Phân lập và khảo sát khả năng chuyển hóa lưu huỳnh của một số chủng vi khuẩn ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý chất thải chăn nuôi

Phân lập và khảo sát khả năng chuyển hóa lưu huỳnh của một số chủng vi khuẩn ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý chất thải chăn nuôi Phân lập và khảo sát khả năng chuyển hóa lưu huỳnh của một số chủng vi khuẩn ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý chất thải chăn nuôi luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

LỜI CAM ĐOAN

- - - - - Tôi tên: Nguyễn Trọng Hưng

Sinh ngày 10 tháng 08 năm 1993

Sinh viên lớp 11DSH04 - Công Nghệ Sinh Học - Trường ĐH Kỹ Công Nghệ TP Hồ Chí Minh

Tôi xin cam đoan : Đề tài “PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHUYỂN HÓA LƯU HUỲNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN, ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI”

do Tiến sĩ Phạm Huỳnh Ninh hướng dẫn là đề tài của riêng tôi Các số liệu, kết quả trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây Những thông tin tham khảo trong khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng

Tất cả những nội dung trong đồ án đúng như nội dung đề tài và yêu cầu của giáo viên hướng dẫn Nếu có sai sót tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trọng Hưng

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp ở Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt đồ án này Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Con xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những người thân trong gia đình đã nuôi con khôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho con được học tập cho đến ngày hôm nay

Ngôi trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn

bó suốt bốn năm học qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong cuộc sống

Ban chủ nhiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, các Thầy Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM đã trang bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để em thực hiện đề tài và làm tốt công việc sau này

TS Phạm Huỳnh Ninh, Phó bộ môn Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ cho em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Chị Lê Hoàng Bảo Vi, anh Vũ Minh phòng Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án

Các anh, chị phòng Phân Tích Thức ăn Chăn Nuôi đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án tại đây

Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng vi sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Sơ lượt về vòng tuần hoàn lưu huỳnh 4

1.1.1 Đồng hóa lưu huỳnh: 6

1.1.2 Tác dụng khử lưu huỳnh (desulphuration): 6

1.1.3 Tác dụng lưu hóa (sulphurication): 7

1.1.4 Tác dụng khử sulfate (sulfate reduction) 8

1.2 Giới thiệu về vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh 9

1.3 Vai trò của vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh: 9

1.2.1 Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (green sulfure bacteria) 11

1.2.2 Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (purple sulfur bacteria): 12

1.2.3 Vi khuẩn tự dưỡng hoá năng không sắc tố 14

1.2.4 Tác động Thiobacillus cho môi trường 15

1.4 Đặc tính của khí hydrosufua (H2S) 16

1.5 Giới thiệu về độn lót lên men vi sinh vật trong chăn nuôi 17

1.5.1 Ứng dụng của vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh trong đôn lót chăn nuôi

…17

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng thí nghiệm 19

2.2 Vật liệu nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh 22

2.3.1.1 Phương pháp lấy mẫu: 22

2.3.1.2 Phương pháp phân lập 23

ii

2.3.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng SO42- [9] 27

2.3.2 Khảo sát môi trường, pH, nhiệt độ, nồng độ muối, nguồn cơ chất, thời gian thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh… 28

2.3.2.1 Khảo sát môi trường tối ưu 28

2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH 28

2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 29

2.3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ NH4Cl 29

2.3.2.5 Ảnh hưởng của nguồn lưu huỳnh đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng nghiên cứu 30

2.3.2.6 Nghiên cứu động học của quá trình lên men 31

2.4.1 Lên men thử nghiệm tạo chế phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm 31

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32

3.1 Kết quả lấy mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh 32

3.1.1 Kết quả lấy mẫu 32

3.2 Kết quả phân lập 33

3.2.1 Kết quả nhuộm Gram 33

3.2.2 Kết quả khảo sát hoạt tính sunfat hóa 37

3.3 Kết quả khảo sát môi trường, pH, nhiệt độ, nồng độ muối, nguồn cơ chất, thời gian thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh 41 3.3.1 Kết quả khảo sát môi trường tối ưu cho chủng TH7 41

3.3.2 Kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng TH7 42

3.3.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp 43

3.3.4 Kết quả ảnh hưởng nồng độ muối NH4Cl 44

3.3.5 Kết quả khảo sát nguồn lưu huỳnh 45

3.3.6 Kết quả khảo Sát sự ảnh hưởng của nồng độ Na2S2O3 47

2.4.2 Kết quả khảo sát động học quá trình lên men 48

3.4 Kết Quả tiến hành lên men thử nghiệm tạo chế phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm 50

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

iii

4.1 Kết luận : 52

4.2 Đề nghị : 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 1

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Địa điểm lấy mẫu tại Phân Viện Chăn nuôi Nam Bộ 32

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn 37

Bảng 3.3 Kết quả định lượng hàm lượng SO42- 39

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát môi trường tối ưu cho chủng TH7 41

Bảng 3.5 Bảng kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng TH7 42

Bảng 3.6 Bảng Kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp 43

Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng nồng độ muối NH4Cl 44

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát nguồn cơ chất 45

Bảng 3.9 Kết quả Khảo Sát sự ảnh hưởng của nồng độ Na2S2O3 47

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát động học quá trình lên men 48

Bảng 3.11 Kết quả kiểm tra nồng độ tế bào trước và sau khi sấy 50

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Một số chủng vi khuẩn lưu huỳnh màu lục 12

Hình 1.2 Một số vi khuẩn lưu huỳnh màu tía 13

Hình 3.1: Khuẩn lạc trên môi trường thạch Beijeninck 33

Hình 3.2: Hình ảnh nhuộm Gram chủng TH8 vật kính 100X 33

Hình 3.3: Hình nhuộm Gram chủng TH7 ở vật kính 100X 34

Hình 3.4: Sự thay đổi pH trong môi trường Thiosulphate broth 35

Hình 3.5: Sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường có bổ sung glucose 35

Hình 3.6: Hình mẫu đối chứng khả năng sử dụng Na2S2O3 36

Hình 3.7: Khả năng sử dụng Na2S2O3 của các chủng vi khuẩn 36

Hình 3.8: Khả năng di động 37

Hình 3.9: Kết quả định tính sunfat của các chủng vi khuẩn 38

Hình 3.10: Hình trước và sau khi chuẩn độ chủng TH7 39

Hình 3.11: Hình trước và sau chuẩn độ chủng TH8 39

Hình 3.12: Đồ thị khảo sát hoạt tính sunphat hóa của 4 chủng vi khuẩn 40

Hình 3.13: Đồ thị kết quả khảo sát môi trường tối ưu cho chủng TH7 41

Hình 3.14: Đồ Thị kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng TH7 43

Hình 3.15: Đồ thị kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp 44

Hình 3.16: Đồ thị kết quả ảnh hưởng nồng độ muối NH4Cl 45

Hình 3.17: Đồ thị kết quả khảo sát nguồn cơ chất 46

Hình 3.18: Khuẩn lạc ở thời gian 48 giờ 48

Hình 3.19: Đồ thị khảo sát động học quá trình lên men chủng TH7 49

Hình 3.20: Môi trường lỏng sau lên men 50

Hình 3.21: Chế phẩm sau khi sấy của chủng TH7 51

300 triệu con gia cầm và hơn 37 triệu con gia súc, nguồn chất thải từ chăn nuôi thải

ra môi trường tới 84,45 triệu tấn trong đó, nhiều nhất là chất thải từ lợn (24,96 triệu tấn), tiếp đến gia cầm (21,96 triệu tấn) và bò (21,61 triệu tấn)

Chất thải trong chăn nuôi lợn là nguồn gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng nhất Chất thải của các trang trại, gia trại nuôi lợn chủ yếu được xử lý bằng hệ thống biogas song biện pháp này chỉ giải quyết được vấn đề thu hồi khí sinh học tận thu làm nhiên liệu còn mức độ giảm thiểu ô nhiễm không đáng kể, không giải quyết triệt để được tình trạng ô nhiễm môi trường đất, nước và mùi hôi thối

Một trong những khí gây mùi thối khó chịu cần được kiểm soát trong chăn nuôi là khí sunful dễ bay hơi, như hydrogen sulfide (H2S), được tạo ra do quá trình lên men yếm khí các hợp chất hữu cơ

Khí H2S là loại khí không màu, dễ cháy và có mùi rất đặc trưng giống mùi trứng thối Ngưỡng nhận biết bằng mùi của khí H2S trong khoảng: 0,0005 ÷ 0,13 ppm Ở nồng độ 10 ÷ 20 ppm: làm chảy nước mắt, viêm mắt

Trong điều kiện bình thường thì H2S là một trong những nguyên nhân gây ra các vấn đề về màu và mùi Nồng độ S2-

tại hố thu nước thải chăn nuôi lợn có thể lên đến 330 mg/l cao hơn rất nhiều so với tiêu chuẩn (theo TCVN 5945 - 2005 cột C nồng độ sunfua là 1,0 mg/l)

Vấn đề đặt ra là làm thế nào để kiểm soát khí hydrogen sulfide trong chăn nuôi?

2

Các khí sulfur dễ bay hơi có thể được hấp thụ bởi các vi khuẩn hóa dưỡng

như Thiobacillus thioparus, quang dưỡng như Cholorobium spp, hay Cholomatium

sp Tuy nhiên các vi khuẩn này cần có điều kiện chuyên biệt để phát triển, khó áp

dụng vào xử lý chất thải chăn nuôi Do đó, các vi khuẩn dị dưỡng sử dụng, phân

hủy sulfur (Thiobacillus, Thiobacterium….) là đối tượng tiềm năng cho việc tuyển

chọn để sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong đệm lót chăn nuôi để hạn chế mùi hôi thối khó chịu từ H2S Hiện tại các sản phẩm vi sinh dùng trong đệm lót sinh học chủ yếu được nhập khẩu, chỉ duy nhất một sản phẩm được sản xuất trong nước là chế phẩm Balasa No1 Nhằm đa dạng hóa sản phẩm dùng trong đệm lót vi sinh, góp phần hạn chế phụ thuộc vào sản phẩm nhập ngoại, cần thiết phải tiến hành phân lập, khảo sát, tìm ra các chủng vi sinh có hoạt lực cao trong phân giải, chuyển hóa các hợp chất hữu, đặc biệt là vi khuẩn chuyển hóa H2S

Từ những nhận định trên tôi thực hiện đề tài : “PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHUYỂN HÓA LƯU HUỲNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN, ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI”

Đề tài này là 1 phần trong đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong đệm lót sinh học cho chăn nuôi của Bộ môn Nghiên Cứu Dinh Dưỡng Chăn Nuôi thuộc Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ

 Mục tiêu và phạm vi của đề tài

- Phân Lập các chủng vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh từ nước thải, bùn, phân…

- Khảo sát môi trường, độ ẩm và pH thời gian thích hợp cho sự sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh

- Xác định được môi trường và pH thời gian thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh

3

- Bước đầu lên men thử nghiệm sản xuất chế phẩm ở quy mô phòng thí

nghiệm

 Ý nghĩa của đề tài

- Phân lập được chủng vi khuẩn có các đặc tính tốt trong chuyển hóa H2S, ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong đệm lót sinh học, phục vụ cho ngành chăn nuôi sạch, không mùi

 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Các thí nghiệm về vi sinh và sản xuất chế phẩm sẽ được thực hiện tại Phòng Phân tích số 12, Nguyễn Chí Thanh, Quận 10, TP.HCM

 Thời gian nghiên cứu

- Từ ngày 25/5/2015 đến 17/8/2015

4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lượt về vòng tuần hoàn lưu huỳnh

Lưu huỳnh (S) là nguyên tố lớn thứ 14 trong vỏ Trái đất, phân tử lượng là 32,06 Giống như P, hàm lượng S trong cơ thể khá thấp, chỉ vào khỏang 0,25%, nhưng lại là một thành phần quan trọng của chất nguyên sinh Trong thiên nhiên S hình thành 8 dạng oxy hóa, từ hóa trị -2 đến +6 Trong các loại oxid, quặng sắt vàng (FeS2) chứa nhiều S nhất, là nguồn S lớn nhất trên trái đất Kho dự trữ S chính ở nham quyển (như quặng sulfur, S trầm tích và nhiên liệu khoáng) Khối lượng muối sulfate hòa tan trong nước biển cũng rất lớn S còn tồn tại trong khí quyển với các dạng khí H2S, SO2 và sulfur methyl Cơ thể sinh vật và chất hữu cơ chứa rất ít S, nhưng là nguồn S có tốc độ tuần hoàn nhanh (Schlesinger, 1997) Tuần hoàn S là một trong các vòng tuần hoàn phức tạp nhất của sinh quyển, vừa có tuần hoàn thể khí, vừa có tuần hoàn trầm tích, cho nên được coi thuộc dạng tuần hoàn quá độ Trong tuần hòan lưu huỳnh, vi sinh vật xúc tác các quá trình oxy hóa và khử S dưới các hình thức khác nhau, thúc đẩy tuần hoàn sinh địa hóa học và đóng vai trò quan trọng hàng đầu

 Vòng tuần hoàn lưu huỳnh cơ sở (theo Prescott và cộng sự)

Quá trình cơ bản của vòng tuần hòan S là: tầng nham thạch sulfate và nhiên liệu hóa thạch trong đất liền và trong đại dương bị phân hủy và phong hóa tự nhiên, cùng với sự phun trào núi lửa sẽ giải phóng H2S, SO2 vào khí quyển S trong khí quyển thông qua tác dụng mưa và trầm lắng một phần trở về biển, phần khác trong đất biến thành muối sulfate dành cho thực vật hấp thu, là thành phần của một số amino axít, di chuyển trong chuỗi thức ăn Chất bài tiết và xác động thực vật bị vi sinh vật phân hủy, S bị giải phóng ra, lại trở về đất hoặc qua các dòng chảy trên mặt đất rửa trôi về sông hồ rồi tới biển và trầm tích ở đáy biển sâu Do hàm lượng S trong thiên nhiên rất phong phú, nhu cầu của sinh vật đối với S không nhiều như đối

5

với C, O, P, nên S rất ít khi trở thành nhân tố hạn chế đối với sự sinh trưởng của cơ thể Theo Black (2002) Vi khuẩn quang hợp dùng hợp chất lưu huỳnh làm chất cho

electron để chuyển hóa lưu huỳnh đó là chức năng của Thiobacillus

Ngược lại, khi sulfate khuếch tán đến môi trường có trạng thái khử thì chúng

sẽ tạo cơ hội cho những nhóm vi sinh vật khác tiến hành khử sulfate (sulfate reduction) Chẳng hạn, khi tồn tại một chất khử hữu cơ có thể sử dụng được thì vi

khuẩn Desulfovibrio sẽ dùng sulfate để làm chất oxy hóa, sử dụng sulfate như chất

nhận electron ngoại lai để hình thành sulfid tích lũy lại trong môi trường Đó là ví

dụ điển hình của quá trình khử dị hóa (dissimilatory reduction) và hô hấp kỵ khí Ngược lại, việc khử sulfate trong quá trình sinh tổng hợp amino axít và protein được coi là một quá trình khử đồng hóa (assimilatory reduction) Nhiều vi sinhvật khác cũng được biết đến là loại khử dị hóa lưu huỳnh nguyên tố, đó là

Desulfuromonas, cổ khuẩn ưa nhiệt, và cả các vi khuẩn lam trong các trầm tích có

độ muối cao Sulfit là một dạng trung gian quan trọng khác, nó có thể bị nhiều loại

vi sinh vật khử thành sulfit, đó là các vi khuẩn như Alteromonas, Clostridium và Desulfomaculum Vi khuẩn Desulfovibrio thường được coi là loại kỵ khí bắt buộc

Tuy nhiên các nghiên cứu gần đây cho biết khi chúng tồn tại trong môi trường có mức oxy hòa tan là 0,04% thì chúng cũng có thể dùng oxy để hô hấp Ngoài ra, các

vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh thuộc nhóm tự dưỡng quang năng rất quan trọng như

Chromatium và Chlorobium có thể tác động mạnh trong điều kiện kỵ khí nghiêm

ngặt dưới chiều sâu của nước, một nhóm lớn các vi khuẩn khác nhau có thể thực hiện quang hợp hiếu khí không sinh oxy (Aerobic anoxygenic photosynthesis) Trong môi trường nước biển và nước ngọt phát hiện thấy các vi khuẩn quang hợp hiếu khí không sinh oxy này sử dụng sắc tố bacterioclorophyl và carotenoid, chúng thường là thành phần chính của quần lạc vi sinh vật Các chi chủ yếu là

Erythromonas, Roseococcus, Porphyrobacter và Roseobacter Các thành phần

“nhỏ” trong vòng tuần hoàn lưu huỳnh có vai trò quan trọng trong sinh học Một ví

dụ điển hình là dỉmtylsulfoniỏpopionat (DMSP), chúng được sử dụng bởi vi khuẩn

6

phù du (bacterioplankton) như nguồn lưu huỳnh để tổng hợp protein, chuyển hóa thành dimethylsulfid (DMS) - một chất lưu huỳnh bay hơi có thể ảnh hưởng tới các quá trình của khí quyển Khi điều kiện pH và thế oxy hóa khử thích hợp, nhiều chuyển hóa quan trọng trong vòng tuần hoàn lưu huỳnh cũng có thể thực hiện thông qua các phản ứng hóa học mà không có sự tham gia của vi sinh vật Một ví dụ quan trọng của quá trình phi sinh học này là sự oxy hóa sulfid thành lưu huỳnh nguyên

tố

Những bước then chốt của vòng tuần hoàn lưu huỳnh bao gồm các quá trình sau đây:

1.1.1 Đồng hóa lưu huỳnh:

Đó là quá trình vi sinh vật sử dụng sulfate và H2S tạo nên vật chất của tế bào Vi sinh vật ngòai một số rất ít có thể đồng hóa trực tiếp S, phần lớn phải dùng sulfate làm nguồn S Sau khi chúng hấp thu sulfate sẽ khử thành sulfur, kết hợp với các chất của tế bào như protein, quá trình đó được gọi là tác dụng khử sulfate chất đồng hóa Tác dụng khử sulfate cần dùng tới năng lượng Trước khi khử sulfate cần tiêu hao ATP để chuyển hóa thành adenosin 5’ phosphosulfate (APS); tiếp theo phải tiêu hao ATP thứ 2 để chuyển hóa APS thành 3’ phosphoadenosin 5’-phosphosulphat (PAPS) Sau đó khử PAPS thành sulfit, rồi khử tiếp thành sulfid Sulfid sinh ra được serine hấp thu, rồi tạo thành cystein

1.1.2 Tác dụng khử lưu huỳnh (desulphuration):

Chỉ quá trình protein và các chất hữu cơ chứa S khác được vi sinh vật phân hủy phóng thích H2S Nhiều Vi sinh vật họai sinh trong hồ có khả năng này, chẳng

hạn các lòai sống trong những hồ nghèo dinh dưỡng như Mycobacterium phlei, Mycobacterium filiforme; các loài sống trong những hồ giàu dinh dưỡng như Pseudomonas fluorescens, Bacterium delicatum Các loài tảo biển thường tổng hợp

dimethylsulfoniopropionat (DMSP), dùng để điều tiết áp suất thẩm thấu tế bào DMSP được vi sinh vật phân giải chuyển hóa thành dimethylsulfid (DMS) DMS

7

bay hơi vào khí quyển, rồi sẽ cùng với H2S dưới tác dụng của ánh sáng tạo thành sulfate

H2S+DMS → S2O32- → H2SO4Loài người đốt cháy các nhiên liệu chứa S, thải SO2 ra khí quyển, hình thành khói axít, H2SO4 tan trong hơi nước, khiến cho pH nước mưa từ trung tính giảm xuống còn 3,5, hình thành nên mưa axít, gây ô nhiễm môi trường và làm nguy hại đến sức khỏe nhân loại

1.1.3 Tác dụng lưu hóa (sulphurication):

Quá trình hình thành H2SO4 từ H2S, S, FeSO4 gọi là lưu hóa hay oxy hóa lưu huỳnh (sulfur oxydation) Tham gia tác dụng lưu hóa có vi khuẩn lưu hóa và vi khuẩn lưu hùynh

Vi khuẩn lưu hóa: Những lòai thuộc chi Thiobacillus có thể oxy hóa S hoặc

sulfid để thu năng lượng, sinh ra H2SO4, đồng hóa CO2 và tổng hợp nên chất hữu

cơ, thường bên trong tế bào không chứa trữ các hạt lưu huỳnh, như Thiobacillus thiooxidans chẳng hạn:

2S + 3O2 + 2H2O → 2H2SO4 + năng lượng

Na2S2O 3 + 2O2 + H2O → Na2SO4 + H2SO4+ năng lượng

H2S + O2 → 2H2O + năng lượng

Vi khuẩn Thiobacillus ferrooxydans có thể thu được năng lượng từ qua trình oxy

hóa FeSO4 thành Fe 2(SO4)3:

4FeSO4 + O2 + H2SO4→ 2 Fe2(SO4)3 + H2O

Vi khuẩn Thiobacillus ferrooxydans chịu được axít mạnh, Fe2(SO4)3 lại là chất dễ hòa tan, vì vậy có thể dùng vi khuẩn này để tách được đồng, sắt ra từ các dạng xỉ quặng hay quặng nghèo:

8

FeS + 7 Fe2(SO4)3 + 8 H2O → 15 FeSO4 + 8 H2SO4 Cu2S + 2 Fe2(SO4)3 → 2Cu SO4

+ 4 FeSO4 + S Phương pháp tách quặng thông qua vi khuẩn được gọi là phương pháp luyện kim ướt, các chất FeSO4, CuSO4 sinh ra sẽ qua các phương pháp hiện đại để thu hồi lại kim loại

Ngoài ra, vi khuẩn lưu hùynh màu lục và vi khuẩn lưu huỳnh màu tía có thể quang hợp trong điều kiện kỵ khí:

CO2 + H2S →(ánh sáng)→ [C H2O] +2S + 2 H2O 3CO2 + 2S + 5H2O →(ánh sáng)→ 3[CH2O] + 2H2SO4

Vi khuẩn lưu huỳnh:Có thể oxy hóa H2S thành S và tích trữ hạt S trong tế bào Khi môi trường thiếu H2S, chúng sẽ oxy hóa tiếp S thành H2SO4 , năng lượng sinh ra được dùng để cố định CO2

2 H2S + O2 → 2S + 2 H2O+ năng lượng 2S + 2 H2O → 2 SO4-2

+ 4H+ + năng lượng

1.1.4 Tác dụng khử sulfate (sulfate reduction)

Tác dụng khử sulfate có 2 dạng: dạng đồng hóa và dạng dạng dị hóa Tác dụng khử sulfate dạng dị hóa là quá trình S hoặc sulfate dưới tác dụng của vi sinh vật được dùng làm thể nhận electron và bị khử thành H2S Ví dụ phẩy khuẩn

Desulfovibrio desulfuricans có thể sử dụng glucose và lactose để khử sulfate:

C6H12O6 + 3H2SO4 → 6 CO2 + 6H2O + 3 H2S+ năng lượng 2CH3CHOHCOOH (axít lactic) + H2SO4 → 2CH3COOH (axít acetic) + 2CO2 + 2H2O + H2S+ năng lượng

Trong phản ứng trên axít lactic oxy hóa không triệt để, làm tích lũy axít acetic.Trong các ống thóat nước thải bằng bê tông hoặc bằng gang, nếu có mặt sulfate, đáy ống thường do thiếu oxy sẽ sản sinh ra H2S H2S sẽ nổi lên bề mặt tàng

9

nước thải, gặp oxy hòa tan, H2S bị vi khuẩn lưu hùynh hoặc vi khuẩn sulfur hóa oxy hóa thành H2SO4 và làm ăn mòn đường ống Trong thực tế có thể chống ăn mòn bằng cách duy trì dòng nước thải chảy thông suốt và nâng cao điện thế khử

1.2 Giới thiệu về vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh

Vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh hay còn gọi là vi khuẩn lưu huỳnh, gồm nhiều loài vi khuẩn lục, vi khuẩn tía có khả năng quang hợp, những vi khuẩn tự dưỡng hoá năng không sắc tố, có khả năng dùng các hợp chất lưu huỳnh làm nguồn năng lượng và nguồn cung cấp điện tử để đồng hoá CO2 và sinh trưởng Thuộc vi khuẩn

lưu huỳnh có nhiều loài của chi Thiobacillus, Thiomicrospira, Sulfolobus Một số vi

khuẩn lưu huỳnh, mặc dù oxi hoá lưu huỳnh và tích luỹ lưu huỳnh trong tế bào, nhưng vẫn còn cần chất hữu cơ để sinh trưởng như các vi khuẩn lưu huỳnh dạng sợi

thuộc chi Deggiatoa, Thiothrix, Thioploca và vi khuẩn lưu huỳnh đơn bào của chi Achromatium,Macromonas, Thiovulum Tham gia tích cực vào vòng tuần hoàn

lưu huỳnh trong tự nhiên, một số có vai trò khử H2S làm sạch nguồn nước Số khác dùng trong khai thác kim loại từ các quặng nghèo hoặc xỉ quặng Ăn mòn làm hư hỏng các thiết bị kim loại trong hầm mỏ, phá huỷ bê tông

1.3 Vai trò của vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh:

- Tham gia vào chu trình chuyển hóa lưu huỳnh trong tự nhiên

- Tạo nguồn năng lượng sơ cấp cho hệ sinh thái

- Cùng với thực vật đưa lưu huỳnh vào protein

- Góp phần điều hòa các chu trình khác như chu trình N, P, K

Sự chuyển hoa lưu huỳnh trong đất diễn ra theo 4 quá trình

- Giai đoạn khoáng hóa

- Giai đoạn oxi hóa lưu huỳnh

- Giai đoạn khử của lưu huỳnh

- Giai đoạn bất động của lưu huỳnh

10

Bốn quá trình này diễn ra tùy theo điều kiện môi trường và tùy theo quá trình diễn

ra trước đó Các quá trình này diễn ra có sự tham gia của vi sinh vật

 Sự khoáng hóa của lưu huỳnh

Điều kiện thoáng khí: sản phẩm là SO42- ngoài phần S sử dụng cho bản thân sinh vật

để tổng hợp protein

Điều kiện yếm khí: Sản phẩm là H2S và một vài mercaptan có mùi nhờ vi khuẩn yếm khí

 Sự oxi hóa lưu huỳnh vô cơ trong đất

Lưu huỳnh vô cơ được tạo ra do khoáng hóa lưu huỳnh và các quá trình khác

bị oxi hóa tạo ra SO42-, quá trình này có thể là phản ứng hóa học thuần túy hoặc do

vi sinh vật nhưng chủ yếu là do vi sinh vật

Có 4 nhóm vi sinh vật oxi hóa S:

Nhóm vi khuẩn hình que thiobacillus gồm 9 loài trong đó T novellus oxi hóa

cả S trong chất hữu cơ

11

+ Họ Chlorobacteriaceae

Nhóm vi khuẩn hình sợi thường gặp trong nước, oxi hóa H2S, vi khuẩn quang tổng hợp thường gặp trong nước

 Sự khử lưu huỳnh trong dất

Khi đất bị thiếu khí do ngập nước, nồng độ sulfid tăng trong khi nồng độ sunfat giảm nhanh, sự khử của S diễn ra mạnh mẽ do lựng vi khuẩn S tăng nhanh

 Sự bất động lưu huỳnh trong đất

Vi sinh vật cần S để phát triển và phải lấy S từ môi trường xung quanh Vi sinh vật có thể lấy S từ Sunfat, hyposulfic, thiosulfat, sunfid và các S hữu cơ như các axít amin trogn tế bào Hiện tượng này gọi là bắt động S trong đất do vi sinh vật

1.2.1 Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (green sulfure bacteria)

Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a cùng với b, c hoặc

e, chứa caroten nhóm 5, hệ thống quang hợp liên quan đến các lục thể (chlorosom)

và độc lập đối với màng sinh chất Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H2, H2S hay S Hạt lưu huỳnh tích luỹ bên ngoài

tế bào Không có khả năng di động , một số loài có túi khí; tỷ lệ G+C là 48-58% (Nguyễn Lân Dũng, 1962)

12

Hình 1.1 Một số chủng vi khuẩn lưu huỳnh màu lục

1.2.2 Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (purple sulfur bacteria):

Vi khuẩn lưu huỳnh tía, danh pháp khoa học Chromatiales, là một nhóm vi khuẩn có khả năng quang hợp, chúng thường được gọi chung là vi khuẩn tía Chúng

là các sinh vật ưa khí, và thường được tìm thấy trong các suối nước nóng hay môi trường nước tù Không giống như thực vật, tảo và cyanobacteria, chúng không sử dụng nước làm chất khử và cũng không sinh oxi trong quá trình quang hợp Thay vào đó, chúng sử dụng ôxi hóa hydro sulfua để tạo ra lưu huỳnh nguyên tố, sau đó, lưu huỳnh này là bị oxy hóa thành axít sulfuric

Vi khuẩn lưu huỳnh tía được chia thành 2 họ, Ectothiorhodospiraceae, và Chromatiaceae chúng có khả năng tạo ra các hạt lưu huỳnh theo thứ tự bên trong

và bên ngoài tế bào, và do đó chúng thể hiện những đặc điểm khác nhau về cấu trúc của các màng tế bào bên trong của chúng

Vi khuẩn lưu huỳnh tía thường được tìm thấy trong các vùng được chiếu sáng nhưng thiếu oxy của các hồ các dạng chứa nước khác nơi mà hydro sulfua tích

tụ, và cũng như trong các "suối lưu huỳnh" nơi mà các sự sản sinh ra hydro sulfua

từ quá trình sinh học hoặc địa hóa có thể gây ra hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lưu

Hình 1.2 một số vi khuẩn lưu huỳnh màu tía

14

1.2.3 Vi khuẩn tự dưỡng hoá năng không sắc tố

Là nhóm vi khuẩn có khả năng oxy hoá lưu huỳnh, hydrosunfua, Na2S2O3 và

Na2S4O6 thành sulfat mà không để lưu huỳnh đọng lại trong tế bào Chúng phân bố rộng rãi trong đất, nước (trong cả nước mặn lẫn nước ngọt) và đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm sạch nước

Đa số vi khuẩn tự dưỡng hoá năng không sắc tố (Thiobacterium thioparus, Thiobacillus thiooxidans), hiếu khí bắt buộc, thường là Gram âm, hình que nhỏ, di

động hay không (có lông roi ở đỉnh) và không có bào tử Các vi khuẩn sulfate hoá phát triển ở các độ pH rất khác nhau có thể dao động từ 2 đến 9,6

Vi khuẩn tự dưỡng hoá năng không sắc hầu như không sử dụng được nguồn cacbon hữu cơ, chúng lấy năng lượng từ qúa trình oxy hoá lưu huỳnh và các hợp chất của lưu huỳnh như hydrosunfua, sulfit và thiosunfat

Đại diện vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh là Thiobacillus có một số đặc

điểm sau:

Các chi Thiobacillus bao gồm các vi khuẩn gram âm không màu hình que

ngắn và di chuyển bằng cách sử dụng một roi cực Kích thước tế bào 0,3 x 1-3 µm

và không hình thành bào tử vi khuẩn phát triển tốt nhất ở 25-35oC và pH từ 3 đến 7

Nó có khả năng thu năng lượng từ quá trình oxy hóa của nguyên tố lưu huỳnh và các hợp chất chứa lưu huỳnh Một vài loài đôi khi có thể đồng hóa một số lượng nhỏ các hợp chất hữu cơ nhưng chỉ đến một mức độ giới hạn và trong một mô hình hạn chế

15

Trong tự nhiên, việc phân phối giảm hợp chất lưu huỳnh vô cơ chỉ là một trong những yếu tố chi phối sự hiện diện và hoạt động của các vi khuẩn lưu huỳnh không màu Một yếu tố quan trọng là yêu cầu về sự hiện diện đồng thời của một nhà tài trợ điện tử và nhận điện tử (tức là, oxy hoặc nitơ oxit) Các vi khuẩn có xu hướng phát triển trong khu vực hẹp và dốc nơi sulfide và oxy cùng tồn tại, chẳng hạn như trong hồ phân tầng và tại giao diện giữa nước hiếu khí và trầm tích kỵ khí

Có hai loại chính của Thiobacillus, một trong đó chỉ mọc ở pH trung tính và hai là

các loài mọc trong môi trường không phải là pH trung tính

1.2.4 Tác động Thiobacillus cho môi trường

Đa số các vi khuẩn lưu huỳnh không màu tạo ra axít sulfuric, nó thường gắn liền với sự ăn mòn oxy hóa của bê tông và ống dẫn, liên quan đến sự ăn mòn của các tòa nhà và các di tích cổ xưa Axít và ô nhiễm kim loại cũng có thể là một kết

quả của các hoạt động của Thiobacillus trong chất thải mỏ (Tuovinen và Kelly,

1972) Về mặt tích cực hơn, việc sản xuất axít sulfuric có thể được sử dụng trong quá trình lọc quặng để tách các kim loại từ quặng nghèo mà không thích hợp cho khai thác bằng phương pháp luyện kim thông thường

16

Trong đất, Thiobacillus đôi khi có thể chịu trách nhiệm về hòa tan các hợp

chất lưu huỳnh, do đó làm cho lưu huỳnh có sẵn (như sulfate) cho đồng hóa bởi các

vi sinh vật và thực vật khác

1.4 Đặc tính của khí hydrosufua (H 2 S)

Trong các hợp chất của lưu huỳnh, khí H2S là một khí quan trọng vì ý nghĩa môi trường của nó Khí H2S phát sinh chủ yếu từ quá trình phân hủy hữu cơ, có mùi hôi đặc trưng và gây ra nhiều tác hại đến sức khỏe của con người, hệ động thực vật Chính vì vậy, từ nhiều thập niên trước, các nhà khoa học đã nghiên cứu về loại khí độc hại này Kết quả của nhiều quá trình nghiên cứu đã chứng minh được nguồn gốc phát sinh, tính chất vật lý cũng như tác động đến môi trường của chúng

Nguồn phát sinh: trong công nghiệp, khí sunfua hydro xuất hiện trong khí thải các quá trình sử dụng nhiên liệu hữu cơ chứa sunfua, các quá trình tinh chế dầu

mỏ, các quá trình tái sinh sợi, hoặc trong công nghiệp ché biến thực phẩm ( Đặng Kim Chi, 2001) Ngoài ra, H2S còn phát sinh từ rác thải sinh hoạt, rác công nghiệp Trong tự nhiên, H2S có trong nước suối, bờ biển, ao tù, trong khí núi lửa, các hầm

lò khai thác than, khí thoát ra từ các chất protein bị thối rữa,…(Phạm Ngọc Đăng, 2003)

Tính chất vật Lý: Theo Lê Xuân Trọng (2007), hydro sunfua là khí không màu, mùi trứng thúi H2S dễ bay hơi so với nước, vì thực tế không tạo thành liên kết hidro giữa các phân tử H2S Khí H2S ít tan tron nước: ở 20oC độ tan cùa S=0,38 g/100g nước

Tác hại của H2S đối với sức khỏe vật nuôi: gây kích ứng mắt, viêm cục bộ màng mắt và đường hô hấp (Curtis, 1983) Tác động gây kích ứng của H2S ít hay nhiều đều giống nhau qua đường hô hấp mặc dù cấu trúc của lớp phổi có thể dễ bị ảnh hưởng nhất viêm phổi lớp sâu thường dẫn tới phù phổi H2S có thể nhanh chóng hấp thụ qua phổi và gây ra nhiễm độc hệ thống hô hấp con vật (Hoàng Thu Hằng, 1997) Theo Waldmann và Wendt (2001), tiêu chuẩn về hàm lượng khí độc

17

tối đa cho phép trong chuồng nuôi của các khí độc H2S là 5ppm Cục quản lý sức khỏe và an toàn nghề nghiệp của Mỹ (OSHA) khuyến cáo nồng độ khí H2S trong chăn nuôi không quá 10ppm

Khí H2S rất độc, chỉ cần nồng dộ bằng 5ppm đã gây ngộ độc, chóng mặt, nhức đầu Ở nồng độ lớn hơn 150 ppm, có thể gây tổn thương đến màng nhầy của

cơ quan hô hấp Với nồng độ 500ppm, gây viêm phổi và tiêu chảy tiếp xúc ngắn với khí H2S ở nồng độ từ 700- 900 ppm thì chúng sẽ nhanh chóng xuyên qua màng túi phổi, xâm nhập vào mạch máu và gây tử vong (Đặng Kim Chi, 2001) Ngoài ra, hydro sunfua còn làm tổn thương lá, rụng lá và làm giảm khả năng sinh trưởng của thực vật

Theo tiêu chuẩn môi trường Việt Nam ( TCVN 5937/5938-1995), nồng độ

H2S cho phép ở khu dân cư là 0,008 mg/m3 (0,0052ppm), ở khu sản xuất là 2mg/m3 (1,3 ppm)

1.5 Giới thiệu về đệm lót lên men vi sinh vật trong chăn nuôi

Hiện nay trên thế giới đã áp dụng nhiều phương pháp chăn nuôi như chăn nuôi hữu cơ, chăn nuôi an toàn sinh học, và mới đây là công nghệ chăn nuôi sinh thái không chất thải dựa trên nền tảng công nghệ lên men vi sinh đệm lốt nền chuồng Với công nghệ này, toàn bộ phân nước tiểu nhanh chống được vi sinh vật phân giải và chuyển thành nguồn thức ăn protein sinh học cho chính vi sinh vật Do

đó, trong chuồng nuôi không có mùi hôi thối vì si sinh vật hữu ích trong chế phẩm

sử dụng đã cạnh tranh và tiêu diệt các vi sinh vật có hại và sinh mùi khó chịu

1.5.1 Ứng dụng của vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh trong đệm lót chăn nuôi

 Sự khử mùi hôi và khí độc

Việc khử mùi hôi và khí độc trong đệm lót là do hấp phụ vật lý của độn lót

và của ánh sáng, nhưng tác dụng khử mùi thối của vi khuẩn hữu ích sử dụng trong chế phẩm vi sinh tổng hợp mới là chủ yếu

18

 Vi sinh vật có ích thực hiện giảm mùi theo hai cách:

Ức chế và khử vi khuẩn có hại, lên men gây thối trong đệm chuồng do tác dụng cạnh tranh của vi sinh vật có lợi

Trong thành phần của tổ hợp vi sinh vật được đưa vào xử lý độn chuồng có

những chủng có thể sử dụng các khí độc (chủng Thiobacillus có thể sử dụng H2S) làm nguồn dinh dưỡng cho sinh trưởng và phát triển của mình Do đó mà góp phần làm giảm nhanh khí độc trong chuồng chăn nuôi (Đỗ Thị Thu Hường, 2011)

19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng thí nghiệm

Tập trung chủ yếu vào nhóm vi khuẩn hiếu khí thuộc các giống Thiobacillus

2.2 Vật liệu nghiên cứu

 Trang thiết bị thí nghiệm

+Môi trường lên men dịch thể

Từ môi trường cơ bản trên tiến hành tiến hành các thí nhiệm để xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập được

+Môi trường lên men rắn

Bột cám gạo 90%

Vỏ trấu ghiền 10%

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh

2.3.1.1 Phương pháp lấy mẫu:

Chuẩn bị môi trường lấy mẫu:

Pepton 1g

Nước cất 1000ml

23

Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường lấy mẫu, dùng tâm bông vô trùng lấy mẫu trực tiếp tại các nguồn nước thải, bùn khác nhau trong trại chăn nuôi cho vào các ống nghiệm chứa môi trường lấy mẫu

2.3.1.2 Phương pháp phân lập

Môi trường thạch Beijeninck được hấp ở 1210C trong 15 phút

Lấy 1 ít sinh khối từ ống nghiệm chứa môi trường chứa mẫu cấy ria lên thạch đĩa Beijeninck Sau đó ủ ở 30oC trong 72 giờ

Quan sát nhìn dạng khuẩn lạc phát triển, tiếp tục chọn những khuẩn lạc có hình dáng đặc trưng cấy chuyển vào môi trường thạch Beijeninck

+ Tăng sinh vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh

Môi trường lỏng Beijeninck chứa bình erlen được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút

Dùng que cấy vòng chạm lấy 1 ít sinh khối sau đó cấy vào môi trường lỏng Beijeninck

Tiến hành nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng 200 vòng trong 24giờ

Xác định mật độ vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường Beijeninck theo phương pháp cấy trang

+Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh trong môi trường lỏng Chuẩn bị môi trường : Môi trường lên men lỏng được chứa trong các ống nghiệm

được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút

Vi khuẩn được tăng sinh sau đó hút 1ml dịch tăng sinh cho vào các ống nghiệm

chứa 9ml môi trường Beijeninck

Tiến hành nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng 200 vòng trong 24giờ

24

+Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh trong môi trường rắn

Chuẩn bị môi trường : Môi trường thạch Beijeninck hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút Để nguội tiến hành đổ đĩa

Vi khuẩn được tăng sinh sau đó dùng que cấy lấy sinh khối trong dịch tăng

sinh cấy ria vào các đĩa chứa môi trường thạch Beijeninck

+Phương pháp Nhuộm gram [3],[7]

Dựa vào khả năng bắt màu khác nhau của vi khuẩn gram (+) và gram (-) được quy định bởi vách tế bào để tiến hành nhuộm gram

Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến)

Vật liệu, hoá chất:

 Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):

2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml ethanol 95%

0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất

Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng

 Dung dịch Iod:

Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml Bảo quản trong lọ tối

 Dung dịch tẩy màu:

Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml ethanol 95% với 30ml aceton

 Dung dịch nhuộm bổ sung:

Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%

Các bước tiến hành:

25

 Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí

 Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần

 Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

 Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

 Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô

 Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí

 Soi kính: dùng vật kính dầu 100X

Kết quả:

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (－) bắt màu đỏ

+Phương pháp kiểm tra sự thay đổi pH

Chuẩn bị môi trường : Môi trường lỏng Beijeninck trong các ống nghiệm

hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút

26

Dùng que cấy lấy sinh khối từ môi trường tăng sinh trước đó cấy vào các ống nghiệm môi trường đã chuẩn bị sẵn

Quan sát sự thay đổi màu của dung dịch trong 15 ngày nuôi lắc

+Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng glucose của các chủng vi khuẩn

Chuẩn bị môi trường : Môi trường thạch Beijeninck có bổ sung 5g/l đường

glucose hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội tiến hành đỗ đĩa

Dùng que cấy lấy sinh khối từ môi trường tăng sinh trước đó cấy vào các đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn

Quan sát sự thay đổi màu của đĩa trong 72h nuôi cấy

+Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng nguồn lưu huỳnh của các chủng vi khuẩn

Chuẩn bị môi trường : Môi trường thạch Beijeninck có bổ sung 5g/l

Na2S2O3 và hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội tiến hành đỗ đĩa

Dùng que cấy lấy sinh khối từ môi trường tăng sinh trước đó cấy vào các đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn

Quan sát sự thay đổi màu của đĩa trong 72h nuôi cấy

+Phương pháp kiểm tra tính di đông trên môi trường thạch mềm

Chuẩn bị môi trường : Môi trường thạch Beijeninck (0,3% agar) hấp khử trùng ở

Ba2+ +SO42- BaSO4 dư: phần kết tủa BaSO4 được nung, phần nước lọc có

Ba2+ dư, cho thêm Mg2+ sau đó chuẩn độ bằng EDTA

Ba2+ + H2Y2-  BaY2- +2H+

H2Y2- + Mg2+  MgY2- +2H+

 Tại điểm tương đương

MgInd ( màu đỏ nho) + H2Y2-  MgY2- + H2Ind ( màu xanh)

Hằng số bền của BaY2- và MgY2- tương đối giống nhau, tuy nhiên, chúng cao hơn hằng số bền của MgInd Mặt khác, hằng số bền của MgInd cao hơn BaInd rất nhiều (107 so với 102) nên tại điểm tương đương, phức MgInd ( đỏ nho) còn lại sau cùng trước khi bị chuyển sang HInd2-

Hút 20ml dung dịch B cho vào bình nón 250ml Trung hòa dung dịch bằng NaOH 2N tới trung tính ( thử bằng giấy quỳ), thêm chính xác V2ml (5ml) dung dịch

Mg2+ có nồng độ C2 Thêm 5ml dung dịch đệm amoniac + amoni clorua và một ít

28

chỉ thị ET-OO Khi đó dung dịch sẽ có màu đỏ nho Chuẩn độ bằng EDTA có nồng

độ Co cho tới khi dung dịch chuyển sang màu xanh thì dừng lại Ghi số ml EDTA

đã chuẩn độ V0 ml

Số mg SO42- = [(

]

+Phương pháp giữ giống

Chủng vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh phận lập, tuyển chọn và được giữ trên

môi trường thạch nghiêng, bảo quản ở 40

C trong suốt thời gian nghiên cứu

2.3.2 Khảo sát môi trường, pH, nhiệt độ, nồng độ muối, nguồn cơ chất, thời gian thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh

2.3.2.1 Khảo sát môi trường tối ưu

 Bố trí thí nghiệm

Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập và tuyển chọn được khảo sát ở 5 môi trường khác nhau MT1; MT2; MT3; MT4; MT5 (lặp lại 3 lần) Sau 72 giờ nuôi lắc ở 180 vòng/phút Sinh trưởng được theo dõi bằng phương pháp đo mật độ tế bào với bước sóng 600 nm trên máy đo so màu

+Phương pháp đo độ đục (OD)

Sinh trưởng được theo dõi bằng phương pháp đo mật độ tế bào với bước sóng 600 nm trên máy đo so màu Kết quả OD cho ta biết độ đục của canh

trường nuôi cấy vi sinh Dùng phương pháp này cho phép ta so sánh được lượng sinh khối giữa các dịch canh trường Đây là phương pháp đơn giản, cho kết quả nhanh nhưng kết quả chỉ mang tính so sánh giữa các mẫu có môi trường tương tự nhau

2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH

pháp đo độ đục được tiến hành như thí nghiệm trên

2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố có tác động đến các quá trình sinh hóa trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Tuỳ từng loại vi khuẩn mà nhiệt độ có ảnh hưởng khác nhau Để tìm ra nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng:

 Bố trí thi nghiệm

Tiến hành nuôi lắc các chủng trong các ống nghiệm chứa môi trường MT1 ở các nhiệt độ 30, 35, 400C (lặp lại 3 lần) Sau 72h lên men, xác định khả năng sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục, phương pháp đo độ đục được tiến hành như thí nghiệm trên

2.3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ NH 4 Cl

 Bố trí thí nghiệm

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NH4Cl đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng sulfat hoá tôi tiến hành thí nghiệm (lặp lại 3 lần) bổ xung NH4Cl vào các ống nghiệm chứa môi trường Beijeninck với hàm lượng từ 0,1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9, g/l đã được hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút Do môi trường là giống nhau nên tôi chọn phương pháp so sánh mật độ bằng đo OD Phương pháp được tiến hành như các thí nghiệm bên trên

30

2.3.2.5 Ảnh hưởng của nguồn lưu huỳnh đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng nghiên cứu

Vi khuẩn sunlfate hoá là nhóm vi khuẩn có khả năng oxy hoá lưu huỳnh,

hydrosunfua, Na2S2O3 và Na2S4O6 thành sulfat mà không để lưu huỳnh đọng lại trong tế bào Vi khuẩn sulfate hoá hầu như không sử dụng được nguồn cacbon hữu

cơ, chúng lấy năng lượng từ qúa trình oxy hoá lưu huỳnh và các hợp chất của lưu huỳnh như hydrosunfua, sulfid và thiosunfat Vì vậy việc lựa chọn được nguồn lưu huỳnh thích hợp làm tăng hiệu quả quá trình lên men

 Bố Trí thí nghiệm

Với mục đích tìm ra được nguồn cung cấp lưu huỳnh thích hợp nhất chúng tôi tiến hành thí nghiệm với những lựa chọn dùng: lưu huỳnh, Na2S, Na2S2O3 với lượng bổ sung vào các ống nghiệm chứa môi trường Beijeninck là 5g/l, sau 72h nuôi cấy dịch lên men được trang cấy đếm khuẩn lạc

Xác định số lượng tế bào bằng Phương pháp cấy gạt (hộp trải)[8]

Mẫu cần xác định số lượng được lắc đều dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch chứa vi sinh vật cho vào ống chứa 9 ml dung dịch muối sinh lý (NaCl = 0.85%)vô trùng, trộn đều

Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở nồng độ thích hợp như : 10-1, 10-2, 10-3,

10-4, 10-5 tiến hành cấy mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào các đĩa Petri (lặp

ba, tức là cấy mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 3 đĩa Petri) Hút 0,1ml cho vào đĩa thạch

đã chuẩn bị sẵn Dùng que gạt vô trùng gạt đều trên bề mặt thạch

Nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp và theo dõi trong vòng từ 24 - 72 h

Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn trên từng đĩa và tính theo công thức:

Mi (CFU/ml) = Ai/Di/V

Trong đó:

31

CFU- Conoly forming unit

Ai là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa

Di là độ pha loãng

V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)

Mật độ tế bào trung bình M trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau

2.3.2.6 Nghiên cứu động học của quá trình lên men

Các chủng vi khuẩn sulfate hoá được nuôi trong môi trường Beijeninck lỏng chứa 20mg/l S- S2O32-. Các bình nuôi lắc ở nhiệt độ và pH thích hợp với tốc độ 200 vòng/phút Cứ sau 8 giờ lấy mẫu một lần, kiểm tra mật độ tế bào bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường Beijeninck thạch đĩa, phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc được tiến hành như các thí nghiệm bên trên

2.4.1 Lên men thử nghiệm tạo chế phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm

Giống: được phân lập và lưu giữ trong tủ lạnh ở dạng thạch nghiêng

Hoạt hoá: trước khi tiến hành lên men, giống được hoạt hoá qua đêm và được bổ sung vào môi trường lên men

Lên men: Môi trường lên men là môi trường đã được tối ưu ở trên, các điều kiệnnhư nhiệt độ, pH, thời điểm dừng quá trình lên men, đã được nghiên cứu và tổng hợp sau đó được phối trộn vào môi trường lên men rắn và đem sấy ở 40oC cho đến khô

Phương pháp lên men

Quá trình lên men dịch thể được tiến hành trong các bình tam giác dung tích 500ml chứa môi trường tương ứng, nuôi lắc 200v/phút ở nhiệt độ nghiên cứu, thời gian lên men 48 giờ

Kêt thúc quá trình lên men lấy dịch lên men để phân tích các chỉ tiêu cần thiết

32

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Kết quả lấy mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh

3.1.1 Kết quả lấy mẫu

Bảng 3.1 Địa điểm lấy mẫu tại Phân Viện Chăn nuôi Nam Bộ

Ghi chú

3 Bùn ở sau vùng nước thải khi đã qua xử lý Bio gas

4 Phân ướt từ chuồng ra (có thể đã lên men)

5 Phân khô, phân cũ (có thể đã lên men)

6 Nước ở đường ống từ các chuồng chảy ra

7 Bùn ở đường ống từ các chuồng chảy ra TH7

11 Nước thải từ chuồng heo nái chửa TH11

13 Phân tươi từ chuồng heo nái (nuôi con)

14 Nước thải từ chuồng heo nái (nuôi con) TH14

16 Phân tươi của gà giống (gà mái đẻ)

17 Phân tươi của gà giống (gà mái đẻ)

Nhận Xét : Trong 20 mẫu phân lập, có bốn mẫu (mẫu số 7, 8, 11 và 14) sau 72h

nuôi cấy cho các khuẩn lạc tròn màu trắng, hóa nâu khi già giống như đặc điểm vi

khuẩn Thiobacillus theo bảng phân loại Bergey trên môi trường Beijeninck thạch

Sau đó, các chủng vi khuẩn trên được ký hiệu TH7, TH8, TH11 và TH14