Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở để kiểm nghiệm paracetamol, loratadin, dextromethorphan hydrobromid, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt

Mục tiêu cụ thể- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời các hoạt chất paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng p

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ĐỂ KIỂM NGHIỆM PARACETAMOL, LORATADIN, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, PHENYLEPHRIN BITARTRAT TRONG

VIÊN SỦI BỌT

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ĐỂ KIỂM NGHIỆM PARACETAMOL, LORATADIN, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, PHENYLEPHRIN BITARTRAT TRONG

VIÊN SỦI BỌT

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc & Độc chất

Mã số : 60 72 04 10

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS PHAN THANH DŨNG

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.Kết quả, số liệu nghiên cứu trong luận văn là trung thực và

không trùng với bất kì công trình khác

Tác giả

Nguyễn Thị Như Ngọc

Luận văn Thạc sỹ dược học – Khóa 2015-2017

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc & Độc chất - Mã số: 60 72 04 10

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ĐỂ KIỂM NGHIỆM PARACETAMOL,

LORATADIN, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, PHENYLEPHRIN BITARTRAT TRONG VIÊN SỦI BỌT

Học viên: Nguyễn Thị Như Ngọc Giáo viên hướng dẫn: TS Phan Thanh Dũng

Mở đầu

Công ty TNHH Hasan – Dermapharm đang nghiên cứu bào chế viên sủi bọtParahasan Multi Symptoms gồm phenylephrin bitartrat (PHE), paracetamol (PAR),dextromethorphan hydrobromid (DEX), loratadin (LOR) nhưng chưa xây dựng tiêuchuẩn cơ sở cho thành phẩm Do đó, đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựngcác chỉ tiêu để góp phần xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho thành phẩm này

Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng

Viên sủi bọt Parahasan Multi Symptoms của công ty TNHH Hasan – Dermapharmchứa PHE 11,7 mg, PAR 500 mg, DEX 15 mg, LOR 5 mg

Phương pháp nghiên cứu

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời PHE, PAR, DEX, LORtrong viên sủi bọt bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA Áp dụng quy trìnhnày để xây dựng phương pháp thử cho chỉ tiêu độ đồng đều hàm lượng đối vớiPHE, DEX, LOR; áp dụng để định tính các hoạt chất dựa vào thời gian lưu và phổUV-Vis tại thời gian lưu Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt Các chỉ tiêu: hình thức, độ đồngđều khối lượng, độ rã thử theo quy định chung của DĐVN IV

Kết quả

Đã xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời PHE, PAR, DEX, LORtrong viên sủi bọt bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA Đã xây dựng và thẩmđịnh quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt

Kết luận

Đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho viên sủi bọt Parahasan Multi Symptoms gồm các

chỉ tiêu: hình thức, độ đồng đều khối lượng; độ rã; định tính; giới hạn tạp aminophenol; định lượng; độ đồng đều hàm lượng của PHE, DEX, LOR

4-Master’s thesis – Academic course: 2015 – 2017Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 60 72 04 10

ESTABLISHING IN-HOUSE SPECIFICATIONS FOR TESTING PARACETAMOL, LORATADINE, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMIDE, PHENYLEPHRINE BITARTRATE IN

in-house specifications for this finished product Therefore, this study was conducted to establish in-house specifications for it.

Materials and methods

in general regulations of the Vietnamese Pharmacopeia (4th Edition)

Result

The process was built and validated for simultaneous determination of PHE, PAR,DEX, LOR in effervescent tablet by RP-HPLC method with PDA detector Theprocess for determination of 4-aminophenol in effervescent tablet was developedand validated

Conclusion

The in-house specifications for Parahasan Multi Symptoms effervescent tablet have

been established, including: form, uniformity of weight, test for disintergration,identification, limit of impurity 4-aminophenol, assay, uniformity dosage units ofPHE, DEX, LOR

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Paracetamol 3

1.2 Dextromethorphan hydrobromid 7

1.3 Loratadin 10

1.4 Phenylephrin bitartrat 12

1.5 Tạp 4-aminophenol 14

1.6 Một số quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan HBr, loratadin, phenylephrin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 18 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu – hóa chất – trang thiết bị 21

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 22

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38

3.1 Định tính paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat 38

3.2 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA 40

3.3 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt 67

3.4 Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho viên sủi bọt chứa paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat 74

CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 84

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ASEAN Association of Southeast Asian Nations Hiệp hội các quốc gia

Đông Nam Á

BP The British Pharmacopoeia Dược điển Anh

DEX Dextromethorphan hydrobromide Dextromethorphan

hydrobromid

EP The European Pharmacopoeia Dược điển châu Âu

HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

nghiệm

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

PDA Photodiode Array Detector Đầu dò dãy diod quang

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

USP United States Pharmacopeia Dược điển Mỹ

UV-Vis Ultra Violet - Visible Tử ngoại – khả kiến

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Công thức cấu tạo paracetamol 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo dextromethorphan hydrobromid 7

Hình 1.3 Công thức cấu tạo loratadin 10

Hình 1.4 Công thức cấu tạo phenylephrin bitartrat 12

Hình 1.5 Công thức cấu tạo 4-aminophenol 14

Hình 1.6 Cơ chế paracetamol tạo ra tạp 4-aminophenol trong HCl 0,1 N/24 giờ 14 Hình 1.7 Cơ chế paracetamol tạo ra 4-aminophenol trong NaOH 0,1 N/24 giờ… 15 Hình 1.8 Ký hiệu GHS 07 và GSH 08 theo hệ thống GHS 15

Hình 3.1 Tính đặc hiệu quy trình định tính Br- 39

Hình 3.2 Tính đặc hiệu quy trình định tính bitartrat 39

Hình 3.3 Biểu đồ hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu … 41

Hình 3.4 Lựa chọn bước sóng phát hiện 42

Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient khảo sát 43

Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient khảo sát (tiếp) 44

Hình 3.7 Sắc ký đồ với pha động ACN - TEA 0,01% điều chỉnh pH 3,0/pH 2,/ pH 2,1 bằng TFA 45

Hình 3.8 Sắc ký đồ với pha động ACN – dung dịch TFA pH 2,1 46

Hình 3.9 Sắc ký đồ với pha động ACN – dung dịch acid phosphoric pH 2,1 46

Hình 3.10 Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký 48

Hình 3.11 Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu 50

Hình 3.12 Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu (tiếp) 51

Hình 3.13 Phổ UV-Vis các pic tại thời gian lưu trong mẫu chuẩn và mẫu thử 52

Hình 3.14 Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt 52

Hình 3.15 Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt (tiếp) 53

Hình 3.16 Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt (tiếp) 54

Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ 58

Hình 3.18 Sắc ký đồ các chương trình gradient khảo sát 67

Hình 3.19 Sắc ký đồ tính đặc hiệu tạp 4-aminophenol 69

Hình 3.20 Đồ thị tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic 4-aminophenol 72

DANH MỤC BẢNG BIỂU – SƠ ĐỒ

Trang

Bảng 1.1 Chương trình gradient định lượng paracetamol bằng HPLC của USP38 5

Bảng 1.2 Chương trình gradient định lượng phenylephrin bitartrat của USP 38 13

Bảng 1.3 Chương trình gradient định lượng 4-aminophenol theo USP 38 16

Bảng 1.4 Giới hạn tạp 4-aminophenol cho phép ở các dược điển 17

Bảng 1.5 Các công trình nghiên cứu trong nước 18

Bảng 1.6 Các công trình nghiên cứu ngoài nước 19

Bảng 2.1 Thành phần và công thức của viên sủi bọt nghiên cứu 21

Bảng 2.2 Thông tin các chất chuẩn 22

Bảng 2.3 Danh mục các trang thiết bị sử dụng 22

Bảng 2.4 Các chương trình gradient khảo sát định lượng 4 hoạt chất 26

Bảng 2.5 Cách pha dãy chuẩn khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng 31

Bảng 2.6 Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng 4 hoạt chất 32

Bảng 2.7 Chương trình gradient (-1%) của độ thô 33

Bảng 2.8 Chương trình gradient (+1%) của độ thô 33

Bảng 2.9 Chương trình gradient khảo sát định lượng tạp 4-aminophenol 34

Bảng 2.10 Cách pha chuẩn khảo sát tính tuyến tính định lượng 4-aminophenol 36

Bảng 2.11 Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng 4-aminophenol 37

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi pha mẫu 40

Bảng 3.2 Hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu 40

Bảng 3.3 So sánh độ phân giải khi thay đổi pH dung dịch B 47

Bảng 3.4 So sánh hệ số bất đối As với dung dịch B là TFA pH 2,1 và TEA 0,01% chỉnh pH 2,1 bằng TFA 47

Bảng 3.5 So sánh cột Inersustain C8 và Inersustain C18 49

Bảng 3.6 Chương trình gradient tối ưu được lựa chọn 49

Bảng 3.7 Kết quả tính thích hợp hệ thống quy trình định lượng 55

Bảng 3.8 Kết quả thẩm định độ lặp lại 56

Bảng 3.9 Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian 56

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát diện tích pic các hoạt chất theo nồng độ 57

Bảng 3.11 Kết quả thống kê hồi quy tuyến tính các hoạt chất 57

Bảng 3.12 Kết quả thẩm định độ đúng paracetamol 58

Bảng 3.13 Kết quả thẩm định độ đúng phenylephrin bitartrat 59

Bảng 3.14 Kết quả thẩm định độ đúng dextromethorphan HBr 59

Bảng 3.15 Kết quả thẩm định độ đúng loratadin 60

Bảng 3.16 Khoảng xác định của các hoạt chất 60

Bảng 3.17 Kết quả thẩm định độ thô - tốc độ dòng 0,9 ml/phút 61

Bảng 3.18 Kết quả thẩm định độ thô - tốc độ dòng 1,1 ml/phút 61

Bảng 3.19 Kết quả thẩm định độ thô - nhiệt độ cột 23 oC 62

Bảng 3.20 Kết quả thẩm định độ thô - nhiệt độ cột 27 oC 62

Bảng 3.21 Kết quả thẩm định độ thô - pH 2,0 63

Bảng 3.22 Kết quả thẩm định độ thô - pH 2,2 63

Bảng 3.23 Kết quả thẩm định độ thô - chương trình gradient (-1%) 64

Bảng 3.24 Kết quả thẩm định độ thô - chương trình gradient (+1%) 64

Bảng 3.25 Kết quả thẩm định độ thô - cột Inertsil C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) 65

Bảng 3.26 Kết quả thẩm định độ thô - vị trí đặt lọ chứa mẫu trong hệ thống tiêm mẫu tự động 65

Bảng 3.27 Kết quả thẩm định độ thô - độ ổn định của dung dịch phân tích 66

Bảng 3.28 Chương trình gradient định lượng tạp 4-aminophenol 68

Bảng 3.29 Kết quả tính thích hợp hệ thống 4-aminophenol 70

Bảng 3.30 Kết quả thẩm định độ lặp lại tạp 4-aminophenol 71

Bảng 3.31 Kết quả độ chính xác trung gian tạp 4-aminophenol 71

Bảng 3.32 Kết quả khảo sát diện tích pic theo nồng độ tạp 4-aminophenol 72

Bảng 3.33 Kết quả tính chính xác tại nồng độ LOQ 73

Bảng 3.34 Kết quả khảo sát hàm lượng tạp 4-aminophenol trong mẫu thử 73

Bảng 3.35 Kết quả thẩm định độ đúng tạp 4-aminophenol 73

Bảng 3.36 Công thức cho một viên sủi bọt 75

Bảng 3.37 Tiêu chuẩn của nguyên phụ liệu 76

Bảng 3.38 Chương trình gradient định lượng tạp 4-aminophenol 79

Bảng 3.39 Chương trình gradient định lượng 4 hoạt chất 80

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cảm lạnh và cảm cúm là bệnh thường hay gặp do nhiễm trùng đường hô hấp gây rabởi một số loại virus khác nhau Các triệu chứng của nó bao gồm sung huyết mũi(nghẹt mũi), viêm mũi dị ứng, mày đay, hắt hơi, sổ mũi, ngứa mũi/họng, ho, sốt,nhức đầu, đau nhức mình, nhức đầu kết hợp viêm xoang Để điều trị các bệnh nàythường kết hợp sử dụng các thuốc làm giảm nhẹ triệu chứng Paracetamol có tácdụng làm giảm sốt và giảm đau từ nhẹ đến vừa Dextromethorphan là thuốc giảm ho

do tác dụng lên trung tâm ho ở hành não dùng để điều trị triệu chứng do do họnghoặc phế quản bị kích thích khi cảm lạnh thông thường hoặc hít phải chất kíchthích Phenylephrin làm giảm nghẹt mũi và chảy mũi do có tác dụng chống sunghuyết mũi, giảm sưng của các mạch máu trong mũi Loratadin làm giảm nhẹ triệuchứng của viêm mũi dị ứng và mày đay, chống ngứa, không có tác dụng an thần [2]

Sự kết hợp đồng thời paracetamol, dextromethorphan, loratadin, phenylephrin trongmột chế phẩm không những làm nâng cao hiệu quả, giảm chi phí mà còn mang lại

sự thuận tiện cho bệnh nhân trong quá trình điều trị và cho bác sỹ khi kê đơn

Hiện nay, trên thị trường chưa có dạng viên sủi bọt chứa đồng thời paracetamol,

dextromethorphan hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat Công ty TNHH

HASAN-DERMAPHARM hiện đang nghiên cứu bào chế viên sủi bọtPARAHASAN MULTI SYMPTOMS chứa đồng thời bốn dược chất này và chưa

xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm Vì vậy, đề tài “Xây dựng tiêu chuẩn cơ

sở để kiểm nghiệm paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Mục tiêu tổng quát

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở để kiểm nghiệm paracetamol, dextromethorphanhydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt

2 Mục tiêu cụ thể

- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời các hoạt chất paracetamol,

dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang

- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamoltrong viên sủi bọt

- Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho viên sủi bọt chứa paracetamol,

dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat.

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 PARACETAMOL

1.1.1 Công thức cấu tạo và danh pháp [1], [10], [11], [18]

1.1.1.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo paracetamol

- 980

C Điểm chảy: 168-172 oC

D Đun nóng 0,1 g chế phẩm trong 1 ml acid hydrocloric trong 3 phút, thêm 1 mlnước, làm lạnh trong đá, không có tủa tạo thành Thêm 0,05 ml dung dịch kalidicromat 0,49%, xuất hiện màu tím và không chuyển sang màu đỏ.

E Chế phẩm phải có phản ứng của nhóm acetyl Thực hiện phản ứng bằng cách đuntrực tiếp trên lửa

b Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thờigian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượngnguyên liệu (phần b mục 1.1.4.1)

1.1.3.2 Thành phẩm

a Lấy một lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 0,5 g paracetamol, thêm 20 mlaceton, khuấy kỹ, lọc, làm bay hơi dịch lọc đến cắn, lấy cắn làm các thí nghiệm [1],[10]:

A Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của paracetamolchuẩn

B Sấy cắn ở 105 oC, độ chảy của cắn khoảng 168-172 oC

C Đun sôi 0,1 g cắn với 1 ml acid hydrocloric 3 phút, thêm 10 ml nước cất, đểnguội Thêm 1 giọt dung dịch kali dicromat 5% sẽ xuất hiện màu tím, không chuyểnsang màu đỏ

b Sắc ký lớp mỏng [18]

Bản mỏng: Silicagel GF254 đã hoạt hoá ở 105 oC trong 1 giờ

Hệ dung môi: Methylen clorid - methanol (4:1)

Dung dịch thử: Hoà tan một lượng bột chế phẩm tương ứng với 10 mg paracetamol

trong 10 ml methanol Lọc

Dung dịch đối chiếu: Hoà tan 10 mg paracetamol trong 10 ml methanol.

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 l các dung dịch trên Triển khai

sắc ký đến khi dung môi đi được 15 cm Lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí.Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm

Vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng về vị trí vàmàu sắc với vết chính thu được trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

c Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thờigian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượngthành phẩm (phần b mục 1.1.4.2)

1 ml dung dịch amoni ceri sulfat 0,1 M tương đương với 7,56 mg C8H9NO2

b Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Pha động:

Dung dịch A: 1,7 g kali dihydrophosphat và 1,8 g dinatri hydrophosphat trong

1 lít nước

Dung dịch B: Methanol

Bảng 1.1 Chương trình gradient định lượng paracetamol bằng HPLC của USP 38

Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B (%)

Dung dịch chuẩn: 0,1 mg/ml paracetamol trong methanol

Dung dịch thử: 0,1 mg/ml paracetamol trong methanol

Điều kiện sắc ký:

Bước sóng phát hiện: 230 nmCột: C8 (100 mm; 4,6 mm; 3,5 µm)Nhiệt độ cột: 35 oC

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phútThể tích tiêm: 5 µl

1.1.4.2 Thành phẩm

a Phương pháp quang phổ UV-Vis [1], [10]

Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn Cân chínhxác một lượng bột viên tương ứng khoảng 0,15 g paracetamol vào bình định mức

200 ml, thêm 50 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M và 100 ml nước, lắc 15 phút,thêm nước đến định mức Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20 ml dịch lọc đầu.Lấy chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml Thêm nước vừa đủđến vạch, lắc đều Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100

ml, thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M, thêm nước đến định mức, lắc đều

Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng 257 nm, dùng cốc dày 1 cm.Mẫu trắng là dung dịch natri hydroxyd 0,01 M

Tính hàm lượng paracetamol, C8H9NO2 theo A (1%, 1 cm) Lấy 715 là giá trị A(1%, 1 cm) ở bước sóng 257 nm

b Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Pha động: Methanol - nước (1:3)

Dung dịch chuẩn: 0,01 mg/ml paracetamol trong pha động

Dung dịch thử gốc: Hòa tan một lượng bột thuốc tương đương với 10 g paracetamol

trong 200 ml nước trong bình định mức 1000 ml, sử dụng nhiệt nếu cần, chờ đếnkhi bột sủi hết, định mức bằng nước đến vạch

Dung dịch thử: Pha loãng dung dịch thử gốc với pha động để được dung dịch thử có

nồng độ 0,16 mg/ml paracetamol

Điều kiện sắc ký:

Bước sóng phát hiện: 243 nmCột: C18 (300 mm; 3,9 mm; 0,5 μm)Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

Thể tích tiêm: 10 µl

1.2 DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID

1.2.1 Công thức cấu tạo và danh pháp [10], [11], [18]

1.2.1.1 Công thức cấu tạo

.HBr.H2O

Hình 1.2 Công thức cấu tạo dextromethorphan hydrobromid

Công thức phân tử: C18H26BrNO.H2O

Phân tử lượng: 370,3 g/mol

1.2.1.2 Danh pháp

Ent-3-methoxy-17-methylmorphinan hydrobromid monohydrat

(9S, 13S, 14S)-3-methoxy-17-methylmorphinan hydrobromid monohydrat

3-Methoxy-17-methyl-9α,13α,14α-morphinan hydrobromid monohydrat

Dung dịch thử: Hòa tan 25 mg chế phẩm trong methanol và pha loãng thành 10 ml

với cùng dung môi

Dung dịch đối chiếu: Hoà tan 25 mg dextromethorphan hydrobromid chuẩn trong

methanol và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi

Cách tiến hành:

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký,lấy bản mỏng ra, làm khô trong không khí Phát hiện vết bằng cách phun thuốc thửkali iodobismuthat Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương tự về vị

trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

D Cho phản ứng của bromid

1.2.3.2 Thành phẩm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thờigian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượngthành phẩm (mục 1.2.4.2)

1.2.4 Định lượng

1.2.4.1 Nguyên liệu

a Phương pháp chuẩn độ điện thế [10], [11]

Hòa tan 0,300 g chế phẩm trong hỗn hợp 5,0 ml acid HCl 0,01 M và 20 ml ethanol(96%) Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 M Xác định điểm tương đương bằng chuẩn độđiện thế Điểm tương đương là điểm uốn của đường cong chuẩn độ điện thế

1 ml dung dịch 0,1 M natri hydroxyd tương đương với 35,23 mg C18H26BrNO

b Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Pha động: Lọc và đuổi khí dung dịch có chứa 0,007 M natri docusat và 0,007 M

amoni nitrat trong hỗn hợp acetonitril và nước (70:30) và chỉnh pH 3,4 bằng acidacetic băng

Dung dịch chuẩn: Hoà tan một lượng chính xác chuẩn dextromethorphan

hydrobromid trong nước để có nồng độ khoảng 1 mg/ml Hút chính xác 10,0 mldung dịch này vào bình định mức 100 ml, định mức bằng pha động, lắc đều, lọc quamàng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 100 mg dextromethorphan hydrobromid, vào

bình định mức 100 ml, định mức bằng nước, lắc đều Hút chính xác 10,0 ml dungdịch này vào bình định mức 100 ml, định mức bằng pha động, lắc đều, lọc quamàng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí

Điều kiện sắc ký:

Bước sóng phát hiện: 280 nmCột C18 (250 mm; 4,6 mm; 5 μm)Tốc độ dòng: 1 ml/phút

Thể tích tiêm: 20 μl

1.2.4.2 Thành phẩm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Pha động: 0,34 g kali dihydrophosphat, 0,3 g triethylamin hydrocloric, 0,15 g natri

lauryl sunfat và 0,1 ml acid phosphoric trong 100 ml hỗn hợp methanol và nước(60:40)

Dung dịch chuẩn: Hoà tan một lượng chính xác chuẩn dextromethorphan

hydrobromid trong nước để được dung dịch có nồng độ 0,6 mg/ml Pha loãng dungdịch này với acid phosphoric 0,1% để được dung dịch có nồng độ 0,06 mg/ml

Dung dịch thử: Cân một lượng bột thuốc tương đương với khoảng 6 mg

dextromethorphan hydrobromid vào bình định mức 100 ml Thêm 10 ml methanol,siêu âm để hòa tan Thêm 0,4 ml acid phosphoric, định mức bằng nước, lắc đều, lọcqua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí

Điều kiện sắc ký:

Bước sóng phát hiện: 214 nmCột: L11 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm)Tốc độ dòng: 2 ml/phút

Thể tích tiêm: khoảng 10 μl

1.3 LORATADIN

1.3.1 Công thức cấu tạo và danh pháp [10], [11], [18]

1.3.1.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.3 Công thức cấu tạo loratadin

b Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thờigian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượngnguyên liệu (phần b mục 1.3.4.1)

1.3.3.2 Thành phẩm

a Phổ hồng ngoại [10]

Chiết xuất một lượng bột viên có chứa 50 mg loratadin với 20 ml aceton, lọc và làmbay hơi dịch lọc đến cắn Phổ hấp thụ hồng ngoại của cắn phù hợp với phổ chuẩncủa loratadin

d Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thờigian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượngthành phẩm (phần b mục 1.3.4.2)

1.3.4 Định lượng

1.3.4.1 Nguyên liệu

a Phương pháp chuẩn độ điện thế [10], [11]

Hòa tan 0,300 g trong 50 ml acid acetic băng Chuẩn độ với acid percloric 0,1 M.Xác định điểm tương đương bằng chuẩn độ điện thế

1 ml dung dịch 0,1 M acid pecloric là tương đương với 38,29 mg C22H23ClN2O2

b Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Dung dịch đệm A: dikali hydrophosphat 0,01 M trong nước

Dung dịch đệm B: dikali hydrophosphat 0,6 M trong nước

Pha động: Acetonitril, methanol và dung dịch đệm A (60:60:70), chỉnh pH 7,2 với

acid photphoric 10%

Dung môi pha loãng: Cho 400 ml dung dịch acid hydrocloric 0,05 N và 80 ml dung

dịch đệm B vào bình định mức 1 lít, định mức bằng hỗn hợp acetonitril và methanol(1: 1)

Dung dịch chuẩn: 0,4 mg/ml loratadin trong dung môi pha loãng.

Dung dịch thử: 0,4 mg/ml loratadin trong dung môi pha loãng.

Điều kiện sắc ký:

Bước sóng phát hiện: 254 nmCột: C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm)Nhiệt độ cột: 25-35 oC

Tốc độ dòng: 1 ml/phútThể tích tiêm: 15 μl

1.3.4.2 Thành phẩm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Dung dịch thử: Cho 10 viên vào bình định mức 250 ml, thêm 100 ml dung dịch acid

hydrocloric 0,05 N, và lắc trong 40 phút hoặc cho đến khi thuốc bị phân tán hoàntoàn Thêm 75 ml hỗn hợp methanol và acetonitril (1:1), lắc đều Thêm 20 ml dikalihydrophosphat 0,6 M, lắc trong 5 phút, định mức bằng hỗn hợp methanol vàacetonitril (1:1), lắc đều

Dung dịch chuẩn: 0,4 mg/ml loratadin trong dung môi pha loãng.

Điều kiện sắc ký: tương tự phần b mục 1.3.4.1

1.4 PHENYLEPHRIN BITARTRAT

1.4.1 Công thức cấu tạo và danh pháp [18]

1.4.1.1 Công thức cấu tạo

So sánh với phổ của phenylephrin bitartratchuẩn.

B Cho phản ứng của gốc bitartrat

C Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương vớithời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép địnhlượng nguyên liệu (mục 1.4.4)

1.4.4 Định lượng

Nguyên liệu

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]

Dung dịch đệm: Hoà tan 3,25 g muối natri 1-octansulfonic trong 1 lít nước, điều

chỉnh pH 2,8 bằng acid phosphoric 3 M

Dung dịch A: Acetonitril - dung dịch đệm (10:90)

Dung dịch B: Acetonitril - dung dịch đệm (90:10)

Bảng 1.2 Chương trình gradient định lượng phenylephrin bitartrat của USP 38 Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B (%)

Dung môi pha loãng: dung dịch A - dung dịch B (80:20)

Dung dịch chuẩn: 0,6 mg/ml phenylephrin hydrocloric trong dung môi pha loãng Dung dịch thử: 0,9 mg/ml phenylephrin bitartrat trong dung môi pha loãng.

Điều kiện sắc ký:

Bước sóng phát hiện: 215 nmCột: C18 (550 mm; 4,0 mm; 3 μm)Nhiệt độ cột: 45 oC

Tốc độ dòng: 1,5 ml/phútThể tích tiêm: 4 μl

1.5 TẠP 4-AMINOPHENOL

1.5.1 Công thức cấu tạo và danh pháp [1], [10], [11], [18], [19]

1.5.1.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.5 Công thức cấu tạo 4-aminophenol

Natri acetat 4-aminophenol

Hình 1.6 Cơ chế paracetamol tạo ra tạp 4-aminophenol trong HCl 0,1 N/24

Acid acetic 4-aminophenol

Hình 1.7 Cơ chế paracetamol tạo ra tạp 4-aminophenol trong NaOH 0,1 N/24 giờ 1.5.4 Độc tính [19]

Theo hệ thống hòa hợp toàn cầu về phân loại và ghi nhãn hoá chất – GHS (GloballyHarmonized System of Classification and Labeling of Chemicals), 4-aminophenolthuộc nhóm GHS 07 và GSH 08

1.5.5 Phương pháp kiểm nghiệm tạp 4-aminophenol trong thành phẩm

1.5.5.1 Dược điển Mỹ (USP 38) [18]

Dung dịch thử gốc: Pha dung dịch thử có nồng độ 10 mg/ml paracetamol từ một

lượng chế phẩm trong dung môi pha loãng

Dung dịch chuẩn gốc: 25 μg/ml 4-aminophenol trong dung môi pha loãng.

Dung dịch chuẩn: Cho 25,0 ml dung dịch thử gốc và 15,0 ml dung dịch chuẩn gốc

vào bình định mức 50 ml và pha loãng với dung môi pha loãng, lọc qua màng lọc0,45 μm, loại bỏ 3 ml dịch lọc đầu

Dung dịch thử: Cho 25,0 ml dung dịch thử gốc vào bình định mức 50 ml định mức

bằng dung môi pha loãng, lọc qua màng lọc 0,45 μm, loại bỏ 3 ml dịch lọc đầu

Dung dịch đệm: 4,0 g natri citrat dihydrat và 1,5 g acid citric khan trong 1 lít nước Dung môi pha loãng: Dung dịch đệm - acetonitril (9:1)

Dung dịch A: Dung dịch đệm phosphat 10 mM pha bằng cách thêm 0,60 g kali

dihydrophosphat và 0,82 g dinatri hydrophosphat vào bình định mức 1 lít, hòa tan

và pha loãng với nước đến thể tích sẽ được dung dịch pH 7,0

Tốc độ dòng: 1 ml/phútThể tích tiêm: 10 μl

1.5.5.2 Dược điển Anh (BP 2016) [10]

Dung dịch thử: Phân tán một lượng chế phẩm chứa 0,2 g paracetamol trong 8 ml

pha động, siêu âm, thêm pha động để được 10 ml, trộn đều và lọc Pha loãng dungdịch này 20 lần với pha động

Dung dịch chuẩn: 0,002% 4-aminophenol và paracetamol trong pha động.

Điều kiện sắc ký:

Cột: C8 (250 mm; 4,6 mm; 5 μm)Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

Nhiệt độ cột: 35 °CBước sóng phát hiện: 245 nmThể tích tiêm: 20 μl

Chương trình sắc ký: chế độ đẳng dòng với pha động như bên dưới.

Pha động: 250 thể tích methanol có chứa 1,15 g dung dịch tetrabutylammonium

40%, 375 thể tích dinatri hydrophosphat 0,05 M và 375 thể tích natridihydrophosphat 0,05 M

1.5.5.3 Dược điển Việt Nam IV [1]

Pha động: Dung dịch natri butansulfonat 0,01 M trong hỗn hợp gồm 0,4 thể tích

acid formic, 15 thể tích methanol và 85 thể tích nước

Dung dịch chuẩn: Chứa 0,001% của 4-aminophenol trong methanol 15%.

Dung dịch thử: Lắc một lượng bột chế phẩm tương ứng 1,0 g paracetamol trong 15

ml methanol, thêm nước vừa đủ 100 ml và lọc

Điều kiện sắc ký:

Cột thép không gỉ (250 mm; 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (10 m)

Tốc độ dòng: 2 ml/phútBước sóng phát hiện: 272 nmThể tích tiêm: 20 μl

1.5.6 Giới hạn tạp 4-aminophenol cho phép ở các dược điển

Bảng 1.4 Giới hạn tạp 4-aminophenol cho phép ở các dược điển Dược điển USP 38 [18] BP 2016 [10] EP 8 [11] DĐVN IV [1]

Nguyên liệu ≤ 0,005% ≤ 50 ppm ≤ 50 ppm ≤ 50 ppm

1.6 MỘT SỐ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PHENYLEPHRIN,

LORATADIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Một số quy trình định lượng đồng thời hai hoặc ba trong số bốn hoạt chấtphenylephrin, paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin bằng phươngpháp HPLC:

• Nghiên cứu trong nước

Bảng 1.5 Các công trình nghiên cứu trong nước

Tài

Bước sóng phát hiện (nm)

Tốc độ dòng (ml/phút)

Thể tích tiêm mẫu (μl)

[6] Paracetamol,

Dextromethorphan HBrLoratadin

ACN - dungdịch TEA 1,5

mM (85:15, tt/tt)

Cột AscentisC8 (250 mm;

4,6 mm; 5μm); nhiệt độphòng

LiChroCartRP18(125 mm; 4,6mm; 5 μm);

Gradient: ACN– Đệm kalidihydrophosphat

pH 2,5

Eclipse XDBC18 (250 mm;

4,6 mm; 5μm); nhiệt độ

35 oC

265

278 1,4 20

• Nghiên cứu ngoài nước

Bảng 1.6 Các công trình nghiên cứu ngoài nước

Tài

Bước sóng phát hiện (nm)

Tốc độ dòng (ml/phút)

Thể tích tiêm mẫu (μl)

-pH 3

Cột C18(250 mm; 4,6mm; 5 μm);

nhiệt độphòng

204 1,4 20

[12] Paracetamol

Dextromethorphan HBrPhenylephrin HCl

Cafein

Gradient: ACN dung dịch natriheptan sulfonat

-Inertsil C8(150 mm; 4,6mm; 5 μm);

nhiệt độphòng

H3PO4)

PerfectSilTarget (150mm; 4,6 mm;

5 μm); nhiệt

độ 30 oC

254220

227 1,2 20

[13] Paracetamol

Phenylephrin HClLoratadin

Methanol : ACN :nước : THF(50:40:10:2,5)

Luna C8(250 mm; 4,6mm; 5 μm)

273247246

0,8 20

[7] Paracetamol

Pseudoephedrin HCl Clorpheniramin maleat

Dextromethorphan HBrChuẩn nội:

Clordiazepoxid

ACN – nước(60:40) (nướcchứa natri dodecylsulfat và TEA,chỉnh pH 2,5 bằng

H3PO4 0,01M vàkali

dihydrophosphat0,01 M)

Hypersil C18(250 mm; 4,6mm; 5 μm);

nhiệt độ

25 oC 203 1,0 10

Nhận xét

Hiện nay, trong Dược điển USP 38, BP 2016, Dược điển Việt Nam IV, và các tàiliệu khác chưa đưa ra quy trình định lượng đồng thời bốn hoạt chất paracetamol,dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương phápHPLC mà chỉ có một số quy trình định lượng riêng lẽ hoặc đồng thời hai hoặc batrong số bốn hoạt chất trên bằng phương pháp HPLC

Các công trình đã công bố này có một số đặc điểm sau:

- Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với cột C8 hoặc C18 cócùng kích thước hạt pha tĩnh 5 μm và chiều dài cột khác nhau

- Sử dụng hệ pha động phân cực gồm một dung môi hữu cơ (acetonitril hoặcmethanol) kết hợp với nước có bổ sung thêm các chất làm cải thiện hình dạng pic,muối tạo cặp ion, chất điều chỉnh pH, …

- Lựa chọn bước sóng phát hiện trong vùng tử ngoại

- pH của dung dịch đệm muối lựa chọn trong khoảng từ 3-5

- Hầu hết các tài liệu tham khảo sử dụng pha động với hệ đệm chứa muối có thể gây

ăn mòn hệ thống, khó rửa cột,… hoặc sử dụng sắc ký tạo cặp ion với pha động có

độ nhớt cao gây ra những khó khăn như áp suất cột cao, thời gian cân bằng giữa phađộng và pha tĩnh diễn ra chậm, khó triển khai chương trình gradient, khó rửa cột

Vì vậy, đề tài tiến hành xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol,dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương phápRP-HPLC với pha tĩnh kém phân cực và pha động phân cực, bước sóng phát hiệntrong vùng tử ngoại Đề tài hạn chế sử dụng các hệ đệm chứa muối và ưu tiên sửdụng pha động gồm dung môi hữu cơ kết hợp với dung dịch nước có chứa các acid,base hữu cơ vừa đóng vai trò tạo pH môi trường vừa là chất cải biến hình dạng pic

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Sản phẩm nghiên cứu: Viên sủi bọt PARAHASAN MULTI SYMPTOMS

Bảng 2.1 Thành phần và công thức của viên sủi bọt nghiên cứu

(mg/viên) Tiêu chuẩn Dược chất

Tá dược

(*) Mất đi trong quá trình pha chế

2.1.2 Dung môi, hóa chất, chất chuẩn

- ACN, MeOH loại dùng cho HPLC (Baker).

- TEA, TFA, acid formic, acid phosphoric, natri butansulfonat, acid nitric, amoniac,

sắt (II) sulfat, hydrogen peroxyd, natri hydroxyd, acid hydrocloric, kalidihydrophosphat, dinatri hydrophosphat đạt tiêu chuẩn phân tích

Bảng 2.2 Thông tin các chất chuẩn

nghiệm thuốcthành phố HồChí Minh

Dextromethorphan HBr QT015 090616 95,80

2.1.3 Trang thiết bị

Bảng 2.3 Danh mục các trang thiết bị sử dụng

1 Máy HPLC Hitachi Chromaster PDA-5430 (Phần mềm xử lý

2 Cân phân tích Shimadzu AUW 120D

(Max = 120 g; Min = 10 mg, e = 1 mg, d = 0,1 mg) Nhật

9 Bộ lọc hút chân không

10 Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu chính xác dùng trong phân tích

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Định tính paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat

2.2.1.1 Định tính paracetamol

- Trong phần định lượng đồng thời 4 hoạt chất bằng HPLC, thời gian lưu của picparacetamol trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồmẫu chuẩn Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic paracetamol trong mẫu thử tương

tự như mẫu chuẩn

- Cho phản ứng đặc trưng của Br- [1]

Hoà tan một lượng chế phẩm có chứa khoảng 3 mg ion bromid trong 5 ml nước,siêu âm khoảng 15 phút, khuấy từ khoảng 15 phút Lọc lấy dịch lọc, acid hoá bằngacid nitric loãng và thêm 0,4 ml dung dịch bạc nitrat 4% Lắc và để yên sẽ tạo tủalổn nhổn Lọc lấy tủa, rửa tủa ba lần, mỗi lần với 1 ml nước Phân tán tủa trong 2 mlnước, thêm 1,5 ml dung dịch amoniac 10 M thì tủa khó tan

2.2.1.3 Định tính phenylephrin bitartrat

- Trong phần định lượng đồng thời 4 hoạt chất bằng HPLC, thời gian lưu của picphenylephrin trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồmẫu chuẩn Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic phenylephrin trong mẫu thử tương

tự như mẫu chuẩn

- Cho phản ứng đặc trưng của bitartrat [1]

Hoà tan một lượng chế phẩm có chứa khoảng 15 mg bitartrat trong 5 ml nước, siêu

âm khoảng 15 phút, khuấy từ khoảng 15 phút Lọc lấy dịch lọc, thêm 0,05 ml dungdịch sắt (II) sulfat 1% và 0,05 ml dung dịch hydrogen peroxyd 10 TT; màu vàngkhông bền vững được tạo thành, sau khi màu vàng biến mất, thêm từng giọt dungdịch natri hydroxyd 2 M, xuất hiện màu xanh tím đến đỏ tía

2.2.1.4 Định tính loratadin

- Trong phần định lượng đồng thời 4 hoạt chất bằng HPLC, thời gian lưu của picloratadin trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫuchuẩn Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic loratadin trong mẫu thử tương tự nhưmẫu chuẩn

2.2.1.5 Thẩm định quy trình định tính: Tính đặc hiệu theo ASEAN 2008 [3], [9]

- Bằng HPLC: tương tự tính đặc hiệu phần định lượng bằng HPLC

- Định tính Br-:

Chuẩn bị các mẫu sau:

+ Mẫu thử: Cân khoảng 2963,2 mg bột thuốc

+ Mẫu chuẩn: Cân khoảng 13,2 mg chuẩn dextromethorphan hydrobromid(tương đương với 3 mg ion bromid)

+ Mẫu placebo: Cân khoảng 2470,9 mg placebo

+ Mẫu thử giả lập không chứa dextromethorphan hydrobromid: Cân khoảng2470,9 mg placebo; thêm các chuẩn paracetamol, phenylephrin bitartrat, loratadin.Thực hiện thí nghiệm với các mẫu trên Quy trình đạt tính đặc hiệu khi:

+ Mẫu placebo và mẫu thử giả lập không chứa dextromethorphanhydrobromid không xuất hiện tủa

+ Mẫu thử và mẫu chuẩn chứa dextromethorphan hydrobromid có xuất hiện

tủa, tủa khó tan trong dung dịch amoniac.

- Định tính bitartrat:

Chuẩn bị các mẫu sau:

+ Mẫu chuẩn: Cân khoảng 31,7 mg chuẩn phenylephrin bitartrat (tương đươngvới 15 mg bitartrat)

+ Mẫu thử: Cân khoảng 8670 mg bột thuốc

+ Mẫu placebo: Cân khoảng 3229,2 mg placebo

+ Mẫu thử giả lập không chứa phenylephrin bitartrat: Cân khoảng 3229,2 mgplacebo; thêm các chuẩn paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin.Thực hiện thí nghiệm với các mẫu trên Quy trình đạt tính đặc hiệu khi:

+ Mẫu placebo và mẫu thử giả lập không chứa phenylephrin bitartrat khôngxuất hiện màu đỏ tía

+ Mẫu thử và mẫu chuẩn chứa phenylephrin bitartrat xuất hiện màu đỏ tía

2.2.2 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA

2.2.2.1 Điều kiện phân tích ban đầu

• Xử lý mẫu

Dung môi pha mẫu: Nước - acetonitril (85:15)

Mẫu chuẩn: Cân chính xác 12,5 mg loratadin; 29,3 mg phenylephrin bitartrat; 37,5

mg dextromethorphan hydrobromid các chất chuẩn cho vào bình định mức 50 ml(bình 1) và định mức cho tới vạch bằng dung môi pha mẫu Cân chính xác 25 mgparacetamol chuẩn cho vào bình định mức 50 ml (bình 2) Hút chính xác 1 ml dungdịch từ bình 1 cho vào bình 2 và định mức bằng dung môi pha mẫu cho tới vạch đểthu được nồng độ các chuẩn paracetamol, dextromethorphan hydrobromid,loratadin, phenylephrin bitartrat về nồng độ tương ứng 0,5000 mg/ml; 0,0150mg/ml; 0,0050 mg/ml; 0,0117 mg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu,siêu âm đuổi khí

Mẫu thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn.

Cân một lượng bột viên tương ứng với khối lượng trung bình viên cho vào bìnhđịnh mức 100 ml, thêm từ từ một lượng khoảng 60 ml dung môi pha mẫu (tránhmẫu sủi mạnh trào ra khỏi bình định mức), chờ cho đến khi mẫu sủi hết, siêu âmtrong khoảng 15 phút, để nguội, định mức cho đến vạch bằng dung môi pha mẫu.Lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu đượccho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu để cónồng độ paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrinbitartrat cuối cùng tương ứng khoảng 0,5000 mg/ml; 0,0150 mg/ml; 0,0050 mg/ml;0,0117 mg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí Tiếnhành sắc ký lần lượt mẫu thử và chuẩn theo điều kiện sắc ký khảo sát

• Điều kiện sắc kýDựa vào cấu trúc hóa học của paracetamol, dextromethorphan hydrobromid,loratadin, phenylephrin bitartrat đều là những chất phân cực có nối đôi liên hợp và

có các nhóm mang màu nên có thể sử dụng kỹ thuật RP-HPLC với pha tĩnh kémphân cực, pha động phân cực và sử dụng đầu dò PDA để định lượng các hoạt chấtnày với điều kiện sắc ký ban đầu như sau:

+ Cột sắc ký: Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm)

+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

+ Thể tích tiêm: 20 μl

+ Nhiệt độ cột: 25 oC

+ Bước sóng phát hiện: lựa chọn bước sóng phát hiện được cả bốn chất và cho tínhiệu tốt nhất

+ Pha động:

o Dung môi A: Acetonitril

o Dung dịch B: Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 3,0 bằng TFA

2.2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Dung môi A (%)

Dung dịch B (%)

Tốc độ dòng (ml/phút)

+ Thay đổi pH và thành phần dung dịch B

Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 2,5 bằng TFA

Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 2,1 bằng TFA

Yêu cầu: Lựa chọn điều kiện sắc ký có các pic đạt các thông số sắc ký theo quy

định Đối với định lượng hỗn hợp đa thành phần, đặc biệt ưu tiên độ phân giải (RS

≥ 1,5), hệ số đối xứng (0,8 ≤ AS ≤ 1,5), độ tinh khiết pic

2.2.2.3 Khảo sát quá trình xử lý mẫu

Sử dụng điều kiện sắc ký xây dựng được để khảo sát quá trình xử lý mẫu:

+ Dung môi pha mẫu: khảo sát 4 dung môi pha mẫu sau:

Yêu cầu: Lựa chọn thời gian siêu âm mẫu có hàm lượng các hoạt chất khác nhau có

ý nghĩa thống kê so với các khoảng thời gian khác

2.2.2.4 Thẩm định quy trình định lượng

Sau khi đã lựa chọn được điều kiện phân tích tối ưu, tiến hành thẩm định quy trình

đã xây dựng được theo hướng dẫn của ASEAN 2008 [4], [9]:

a Tính đặc hiệu

Chuẩn bị dung môi pha mẫu, mẫu giả dược (placebo), mẫu chuẩn riêng lẽ, mẫuchuẩn hỗn hợp, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt:

- Mẫu được oxy hoá bởi hydrogen peroxyd 3% trong 24 giờ: Cân khoảng 3200 mg

bột thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch H2O2 3%,chờ sủi bọt hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch H2O2 3%,,lắc đều Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Lắc đều,lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu đượccho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu Lọcqua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí

- Mẫu thủy phân trong natri hydroxyd 0,5 N trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột

thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch NaOH 0,5 N,chờ sủi bọt hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch NaOH 0,5

N, lắc đều Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Lắcđều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu Hút chính xác 1 ml dịch lọc thuđược cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu.Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí

- Mẫu thủy phân trong acid hydrocloric 0,5 N trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg

bột thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch HCl 0,5 N,chờ sủi bọt hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch HCl 0,5 N,lắc đều Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Lắc đều,lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu đượccho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu Lọcqua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí

- Mẫu chiếu ánh sáng trực tiếp trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải

thành một lớp mỏng trong đĩa petri và để dưới ánh sáng mặt trời trong 48 giờ Sau

đó cho bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu,siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều, lọc quagiấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vàobình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu Lọc qua mànglọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí

- Mẫu chiếu tia UV trong vòng 24 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải thành

một lớp mỏng trong đĩa petri và để dưới đèn UV 254 nm trong 24 giờ Sau đó cho

bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, siêu

âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều, lọc qua giấylọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bìnhđịnh mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu Lọc qua màng lọc0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí

- Mẫu đặt ở nhiệt độ 60 o C trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải thành

một lớp mỏng trong đĩa petri và cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 60 oC ± 2 oC trong 48giờ Sau đó cho bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môipha mẫu, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều,lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu đượccho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu Lọcqua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí

- Mẫu đun cách thủy 60 o C trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho vào

bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, chờ mẫu sủi bọt hết,siêu âm 25 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều Dung dịchsau khi pha được đun cách thủy ở nhiệt độ 60 oC trong 48 giờ Để nguội, lọc quagiấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vàobình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu Lọc qua mànglọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí

Tiến hành sắc ký các loại mẫu theo quy trình phân tích Ghi lại các sắc ký đồ Xácđịnh thời gian lưu, độ tinh khiết của pic, phổ UV của pic hoạt chất cần phân tíchtrong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn

- Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic phải tănglên so với trước khi thêm chuẩn

- Trên sắc ký đồ mẫu thử ở các điều kiện khắc nghiệt, các pic tạp xuất hiện phảitách ra khỏi các pic hoạt chất cần phân tích (độ phân giải RS ≥ 1,5).

- Pic của hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ của các mẫu phải tinh khiết (độtinh khiết pic xấp xỉ 100%) Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic chính trong mẫuthử giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic trong mẫu chuẩn

b Tính thích hợp hệ thống

Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 100% so với nồng độ định lượng trong dãymẫu chuẩn khảo sát tính tuyến tính tiến hành sắc ký 6 lần, ghi lại các sắc ký đồ vàxác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic trung bình và các thông số khác của pic(độ phân giải RS, hệ số đối xứng AS, số đĩa lý thuyết N…)

Yêu cầu:

- Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2,0%

- Các pic phải đạt các thông số sắc ký khác (0,8 ≤ AS ≤ 1,5; RS ≥ 1,5) [4]

Sc, St: Diện tích pic trong mẫu chuẩn, mẫu thử

Dc, Dt: Độ pha loãng của mẫu chuẩn, mẫu thử

mc, mt: lượng cân của mẫu chuẩn, mẫu thử (mg)C%: hàm lượng % của chất chuẩn

MW: khối lượng trung bình viên (mg)T: hàm lượng trên nhãn của hoạt chất trong một viên

Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượnghàm lượng hoạt chất có trong các mẫu