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện

các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi

cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần cần thiết