Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở lúa Việt Nam Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở lúa Việt Nam Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở lúa Việt Nam luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp
TỔ NG QUAN TÀI LI Ệ U
Gi ớ i thi ệ u chung v ề cây lúa
1.1.1 Ngu ồn gốc và phân loại cây lúa
Cây lúa (Oryza sativa L), hay còn gọi là lúa Châu Á, được thuần hóa từ lúa dại tại ba trung tâm đầu tiên ở Đông Nam Á, bao gồm Assam (Ấn Độ), biên giới Thái Lan-Myanmar, và trung du Tây Bắc Việt Nam Theo tài liệu lịch sử của Trung Quốc, nghề trồng lúa đã xuất hiện khoảng năm 2800-2700 TCN.
Theo CADNolle, nguồn gốc cây lúa trồng bắt nguồn từ Miền Nam Việt Nam và Campuchia, trong khi Gutschin cho rằng cái nôi của nghề trồng lúa nằm ở chân dãy Himalaya, trải dài đến các vùng đồng bằng Bengal, Assam và Thái Lan, nơi có nhiều loại lúa hoang dại cùng với các giống lúa trồng phong phú.
Cây lúa có nguồn gốc chủ yếu từ vùng đầm lầy Đông Nam Á, theo nhiều tài liệu khảo cổ Mặc dù có nhiều giả thuyết khác nhau về nguồn gốc của cây lúa, nhưng đa số đều thống nhất rằng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm đã giúp cây lúa phát triển và lan rộng ra các khu vực khác.
Lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angios Permes), lớp một lá mầm (Mono
Lúa trồng thuộc chi Oryza, thuộc bộ hòa thảo có hoa (Graminales) và họ hòa thảo (Graminae), bao gồm 23 loài phân bố toàn cầu, trong đó có hai loài lúa trồng chính Oryza sativa L là loài phổ biến nhất, chủ yếu tập trung ở Châu Á, với ba loài phụ: Japonica, phân bố ở vùng vĩ độ cao như Bắc Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên, nổi bật với khả năng chịu rét cao và ít bị sâu bệnh.
Indica là loại cây trồng phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ và Mianma, với đặc điểm hạt dài, thân cao và dễ đổ Loại cây này chịu sâu bệnh nhưng có năng suất thấp và mẫn cảm với ánh sáng Javanica, với đặc điểm trung gian, có hạt dài, dày và rộng hơn hạt Indica, nhưng chỉ được trồng ở một số khu vực của Indonesia.
Cây lúa được phân loại thành hai loại dựa trên điều kiện sinh thái: lúa cạn và lúa nước Lúa cạn thường được trồng vào mùa mưa trên những vùng đất cao, có khả năng thoát nước tự nhiên, và trên các chân ruộng không có bờ hoặc không có nước dự trữ trên bề mặt.
Nhiều nghiên cứu cho thấy lúa cạn phát triển từ lúa nước, cho phép trồng ở vùng khô hạn nhưng vẫn sinh trưởng tốt trên đất ướt Đây là đặc tính nông học nổi bật của lúa cạn, khác biệt với các giống lúa khác.
Hiện nay có thể chia lúa cạn thành hai nhóm:
Nhóm lúa cạn cổ truyền bao gồm các giống lúa địa phương có khả năng thích nghi tốt và tồn tại lâu dài Những giống lúa này nổi bật với tính chống chịu cao, nhưng một hạn chế lớn là năng suất thấp.
Nhóm lúa không chủ động nước hoặc sống nhờ nước trời được phân bố trên những nương bằng, chân đồi thấp với độ dốc dưới 5 độ Đây là những giống lúa cạn mới lai tạo, có khả năng chịu hạn trong các giai đoạn sinh trưởng nhất định, đồng thời có hiệu suất sử dụng nước và tiềm năng năng suất cao.
Năng suất của các giống lúa cạn thường thấp do hai nguyên nhân chủ yếu:
Giống lúa cạn phát triển trên những vùng đất nghèo dinh dưỡng và dân trí thấp, mặc dù năng suất chỉ đạt trung bình 15 tạ/ha, nhưng chúng đóng góp đáng kể vào tổng sản lượng lúa, chiếm từ 20% đến 40% ở những khu vực sản xuất lương thực khó khăn Việc trồng giống lúa này không chỉ giúp cung cấp lương thực tại chỗ cho người dân mà còn giảm thiểu chi phí vận chuyển, tạo sự chủ động trong nguồn lương thực trong một khoảng thời gian nhất định, phù hợp với điều kiện của nhiều địa phương.
Hình 1.1 Sơ đồ tiến hóa hai loài lúa trồng
1.1.2 Ngu ồn tài nguyên lúa Việt Nam
Việt Nam có lãnh thổ trải dài từ 8 đến 23 độ vĩ Bắc, dẫn đến địa hình và khí hậu đa dạng và phức tạp Đất nước này nổi bật với những ngọn núi cao ở phía Bắc, vùng đất cao rộng lớn ở nam Trung Bộ, cùng hai đồng bằng lớn là đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long.
Việt Nam là quốc gia đa dạng với 54 dân tộc, mỗi dân tộc có những phong tục canh tác và sở thích về chất lượng lúa gạo riêng Qua quá trình phát triển nền văn minh nông nghiệp lâu đời, người dân đã thuần hóa nhiều giống lúa, từ lúa hoang dại đến lúa trồng hiện nay Nhiều nhà khoa học quốc tế khẳng định rằng Việt Nam là một trong những trung tâm khởi nguồn của cây lúa tại khu vực Đông Nam Á và Ấn Độ.
Việt Nam sở hữu sự phong phú về điều kiện tự nhiên và đa dạng thành phần dân tộc, với sự phân bố cư trú ở các độ cao khác nhau Những tập quán canh tác và thị hiếu sử dụng lúa gạo khác nhau giữa các vùng và dân tộc đã góp phần tạo nên nguồn gen cây lúa đa dạng và phong phú của đất nước.
Tài nguyên lúa hoang d ại
Lúa hoang dại đang thu hút sự chú ý của các nhà khoa học vì chúng cung cấp gen quý cho việc phát triển giống mới trong công nghệ sinh học Tại Việt Nam, lúa hoang dại phân bố chủ yếu ở đồng bằng Bắc Bộ và duyên hải miền Trung, nhưng đang dần bị mất do thâm canh tăng vụ Ở đồng bằng sông Cửu Long, lúa dại vẫn là nguồn lương thực quan trọng cho người dân địa phương Đến thập kỷ 70 của thế kỷ 20, nông dân Nam Bộ vẫn còn thu hoạch lúa dại để làm thực phẩm Việt Nam hiện có 4 loài lúa hoang dại.
- Oryza rufipogon: có ở Điện Biên Phủ, Thừa Thiên Huế, đồng bằng sông
Cửu Long Theo viện nghiên cứu lúa IRRI thì loài này có nguồn gen chịu chua phèn cao nhất thế giới
- Oryza nivaza: Ở tỉnh Đăklăk và dọc biên giới Việt Nam –Campuchia, là nguồn gen kháng rầy nâu và rầy lưng trắng
- Oryza oficinalis: Có nhiều ởđồng bằng sông Cửu Long
- Oryza granulata : Ở các tỉnh vùng Tây Bắc, đang được các nhà khoa học khai thác nguồn gen chịu hạn
Việt Nam đã trải qua hàng nghìn năm gieo trồng và thuần hóa cây lúa, tạo ra nguồn tài nguyên lúa trồng đa dạng và phong phú Sự đa dạng này được hình thành nhờ vào đặc điểm địa lý sinh thái phong phú trên toàn lãnh thổ Hiện nay, Việt Nam có 3 nhóm lúa địa phương với những đặc tính di truyền khác nhau, góp phần làm phong phú thêm nền nông nghiệp nước nhà.
H ạn hán và cơ chế ch ố ng ch ị u h ạ n ở th ự c v ậ t
1.2.1 Khái ni ệm và phân loại hạn hán
Hạn đối với thực vật là khái niệm chỉ sự thiếu nước do môi trường gây ra, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trong suốt quá trình hoặc từng giai đoạn cụ thể.
Mức độ khô hạn do môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây, từ việc giảm năng suất đến tình trạng hủy hoại cây và mùa màng Theo nghiên cứu của Robert và cộng sự (1991), hạn được coi là nguyên nhân gây thiệt hại lớn nhất cho năng suất lúa Trên toàn cầu, thiệt hại hàng năm do khô hạn đối với sản xuất lúa ước tính khoảng 1,024 triệu đô la.
1.2.2 Phân lo ại hạn hán đối với cây trồng
Hạn không khí thường được đặc trưng bởi nhiệt độ cao từ 39°C đến 42°C và độ ẩm thấp dưới 65% Hiện tượng này phổ biến ở các tỉnh miền Trung Việt Nam trong các đợt gió Lào và tại vùng Bắc Bộ vào cuối thu, đầu đông Ngoài ra, hiện tượng này cũng xuất hiện ở một số quốc gia khác như gió Chamsin ở Israel và gió Mistral ở miền Nam nước Pháp, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến một số loại cây trồng như phong lan, cam, chanh và đậu tương.
Hạn không khí ảnh hưởng trực tiếp đến các bộ phận trên mặt đất của cây, đặc biệt là hoa, lá và chồi non Đối với cây lúa, hạn không khí gây ra hiện tượng héo tạm thời do nhiệt độ cao và độ ẩm thấp làm tăng tốc độ thoát hơi nước, khiến rễ không hút đủ nước để bù đắp Mức độ phản ứng của cây với sự mất nước phụ thuộc vào giai đoạn phát triển Hạn không khí đặc biệt nghiêm trọng trong giai đoạn hình thành cơ quan sinh sản và có thể gây thiệt hại lớn trong giai đoạn lúa phơi màu, dẫn đến mất mùa nếu gặp nhiệt độ cao và độ ẩm thấp, mặc dù nước trong đất vẫn đầy đủ, làm cho hạt phấn không nảy mầm và quá trình thụ tinh không diễn ra.
Mức độ khô hạn của đất phụ thuộc vào sự bốc hơi nước và khả năng giữ nước của đất, dẫn đến áp suất thẩm thấu cao khiến cây không thể hấp thụ nước qua rễ, gây héo lâu dài Hạn đất có thể xảy ra ở bất kỳ khu vực nào, đặc biệt là ở những nơi có điều kiện khí hậu, địa hình và thổ nhưỡng đặc thù như sa mạc Châu Phi, đất đồi trọc Châu Á, và những mùa ít mưa ở Châu Âu Tóm lại, hạn đất ảnh hưởng trực tiếp đến bộ phận rễ của cây, từ đó tác động lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Hạn toàn diện là hiện tượng khi hạn đất và hạn không khí xảy ra đồng thời, dẫn đến việc giảm nhanh hàm lượng nước trong lá cây Mặc dù sức hút nước từ rễ cây tăng, nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt, không đủ cung cấp cho cây, gây ra hiện tượng héo vĩnh viễn và cây không thể phục hồi Tại Việt Nam, hạn toàn diện thường xảy ra ở các tỉnh miền Trung như Nghệ An và Quảng Trị, gây thiệt hại đáng kể cho năng suất lúa vào cuối hè.
1.2.3 Cơ sở di truyền của tính chịu hạn
Sự chống chịu khô hạn ở cây trồng được thể hiện qua các tính trạng như hình thái rễ, lá, và phản ứng sinh lý, được gọi là tính trạng thành phần Cơ chế chống chịu này tương đồng ở nhiều loài cây, đặc biệt là ở mức độ phân tử Cây trồng có khả năng nhận tín hiệu và truyền thông tin vào hệ thống tế bào, kích thích hoạt động của gen mục để ứng phó với stress khô hạn Chống chịu khô hạn là một tính trạng phức tạp, chịu ảnh hưởng bởi hệ thống gen và các yếu tố môi trường Cây có thể tăng hàm lượng các chất hòa tan như proline và trehalose để bảo vệ thẩm thấu, đồng thời điều chỉnh nồng độ hormone như ABA để giảm thoát hơi nước và tăng khả năng giữ nước Protein LEA cũng đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định màng tế bào trong điều kiện khô hạn Nhiều gen liên quan đến phản ứng với stress khô hạn đã được xác định, như gen MAP kinase và DREB, cho thấy sự thay đổi biểu hiện gen có thể ảnh hưởng đến khả năng chống chịu của cây, từ đó cải thiện sự phát triển và tăng trưởng trong điều kiện thiếu nước.
1.2.4 Ảnh hưởng của hạn hán đối với cây lúa
Nước đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa hóa sinh và là môi trường cho các phản ứng trao đổi Do đó, cung cấp nước cho cây là biện pháp canh tác thiết yếu, và nghiên cứu nhằm tăng cường tính chịu hạn của cây trồng luôn là mục tiêu hàng đầu trong việc phát triển giống cây.
Mức độ thiếu hụt nước ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây, với thiếu nước nhẹ làm giảm tốc độ sinh trưởng và thiếu nước nghiêm trọng dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, gia tăng quá trình lão hóa tế bào Khi cây thiếu nước, nguyên sinh chất có thể bị đứt vỡ, gây tổn thương và chết cho tế bào và mô Đặc biệt đối với cây lúa, nếu lượng nước trong đất chỉ còn 50% lượng cần thiết, mức độ ảnh hưởng đến năng suất sẽ phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây.
- Giảm 1/5 năng suất khi hạn hán xuất hiện vào giai đoạn đẻ nhánh
- Giảm 1/3 năng suất khi cây lúa đang trong giai đoạn phân hóa làm đòng và trỗ bông
- Giảm 2/3 năng suất hay thậm chí là mất mùa hoàn toàn vào giai đoạn cây lúa đang trỗ bông và thụ phấn
Trong giai đoạn 1998-1999, các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh và Quảng Trị đã chứng kiến năng suất lúa giảm tới 80% ở những diện tích bị hạn trong thời kỳ làm đòng Nhiều địa phương buộc phải hủy bỏ lúa đang trong thời kỳ đẻ nhánh để cấy lại.
Kháng hạn là khả năng của cây trong việc ra hoa và tạo hạt khi thiếu nước Dưới điều kiện hạn hán, quá trình ra hoa và phát triển của cây bị chậm lại Nếu hạn hán xảy ra từ 30 đến 10 ngày trước khi ra hoa, nó sẽ ảnh hưởng đến bầu nhụy và sự giảm phân của hạt phấn Hạn hán diễn ra từ 10 đến 5 ngày trước sẽ làm chậm quá trình kéo dài nhụy và mô chống đỡ Sự thay đổi di truyền trong giai đoạn ra hoa cũng bị ảnh hưởng và chậm lại khi cây gặp phải điều kiện hạn hán.
1.2.5 Ph ản ứng của cây lúa với hạn hán
Khi cây gặp hạn, bộ lá sẽ ngừng phát triển hoặc phát triển chậm lại nhằm hạn chế sự thoát hơi nước Đồng thời, phiến lá trở nên mỏng hơn và có nhiều lông hơn để giảm thiểu sự tích tụ nhiệt.
Lúa chịu hạn phản ứng thực tiễn bằng cách đóng khí khổng khi gặp điều kiện hạn, giúp hạn chế thoát hơi nước nhưng cũng làm giảm khả năng quang hợp Đặc điểm thích nghi của lúa chịu hạn là nâng cao hiệu suất quang hợp trước khi khí khổng đóng lại trong điều kiện khô hạn.
Lá có xu hướng cuộn lại và giảm góc độ, giúp giảm cường độ bức xạ trên bề mặt lá, tăng cường ánh sáng đi xuống phía dưới và duy trì mức độ thoát hơi nước tối thiểu.
Khi cây gặp điều kiện hạn, axit abcisic (ABA) được tổng hợp tăng cường ở rễ và vận chuyển lên lá, làm tăng tốc độ già hóa của lá và đóng khí khổng, từ đó giảm thiểu sự thoát hơi nước Sự gia tăng ABA trên lá cũng làm tăng mức độ héo, giúp cây giảm bớt tác động của bức xạ mặt trời, tiết kiệm nước và giảm diện tích bề mặt lá.
Các phương pháp ngh iên c ứu đa dạ ng di truy ề n
Đa dạng di truyền là một khía cạnh quan trọng của đa dạng sinh học, đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì cân bằng sinh thái và môi trường sống của các sinh vật, bao gồm cả con người Khái niệm này bao gồm sự đa dạng trong các quần xã sinh vật, giữa các loài và ở cấp độ di truyền trong cùng một loài Mặc dù là cấp độ thấp nhất, đa dạng di truyền có ảnh hưởng lớn đến tiến hóa và khả năng thích nghi của các loài Nó thể hiện sự phong phú của nguồn gen và kiểu gen, với mỗi loài có cấu trúc nhiễm sắc thể và số lượng nhiễm sắc thể khác nhau Trong quá trình tiến hóa, nhiễm sắc thể có thể thay đổi, dẫn đến sự xuất hiện của nhiều dạng khác biệt trong các cá thể.
Các nghiên cứu trước đây về mức độ đa dạng di truyền chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái Tuy nhiên, với các phương pháp phân tích mới, đã phát hiện ra rằng biến dị di truyền trong các loài được cấu trúc có thứ bậc giữa các nhóm như dưới loài, thứ và quần thể Mức độ đa dạng di truyền thực chất phụ thuộc vào số lượng và sự khác biệt của các gen bên trong loài Nếu biến dị xảy ra giữa các alen trong locut và tế bào, nó được gọi là dị hợp tử, và sự biến đổi này ở các tế bào đa bội có thể lớn hơn ở tế bào lưỡng bội Mức độ khác biệt giữa các locus trong tế bào phụ thuộc vào việc các gen có được lặp lại trong hệ gen hay không.
Nghiên cứu đa dạng di truyền đóng vai trò quan trọng trong chọn giống, giúp các nhà khoa học đánh giá và bảo tồn nguồn gen quý để duy trì đa dạng sinh học Qua đó, việc chọn lựa cặp bố mẹ trong lai tạo giống có thể tối ưu hóa ưu thế lai, góp phần duy trì nòi giống, kháng bệnh và thích nghi với biến đổi môi trường.
Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị hình thái là phương pháp đánh giá dựa vào các đặc điểm hình thái như hình dạng, kích thước và đặc điểm của các bộ phận.
Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có ưu điểm dễ tiếp cận và không yêu cầu thiết bị đắt tiền, được áp dụng phổ biến để phân biệt các giống cây trồng Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp phải một số hạn chế, bao gồm số lượng chỉ tiêu hình thái có hạn, sự ảnh hưởng của môi trường và phụ thuộc vào giai đoạn phát triển cụ thể.
Đánh giá thống kê cần thực hiện với quy mô lớn để đảm bảo tính chính xác Nhiều tính trạng đa gen không phải tất cả các gen đều biểu hiện ra kiểu hình có thể đánh giá Do đó, các nhà chọn giống thường kết hợp chỉ tiêu hình thái với chỉ thị sinh hóa và chỉ thị ADN để đạt được kết quả chính xác nhất.
Protein và các hoạt chất trao đổi là sản phẩm của quá trình biểu hiện gen ở sinh vật, và nghiên cứu sự khác biệt trong thành phần của chúng giúp xác định các khác biệt di truyền giữa các cá thể và loài Điện di protein trên gel là phương pháp hiệu quả để phân biệt và nhận diện các loài vi sinh vật Các protein và sản phẩm trao đổi chất được sử dụng làm chỉ tiêu đánh giá, gọi là chỉ thị hóa sinh, trong đó chỉ thị isozyme là phổ biến nhất Isozyme, với trình tự amino acid khác nhau nhưng cùng xúc tác cho một phản ứng hóa học, được trích ly, tinh sạch và điện di trên gel Các thành phần trong gel biến tính phá vỡ cấu trúc bậc cao của chuỗi amino acid, và dưới tác động của điện trường, các isozyme sẽ phân tích dựa trên khối lượng và độ tích điện Sự đa hình của các băng điện di thu được giúp nhận diện từng cá thể và đánh giá sự đa dạng trong quần thể nghiên cứu.
Chỉ thị hóa sinh được coi là đáng tin cậy hơn so với chỉ thị hình thái, vì mỗi protein là sản phẩm của một gen, do đó sự đa dạng của các protein phản ánh gián tiếp sự đa dạng trong kiểu gen của sinh vật Tuy nhiên, đối với các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi, đặc biệt là giữa các giống cây trồng, các sản phẩm biểu hiện gen có thể không phản ánh đúng sự khác biệt về gen.
Chỉ thị hóa sinh như protein và enzyme không thể hiện rõ sự đa hình, do đó không phản ánh chính xác bản chất di truyền của các tính trạng Điều này hạn chế khả năng ứng dụng của chúng Vì vậy, trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền hiện nay, chỉ thị ADN trở thành lựa chọn phổ biến hơn cả.
1.3.4 Ch ỉ thị phân tử ADN
Các chỉ thị phân tử ADN dựa trên tính đa hình của ADN, giúp xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài khác nhau Chúng cũng được sử dụng để phát hiện loài mới và nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa, cũng như phục vụ cho việc lựa chọn tổ hợp lai.
Chỉ thị phân tử ADN, bao gồm gen và đoạn ADN đặc hiệu, có tính ổn định cao và có thể xác định chính xác trong mọi loại mô mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường Chỉ thị di truyền phân tử được phân loại thành hai nhóm chính.
- Chỉ thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP
- Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR…
1.3.4.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn)
Năm 1980, Botstein và cs đã phát minh ra phương pháp RFLP (đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn)
Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là phương pháp nhận dạng ADN thông qua quá trình lai axit nucleic Nguyên lý của RFLP dựa trên việc cắt ADN bằng enzyme giới hạn, tạo ra các đoạn ADN có kích thước khác nhau Khi thực hiện điện di, các đoạn này sẽ phân bố khác nhau trên gel, và sau khi biến tính, chúng trở thành sợi đơn được chuyển lên màng cellulose băng nylon Trong quá trình lai ADN, nếu các đoạn ADN này bổ sung với mẫu dò đã được đánh dấu phóng xạ hoặc hóa học, sẽ xảy ra phản ứng lai, cho phép xác định sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau.
Kỹ thuật RFLP, được giới thiệu lần đầu bởi các nhà di truyền học trong nghiên cứu lập bản đồ gen liên quan đến bệnh ở người (Botstein và cộng sự, 1980), đã trở thành một công cụ quan trọng trong lĩnh vực di truyền học.
RFLP là chỉ thị đồng trội phổ biến trong tạo giống cây trồng, phục vụ nhiều mục đích như lập bản đồ di truyền, chọn lọc sớm tính trạng đơn gen và phân tích đa hình di truyền Tuy nhiên, phương pháp này gặp phải một số hạn chế, bao gồm thời gian và công sức tốn kém, kỹ thuật phức tạp, sử dụng chất phóng xạ độc hại và yêu cầu ADN chất lượng cao.
1.3.4.2 Ch ỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chi ều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc
Chỉ thị AFLP, được phát hiện bởi Zabeau Vos vào năm 1993 và được mô tả chi tiết bởi Vos và cộng sự vào năm 1995, là công cụ quan trọng để xác định mối quan hệ giữa các giống và loài Chúng đóng vai trò là nguồn chỉ thị di truyền cho việc lập bản đồ liên kết di truyền, giúp nhận biết sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các đặc điểm hình thái, năng suất, chất lượng và các locus gen khác.
Kỹ thuật AFLP dựa trên sự nhân bản chọn lọc ADN từ hệ gen đã xử lý bằng enzyme giới hạn Kỹ thuật này gồm bốn bước:
• Cắt ADN hệ gene bằng enzyme giới hạn và gắn các oligonucleotide tiếp hợp (adapter)
• Khuếch đại tiền chọn lọc bằng cặp mồi tiền chọn lọc
• Khuếch đại chọn lọc sử dụng các tổ hợp mồi EcoRI và MseI chọn lọc khác nhau
• Phân tích trên gel các đoạn ADN được nhân lên
Thành t ự u trong nghiên c ứu đa dạ ng di truy ề n lúa
Lúa là cây lương thực chủ đạo trong nông nghiệp khu vực Châu Á – Thái Bình Dương, và việc nâng cao năng suất lúa thông qua sự kết hợp giữa phương pháp truyền thống và công nghệ sinh học đang được nhiều quốc gia chú trọng Các nhà chọn giống đã áp dụng biến đổi di truyền để phát triển những giống lúa có tiềm năng năng suất cao, chất lượng gạo tốt, khả năng kháng sâu bệnh và chống chịu với các điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng và mặn.
Mục tiêu nâng cao năng suất và chất lượng đã dẫn đến việc thu hẹp số lượng các tính trạng trong quá trình lai giống, làm gia tăng sự tương đồng di truyền giữa các giống lúa lai so với giống hoang dại Việc thay thế giống truyền thống bằng giống lúa lai không chỉ làm mất đi nguồn gen hoang dại quý giá, mà còn giảm thiểu sự đa dạng di truyền của cây lúa, ảnh hưởng đến đa dạng sinh học Do đó, nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nhằm bảo tồn các giống lúa đặc sản và hỗ trợ công tác chọn tạo giống là một yêu cầu cấp thiết.
1.4.1 Nghiên c ứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hình thái
Chỉ thị hình thái đóng vai trò quan trọng trong việc phân loại và đánh giá đa dạng di truyền của lúa, đặc biệt trong việc chọn lựa các tổ hợp lai để tạo giống Kato là người đầu tiên áp dụng chỉ thị hình thái để phân loại dưới loài lúa trồng Châu Á, sử dụng các tính trạng như chiều dài lá, chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, màu phiến lá và dạng bông của 90 giống lúa từ Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản Kết quả phân tích cho thấy lúa trồng Châu Á được chia thành hai nhóm chính: Indica và Japonica.
Chang và cộng sự [32] xác định rằng chiều dài hạt thóc và tỷ lệ dài hạt/rộng hạt được điều khiển bởi đơn gen, hai gen hoặc trung gen với hệ số di truyền cao, đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá đa dạng di truyền của lúa Tác giả đề xuất chia lúa trồng Châu Á thành ba loài phụ: Indica, Japonica và Javanica Ngoài ra, các chỉ tiêu như độ dài của trụ gian lá mầm, độ phân hủy kiềm, chiều dài/rộng hạt và phản ứng của hạt thóc với dung dịch phenol cũng được sử dụng để phân loại lúa Indica và Japonica.
(Oka, 1958) [40] Oka đã tiến hành chọn ngẫu nhiên 147 giống từ tập đoàn lúa địa phương trên 1000 giống thu thập từ các nước Ấn Độ, Đông Dương, Trung Quốc và
Nhật Bản đã tiến hành quan sát 41 chỉ tiêu và tính trạng của các giống lúa, trong đó 11 tính trạng cho thấy sự biến dị lớn Chỉ tiêu phản ứng của hạt thóc với dung dịch phenol là quan trọng nhất, giúp phân loại các giống lúa thành hai nhóm: nhóm bắt màu (Indica) và nhóm không bắt màu (Japonica) Tại Việt Nam, đặc điểm hình thái được sử dụng phổ biến trong việc đánh giá giống lúa, đóng vai trò quan trọng trong chọn lọc và lai tạo giống Năm 2006, Lưu Ngọc Trình đã đánh giá 60 tính trạng hình thái của 1.819 giống lúa, cùng với 40-50 tính trạng của 1.385 giống và 20-30 tính trạng của 2.066 giống trong tổng số 6.083 giống đang được bảo quản tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc Gia.
1.4.2 Nghiên c ứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hóa sinh Đánh giá đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hóa sinh được sử dụng rộng rãi từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX Second (1982) [69] dựa vào kết quả phân tích 40 locut đẳng men (isozym) của hai loại lúa trồng Châu Á (Oryza sativa) và lúa trồng Châu Phi (Oryza glaberima) đã cho thấy lúa trồng Châu Á được chia thành hai nhóm
Chỉ thị hóa sinh do Glaszmann (1987) phát triển đã phân loại loài Oryza sativa thành sáu nhóm, trong đó nhóm Indica và Japonica là hai nhóm đối cực theo phân loại của Chang (1976) Mặc dù khác nhau về mặt hình thái, nhưng các đặc điểm di truyền của chúng không có sự khác biệt lớn Glaszmann đã gộp lúa Japonica vào nhóm này và gọi lúa Japonica theo phân loại của Chang là Japonica truyền thống hoặc Japonica ôn đới.
Javanica là lúa Japonica nhiệt đới
Các nghiên cứu về đa dạng di truyền của lúa ở Việt Nam đã được thực hiện quy mô lớn, tập trung vào 101 giống lúa địa phương tại huyện Nho Quan, Ninh Bình và huyện Đà Bắc, Hòa Bình Kết quả cho thấy có 44 giống lúa, chiếm 43,6%, thuộc nhóm đa dạng di truyền cao, được phân tích thông qua 9 locut từ 5 enzym khác nhau.
Indica và 57 giống (56,4%) thuộc lúa Japonica (Trần Danh Sửu, 2004) [20]
Vào năm 1999, Nguyễn Văn Tạo đã thực hiện phân tích đa dạng di truyền của 53 giống lúa miền Nam, sử dụng 19 locut của 10 enzym, và phát hiện có 21 trường hợp biến đổi di truyền trong các giống lúa này.
1.4.3 Nghiên c ứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị ADN
Với sự tiến bộ của sinh học phân tử, chỉ thị ADN đã được áp dụng hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật, đặc biệt trong phân tích đa dạng và chọn giống phân tử (MAS - Marker Assisted Selection) Gần đây, nghiên cứu về đa dạng di truyền lúa sử dụng chỉ thị ADN đã diễn ra mạnh mẽ, với các chỉ thị như RFLP, RAPD, AFLP và SSR.
RAPD là chỉ thị phổ biến trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nhờ vào ưu điểm đơn giản, nhanh chóng và chi phí thấp, không yêu cầu biết trước trình tự ADN Virk và cộng sự (1995) đã xác định các giống lúa trùng lặp từ 47 mẫu thuộc 44 giống trong tập đoàn nguồn gen lúa tại IRRI Bùi Chí Bửu và cộng sự (1999) đã sử dụng 20 chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng di truyền của 72 giống lúa địa phương Việt Nam.
Một số nghiên cứu đã kết hợp chỉ thị RAPD với các chỉ thị khác như SSR và AFLP để cải thiện độ tin cậy của kết quả, do RAPD có nhược điểm kém ổn định Nghiên cứu của Mahmoud về biến động và quan hệ di truyền của 7 giống lúa bằng cách sử dụng 8 chỉ thị RAPD, 6 chỉ thị SSR và 8 chỉ thị AFLP cho thấy mức độ đa hình lần lượt là 72,2%, 90% và 67,9% Kết quả này khẳng định rằng các kỹ thuật này đều có thể áp dụng hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa.
Song Z.P và cs., (2003) [73], đã sử dụng 23 chỉ thịSSR phân tích đa hình của
232 cá thể thuộc 6 quần thể lúa (3 quần thể từ Jiangxi và 3 quần thể từ Hunan-Trung
Quốc) Kết quả thu được tổng số 115 alen và các nhà nghiên cứu cho rằng quần thể lúa ở Jiangxi ở mức độđa hình cao hơn Hunan.
Võ Thị Minh Tuyền và cs., (2007) [25], đã sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu
Nghiên cứu đã xác định 10 giống lúa với nguồn gốc khác nhau và mức độ tương đồng di truyền từ 0,49 đến 0,96 Kết quả này cho phép phân loại các giống lúa thành các nhóm dựa trên khoảng cách di truyền, tạo cơ sở cho việc chọn bố mẹ trong quá trình phát triển giống lúa lai.
Nghiên cứu của Olufowote và cộng sự (1997) cho thấy chỉ thị RFLP và SSR đã được áp dụng để phân tích biến động di truyền trong 71 giống lúa, với kết quả cho thấy các giống lúa địa phương có mức đa dạng và dị hợp tử cao hơn so với giống lúa cải tiến Cả hai phương pháp đều chỉ ra rằng số lượng alen ở giống lúa địa phương vượt trội hơn Đặc biệt, chỉ thị SSR có khả năng phân biệt rõ ràng các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi và cho thấy số lượng alen cao hơn so với chỉ thị RFLP Xu và cộng sự (2004) đã sử dụng 113 chỉ thị RFLP và 60 chỉ thị SSR để định lượng đa dạng alen của 125 giống lúa từ các Bang miền Tây và miền Nam Mỹ, cùng với 111 giống từ tập đoàn lúa Quốc tế tại IRRI.
Masood (2004) đã giải trình tự bộ gen lục lạp của lúa dại (Oryza nivara), trong khi Fukuoka (2003) nghiên cứu đa dạng di truyền của 129 giống lúa bản địa miền Bắc Việt Nam thông qua chi thị phân tử RFLP và ADN lục lạp Phân tích nhóm dựa trên các chi thị RFLP cho thấy sự đa dạng của giống lúa ở miền Bắc.
Nghiên c ứ u lúa ch ị u h ạ n trên th ế gi ớ i và Vi ệ t Nam
1.5.1 Nghiên c ứu lúa chịu hạn trên thế giới
Sinh học phân tử trong nghiên cứu kháng hạn đã được áp dụng rộng rãi cho cây lúa, bắt đầu với việc phân tích QTL và lập bản đồ di truyền toàn bộ hệ gen lúa thông qua các chỉ thị microsatellite, như được thực hiện bởi McCouch và cộng sự (2002) Các nhà nghiên cứu lúa trên toàn cầu cũng đã xây dựng bản đồ đa dạng di truyền của quần thể lúa và các cơ sở dữ liệu liên quan, theo Ware và cộng sự (2002).
Nghiên cứu lập bản đồ gen cây lúa đã thành công trong việc xác định các vùng di truyền liên kết với những tính trạng như chiều cao cây, ngày ra hoa, và trong một số trường hợp, có thể xác định các gen đặc biệt nằm dưới một QTL (Ishimanu và cs, 2004).
Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử trong việc chọn tạo giống lúa chịu hạn đã đạt nhiều thành tựu trong những năm qua Wang và cộng sự (2007) đã so sánh sự thể hiện gen giữa giống lúa nước và lúa cạn trong điều kiện khô hạn bằng cDNA microarray Các giống lúa được sử dụng bao gồm IRAT109, Haogelao, Han 297 (lúa cạn) và Zhongzuo 93, Yuefu, Nipponbare (lúa nước) Kết quả cho thấy có 64 unique ESTs thể hiện cao ở giống lúa cạn và 79 unique ESTs ở giống lúa nước Tác giả dự đoán rằng sự thể hiện cao của các gen mục tiêu ở lúa cạn có thể cải thiện khả năng chống chịu stress do khô hạn trong lúa nước và các loài cây trồng liên quan.
Bản đồ các QTL và gen kháng hạn đã được xác định trên nhiễm sắc thể lúa, với 32 locus tính trạng số lượng QTL liên kết với gen kháng hạn nằm trên các NST số 1, 2, 4, 8 và 9 Các gen kháng hạn này có liên quan đến tính trạng điều khiển áp suất thẩm thấu.
Osmotic adjustment, cell-membrane stability, abscisic acid levels, stomatal regulation, leaf water status, and root morphology are critical factors influencing plant resilience and adaptation to environmental stress.
Shen và cộng sự (1999) đã nghiên cứu quần thể đơn bội kép (DH) từ cặp lai IR64 x Azucena tại Viện Lúa Quốc Tế (IRRI) Họ đã xác định bốn đoạn trên nhiễm sắc thể số 1, 2, 7 và 9, liên quan đến các QTL ảnh hưởng đến trọng lượng rễ lúa dài, trọng lượng rễ dài so với thân chồi, trọng lượng rễ dài so với số chồi, chiều dài rễ tối đa, độ dày của rễ, và trọng lượng rễ tổng số, tất cả đều có liên quan đến khả năng chịu hạn của lúa.
Zhang và cộng sự (1999) đã lập bản đồ di truyền QTL liên quan đến khả năng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA) trên quần thể RIL của tổ hợp lai IR58821-23-B-2-1 và IR52561-UBN-1-12, với 166 dòng con lai được chọn Để thiết lập bản đồ QTL, nhóm nghiên cứu đã sử dụng 383 AFLP và 106 RFLP.
Các tính trạng số lượng (QTL) ở cây lúa trong giai đoạn mạ bao gồm tổng số rễ, thể tích rễ, số chồi, tỷ lệ rễ/chồi, chiều dài rễ tối đa, điểm chống chịu khô hạn, độ dày của rễ, chiều cao của cây mạ, trọng lượng của rễ khô và độ cuốn lại của lá lúa Bản đồ QTL đã được thiết lập bởi Shashidhar và cộng sự (1999) Ngoài ra, Huang N và cộng sự (2002) cũng đã lập bản đồ QTL cho tính trạng chiều cao của cây lúa bằng phương pháp RFLP, sử dụng 5 quần thể khác nhau.
C039/Moroberekan, IR64/Azucena, Palawan/1R42, Tesanai2/CB và Waiyin/CB có kích thước quần thể biến đổi từ 135 đến 250 Nghiên cứu đã phát hiện 23 QTL trải rộng trên 12 NTS, đặc biệt là 13 gen lùn ở lúa có mối quan hệ gần gũi với các QTL này.
1.5.2 Nghiên c ứu lúa chịu hạn ở Việt Nam
Trong những năm gần đây, cả trên thế giới và ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về khả năng chịu hạn và việc tuyển chọn các giống lúa chịu hạn cho những vùng canh tác khó khăn Các nhà sinh lý học cho rằng, áp suất thẩm thấu đóng vai trò quan trọng trong khả năng chống chịu hạn của cây trồng Nghiên cứu gần đây đã khẳng định rằng áp suất thẩm thấu không chỉ ảnh hưởng đến khả năng chống hạn mà còn liên quan đến tỷ lệ nảy mầm, đồng thời đề xuất sử dụng chỉ số này để xác định các kiểu gen có áp suất thẩm thấu cao.
Trần Nguyên Tháp (2001) đã nghiên cứu các đặc trưng cơ bản của giống lúa chịu hạn để xây dựng chỉ tiêu chọn giống Từ kết quả thu được, tác giả đề xuất mô hình chọn giống lúa chịu hạn Trong thí nghiệm đánh giá khả năng chống chịu hạn nhân tạo, tác giả khuyến cáo sử dụng nồng độ muối KClO3 3% hoặc nồng độ đường Saccarin 0,8-1,0% để xử lý hạt.
Vũ Văn Liết và cộng sự (2004) đã tiến hành thí nghiệm sử dụng dung dịch KClO3 3% để ngâm hạt thóc trong 48 giờ trước khi nảy mầm, cùng với việc xử lý rễ mạ bằng dung dịch KClO3 1%, nhằm thanh lọc các giống lúa có khả năng chịu hạn.
Trong giai đoạn 1995-1997, Vũ Tuyên Hoàng, Trương Văn Kính và cộng sự
Ba giống lúa mới, CH5, CH7 và CH132, đã được công bố với những đặc tính vượt trội như năng suất cao, khả năng chống hạn và thích ứng tốt với đất nghèo dinh dưỡng Đặc biệt, giống CH5 đã được công nhận là giống quốc gia từ năm 2002 nhờ khả năng chống chịu sâu bệnh và năng suất cao, được gieo trồng rộng rãi ở nhiều vùng khó khăn về nước.
Trần Nguyên Tháp và các cộng sự (2002) đã chỉ ra rằng gen chống hạn đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh hàm lượng proline trong lá lúa khi môi trường thay đổi Trong điều kiện khủng hoảng nước, hàm lượng proline khác nhau giữa các giống lúa cạn và lúa nước, với các giống chịu hạn tốt có hàm lượng proline cao, biểu hiện đặc điểm chịu hạn và mức suy giảm năng suất thấp Sự khác biệt này làm nổi bật vai trò của gen trong cơ chế chống lại sự mất nước trong điều kiện gieo trồng cạn Tại Việt Nam, nghiên cứu về nguồn gen chịu hạn ở mức độ phân tử đã được thực hiện trong nhiều năm, bao gồm việc lập bản đồ QTL tính kháng hạn ở giống lúa nương với sự hỗ trợ của tổ chức Rockefeller tại Viện Công nghệ Sinh học Nguyễn Đức Thành (2004) Viện Di truyền Nông nghiệp cũng đã tiến hành các nghiên cứu phân tích di truyền và lập bản đồ gen chịu hạn ở một số giống lúa địa phương.
Năm 2010, Nguyễn Thị Lang và cộng sự đã xác định 42 giống lúa có khả năng chịu hạn cao cho sản xuất ở đồng bằng sông Cửu Long Họ cũng thiết lập bản đồ QLT chống chịu khô hạn cho quần thể BC2F2 từ tổ hợp lai OM1490/WAB880 - 1 - 38 - 20 - P1 HB, sử dụng 234 SSR đa hình trên 12 NST với khoảng cách trung bình giữa các marker là 10,97 cM Đánh giá kiểu hình tập trung vào ba tính trạng chống chịu hạn trong giai đoạn trỗ hoa, chiều dài rễ và khối lượng rễ Bản đồ QTL cho thấy sự liên kết gen chống chịu khô hạn trên các NST số 2, 3, 4, 8, 9, 10 và 12.