Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp trong aspergillus niges D15 LCC1 và khảo sát khả năng ứng dụng

Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp trong aspergillus niges D15LCC1 và khảo sát khả năng ứng dụng Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp trong aspergillus niges D15LCC1 và khảo sát khả năng ứng dụng luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE

TÁI TỔ HỢP TRONG ASPERGILLUS NIGER

D15#26LCC1 VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE

TÁI TỔ HỢP TRONG ASPERGILLUS NIGER

1 PGS TS TÔ KIM ANH

2 TS LÊ QUANG HÒA

Hà Nội - 2012

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc các tác giả khác công bố

Hà Nội, ngày…….tháng………năm 2012

Nguyễn Thị Phương Mai

ii

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Tô Kim Anh – Viện trưởng – Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt và cấp kinh phí cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa và GS.TS Đặng Thị Thu – Phòng Hóa Sinh – Vi sinh và Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt cho tôi thực hiện nghiên cứu này

Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm – Trưởng bộ môn Hóa sinh – Vi sinh và Sinh học phân tử cùng các thầy, cô giáo vá các cán bộ phòng Hóa sinh – Vi sinh và Sinh học phân tử đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Tuấn Anh – giảng viên bộ môn Hóa sinh-Vi sinh

và Sinh học phân tử, Th.s Lê Tuân - cán bộ nghiên cứu bộ môn Hóa sinh-Vi sinh và Sinh học phân tử cùng các học viên đã hướng dẫn tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại bộ môn

Tôi xin được cảm ơn TS Trương Quốc Phong – Trưởng phòng thí nghiệm Proteomic, cùng các cán bộ và các học viên tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

đã động viên, hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Cộng đồng Hà Tây cùng gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày…… tháng…….năm 2012

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Phương Mai

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT viii

BẢNG VIẾT TẮT CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ix

DANH MỤC CÁC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 LACCASE 3

1.1.1 NGUỒN THU LACCASE 3

1.1.1.1 Laccase trong tự nhiên 3

1.1.1.2 Laccase tái tổ hợp 4

1.1.2 CẤU TRÖC CỦA LACCASE 6

1.1.3 CƠ CHẾ XÖC TÁC CỦA LACCASE 9

1.1.3.1 Xúc tác chuyển hóa các hợp chất phenol 9

1.1.3.2 Xúc tác chuyển hóa các hợp chất khác 10

1.1.4 ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE 11

1.1.4.1 Khối lượng phân tử 11

1.1.4.2 Tính đặc hiệu cơ chất 12

1.1.4.3 Các hằng số động học của phản ứng của laccase 12

1.1.4.4 pH tối ưu và độ bền pH 14

1.1.4.5 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt 15

1.1.4.6 Các chất kìm hãm 15

iv

1.2 ỨNG DỤNG CỦA LACCASE 16

1.2.1 Laccase trong phân hủy các hợp chất mạch vòng 16

1.2.2 Ứng dụng trong công nghiệp giấy 17

1.2.3 Ứng dụng laccase công nghiệp dệt nhuộm 17

1.2.4 Laccase trong công nghiệp thực phẩm 18

1.2.5 Laccase trong sản xuất bioethanol 19

1.2.6 Các ứng dụng khác của laccase 19

1.3 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE TỪ NẤM MỐC 20

1.3.1 Ảnh hưởng của trạng thái nấm mốc 20

1.3.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường 20

1.3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon 20

1.3.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 21

1.3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng 22

1.3.2.4 Ảnh hưởng của chất cảm ứng 23

1.3.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH 24

1.3.2.6 Ảnh hưởng của sự thông khí 25

1.4 KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE 25

1.4.1 Lên men gián đoạn 26

1.4.2 Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed-batch) 27

1.4.3 Lên men liên tục 28

1.4.4 Động học của quá trình sinh tổng hợp laccase 29

1.4.4.1 Động học phát triển của nấm mốc 29

1.4.4.2 Động học quá trình tạo sản phẩm trong các hệ thống lên men 30

1.4.5 Sinh tổng hợp laccase nhờ hệ thống biểu hiện A niger D15#26- pAN52-4 32

1.5 TINH CHẾ LACCASE 34

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

v

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 36

2.1.1 Các mẫu vật nghiên cứu 36

2.1.2 Vi sinh vật 36

2.1.3 Các loại thiết bị 37

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 38

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.2.1 Xác định sinh khối nấm mốc 38

2.2.2 Xác định hoạt độ laccase 38

2.2.3 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 39

2.2.4 Xác định đường khử theo phương pháp DNS 40

2.2.5 Xác định protein bằng phương pháp Lowry 40

2.2.6 Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE) 41

2.2.7 Điện di không biến tính phát hiện laccase 41

2.2.8 Xác định hàm lượng ethanol 41

2.2.9 Xác định hàm lượng phenol tổng số bằng phương pháp Folin Ciocalteau 42

2.2.10 Thu bào tử nấm mốc trên đĩa thạch 42

2.2.11 Phân lập và sàng lọc các chủng sinh laccase 43

2.2.12 Phương pháp sàng lọc dòng biểu hiện laccase 43

2.2.13 Phương pháp nuôi cấy và tối ưu hóa điều kiện nuôi A niger D15#26lcc1 1.8B 43

2.2.14 Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B 44

2.2.15 Tinh chế laccase tái tổ hợp 45

2.2.16 Khảo sát đặc tính cơ bản của enzyme 45

2.2.17 Thu nhận chế phẩm enzyme kỹ thuật 46

2.2.18 Nghiên cứu sử dụng laccase trong chuyển hóa lignocellulose 47

2.2.18.1 Xác định hàm lượng lignin theo phương pháp biến tính của Komarov 47

2.2.18.2 Khảo sát vai trò khử độc dịch thủy phân bã mía của laccase 48

vi

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50

3.1 SÀNG LỌC NGUỒN GEN SINH TỔNG HỢP LACCASE 50

3.2 SÀNG LỌC CÁC DÕNG A NIGER D15#26 lcc1 SINH TỔNG HỢP LACCASE 53

3.3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TĂNG TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LACCASE TRONG A niger D15#26lcc1 1.8B 57

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ glucose 57

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 60

3.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp 61

3.3.4 Ảnh hưởng của pH 62

3.3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 64

3.4 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP LACCASE TỪ A niger D15#26lcc1 1.8B TRONG LÊN MEN GIÁN ĐOẠN 66

3.4.1 Chọn miền khảo sát 66

3.4.2 Thiết lập mô hình 67

3.4.3 Tối ưu hóa quá trình tổng hợp laccase 71

3.5 KHẢO SÁT ĐỘNG THÁI TỔNG HỢP LACCASE 72

3.5.1 Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sinh tổng hợp laccase 72

3.5.2 Động thái của quá trình sinh tổng hợp laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B trong hệ thống lên men gián đoạn 74

3.6 THỬ NGHIỆM SINH TỔNG HỢP LACCASE TRONG LÊN MEN HAI GIAI ĐOẠN 75

3.7 THỬ NGHIỆM LÊN MEN FED-BATCH 78

3.8 TINH CHẾ LACCASE 81

3.9 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP 83

3.9.1 Ảnh hưởng của pH tới laccase 83

3.9.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới enzyme 84

3.9.3 Các hằng số động học của phản ứng enzyme 85

vii

3.10 KHẢO SÁT ỨNG DỤNG LACCASE TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL TỪ

LIGNOCELLULOSE 87

3.10.1 Tiền xử lí hóa nhiệt kết hợp với laccase 87

3 10.2 Vai trò laccase trong khử độc dịch thủy phân cho mục tiêu lên men ethanol 88

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92

KẾT LUẬN 92

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 94

PHỤ LỤC 104

viii

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

thuật ngữ viết tắt

Giải thích các từ hoặc thuật ngữ viết tắt

1 ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

13 PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon– Hydrocacbon mạch vòng

14 RBBR Remazol Brilliant Blue R

15 SDS – PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

4 KS Hằng số bán bão hòa cơ chất hay hằng số Monod, kg cơ chất.m-3

5 YP/S Hiệu suất tạo sản phẩm, g sản phẩm/g cơ chất

6 YX/S Hiệu suất tạo sinh khối, g sinh khối/g cơ chất

7 ΔP Sự thay đổi của sản phẩm, g sản phẩm

8 ΔS Sự thay đổi của cơ chất, g cơ chất

x

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Khối lượng phân tử và số lượng izozyme laccase trong tự nhiên 11

Bảng 2.1 Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố 44

Bảng 3.1 Số lượng các mẫu và chủng nấm thu được từ quá trình phân lập 50

Bảng 3.2 Kết quả sàng lọc hoạt tính laccase trên môi trường chứa các chất chỉ thị 51

Bảng 3.3 Hoạt độ laccase sau 9 ngày nuôi cấy trên MT2 52

Bảng 3.4 Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố thực nghiệm 66

Bảng 3.5 Kết quả thực nghiệm 67

Bảng 3.6 Kết quả phân tích hồi quy – hàm mục tiêu hoạt độ laccase (U/L) 68

Bảng 3.7 So sánh hiệu suất sinh trưởng và tổng hợp laccase của A.niger D15#26lcc1 1.8B (thực hiện trong bình tam giác 250 ml) 77

Bảng 3.8 So sánh hằng số động học của quá trình sinh tổng hợp laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B trong hệ thống lên men 80

Bảng 3.9 Các bước tinh sạch laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B 82

Bảng 3 10 So sánh hằng số động học của laccase tái tổ hợp, cơ chất ABTS 85

Bảng 3.11 Hiệu quả thu hồi laccase nhờ kỹ thuật lọc dòng ngang 86

Bảng 3.12 Hiệu suất thu hồi laccase nhờ kết tủa với (NH4)2SO4 bão hòa 87

xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sự phân bố các ion Cu 2+ trong laccase từ B subtilis 7

Hình 1.2 Cơ chế xúc tác của laccase 8 Hình 1.3 Cơ chế xúc tác phân hủy các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase 9 Hình 1.4 Cơ chế xúc tác phân hủy các tiểu phần không có bản chất phenol bởi laccase 11 Hình 1.5 Mô hình động học sinh trưởng nấm mốc theo Monod 29 Hình 1.6 Mô hình động học sinh trưởng và tổng hợp sản phẩm trong lên men gián đoạn 30 Hình 1.7.Các chế độ bổ sung dinh dưỡng trong lên men fed-batch 31 Hình 2.1 Cấu tạo vectơ biểu hiện pAN52 - 4 37 Hình 3.1 Vòng oxy hóa cơ chất chỉ thị tanic (a), RBBR (b) và phản ứng định tính của

laccase với syringaldazine (c: A-dương tính, B- âm tính) 51

Hình 3.2 Vòng oxy hóa cơ chất ABTS (a) và syringaldazine (b) của các chủng N7.2,

R5.3 và T versicolor 06 trên môi trường MT1 52 Hình 3.3 Kết quả sàng lọc chủng laccase tái tổ hợp trên môi trường tối thiểu được bổ sung thêm ABTS 54

Hình 3.4 Kết quả chọn dòng A niger D15#26lcc1 sinh tổng hợp laccase 55 Hình 3.5 Điện di đồ phổ protein của A niger D15#26lcc1 1.8B, A niger D15#26 và T

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH đến tổng hợp hợp protease và sinh trưởng của A niger D15#26lcc1 1.8B 63

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ NaNO 3 đến tổng hợp laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B 64

Hình 3.16 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy và tốc độ cấp khí đến tổng hợp laccase 73 Hình 3.17 Động thái quá trình sinh tổng hợp laccase từ A nigerD15#26lcc1 1.8B 75 Hình 3.18 Thử nghiệm lên men hai pha tổng hợp laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B

trong bình tam giác 250ml 76

Hình 3.19 Ảnh hưởng của nồng độ glucose trong lên men bán liên tục (fed-batch) (A) - glucose 0,125g/l.h; (B) - glucose 0,25g/l.h 79

Hình 3.20 Sắc ký đồ tinh sạch laccase từ A.niger D15#26lcc1 1.8B trên cột Hitrap Q fast

flow, rửa cột với đệm axetat natri 25mM, pH 5, gradient NaCl 0 – 1M 81

Hình 3.21 Điện di đồ (A) SDS-PAGE và (B) PAGE 82 Hình 3.22 Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ (A) và độ bền pH (B) của laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B 83

Hình 3 23 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ (A) và độ bền (B) laccase từ A niger D15#26

lcc1 1.8B 84

Hình 3.24 Vai trò của laccase trong xử lý bã mía 88 Hình 3.25 Khả năng loại phenol trong dịch tiền xử lý của laccase 90 Hình 3.26 So sánh khả năng loại bỏ phenol của enzyme tái tổ hợp (NC) và enzyme thương mại

(TM) 90

Hình 3.27 Khả năng lên men dịch thủy phân 1% cellulose bã mía sau xử lý với laccase 91

1

MỞ ĐẦU

Laccase (EC 1.10.3.2) là một polyphenol oxidase chứa nhiều nguyên tử đồng trong trung tâm xúc tác và thường được gọi là polyphenol oxidase đa đồng Laccase có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành các gốc quinin và sau đó oxy hóa chúng thành quinon, phản ứng oxy hóa gắn liền với sự khử phân tử oxy tạo thành nước Laccase được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp bao gồm tẩy trắng giấy, tẩy màu của thuốc nhuộm vải, loại bỏ hợp chất phenol dư trong rượu, khử độc môi trường, trong sản xuất nhiên liệu sinh học…

Laccase có thể thu nhận từ vi khuẩn, thực vật và côn trùng nhưng với hoạt tính hạn chế Các laccase trong nấm được quan tâm nhiều hơn do khả năng xúc tác của chúng Các chủng tổng hợp laccase trong tự nhiên thường có hoạt tính thấp và đòi hỏi các chất cảm ứng tạo enzyme với giá thành cao Trong thời gian gần đây việc sản xuất laccase tái tổ hợp

đã góp phần giảm đi tính phức tạp của quá trình lên men tổng hợp enzyme

Các hệ thống đã được sử dụng để biểu hiện laccase thành công cho đến nay bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm sợi Laccase biểu hiện trong vi khuẩn và nấm men thường không cho phép thu nhận được enzyme hoạt tính cao do yêu cầu glycosyl hóa cao của các nguồn gen nấm mốc Hệ thống biểu hiện laccase trong nấm sợi có ưu điểm là thực hiện quá trình glycosyl hóa tương tự như nấm mốc ở trạng thái tự nhiên, có khả năng tiết ra một lượng lớn protein tái tổ hợp có hoạt tính Hệ thống biểu hiện laccase ở nấm sợi thành công chủ

yếu trong các vật chủ như: Aspergillus oryzae, A niger, A sojae, Trichoderma reseei…

Tuy nhiên, cho tới nay, hoạt độ đạt được của các chủng tái tổ hợp vẫn còn ở mức hạn chế,

có rất ít các nghiên cứu về các kỹ thuật lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp từ nấm sợi được công bố Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên

cứu đề tài “Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp từ A niger

D15#26lcc1 và khảo sát khả năng ứng dụng”

* Mục tiêu nghiên cứu:

- Nghiên cứu kỹ thuật lên men laccase của Trametes versicolor 06 biểu hiện trong A

niger D15#26lcc1, nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp

- Xác định đặc tính laccase của T versicolor 06 biểu hiện trong A niger D15#26lcc1

2

* Nội dung nghiên cứu

- Tuyển chọn chủng nấm sinh tổng hợp laccase

- Sàng lọc các dòng A niger D15#26lcc1 tái tổ hợp sinh tổng hợp laccase

- Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp laccase trong A niger D15#26lcc1 1.8B

- Tinh chế và xác định đặc tính laccase tái tổ hợp

- Khảo sát khả năng ứng dụng của laccase tái tổ hợp

* Những đóng góp mới của luận án:

- Là công trình đầu tiên nghiên cứu kỹ thuật lên men thu nhận laccase tái tổ hợp của T

versicolor 06 biểu hiện trong A niger D15#26lcc11.8B bao gồm lên men gián đoạn, lên

men hai pha và lên men bán liên tục, hoạt độ laccase tích lũy đạt 8856 U/L trong lên men bán liên tục (fed-batch), tăng 1,5 lần so với lên men gián đoạn thông thường và tăng 6,05

lần so với chủng gốc T versicolor 06

- Laccase tái tổ hợp được khảo sát đặc tính, thử nghiệm sử dụng hỗ trợ quá trình tiền

xử lý lignocellulose và khử độc dịch thủy phân cho lên men ethanol, tăng khả năng loại bỏ phenol 57,17%, đạt hiệu suất lên men 72,76% Đóng góp này của luận án mở ra khả năng

sử dụng enzyme trong cocktail enzyme trong sản xuất bioethanol từ lignocellulose

3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Laccase (benzenediol : oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) thuộc nhóm các oxidase

có chứa nhiều ion đồng trong phân tử Các enzyme này có khả năng xúc tác sự oxy hóa của nhiều loại cơ chất khác nhau với chất nhận điện tử cuối cùng là oxy Laccase có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành các gốc quinin và sau đó oxy hóa chúng thành quinon Phản ứng oxy hóa gắn liền với sự khử phân tử oxy tạo thành nước [117] Bên cạnh đó laccase có khả năng xúc tác chuyển hóa các hợp chất không có bản chất phenol với sự tham gia của các chất chuyển điện tử trung gian

1.1 LACCASE

1.1.1 NGUỒN THU LACCASE

1.1.1.1 Laccase trong tự nhiên

Laccase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên trong các loại thực vật, nấm và vi khuẩn

Laccase từ thực vật được phát hiện lần đầu tiên ở Rhus vernicifera (ở cây sơn mài Nhật

Bản) vào năm 1883 [128] Sau đó, laccase được nghiên cứu ở rất nhiều các loại thực vật

khác như ở Ficus racemosa L (cây sung), Weeping willow (cây thùy dương), Nicotiana

tabacum (cây thuốc lá) và Prunus persica (cây đào) Laccase thực vật đóng vai trò trong sự

hình thành thân gỗ, có vai trò polyme hóa các monolignol hình thành các dimer và trimer

trong quá trình lignin hóa Laccase từ cây R vernicifera là một laccase thực vật đầu tiên

được nghiên cứu về đặc tính lý hoá và đặc tính quang phổ, đồng thời được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu cơ chế phản ứng chung của laccase [61] Mặc dù laccase được phát hiện đầu tiên ở thực vật, nhưng nhìn chung laccase có nguồn gốc thực vật ít được nghiên cứu vì phần lớn chúng là các enzyme có thế oxy hóa khử thấp Việc tách chiết và tinh chế laccase từ thực vật thường rất khó vì dịch chiết từ thực vật chứa một số lượng lớn enzyme oxy hóa khử với phổ cơ chất rộng Đây là lý do chính khiến cho các nghiên cứu về laccase từ thực vật bị hạn chế

Ngoài các nguồn laccase từ thực vật, sinh tổng hợp laccase trong vi khuẩn cũng được khảo sát trong các nghiên cứu gần đây Vi khuẩn đầu tiên được phát hiện có khả năng tổng

hợp laccase là Azospirillum lipoferum [49] Laccase từ vi khuẩn này có khả năng tham gia vào việc hình thành hợp chất melanin Các loài vi khuẩn Bacillus subtilis gần đây cũng

được phát hiện là nguồn sinh tổng hợp laccase Tuy nhiên, laccase trong vi khuẩn thường thu được hoạt tính rất thấp và khó có khả năng ứng dụng trong thực tiễn sản xuất

4

Laccase từ nấm đã được hai nhà khoa học là Bertrand và Laborde nghiên cứu từ năm

1896 [117] Laccase trong nấm là các enzyme ngoại bào có chứa nhiều nguyên tử đồng xúc tác các phản ứng oxy hoá, tham gia chủ yếu vào quá trình phân giải lignin Đây là đặc điểm

nổi bật của laccase trong nấm đảm thuộc họ Basidiomycetes Một số loại nấm đảm đã được

nghiên cứu kỹ về đặc tính cũng như khả năng sinh tổng hợp laccase trong tự nhiên như

Pleurotus ostreatus, Phlebia radiate, Coriolus (Trametes, Polyporus) versicolor Bên cạnh

đó, laccase cũng được thu nhận từ các nấm thuộc họ Ascomycetes, Deuteromycetes cũng

như trong nấm men [65]

Ngoài thực vật, nấm và vi khuẩn, hoạt tính của laccase cũng được tìm thấy trong lớp

biểu bì của một số loại côn trùng như Anopheles gambiae, Aedes aegypti, Tribolium

castanem, Manduca sexta, Nephotettix cincticeps [50] Tuy vậy, nguồn enzyme này không

được khai thác nhiều do đặc tính không nổi trội của chúng

Hiện nay trong các nguồn laccase trong tự nhiên thì laccase trong nấm được nghiên cứu kỹ về đặc tính xúc tác, cơ chất đặc hiệu, khả năng xúc tác cũng như sự đa dạng trong

nguồn gen Laccase từ T versicolor được biết đến với thế oxi hóa khử cao nhất (780 – 800mV), các gen mã hóa laccase từ T versicolor cũng đã được tách chiết và biểu hiện

trong nhiều hệ biểu hiện laccase tái tổ hợp, có thể ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp

1.1.1.2 Laccase tái tổ hợp

Do khả năng xúc tác oxy hóa được nhiều loại cơ chất mà điển hình là các hợp chất có chứa vòng phenol nên các laccase có rất nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học Tuy nhiên, như đã nói, laccase được tổng hợp từ các chủng tự nhiên thường với lượng rất ít và yêu cầu các chất cảm ứng với giá thành cao [71] Do vậy, rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu, phát triển và sử dụng các hệ thống khác nhau biểu hiện gen mã hóa laccase nhằm tạo ra một lượng enzyme đủ lớn với giá thành thấp đáp ứng nhu cầu ứng dụng của laccase trong các lĩnh vực công nghiệp khác nhau

Tùy vào hệ thống biểu hiện sử dụng, hoạt tính và các đặc tính của laccase tái tổ hợp không hoàn toàn giống với chủng gốc và không giống nhau ngay cả khi cùng nguồn gen Laccase có nguồn gốc từ nấm mốc và nấm, thường có tỉ lệ glycosyl hoá cao, thành phần carbohydrate của laccases có thể chiếm 10 đến 45% trọng lượng phân tử enzyme Do mức

độ glycosyl hóa trong các vật chủ không hoàn toàn giống nhau nên khả năng biểu hiện laccase đạt hiệu quả khác nhau, thông thường các nghiên cứu cho thấy việc biểu hiện đạt

5

hiệu quả thấp trong các thể chủ vi khuẩn hoặc nấm men do không có khả năng hoặc khả năng glycosyl hóa không phù hợp của chúng [16]

Để sản xuất các protein tái tổ hợp nói chung, các hệ thống biểu hiện dựa trên vật chủ

E coli được sử dụng phổ biến nhất do các ưu điểm có nhiều vector biểu hiện, dễ kiểm soát

sự biểu hiện gen, dễ nuôi cấy, và hiệu suất tổng hợp protein mục tiêu cao Tuy nhiên, đối với trường hợp các laccase từ nấm, đến nay việc biểu hiện các enzyme này trong tế bào

chủ E coli là không hiệu quả [71] Nguyên nhân chính có thể là do các hệ thống biểu hiện

ở E coli không cho phép thực hiện biến đổi hậu dịch mã glycosyl hóa, vốn cần thiết cho

hoạt động và độ bền của các laccase

Các hệ thống vật chủ đã được sử dụng để biểu hiện thành công laccase từ nấm cho đến

thời điểm này chủ yếu là nấm men: S cerevisiae, P pastoris, P methalonica, Yarrowia

lipolytica, K lactis và nấm mốc, điển hình như: A oryzae, A niger, A sojae, T reseei, Pycnoporus cinabarinus…[71]

Các hệ thống biểu hiện trong nấm men có ưu điểm là dễ thực hiện, với nhiều loại vector đã được thương mại hóa Ngoài các ưu điểm khác như khả năng thực hiện các biến đổi hậu dịch mã, khả năng nuôi cấy với mật độ cao, nấm men còn có ưu điểm là không có nhiều protein ngoại bào giúp cho việc tinh sạch các protein tái tổ hợp khi được tiết ra bên ngoài tế bào dễ dàng hơn Hai loài nấm men thường được lựa chọn để biểu hiện laccase tái

tổ hợp là S cerevisiae và P pastoris [46; 119] P pastoris đã được chứng minh là hệ thống biểu hiện laccase tái tổ hợp tốt hơn so với S cerevisiae với hiệu suất đạt từ 8 đến17 mg/l

[21] Hiệu suất sản sinh laccase thay đổi đáng kể phụ thuộc vào gen mã hóa laccase và vật

chủ được sử dụng để biểu hiện Các nghiên cứu cho thấy, lcc1 từ T versicolor được biểu hiện thành công trong P pastori đạt hiệu suất sinh tổng hợp laccase 2,8 U/L nhưng lại không biểu hiện được trong S cerevisiae [16; 24] Việc biểu hiện laccase trong nấm men

cho phép giải quyết các mục tiêu cụ thể Ví dụ, cồn nhiên liệu đã được sản xuất từ các

nguồn vật liệu thô bằng việc sử dụng S cerevisiae biểu hiện laccase có tính chống chịu các

chất độc được sinh ra trong tiền xử lý lignocellulose bằng kiềm [76] Tuy nhiên, một trong những vấn đề gặp phải khi sử dụng các vật chủ nấm men để sản xuất laccase tái tổ hợp là hiện tượng glycosyl quá mức (hyperglycosylation) Điều này làm giảm hoạt tính của chế phẩm laccase thu nhận được trong canh trường [101]

Để giải quyết những nhược điểm khi biểu hiện laccase từ nấm trong thể chủ nấm men, các hệ thống biểu hiện laccase dựa trên thể chủ nấm mốc có ưu điểm nổi bật do khả năng

6

thực hiện quá trình glycosyl hóa tương tự như trong nấm mốc ở trạng thái tự nhiên và có thể tiết ra một lượng lớn protein tái tổ hợp bên ngoài tế bào Hiệu suất sinh tổng hợp laccase thu nhận từ nấm sợi có thể cao hơn nhiều so với trong nấm men, có thể tới vài trăm

mg/l [16; 101] Theo Bohlin và cs, laccase tái tổ hợp từ T versicolor biểu hiện trong A

niger đạt hiệu suất sinh tổng hợp laccase 2700 U/L Trong các hệ thống nấm mốc, A niger

là vật chủ được sử dụng hiệu quả để biểu hiện các protein tái tổ hợp [43] Nghiên cứu của

Eric Record và cs [101] biểu hiện laccase lac1 từ P cinnabarinus trong A niger D15#26,

sử dụng plasmid pAN52-4 mã hóa enzyme glyceraldehytde-3-phosphate dehydrogenase, đoạn khởi động cho phép biểu hiện mạnh các protein tái tổ hợp đặc biệt trong môi trường

có glucose Hoạt tính laccase tăng 80 lần và đạt tối đa 7000 U/L Saloheimo và cs [105]

tổng hợp laccase tái tổ hợp từ Phlebia radiata biểu hiện trong T reesei chỉ thu được

20mgl-1 Lên men tổng hợp laccase tái tổ hợp từ Mt thermophil biểu hiện trong A oryzae

1.1.2 CẤU TRÚC CỦA LACCASE

Laccase được cấu tạo từ các glycoprotein, với phần cacbohydrat góp phần tạo nên mức

độ ổn định cao của enzyme [97] Trong nấm thường xảy ra quá trình glycosyl hóa với mức

độ dao động khác nhau, laccase từ Coriolopsis fulvocinnerea có mức độ glycosyl hóa lên đến 32% [110] và laccase từ Pleurotus pulmonarius có mức độ glycosyl hóa tới 45% [33]

Cấu trúc của laccase được đặc trưng bởi sự tham gia của ít nhất một ion Cu2+ dạng T1, một ion Cu2+

dạng T2 và hai ion Cu2+ dạng T3 Ba dạng này có thể được phân biệt nhờ sử dụng cộng hưởng thuận từ (EPR – electroparamagnenic resonance spectroscopy) [29] Dạng đồng T1, nguyên nhân tạo nên màu xanh da trời của protein, hấp phụ mạnh ánh sáng

có bước sóng 610 nm và là dạng được phát hiện bằng cộng hưởng từ Dạng đồng T2 không tạo màu trong phổ ánh sáng nhìn thấy nhưng thể hiện từ tính trong cộng hưởng từ Dạng đồng T3 gồm có một cặp ion Cu2+ có cấu trúc hai nhân và có khả năng hấp phụ yếu ở bước sóng 330 nm gần vùng tia tử ngoại nhưng không tạo nên tín hiệu khi phân tích bằng cộng hưởng từ [117] Ion đồng T1 thường được liên kết với hai gốc histidine và một gốc cysteine Ngoài ra, các ion này còn có khả năng liên kết với methionine ở vi khuẩn, leucine hoặc phenylalanine ở nấm sợi (Hình 1.1) Trên thực tế, mặc dù có sự tương đồng lớn về các thông số cộng hưởng từ nhưng thế oxi hoá khử của trung tâm Cu2+

T1 có những thay

7

đổi lớn giữa các cơ chất và enzyme có nguồn gốc khác nhau, quy định khả năng xúc tác phản ứng của chúng

Hình 1.1 Sự phân bố các ion Cu 2+ trong laccase từ B subtilis [36]

Các ion Cu2+ ở vị trí T2/T3 có thể kết hợp với 8 gốc histidines tạo nên một cấu trúc ổn định trong 4 khung His-X-His Hai nguyên tử T3 được liên kết với 6 gốc histidine trong khi đó nguyên tử T2 được liên kết với 2 gốc histidine còn lại Một phối tử hydroxyl nối cặp ion Cu2+ T3 với nhau Chính sự bắt cặp của 2 ion T3 này dẫn đến sự khử từ tính nên không tạo tín hiệu cộng hưởng từ

Tất cả các ion đồng đều đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác của laccase T1 có vai trò là nơi nhận điện tử đầu tiên từ cơ chất, sau đó điện tử này được vận chuyển qua bộ ba axit amin (His-Cys-His) đến vị trí T2/T3 Tại T2/T3, oxy nhận điện tử và bị khử thành H2O Thế oxi hóa khử của trung tâm T1 trong laccase từ các loại nấm là khác nhau Laccase

của Myceliophthora thermophila có thế oxi hóa khử khoảng 0,465 V Thế oxi hóa khử của laccase từ T versicolor cao nhất, đạt 0,780 V, làm cho chúng có khả năng phản ứng lớn nhất trong các loại laccase Thế oxi hóa khử của trung tâm T1 của T versicolor cũng được

Xu và cs [124] chứng minh là cao nhất đạt 0,5 – 0,8 V, do đó chúng có khả năng xúc tác

8

oxi hóa cơ chất và chuyển điện tử mạnh mẽ, có khả năng xúc tác phân hủy các hợp chất không có bản chất phenol

Hình 1.2 Cơ chế xúc tác của laccase [96]

Laccase từ nấm thường có nhiều isozym, số lượng các isozym khác nhau giữa các loài Các isozym laccase có thể khác nhau rõ rệt về pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, độ bền pH, độ bền nhiệt, và ái lực với cơ chất [7; 54] Ngoài ra, các isozym có thể khác nhau về tính chất vật lý

Các isozym khác nhau ở trình tự amino acid và hoạt tính với các cơ chất chuẩn của

laccase Palmieri và cs [96] cho thấy trong nấm P ostreatus có hai isozym (POXA1 và POXA2) có trọng lượng phân tử là 61 và 67 kDa, pI tương ứng là 6,7 và 4 Trong T

versicolor có hai isozym (laccase 1 và laccase 2) có trọng lượng phân tử 64 và 67kDa, pI

tương ứng 3,1 và 3,3 [24] Laccase từ P ostreatus V-184 có bốn isozym khác nhau (LCC1,

LCC2, LCC3 và LCC4), tất cả các isozym này đều đã được tinh chế và xác định đặc tính với cơ chất ABTS và guaicol, trong đó LCC1 và LCC2 có khối lượng phân tử 60 và 65 kDa, đều có giá trị pI tương ứng là 3, LCC3 và LCC4 khối lượng phân tử ước tính khoảng

80 và 82 kDa với giá trị pI tương ứng là 4,7 và 4,5 [84] Laccase của R solani và Fusarium

proliferatum có bốn isozym với các điểm đẳng điện khác nhau [73], T villosa có năm loại

isozym, các isozym này chỉ khác nhau về thành phần carbohydrate [125]

9

1.1.3 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA LACCASE

1.1.3.1 Xúc tác chuyển hóa các hợp chất phenol

Laccase xúc tác oxy hóa cơ chất điển hình là p-dihydroxy phenol hoặc là hợp chất phenol khác đồng thời khử oxy thành nước Laccase xúc tác phổ cơ chất rất rộng bao gồm các diphenol, các polyphenol hoặc các hợp chất có bản chất tương tự phenol như các diamine, amin thơm, hợp chất mạch vòng thơm dễ oxi hóa khác và các benzenethiol [123] Một số loại cơ chất phenol thông dụng cho laccase bao gồm 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde azine (syringaldazine, SYR), 1-naphtol, p-cresol (1-hydroxy-4-methylbenzene), 2,6-dimethoxyphenol (DMP) và 2-methoxyphenol (guaiacol, GUA) hoặc hợp chất được sản sinh khi tham gia phân huỷ hợp chất lignin Thurston [117] đã chứng minh rằng hydroquinone và catechol là những cơ chất chính của laccase, guaicol và DMP

thường phản ứng tốt hơn, P-phenylene diamine là cơ chất được sử dụng rộng rãi còn

syringaldazine là cơ chất đặc hiệu của laccase Vì vậy, laccase có khả năng xúc tác oxi hóa các monophenol, các diamine và một loạt các hợp chất mạch vòng phenol

Hình 1.3 Cơ chế xúc tác phân hủy các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase [6]

Khi bị oxy hoá bởi laccase, cơ chất bị mất một điện tử và hình thành một gốc tự do Sau đó gốc không bền này có thể tiếp tục bị oxi hóa bởi laccase (biến đổi phenol thành quinine) hoặc tiếp tục tham gia phản ứng không được xúc tác bởi enzyme như hydrat hóa, phản ứng oxi hóa khử hoặc phản ứng trùng hợp [117] Quá trình oxy hóa lignin bởi laccase được mô tả như trong Hình 1.3, theo đó, các tiểu phần phenol trong cấu trúc phân tử lignin

10

bị oxy hóa bởi laccase và tạo ra các gốc tự do phenoxy Các gốc oxy hóa này có thể tiếp tục bị cắt khỏi mạch, được cacbonyl hóa hoặc polyme hóa [117]

Laccase từ Cerrena unicolor và T versicolor oxy hoá các hợp chất meta-phenol ở mức

độ khác nhau Trong khi laccase từ C unicolor oxi hoá mạnh các hợp chất para-phenol [42] thì laccase từ T versicolor có khả năng oxi hoá các hợp chất ortho-phenol [62] Các

nghiên cứu so sánh về tính chất laccase của nấm cho thấy tất cả các laccase đều có khả năng oxy hoá axit methoxyphenolic nhưng ở các mức độ khác nhau Hai hợp chất có nguồn gốc từ các hydroquinone là 2-methoxy-1,4-benzohydroquinone và 2,6-dimethoxy-1,4-benzohydroquinone cũng đã được chứng minh là bị oxy hoá bởi laccase từ nấm

Pleurotus eryngii [51]

1.1.3.2 Xúc tác chuyển hóa các hợp chất khác

Laccase cũng có thể oxy hóa các hợp chất không có bản chất phenol (non-phenolic) khi có mặt chất chuyển điện tử trung gian (mediator) thích hợp (Hình 1.4A) Cơ chế xúc tác của hệ thống laccase - mediator bắt đầu bằng việc laccase oxy hóa chất trung gian chuyển chất trung gian về dạng oxy hóa; sau đó các hợp chất trung gian đã được oxy hóa tiếp tục thực hiện phản ứng oxy hóa khử với cơ chất tạo sản phẩm (Hình 1.4B) Hiện nay,

có hơn 200 chất chuyển điện tử trung gian đã được tìm thấy trong đó ABTS, HBT hydroxybenzotriazole), guaiacol, syringaldazine là các chất chuyển điện tử trung gian được

(1-sử dụng rộng rãi nhất Các chất chuyển điện tử trung gian lý tưởng phải là một cơ chất tốt của laccase, cấu trúc dạng oxi hóa và dạng khử của chúng phải ổn định nhưng không ức chế hoạt tính enzyme Các chất chuyển điện tử trung gian phải có thế oxi hóa khử cao và

có thể thực hiện các phản ứng xúc tác phức tạp mà không bị giảm hoạt tính hóa học Theo nghiên cứu của Sa´nchez và cs cho thấy syringaldazine và ABTS có thế oxi hóa khử cao nhất tương ứng khoảng từ 800 – 873mV [104] Laccase thường hoạt động phối hợp với các enzyme khác, làm tăng hiệu quả của quá trình phân giải Các nghiên cứu vẫn đang được tiếp tục tiến hành để làm sáng tỏ vai trò của laccase trong quá trình phân giải này, đặc biệt

là trong quá trình phân giải lignin Bên cạnh đó, vai trò khử độc của dịch thủy phân cho mục tiêu lên men ethanol của laccase cũng được khẳng định Laccase có khả năng loại bỏ các hợp chất phenol trong dịch thủy phân cao nhất trong số các enzyme thử nghiệm, chỉ sau nhựa trao đổi ion [25]

11

Hình 1.4 Cơ chế xúc tác phân hủy các tiểu phần không có bản chất phenol bởi laccase [5; 10]

A Cơ chế xúc tác oxi hóa của laccase với chất chuyển điện tử trung gian (mediator), B Oxy hóa tiểu đơn vị không có bản chất phenol của lignin với sự tham gia của chất chuyển điện tử trung gian

1.1.4 ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE

1.1.4.1 Khối lƣợng phân tử

Laccase có khối lƣợng phân tử dao động trong khoảng 60 – 80 kDa, tuy vậy nhiều

laccase có khối lƣợng phân tử lớn nhƣ laccase từ các loại nấm Ascomycetes nhƣ M

indicum và Podospora anserina có khối lƣợng phân tử 100 kDa, laccase từ A nidulans có

khối lƣợng phân tử 110 kDa (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Khối lượng phân tử và số lượng izozyme laccase trong tự nhiên

phân tử (kDa)

Tài liệu tham khảo

12

Bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, Bourbonnais và cs đã xác định được laccase từ

T versicolor có hai isozym là laccase 1 và laccase 2 có kích thước khác nhau tương ứng là

64 và 67 kDa [20] Khả năng xúc tác oxi hóa của lcc2 thấp hơn so với lcc1 khoảng 73% – 97% đối với cùng một cơ chất Lcc1 tham gia vào cắt liên kết Cα - Cβ trong quá trình phân hủy các hợp chất không có bản chất phenol, tham gia mạnh vào quá trình phân hủy các hợp

chất lignin hơn so với lcc2, do đó lcc1 của T versicolor được các nhà nghiên cứu lựa chọn

làm nguồn gen chủ yếu trong biểu hiện sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp cho các ứng dụng trong công nghiệp [20]

1.1.4.2 Tính đặc hiệu cơ chất

Laccase có tính đặc hiệu thấp, có khả năng xúc tác các hợp chất gốc phenol và các hợp chất không có bản chất phenol khi có mặt của các mediator Các nghiên cứu cho thấy laccase từ các loại nấm khác nhau thì có khả năng xúc tác oxy hóa các cơ chất ở các vị trí

ortho-, meta- hoặc para – phenol khác nhau Laccase từ Leptoporus litschaueri, Polyporus

brumalis và T versicolor được chứng minh rằng là có khả năng xúc tác các hợp chất

phenol ở vị trí ortho- khi có sự tham gia của các cơ chất guaiacol, o-phenylenediamine, caffeic axit, catechol, dihydroxyphenylalanine, protocatechuic, axit gallic và pyrogallol Thông thường, quá trình oxy hóa các cơ chất ở vị trí ortho xảy ra mạnh hơn so với ở vị trí para như p-phenylenediamine, p-cresol, hydroquinone Quá trình oxy hóa vị trí meta như với cơ chất m-phenylenediamine, orcinol, resorcinol và phloroglucinol được xem là chậm nhất [14] Quá trình oxy hóa các hợp chất không có bản chất phenol phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất Trong số các cơ chất không có bản chất phenol thì ABTS được cho là cơ chất phù hợp và phổ biến nhất trong các nghiên cứu về laccase [115]

1.1.4.3 Các hằng số động học của phản ứng của laccase

Hằng số Michealis (Km), tốc độ phản ứng tối đa (Vmax) và thông số biểu thị khả năng xúc tác của một phân tử enzyme (Kcat) được sử dụng để mô tả động học của một phản ứng enzyme Những hằng số này thay đổi nhiều phụ thuộc vào từng loại laccase và các loại cơ chất khác nhau Giá trị Km của các laccase của T versicolor, Trametes sp, Ceriporiopsis

subvermispora, Trichophytonrubrum, Chamaecytisus hirsutus [53] dao động trong khoảng

là 10μM với cơ chất syringaldazine và ABTS cho đến 100 μM với cơ chất DMP và guaiacol Giá trị Km của laccase thấp nhất với cơ chất syringaldazine (một dạng trùng ngưng của 2 phân tử 2,6-dimethoxyphenol được liên kết với nhau bằng một cầu azide) và ABTS, enzyme có ái lực lớn nhất với các cơ chất này Trong khi đó, laccase có ái lực thấp với cơ chất DMP và guaiacol

Km phụ thuộc vào điều kiện, nồng độ ion và các điều kiện nhiệt độ cũng như nồng độ enzyme, cơ chất trong các chủng tự nhiên và ngay cả laccase biểu hiện trong các vật chủ khác nhau Colao và cs [30] đã chứng minh sự khác nhau của các thông số động học phản ứng enzyme của laccase từ nấm biểu hiện trong các hệ biểu hiện khác nhau ngay cả đối với cùng một cơ chất Bảng 1.2 chỉ rõ sự khác biệt của các hằng số động học của laccase trong

tự nhiên và laccase tái tổ hợp với các cơ chất khác nhau

Chủng nấm

tự nhiên

Các chủng biểu hiện

Tài liệu tham khảo

14

1.1.4.4 pH tối ưu và độ bền pH

Giá trị pH tối ưu của laccase tự nhiên nằm trong vùng axit và phụ thuộc rất nhiều vào

cơ chất Khi sử dụng ABTS là cơ chất thì pH tối ưu cho các laccase thường là 3 Tuy nhiên, đối với quá trình oxi hóa các hợp chất phenol như DMP, guaiacol và syringaldazine, giá trị pH tối ưu cho hoạt động của enzyme cao hơn, thường dao động trong khoảng từ 4.0 – 7.0 pH tối ưu cho hoạt động của laccase từ nấm khi sử dụng cơ chất là hydroquinone hay catechol lần lượt dao động trong khoảng 3,6 - 4,0 và 3,5 - 6,2 [110] Quá trình oxi hoá các hợp chất phenol phụ thuộc vào thế năng oxi hoá khử khác nhau giữa các hợp chất phenol và ion đồng T1 [123] Các giá trị Eo của phản ứng laccase-cơ chất phenol giảm khi tăng pH do quá trình oxi hoá proton Vai trò của ion Cu2+

T1 với pH tối ưu của laccase đã được Palmieri và cs [96] chứng minh rằng khi không có sự tham gia của T1 trong trung tâm hoạt động của laccase sẽ đẩy pH tối ưu về vùng trung tính và làm giảm vận tốc phản

ứng Laccase từ T versicolor có pH tối ưu là 3 đối với cơ chất ABTS Laccase từ một số chủng nấm khác như C subvermispora, Trichophyton rubrum cũng có pH tối ưu là 3

Giá trị pH tối ưu của laccase tái tổ hợp biểu hiện trong các vật chủ khác nhau có thể tương tự hoặc thay đổi so với pH của chủng gốc Một nghiên cứu khác của Record và cs

cho thấy laccase của P cinnabarinus biểu hiện trong A niger D15#26, tối ưu ở pH 4,

enzyme này có độ bền pH tương tự với laccase trong chủng gốc [101] Madzak và cs [82]

chứng minh laccase tái tổ hợp từ T versicolor biểu hiện trong Y lipolytica có pH tối ưu với cơ chất ABTS là 3 nhưng với cơ chất 2,6-DMP là 3,5 Laccase từ T versicolor biểu hiện trong P pastoris pH tối ưu là 5 trong khi pH tối ưu của laccase của chủng gốc là 3

[16] Như vậy, các hệ biểu hiện khác nhau đối với cùng một nguồn enzyme cũng làm thay đổi pH tối ưu và độ bền pH của enzyme tái tổ hợp so với enzyme gốc

Độ bền pH của các laccase khác nhau khá nhiều, đa phần các laccase bền ở pH 6 Độ

bền pH của laccase từ T versicolor nằm trong dải pH từ 2,5 - 7 sau một giờ ủ còn trên 50% [53] Theo nghiên cứu của Calao và cs, laccase từ T trogii biểu hiện trong P pastoris bền

ở pH 6; sau 5 giờ ủ ở pH 6, hoạt tính laccase vẫn còn trên 80% đối với cơ chất ABTS, nhưng không bền ở pH thấp, enzyme chỉ còn 25% hoạt tính ở pH 2,5 sau 5 giờ ủ và dưới

50% khi ủ ở pH 3,5 Đối với cơ chất DMP, laccase1 từ T trogii biểu hiện trong P

pastoris, hoạt tính laccase còn 98% sau 5 giờ ủ ở pH 6 còn 22% khi ủ ở pH 2,5 trong 5 giờ

ủ Đối với laccase từ chủng gốc T versicolor, enzyme bền ở pH từ 3 – 7 sau 1 giờ ủ hoạt

tính enzyme vẫn giữ được trên 50%

15

1.1.4.5 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt

Khoảng nhiệt độ hoạt động của các laccase thường trong khoảng 25 – 300

C tùy vào từng loại cơ chất xúc tác và các loại laccase khác nhau Với cơ chất là DMP laccase hoạt động ở 250

C – 300C [96], với cơ chất là ABTS laccase thường hoạt động trong khoảng

270C– 300C [18], với syringaldazine thì laccase hoạt động ở 270C - 300C [40]

Nhiệt độ tối ưu của các laccase thay đổi trong khoảng 25-80°C, một vài loại enzyme có nhiệt độ tối ưu dưới 350

C Nhiệt độ tối ưu của laccase từ P ostreatus nằm trong khoảng 25

– 350

C [96] Riêng laccase từ G lucidum tối ưu trong khoảng nhiệt độ thấp hơn, ở 250C [70] Tính bền nhiệt của laccase có ý nghĩa rất quan trọng trong các ứng dụng của enzyme

[69] Laccase từ vi khuẩn S lavendulae bền ở 70°C trong 100 phút, từ B subtilis bền ở

80°C trong 112 phút Laccase từ nấm mốc kém bền hơn, chỉ bền ở 70°C trong 1 giờ và

80°C trong 10 phút Laccase từ G lucidum bất hoạt ngay lập tức ở 600C, trong khi đó

laccase từ M albomyces có khả năng chịu được nhiệt độ 600

C trong 5 giờ Theo nghiên

cứu của Han và cs, T versicolor bền ở 500C sau 4 giờ ủ [26; 45]

Cũng như pH, ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền của laccase tái tổ hợp khác nhau khi được biểu hiện trong các hệ thống và khác nhau đối với các cơ chất khác

nhau Lac 4 từ P sajor-caju biểu biện trong P pastoris có nhiệt độ tối ưu là 350C với cơ chất là ABTS, bền nhiệt độ trong khoảng 350C đến 650C, laccase bền và ổn định sau một giờ ủ ở 350C; khi nhiệt độ tăng lên 450C hoạt độ laccase còn lại 25% và ở 600

C thì không

còn hoạt tính [112] Trong nghiên cứu của Madzak và cs laccase tái tổ hợp từ chủng gốc T

versicolor biểu hiện trong các hệ biểu hiện Y lipolytica, P methanolica và P pastoris đều

có nhiệt độ tối ưu 300

C [54; 82] Laccase từ P cinnabarinus biểu hiện trong A niger có nhiệt

sẽ kìm hãm sự tiếp xúc của laccase với cơ chất, đồng thời ngăn ngừa sự tự oxy hóa của cơ chất nên hoạt tính laccase sẽ bị giảm Mức độ kìm hãm của halogen đối với laccase thay đổi tuỳ loại laccase bởi có thể do liên quan đến cấu trúc của chúng Các chất ức chế khác có thể là các ion kim loại nặng như Hg2+hay axit béo, sulfhydryl, hydroxyglycine và các cation ammonium Những hợp chất này có thể ảnh

16

hưởng đến laccase qua các ion đồng T2 hoặc làm thay đổi cấu trúc không gian của laccase

[123] Một số nghiên cứu cho thấy các chất ức chế hoạt động của enzyme laccase trong T

versicolor chủ yếu là azide, thioglycolic và các axit diethyldithiocarbamic, trong đó EDTA

ảnh hưởng ít đến hoạt độ laccase [11]

1.2 ỨNG DỤNG CỦA LACCASE

Laccase là enzyme được ứng dụng rất rộng rãi trong các phản ứng oxy hoá công nghiệp vì chúng có thể oxy hoá nhiều cơ chất khác nhau, đặc biệt trong phân hủy các hợp chất mạch vòng Một trong các ưu thế của laccase là sử dụng oxy phân tử sẵn có để làm chất nhận điện tử, thay vì dùng các cofactor đắt tiền như NADP+ hay phức tạp cho sử dụng như H2O2 (trường hợp mangan peroxydase, lignin peroxydase), góp phần giảm chi phí hoặc đơn giản hóa các quá trình xúc tác Các ứng dụng của laccase trong các ngành công nghiệp nhằm mục đích tiết kiệm năng lượng, tăng cường khả năng phân hủy sinh học, nâng cao hiệu quả, bền vững và tạo ra các sản phẩm thân thiện với môi trường

1.2.1 Laccase trong phân hủy các hợp chất mạch vòng

Các hydrocacbon mạch vòng dạng PAH có độc tính rất cao, gây ô nhiễm môi trường

và được phân bố rộng rãi trong tự nhiên (môi trường đất và nước) Thành phần của chúng bao gồm hai hoặc nhiều vòng thơm kết hợp với nhau, chúng được hình thành trong quá trình đốt cháy nhiên liệu không hoàn toàn [48] Một số hợp chất PAHs như benzo pyrene [a] được biết đến là chất gây đột biến gen và gây ung thư Một số PAHs trọng lượng phân

tử thấp như anthracene không gây ung thư, cơ chế của quá trình oxi hóa anthracene tương

tự như benzo [a] pyrene và benz [a] anthracene Trong tự nhiên các hợp chất hữu cơ mạch vòng phức tạp thường khó bị phân hủy trong điều kiện tự nhiên Laccase đã được chứng minh có nhiều ứng dụng trong xử lý sinh học đất bị ô nhiễm các hợp chất khó phân hủy đó Laccase cùng với chất chuyển điện tử có thể oxi hóa các chất ô nhiễm hữu cơ độc hại như xenobiotic, PAH, chlorophenols, nonylphenols và các chất ô nhiễm khác

Nghiên cứu của Patrick và cs (1996) đã chứng minh laccase từ T versicolor có thể xúc

tác quá trình oxy hóa các hợp chất mạch vòng không có bản chất phenol như anthracene và benzo [a] pyrene khi có mặt của ABTS là chất chuyển điện tử trung gian Theo nghiên cứu

này thì cả laccase 1 và laccase 2 từ T versicolor đều tham gia xúc tác oxy hóa anthracene

chuyển hóa thành anthraquinone, cơ chế xúc tác của laccase tới PAHs tương tự như các hợp chất hydrocacbon mạch vòng khác [32]

17

1.2.2 Ứng dụng trong công nghiệp giấy

Laccase được ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy và được kết hợp cùng với các chất chuyển điện tử trung gian Các chất này chủ yếu là các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử nhỏ nhưng có thế oxi hóa khử cao (>900mV) được sử dụng để oxi hóa các hợp chất không có bản chất phenol Bourbonnais và cs [19] đã nghiên cứu quá trình tẩy trắng

bột giấy bằng laccase của T versicolor có sự tham gia của ABTS, HBT là chất chuyển điện

tử trung gian Kết quả cho thấy cơ chế của quá trình oxy hóa khi có mặt ABTS và HBT là

khác nhau: Khả năng hấp thụ oxy của HBT chậm hơn nhiều so với ABTS Ngoài ABTS và HBT, người ta cũng sử dụng một số chất chuyển điện tử trung gian khác trong tẩy trắng giấy như 1-nitroso-2-naphthol-3,6-disulfonic acid, 4-hydroxy-3-nitroso-1-naph-thalenesulfonic acid, promazine, chlorpromazine, và Remazol brilliant blue

Nghiên cứu của Camarero và cs [22] cho thấy quá trình tẩy trắng bột giấy bằng cách sử

dụng laccase từ P cinnabarinus, T versicolor, P eryngii kết hợp cùng các chất chuyển

điện tử trung gian ABTS và HBT đã đạt được độ sáng 82% so với 60% khi xử lý bằng peroxydase

Arias và cs [6] đã chứng minh rằng laccase từ S cyaneus CECT 3335 có thể phân hủy

lignin trong bột giấy kraft của gỗ bạch đàn cùng với sự tham gia của ABTS là chất chuyển điện tử trung gian [121] Sử dụng laccase trong tẩy trắng bột giấy với sự tham gia của chất chuyển điện tử trung gian làm giảm lượng clo sử dụng, giúp làm giảm ô nhiễm môi trường trong quá trình sản xuất giấy

1.2.3 Ứng dụng laccase công nghiệp dệt nhuộm

Campos và cs [23] đã nghiên cứu quá trình oxy hóa indigo sử dụng laccase từ T

hirsuta (THL1, THL2) và Sclerotium rolfsii (SRL1) được biết đến là tham gia vào quá

trình oxy hóa thuốc nhuộm indigo trong xử lý vải denim Kết quả thu được cho thấy laccase từ hai loài này đều có khả năng oxy hóa indigo tạo thành sản phẩm ít độc hơn là isatin (indole-2,3-dione) và hợp chất này có thể bị thủy phân thành axit anthranilic (2-aminobenzoic) (vitamin L1) Kết quả nghiên cứu so sánh khả năng xúc tác của laccase xúc tác phân hủy indigo khi có mặt các chất chuyển điện tử trung gian gồm acetosyringone, 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) và 4-hydroxybenzenesulfonic acid (PHBS) cho thấy 30%

indigo bị chuyển hóa bởi laccase của S rolfsii (SRL1) và Acetosyringone

Nước thải dệt nhuộm là sự tổng hợp các nguồn thải phát sinh từ các công đoạn hồ sợi, nấu, tẩy trắng, làm bóng sợi, nhuộm in và hoàn tất sản phẩm Các chất ô nhiễm chủ yếu có

18

trong nước thải dệt nhuộm là các hợp chất hữu cơ khó phân hủy bao gồm: Thuốc nhuộm, các chất hoạt động bề mặt, các hợp chất hữu cơ Trong số các chất ô nhiễm có trong nước thải dệt nhuộm, thuốc nhuộm là thành phần khó xử lý nhất, đặc biệt là thuốc nhuộm azo không tan Thông thường các chất màu có trong thuốc nhuộm không bám dính hết vào sợi vải trong quá trình nhuộm mà bao giờ cũng tồn dư một lượng nhất định trong nước thải Lượng thuốc nhuộm tồn dư trong nước thải chiếm 50% tổng lượng thuốc nhuộm được sử dụng trong công đoạn nhuộm [107] Đây chính là nguyên nhân làm cho nước thải dệt nhuộm có độ màu cao và nồng độ chất ô nhiễm lớn Theo nghiên cứu của Abadulla và cs

[77] sử dụng laccase từ T hirsuta phân hủy các hợp chất màu indigo, azo và thuốc nhuộm

anthraquinonic trong nước thải dệt nhuộm, các chất màu được xử lý với laccase giá trị thu

được đạt hiệu suất 80% Laccase từ P ostreatus, Schizophyllum commune, N crassa,

Polyporus sp, Sclerotium rolfsii, T villosa và Mycelioph tora thermophila cũng được sử

dụng trong xử lý các chất màu trong nước thải dệt nhuộm Hiệu suất xử lý phụ thuộc vào

từng loại laccase từ các chủng nấm khác nhau, laccase từ Polyporus sp và T villosa đạt hiệu suất xử lý 20%, từ Schizophyllum commune hiệu suất xử lý tăng trên 25% [77] Hiện

nay sử dụng enzyme laccase trong xử lý nước thải dệt nhuộm được đánh giá tăng hiệu quả

xử lý, hiệu quả kinh tế, giảm nồng độ và thành phần các chất ô nhiễm trong nước thải

1.2.4 Laccase trong công nghiệp thực phẩm

Ổn định rượu vang là ứng dụng chính của laccase trong công nghiệp thực phẩm Nước nho ép trong sản xuất rượu vang là một hỗn hợp phức tạp với các thành phần khác nhau như đường, các axit hữu cơ và các hợp chất phenol (tạo nên màu sắc, hương và vị của rượu vang) Do đó, việc loại bỏ một phần các polyphenol trong nước nho ép và rượu vang để ổn định rượu cần phải được tiến hành có chọn lọc để tránh gây ra những thay đổi không mong muốn về đặc tính cảm quan đặc trưng của sản phẩm

Ngoài các ứng dụng trong công nghệ sản xuất đồ uống thì laccase cũng được ứng dụng

để đánh giá cảm quan và chất lượng của thực phẩm trong sản xuất và bảo quản Trong thực phẩm laccase đã được sử dụng để kiểm soát hương thơm, tăng vị giác hoặc giảm những sản phẩm không mong muốn trong nhiều loại sản phẩm thực phẩm Takemori và cs đã sử

dụng laccase từ C versicolor để cải thiện hương vị của hạt cacao và các sản phẩm từ hạt

cacao Vị đắng và các vị khó chịu khác của sản phẩm từ cacao đã được loại bỏ khi được xử

lý bằng laccase [114]

19

1.2.5 Laccase trong sản xuất bioethanol

Lignocellulose là nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất cồn sinh học do hàm lượng cacbonhydrat cao, trữ lượng lớn

thạch đang cạn kiệt và quan trọng là không sử dụng nguyên liệu lương thực Từ 1kg cellulose có thể thu được xấp xỉ 0,56 kg ethanol Tuy nhiên, công nghệ sản xuất bioethanol

từ lignocellulose nói chung chưa được thương mại hóa, nguyên nhân do giá thành enzyme thủy phân cao và công nghệ sản xuất đặc biệt là tiền xử lí còn chưa tối ưu

Quá trình tiền xử lí nguyên liệu lignocellulose có thể được tiến hành bằng rất nhiều các phương pháp khác nhau như: Phương pháp cơ học, phương pháp hóa học và phương pháp sinh học Loại bỏ lignin là mục tiêu cơ bản cho công đoạn tiền xử lý nhằm làm cellulase dễ tiếp cận với cellulose, thủy phân chúng thành đường cho lên men Các enzyme ngoại bào của các nấm mốc có khả năng oxy hóa mạnh mạng lưới lignin do sản sinh hệ enzyme phân hủy lignin Lignocellulose có khả năng bị phân hủy chậm bởi các vi sinh vật trong tự nhiên

đặc biệt là P chryzosporium, T versicolor, P ostreatus, P sordida, T hirsutus và F

culmorum do có phổ các enzyme phân hủy lignin khá phong phú, trong đó bao gồm

laccase [56] Ngoài ứng dụng trong tiền xử lý nguyên liệu lignocelluloses, laccase được ứng dụng trong

là polyme hóa và cũng có thể là cả hai quá trình này [45]

Anui Kumar Chandel và cs [25] đã nghiên cứu quá trình khử độc dịch thủy phân bã mía có chứa các chất ức chế cho lên men như furans, các hợp chất phenol và axit axetic cho thấy khử độc dịch thủy phân với nhựa trao đổi anion làm giảm 63,4% furans và 75,8% hàm lượng các hợp chất phenol Khi xử lý bằng than hoạt tính, hàm lượng furans và phenol tổng số giảm tương ứng là 38,7% và 57,5% Với quá trình xử lý bằng laccase hàm lượng phenol tổng số giảm đến 77,5% nhưng không ảnh hưởng đến furans và axit axetic Tiến hành

lên men dịch thủy phân nhờ nấm men Candida shehatae NCIM 350 cho thấy hàm lượng

ethanol đạt cao nhất (0,48g/g) khi tiến hành khử độc bằng trao đổi ion, tiếp đó là đến than hoạt tính đạt (0,42 g/g), laccase (0,37 g/g) và bằng phương pháp trung hòa axit đạt (0,22g/g)

1.3.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường

Theo Galhaup và cs [45], hạn chế lớn nhất trong việc ứng dụng laccase trên quy mô sản xuất lớn là khả năng sinh tổng hợp enzyme thấp của vi sinh vật Cho tới nay, khả năng tổng hợp laccase đã được cải thiện khá nhiều nhờ tạo ra các chủng tái tổ hợp sinh tổng hợp laccase Các yếu tố môi trường như nguồn cacbon, nguồn nitơ, các chất cảm ứng, pH và nhiệt độ môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh tổng hợp laccase nhờ các chủng tự nhiên cũng như các chủng tái tổ hợp

1.3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon

Nguồn cacbon cũng như nồng độ cacbon trong môi trường đóng một vai trò quan trọng trong sản xuất enzyme laccase trong các chủng tự nhiên Mansur và cs chứng minh được rằng khi bổ sung fructose vào trong môi trường sinh tổng hợp laccase nhờ nấm đảm

Basidiomycetes sp I-62 (CECT 20197), hoạt tính laccase tăng gấp 100 lần [85] Glucose và

cellobiose cũng được chứng minh là giúp cải thiện sự sinh tổng hợp laccase trong nấm T

pubescens [45] Trong quá trình phân hủy nguyên liệu lignocellulose trong môi trường cám

gạo, khả năng tổng hợp của laccase trong nấm T versicolor tăng gấp 50 lần so với lên men

trong môi trường có bổ sung glucose Tuy nhiên điều này lại không áp dụng được đối với các laccase tái tổ hợp

Quá trình sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp trong các vật chủ biểu hiện phụ thuộc vào bản chất các vectơ sử dụng cho biểu hiện laccase Record và cs [101] biểu hiện gen

21

laccase1 từ P cinnabarinus vào vật chủ A niger D15#26 sử dụng vectơ biểu hiện là

pAN52-4 Vectơ biểu hiện này chứa đoạn khởi động mã hóa enzyme glyceraldehytde-3- phosphate dehydrogenase cho phép biểu hiện các protein tái tổ hợp với chất cảm ứng là

glucose Bohlin và cs cũng sử dụng vectơ pGAPZ biểu hiện laccase từ T versicolor trong

A niger D15 cho phép sinh tổng hợp laccase trong môi trường có chất cảm ứng là glucose,

tích lũy 2700U/L [16] Laccase từ S coelicolorđược biểu hiện trong S lividans IAF10-164

nhờ vectơ biểu hiện pIAFD95A trong môi trường có D-xylose là nguồn cacbon chính, đạt hiệu suất 350 mg/L [35]

Sử dụng nồng độ cac bon cao trong môi trường lên men sinh tổng hợp laccase từ nấm mốc có thể giúp cho sinh trưởng của nấm mốc nhưng có thể hạn chế sự tổng hợp laccase trong canh trường do nồng độ cơ chất cao làm tăng độ nhớt dịch lên men, giảm hàm lượng oxi hòa tan trong môi trường Để khắc phục hiện tượng này, trong môi trường lên men có thể bổ sung nguồn glucose ở nồng độ thấp hoặc bổ sung dần trong quá trình lên men đảm bảo đồng thời hai quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp laccase

1.3.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Việc sản sinh laccase không chỉ phụ thuộc vào nguồn nitơ mà còn phụ thuộc vào hàm lượng nitơ được sử dụng Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau như: Ammonium

tartrate, nitrat natri, asparagin và cao nấm men đến sinh tổng hợp laccase trong P

sanguineus được khảo sát Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả tổng hợp laccase giảm dần

theo thứ tự của các nguồn nitơ như sau: Asparagine > ammonium tartrate > yeast extract > sodium nitrate [38] Các nghiên cứu cũng công bố vai trò của asparagin trong tổng hợp

laccase nhờ T vesicolor [65]

Nguồn nitơ vô cơ như NaNO3 được sử dụng phổ biến cho biểu hiện laccase từ T

versicolor trong các vật chủ A niger, P pastoris [16] (NH4)2SO4 được sử dụng trong biểu

hiện laccase trong T reesei [67] Laccase từ P cinnabarinus biểu hiện trong A niger [101]

sử dụng duy nhất nguồn NaNO3 trong môi trường lên men, đạt hiệu suất 70 mg/l

Một số các nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa các nguồn nitơ khác nhau trong sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp Ngoài các nguồn nitơ vô cơ, pepton và cao nấm men cũng được sử dụng là nguồn nitơ hữu cơ kết hợp cho sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp Nuôi cấy

lắc trong bình tam giác, laccase từ M thermophila biểu hiện trong A oryzae được tổng hợp

19 mg/l [12] khi sử dụng nguồn nitơ kết hợp (NH4)2SO4 và cao nấm men Laccase từ C

cinereus biểu hiện trong A oryzae đạt được 135 mg/l sử dụng kết hợp (NH4)2SO4, cao nấm

22

men và urea [126] Tuy nhiên, đa phần laccase biểu hiện trong nấm men như S cerevisiae

và P pastoris đều cho hoạt tính thấp hơn, đạt khoảng 5-8 mg/l khi sử dụng kết hợp nguồn

nitơ giữa trypton và cao nấm men [112]

1.3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng

Các nguyên tố đa lượng cho sinh tổng hợp laccase trong nấm sợi thường sử dụng là: S,

P, K, Ca, Mg, Fe, thường chiếm từ vài phần nghìn đến vài phần trăm so với trọng lượng khô của sợi nấm Phospho chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của nấm sợi Phospho tham gia cấu tạo nên nhiều chất hữu cơ rất quan trọng trong tế bào nấm như nucleotit, protein, phosphoprotein, phosphatit Lưu huỳnh tham gia vào thành phần một số axit amin: Cystin, cystein, methionin,… trong nhiều coenzyme: Axit lipoic, adenozin, biotin… Kali tham gia vào quá trình trao đổi gluxit Mg2+ mang tính chất là một cofactơ đối với nhiều enzyme, nó tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng 80 enzyme trong tế bào (ADNase, esterase, cacboxylase, enolase, nhiều enzyme chuyển hóa protein, các enzyme oxy hóa khử…) Thiếu Mg2+có thể dẫn đến việc ức chế quá trình hình thành bào tử nấm sợi Canxi chiếm khoảng vài phần trăm trong phần khoáng của tế bào nấm Canxi không tham gia vào thành phần các chất hữu cơ nhưng nó đóng vai trò trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng (như giữa các nucleotit, protein, axit nucleic) Trong nuôi cấy nấm sợi, các nguyên tố khoáng đa lượng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới dạng các muối vô cơ như KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, KCl, FeCl,… [9]

Cũng như với các sinh vật khác, các nguyên tố vi lượng là những nguyên tố mặc dù chỉ cần thiết với hàm lượng rất nhỏ nhưng không thể thiếu cho sự trao đổi chất, sinh trưởng của nấm sợi Đối với nấm sợi, các nguyên tố vi lượng bao gồm: Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, B… Các nguyên tố này thường có liên quan mật thiết với các quá trình xúc tác sinh học trong tế bào nấm sợi Một số nguyên tố tham gia vào cấu trúc của các enzyme Đặc biệt đối với laccase thì ion đồng có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình tổng hợp laccase [58] Hoạt độ laccase sẽ tăng cao khi có mặt của các ion Cu2+

Theo Alberto và cs trong môi

trường sinh tổng hợp laccase từ T versicolor có chứa 3 mM CuSO4 làm tăng hoạt tính

laccase từ 1200 U/L lên đến 4000 U/L [77] Trong sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp từ T

versicolor biểu hiện trong A niger D15, CuSO4 nồng độ 0,1 mM trong môi trường lên men kích thích khả năng tổng hợp laccase, đạt 2700 U/L [16]

23

1.3.2.4 Ảnh hưởng của chất cảm ứng

Việc tổng hợp laccase trong tự nhiên cần có các chất cảm ứng Laccase được tạo ra với nồng độ thấp khi các chủng nấm mốc được nuôi trong môi trường cơ bản thông thường và được tạo ra với nồng độ cao hơn khi môi trường được bổ sung các chất cảm ứng như axit ferulic, 2,5-xylidene, lignin và veratryl alcohol [20] Ảnh hưởng của 2,5-xylidene lần đầu

tiên được Fahraeus và cs nghiên cứu vào năm 1958 trên nấm T versicolor Dưới tác dụng

của chất cảm ứng trong môi trường nuôi cấy, hoạt độ laccase tăng 160 lần so với môi

trường không có chất cảm ứng Đối với P cinnabarinus, 2,5-xylidine làm tăng khả năng tổng hợp laccase gấp 9 lần [37] Trong Trichophyton rubrum LKY-7, nồng độ 2,5µM 2,5-

xylidine có làm tăng khả năng tổng hợp laccase lên đến 8 lần so với môi trường không có

chất cảm ứng [64] Tuy nhiên, các nấm thuộc họ nấm đảm như Basidiomycete PM1 (CECT

2971), sự sinh tổng hợp không bị ảnh hưởng bởi 2,5-xylidine [31] Các chất cảm ứng, đa

số là các hợp chất mạch vòng thơm thường có giá thành cao hoặc có hại cho sức khoẻ vì thế chúng ít được ứng dụng trong sản xuất công nghiệp Việc sử dụng các chất cảm ứng thân thiện với môi trường và có giá trị kinh tế đang là vấn đề thu hút sự quan tâm lớn để tăng cường sản xuất laccase từ các chủng tự nhiên In-Young Lee (1999) cho rằng, bổ sung ethanol vào trong môi trường nuôi cấy làm tăng khả năng sinh tổng hợp laccase 20 lần Ảnh hưởng của ethanol có thể được so sánh là ngang với veratryl alcohol và tốt hơn xylidine và guaiacol

Trong sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp, các chất cảm ứng được bổ sung vào môi trường sinh tổng hợp laccase phụ thuộc vào promoter của hệ thống biểu hiện Methanol là chất

cảm ứng cho sinh tổng hợp laccase trong P pastoris, nếu nồng độ methanol quá lớn trong

môi trường sẽ gây độc cho chủng chủ và ức chế khả năng sinh tổng hợp laccase, ngược lại, nếu hàm lượng methanol thấp trong môi trường lên men thì quá trình tổng hợp laccase xảy

ra yếu J O’Callaghan và cs [93] bổ sung hàng ngày 1% methanol trong lên men sinh tổng

hợp laccase từ T versicolor biểu hiện trong P pastoris, hiệu suất đạt 15,8 U/L Đối với các

chủng nấm tự nhiên, ion Cu2+ có thể là chất cảm ứng mạnh mẽ cho tổng hợp laccase trong

T versicolor nhưng đối với chủng tái tổ hợp thì hầu như ion Cu2+ không còn giữ vai trò là chất cảm ứng mà chỉ đóng vai trò khoáng vi lượng cần có trong môi trường nuôi cấy

A.niger D15#26 là chủng chủ sử dụng promoter của gen gpdA mã hóa enzyme

glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase, cho phép biểu hiện mạnh protein trong môi trường có glucose, do đó đối với hệ biểu hiện này thì glucose vừa là nguồn cacbon đồng thời cũng đóng vai trò là chất cảm ứng thuận lợi cho quá trình sinh tổng hợp laccase [16]

24

Kiiskinen và cs [68] lại sử dụng chủng nấm men S cerevisea cho biểu hiện laccase từ M

albomyces, sử dụng promoter GAL1 cho sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp khi trong môi

trường có galactose như một chất cảm ứng

Như vậy, việc sử dụng promoter trong biểu hiện gen laccase quyết định nguồn cacbon

và chất cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Với các hệ biểu hiện mà glucose hoặc đường là chất cảm ứng sẽ thuận lợi cho quá trình lên men và thân thiện môi trường hơn

1.3.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

Trong môi trường nuôi cấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp laccase Thông thường nấm mốc được nuôi cấy ở nhiệt độ 25-30°C là nhiệt độ thích hợp sinh tổng hợp laccase Khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao hơn 30°C hoặc thấp hơn 25°C thì sinh trưởng chậm dẫn đến hoạt tính của laccase bị giảm

Thurston [117] cho rằng nhiệt độ tối ưu trong sinh tổng hợp laccase là 25°C trong điều kiện có ánh sáng, và ở 30°C trong điều kiện tối Theo nghiên cứu của Xavier và cs [122],

tổng hợp laccase từ T versicolor ở nhiệt độ 300

C, trong T modesta ở nhiệt độ 300C, P

ostreatus ở 250C là hợp lý

Sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp trong P pastoris, sinh khối nấm men được hoạt hóa ở

300C sau đó việc tổng hợp laccase được tiến hành ở 200

C T versicolor biểu hiện trong P

methanolica sinh tổng hợp laccase ở 200C [16; 52] Theo nghiên cứu của Alessandra và cs

laccase từ P ostreatus biểu hiện trong Kluyveromyces lactis và S cerevisiae ở 280

C Bohlin và cs cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp laccase nhờ hệ

biểu hiện A niger D15 là 300

C Nhiệt độ này cũng trùng với nghiên cứu của Record và cs khi

biểu hiện gen lcc1 từ P cinnabarinus trong A.niger D15#26 [16; 101]

Cho đến nay vẫn chưa có nhiều thông tin về ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp laccase, nhưng thông thường nấm mốc được nuôi cấy trong môi trường pH 5 đạt sinh

trưởng và sinh tổng hợp laccase cao nhất trong các chủng nấm T versicolor, P.ostreatus,

P cinnabarinus… [117] Sinh tổng hợp laccase nhờ P ostreatus DM-1513 đạt hiệu quả

cao nhất khi với môi trường có pH ban đầu 6,0 - 6,5 [87] Với T modesta, pH tối ưu cho tổng hợp enzyme được xác định là 6,95 [92] Theo Han và cs T versicolor sinh tổng hợp

laccase với pH ban đầu trong môi trường lên men là 5

pH tối ưu trong sinh tổng hợp laccase tự nhiên và laccase tái tổ hợp không giống nhau

Nghiên cứu của J O’Callaghan và cs [93] cho thấy sinh tổng hợp laccase từ T versicolor

25

biểu hiện trong P pastoris sử dụng vector pPIC3.5 mạnh mẽ ở pH 5,5 - 7,0 Ở pH 6,0 – 7,0

laccasse được tổng hợp mạnh sau 144h trong khi đó nếu giá trị pH ban đầu trong môi

trường thấp hơn 5,5 gần như không tổng hợp laccase Laccase từ T versicolor biểu hiện trong nấm mốc A niger D15 cho thấy kết quả ngược lại, tại pH 6 laccase được tổng hợp

mạnh mẽ nhất còn tại giá trị pH 5 và 7 thì tốc độ tổng hợp laccase thấp [16]

1.3.2.6 Ảnh hưởng của sự thông khí

Kiểm soát nồng độ oxi hòa tan trong hệ thống lên men là nhiệm vụ bắt buộc trong lên men Bocking và cs [15] đã kiểm soát nồng độ oxi hòa tan trong lên men bán liên tục

A.oryzae là 1,8 lít/lít/phút giúp cho việc tổng hợp enzyme α – amylase và glucoamylase từ

chủng tái tổ hợp hiệu suất tổng hợp enzyme là 24,3g/l cao hơn so với khả năng tổng hợp enzyme trong chủng tự nhiên là 21,7g/l (hiệu suất tăng 11%)

Một yếu tố nữa cũng ảnh hưởng rất lớn đến độ hòa tan oxy là tốc độ khuấy và tốc độ cấp khí, tuy vậy, với quá trình tổng hợp laccase nhờ nấm mốc, cần xem xét đồng thời ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn tới trạng thái nấm mốc Tốc độ khuấy 250, 500 và 750 vòng/phút đã được khảo sát trong tổng hợp laccase nhờ nấm mốc cho thấy quá trình lên men với tốc độ khuấy 250 vòng/phút cho hoạt tính cao hơn [41] Hess và cs [55] cho rằng

sinh tổng hợp laccase trong T multicolor giảm đáng kể khi lên men trong bình lên men so

với bình tam giác, khi cánh khuấy của bình lên men quá mạnh sẽ phá vỡ cấu trúc tế bào nấm dẫn đến tế bào bị tổn thương và hạn chế quá trình sinh trưởng và tổng hợp sản phẩm, enzyme không được hình thành hoặc được hình thành không đáng kể Ryan và cs đã khắc phục nhược điểm trên bằng cách cách cấp khí thay cho đảo trộn trong hệ thống lên men

cho sinh tổng hợp laccase từ T pubescens [103] Kết quả cho tốc độ sinh trưởng mạnh của

nấm mốc cùng với sinh tổng hợp laccase cao trong hệ thống lên men Kỹ thuật lên men theo chiến lược cấp khí cũng được áp dụng trong xử lý nước thải ô liu nhờ enzyme phân

hủy lignin từ P ostreatus [95] Kỹ thuật lên men này đem lại hiệu quả lớn là do không sử

dụng khuấy tốc độ cao, tế bào nấm mốc không bị tổn thương do đó không ảnh hưởng đến sinh tổng hợp laccase, ngoài ra hệ thống này đơn giản, dễ thực hiện, an toàn và với chi phí thấp

1.4 KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE

Lên men là quá trình phức tạp với nhiều yếu tố ảnh hưởng khác nhau, trong đó quá trình sinh trưởng và quá trình hình thành sản phẩm không chỉ bị ảnh hưởng bởi các thông

số trong môi trường mà đặc biệt còn bị ảnh hưởng bởi kỹ thuật quá trình lên men, bao gồm

Trong những năm gần đây kỹ thuật lên men trong môi trường rắn đã nhận được nhiều

sự chú ý So với lên men lỏng, lên men rắn có quy trình đơn giản, giảm nhu cầu cung cấp năng lượng và lượng nước thải sản sinh Lên men rắn có thể thích hợp cho sản xuất enzyme trong nấm sợi từ các nguyên liệu tự nhiên Trong nghiên cứu sinh tổng hợp laccase, lignocellulose từ các phế thải công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp và lâm nghiệp được sử dụng làm vật liệu tự nhiên cho nấm mốc phát triển, kích thích quá trình sinh tổng hợp laccase Tuy nhiên, lên men rắn có những nhược điểm như: Diện tích sử dụng trong lên men lớn, thời gian lên men dài, khó đáp ứng được yếu tố vô trùng, khó điều khiển quá trình lên men, do đó rất khó tối ưu để đạt được hiệu suất sinh tổng hợp laccase cao và khó nâng cấp quy mô Chính vì thế, lên men rắn chưa được xem là lên men quy mô công nghiệp cho laccase

Hầu hết các enzyme công nghiệp, bao gồm cả laccase được sản xuất nhờ lên men trên môi trường lỏng Quá trình lên men trên môi trường lỏng rất thông dụng, dễ điều khiển pH, thông khí, bổ sung cơ chất, dễ dàng nâng quy mô, dễ thu hồi enzyme nhưng việc kiểm soát nhiễm tạp phức tạp hơn so với lên men rắn Lên men sinh tổng hợp enzyme trong môi trường lỏng được thực hiện dưới nhiều dạng thức và chiến lược lên men tùy theo mục tiêu, đặc tính chủng nuôi cấy, đặc điểm sản phẩm và năng lực thiết bị: Lên men gián đoạn, lên men bán liên tục hay lên men liên tục tùy theo đặc điểm từng quá trình, nhằm kiểm soát tốt hơn tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật và sự tạo thành sản phẩm

1.4.1 Lên men gián đoạn [86]

Quá trình lên men trên môi trường lỏng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, bao gồm thành phần môi trường, mức độ và hình thức thông khí, tốc độ khuấy, tốc độ dòng (nếu là lên men liên tục), độ nhớt môi trường, điều kiện nuôi

Lên men gián đoạn là một hệ thống đóng, tại đó các chất dinh dưỡng cần thiết được cung cấp cho sự phát triển của vi sinh vật và sự hình thành sản phẩm một lần và ngay từ đầu quá trình lên men Vi sinh vật sau khi được cấy vào hệ thống lên men sẽ sinh trưởng và phát triển Hệ thống lên men có thể được kiểm soát các thông số như: Nhiệt độ, oxi, pH Trong hệ thống lên men gián đoạn, các thông số của quá trình lên men đều biến động theo