Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh khiết từ cây nhân trần tía adenosma bracteosum bonati

Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh khiết từ cây nhân trần tía adenosma bracteosum bonati Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh khiết từ cây nhân trần tía adenosma bracteosum bonati luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, dung môi, hoá chất, trang thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu a Nguyên liệu thực vật

Toàn cây Nhân trần tía thu hái tại núi Bà Đen, tỉnh Tây Ninh vào tháng 9, năm

2017 Mẫu cây được định danh bởi PGS TS Trần Hợp, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

Cây được thu hoạch lúc sáng sớm Được bảo quản trong thùng xốp có đục lỗ, tránh ẩm mốc

Sau đó mang đi phơi dưới bóng râm, tránh dưới anh nắng trực tiếp cho đến khi khô b Nguyên liệu động vật

Chuột bạch chủng Swiss albino có lông trắng sáng, khỏe mạnh với khối lượng cơ thể 21 ± 2 g được mua từ Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh Động vật thực nghiệm này được nuôi dưỡng bằng thức ăn chuẩn do Viện Pasteur cung cấp trước khi tiến hành nghiên cứu.

Cồn 96% loại dùng cho thực phẩm

Các dung môi hữu cơ: Aceton (Ac), chlorofrom (CF), methanol (MeOH), benzen

(Bz), ethyl acetat (EA), sử dụng loại AR do Trung Quốc sản xuất

Các hoá chất khác: HCl, H2SO4, NaOH, KOH, bột Mg kim loại, FeCl3, vanilin sử dụng loại tinh khiết phân tích

- Vitamin C; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma – Đức)

- Glibenclamide; Streptozocin; Carbon tetrachloride; Ciprofloxacin (Flamingo - Ấn Độ)

- FeCl3, K3Fe(CN)6; CCl3COOH; H3PO4; NaCO3; BaCl2; H2SO4; D- glucose; Đệm phosphate; Đệm acetate

- Dung môi dùng cho phân tích (AR): Methanol (Xilong – Trung Quốc); Dimethyl sulfoxyde

- DMSO (Xilong - Trung Quốc); Chloroform (Việt Nam); Ethyl acetate (Xilong

Các hoá chất và thuốc thử khác thông dụng trong phòng thí nghiệm

Phần thực nghiệm của đề tài được thực hiện chủ yếu tại Phòng Hóa hợp chất thiên nhiên thuộc Viện Công nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng các máy móc và thiết bị hiện đại.

Máy cô quay chân không Rotavapor 05 basic IKA

Cân kỹ thuật OHAUS Voyager Pro, P = 0,01 g, max = 210 g

Cân phân tích Pioneer, P = 0,1 mg, max = 210 g Đèn UV 254/365 nm Spectroline ENF – 240C/FE

Máy đo phổ hồng ngoại Bruker Alpha T

Máy quang phổ UV-Vis U2800 Hitachi

Các thiết bị thông dụng khác trong phòng thí nghiệm

Tủ sấy chân không Salvis

Máy đo đường huyết Benecheck Plus (Đài Loan)

Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Cao C Cao AQ Cao Et

Chloroform Ngâm kiệt trong nước Ngâm kiệt trong cồn

Bột dược liệu Đánh giá khả năng quét gốc tự do

DPPH Đánh giá khả năng chống oxy hóa trên FRAP

Hoạt tính ức chế enzyme Xathin oxidase

Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết lên lượng đường trong máu

Chống oxy hóa in vivo qua mô hình khả năng bảo vệ gan trên chuột bị gây độc bởi CCl4

Cao Et trích ly lỏng-lỏng thu cao phân đoạn CHCl3

Qua các sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng

Phổ MS, NMR (DMSO, HSQC,…) Định danh

Khảo sát ảnh hưởng của hợp chất lên lượng đường trong máu

2.2.1 Xác định độ ẩm Độ ẩm của dược liệu được thực hiện bằng phương pháp Xác định mất khối lượng do làm khô Cụ thể là dùng phương pháp: sấy trong tủ sấy ở áp suất thường theo Dược điển Việt Nam Quyển III, Phụ lục 5.16 [1]

Để thực hiện sấy cốc cân, đầu tiên cần đặt cốc vào bình hút ẩm trong 30 phút Sau đó, sử dụng cân phân tích có độ chính xác 0,001 g để cân khối lượng của cốc Tiếp theo, cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào cốc đã biết trước khối lượng Đặt cốc vào tủ sấy ở nhiệt độ 125 o C – 130 o C trong 1 giờ và tiến hành cân khối lượng Lặp lại quy trình này cho đến khi sự chênh lệch trọng lượng giữa hai lần cân không vượt quá 0,5 mg.

Tính toán kết quả Độ ẩm được tính bằng phần trăm theo công thức:

W: độ ẩm của dược liệu (%) mbd: Khối lượng ban đầu (g) msau: Khối lượng sấy (g)

2.2.2 Quá trình chiết và thu nhận cao chiết

Nguyên liệu sử dụng là toàn cây Nhân trần tía tươi, được rửa sạch, phơi khô và nghiền thành bột có kích thước từ 1,5 đến 2 mm.

Mục đích của nghiên cứu là chiết xuất các hợp chất từ cây Nhân trần tía bằng dung môi ethanol và nước Quá trình chiết xuất được thực hiện trong khoảng thời gian 24 - 48 giờ, với sự hỗ trợ của máy lắc ở tốc độ 150 vòng/phút.

Để thực hiện, ngâm bột cây Nhân trần tía vào dung môi ethanol 96%, nước và chloroform với tỉ lệ khối lượng và dung môi là 1:10 Lắc hỗn hợp trong 24 - 48 giờ với tốc độ 150 vòng/phút và lặp lại quy trình này 3 lần.

Để thu hồi dịch chiết, cần thực hiện lọc thô nhằm loại bỏ cặn bã nguyên liệu có trong dịch chiết, từ đó thu được dịch trong sạch để chuẩn bị cho quá trình thu cao tiếp theo.

Cô quay được thực hiện để thu hồi dung môi cho tái sử dụng Sau khi thu được cao thô từ các dịch chiết nước, cồn và chloroform, toàn bộ cao sẽ được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh ở nhiệt độ từ 10°C đến 14°C để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.

Sử dụng một phần cao thô từ dịch chiết cồn để tiếp tục quá trình chiết phân đoạn

- Cao ethanol thô sau đó được hoà vào lượng nước cất vừa đủ để hòa tan cao và tiếp tục được phân chia bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

Cho dung dịch cao ethanol vào bình lóng và thêm chloroform (CHCl3) với tỉ lệ 1:1 so với cao chiết Lắc nhẹ và chờ hỗn hợp phân lớp hoàn toàn Sau đó, tháo van chiết để lấy pha CHCl3 nằm dưới, trong khi pha nước nằm trên được cho vào bình chứa Lặp lại quá trình này 4 lần.

- Đuổi dung môi bằng phương pháp cô quay ở nhiệt độ 45 o C, thu được cao phân đoạn CHCl3

- Cao phân đoạn được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng cao thu được

Sau khi chiết xuất từng loại dược liệu, chúng ta thu được cao chiết và cân khối lượng của các cao này bằng cân phân tích 4 số Việc tính toán phần trăm cao thu được giúp đánh giá hiệu quả kinh tế của dược liệu Công thức tính phần trăm cao cho mỗi loại dược liệu được áp dụng để xác định giá trị kinh tế của chúng.

2.2.4 Phương pháp định tính các thành phần hóa học từ cao cồn và nước của Nhân trần tía

Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học được thực hiện theo phương pháp của bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh, cải tiến từ phương pháp của trường đại học Dược khoa Rumani, đồng thời tham khảo quy trình định tính terpenoid của Yadav và cộng sự (2011).

Nguyên tắc tách các hợp chất trong dược liệu dựa vào độ hòa tan của chúng trong các dung môi có độ phân cực khác nhau Sau khi tách, các hợp chất này được xác định thông qua các phản ứng chuyên biệt Cao cồn và cao nước được chia thành hai phần: phần một pha với H2SO4 10% để kiểm tra sự hiện diện của nhóm alkaloid; phần hai pha với DMSO 1% để phân tích và định tính các thành phần hóa học như carbohydrate, saponin, flavonoid, amino acid, anthraquinone glycoside, steroid, polyphenol và tanin.

 Định tính thành phần khử:

Thử nghiệm Fehling là phương pháp xác định sự hiện diện của đường khử trong mẫu Để thực hiện, hút 2 ml mẫu vào ống nghiệm, sau đó thêm lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B Tiến hành đun cách thủy trong 5 phút và quan sát sự xuất hiện của kết tủa màu đỏ CuO, cho thấy sự có mặt của đường khử.

Lấy 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ và bốc hơi đến cắn Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm một ít cồn cao độ và tiếp tục bốc hơi cho đến khi cắn đạt được Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng cho thấy có tinh dầu.

 Định tính thành phần alkaloid:

Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu vào ống nghiệm và thêm vài giọt thuốc thử Mayer, sau đó quan sát kết tủa màu đục xuất hiện Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và quan sát sự hình thành kết tủa màu vàng cam Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu vào ống nghiệm và thêm 2 giọt thuốc thử Hager.

34 ml thuốc thử Hager và quan sát hình thành kết tủa màu vàng Thử nghiệm Wagner: hút

2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Wagner và quan sát sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ

 Định tính thành phần saponin:

Thử nghiệm tạo bọt: hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh và quan sát sự hình thảnh bọt ổn định

 Định tính thành phần anthraquinone glycoside:

Thử nghiệm Bontrager bao gồm việc hút 2 ml mẫu vào ống nghiệm, thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi trong 30 phút Sau đó, lọc nóng và để nguội dịch lọc, thêm 3 ml benzene và lắc đều Sau khi để yên, tách lấy lớp benzene, thêm 2 ml ammonia 10% và đun trong 30 phút Nếu lớp ammonia xuất hiện màu đỏ, kết luận có anthraquinone glycosides; nếu không, kết luận là âm tính.

 Định tính thành phần polyphenol:

Lấy 2 ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm nhỏ Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3

5%, lắc đều Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: có polyphenol

 Định tính thành phần tanin: