BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN CẢNH THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN, ATORVASTATIN VÀ HAI CHẤT CHUYỂN HÓA ORTHO-HYDROXY AT
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN CẢNH THU
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN, ATORVASTATIN VÀ HAI CHẤT CHUYỂN HÓA
ORTHO-HYDROXY ATORVASTATIN, PARA-HYDROXY
ATORVASTATIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG
Trang 2ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN CẢNH THU
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN, ATORVASTATIN VÀ HAI CHẤT CHUYỂN HÓA
ORTHO-HYDROXY ATORVASTATIN, PARA-HYDROXY
ATORVASTATIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Nguyễn Cảnh Thu
Trang 4
Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2015 – 2017
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 60 72 04 10
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN,
ATORVASTATIN VÀ HAI CHẤT CHUYỂN HÓA ORTHO-HYDROXY
ATORVASTATIN, PARA-HYDROXY ATORVASTATIN
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS
Nguyễn Cảnh ThuHướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn
Từ khóa: LC-MS/MS, amlodipin, atorvastatin, ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy
atorvastatin
Mở đầu: Các dạng thuốc kết hợp amlodipin và atorvastatin được sử dụng để điều trị huyết
áp cao, đau thắt ngực, giảm nguy cơ đột quỵ và các biến chứng tim mạch Trên thế giới đã
có một số công trình định lượng đồng thời amlodipin, atorvastatin và chất chuyển hóatrong dịch sinh học bằng các kỹ thuật khác nhau Tuy nhiên cho đến nay chưa có nghiêncứu nào trong nước công bố quy trình định lượng đồng thời amlodipin, atorvastatin và haichất chuyển hóa của atorvastatin trong huyết tương người Do đó, đề tài này được thựchiện với mục tiêu xây dựng quy trình định lượng đồng thời amlodipin, atorvastatin và hai
chất chuyển hóa ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin trong huyết tương
người bằng kỹ thuật LC-MS/MS để có thể ứng dụng trong nghiên cứu sinh khả dụng và
đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa amlodipin và atorvastatin
Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu huyết tương người chứa hỗn hợp amlodipin, atorvastatin
và hai chất chuyển hóa ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin Phương
pháp nghiên cứu: Mẫu huyết tương giả lập chứa các chất phân tích cùng chuẩn nội
rosuvastatin được xử lý bằng các phương pháp như tủa protein với methanol, acetonitril,chiết lỏng-lỏng với tert-butyl methyl ether, ethyl acetat Mẫu sau khi xử lý sẽ được địnhlượng bằng kỹ thuật LC-MS/MS Sau cùng, quy trình định lượng được thẩm định theohướng dẫn của FDA và EMA về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học
Kết quả: Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời amlodipin, atorvastatin và hai
chất chuyển hóa của atorvastatin trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS.Phương pháp chiết lỏng-lỏng với hỗn hợp tert-butyl methyl ether và ethyl acetat (50:50)cho hiệu suất chiết trên 75% Điều kiện sắc ký bao gồm cột Gemini C18 (150 x 2 mm; 3µm), pha động acetonitril và đệm amoni acetat 10 mM, pH 3,5 (52:48) Qui trình đã đượcthẩm định đạt yêu cầu chung của một qui trình phân tích mẫu trong dịch sinh học
Kết luận: Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời amlodipin, atorvastatin và hai
chất chuyển hóa của atorvastatin trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS Quitrình có thể được ứng dụng để đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm chứaamlodipin và atorvastatin
Trang 5
Master’s Thesis – Academic course: 2015 – 2017
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 60 72 04 10
DEVELOPMENT OF A LC-MS/MS METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF AMLODIPINE, ATORVASTATIN
AND ITS ORTHO-HYDROXY ATORVASTATIN AND PARA-HYDROXY
ATORVASTATIN METABOLITES IN HUMAN PLASMA
Nguyen Canh ThuSupervisor: Assoc Prof Dr Nguyen Duc Tuan
Keywords: LC-MS/MS, amlodipine, atorvastatin, ortho-hydroxy atorvastatin,
para-hydroxy atorvastatin
Introduction: The combination drugs of amlodipine and atorvastatin are being used to
treat hypertension, angina, to lower the risk of stroke, and cardiovascular complication.There have been several studies on simultaneous quantitative determination of amlodipine,atorvastatin and its metabolites in biological fluids by various techniques However, therehave been no published local studies on quantitative procedure for amlodipine,atorvastatin, and metabolites so far Therefore, the aim of this study was to develop a
simultaneous quantitative procedure of amlodipine, atorvastatin and two metabolites hydroxy atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin in human plasma by LC-MS/MS that can
ortho-be applied for bioavailability study and bioequivalence assessment of the pharmaceuticalscontaining amlodipine and atorvastatin
Materials and methods: Object of study: Human plasma samples containing the mixture
of amlodipine, atorvastatin and two metabolites ortho-hydroxy atorvastatin and hydroxy atorvastatin Methods of study: Human plasma samples containing the analytes
para-and rosuvastatin as internal stpara-andard, was treated by protein precipitation with methanol,acetonitrile or liquid-liquid extraction with tert-butyl methyl ether and ethyl acetate Theextracted samples was then determined by LC-MS/MS Finally, the assay procedure wasvalidated on the basis of guideline on bioanalytical method validation by FDA and EMA
Results: The procedure for simultaneous assay of amlodipine, atorvastatin and its
metabolites in human plasma by LC-MS/MS was developed Liquid-liquid extractionmethod with a mixture of tert-butyl methyl ether and ethyl acetate (50:50) used as theextractant, which gave extraction recovery of above 75% The chromatographic separationwas achieved on a Gemini C18 (150 x 2 mm; 3 µm) column with the mobile phasecontaining acetonitrile and ammonium acetate buffer 10 mM, pH 3.5 (52:48) Theprocedure was successfully validated with general recommendations for a bioanalyticalprocedure
Conclusion: The procedure for simultaneous assay of amlodipine, atorvastatin with two
metabolites in human plasma by LC-MS/MS was developed The procedure can be appliedfor bioequivalence assessement of combination products containing amlodpine andatorvastatin
Trang 6
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1.TỔNGQUANVỀAMLODIPIN 3
1.2.TỔNGQUANVỀATORVASTATIN 5
1.3.TỔNGQUANVỀSẮCKÝLỎNGKHỐIPHỔLC-MS/MS 9
1.4 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNHLƯỢNG THUỐCTRONG DỊCH SINH HỌCTHEOHƯỚNGDẪNUS-FDAVÀEMA 14
1.5 TỔNG QUAN CÁC CÔNG TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPINVÀATORVASTATINTRONGHUYẾTTƯƠNGNGƯỜI 19
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1.NGUYÊNVẬTLIỆU-ĐỐITƯỢNGNGHIÊNCỨU 24
2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 26
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33
3.1.KHẢOSÁTĐIỀUKIỆNKHỐIPHỔ 33
3.2.KHẢOSÁTCHẤTCHUẨNNỘI 34
3.3.KHẢOSÁTĐIỀUKIỆNSẮCKÝ 35
3.4.KHẢOSÁTQUYTRÌNHXỬLÝMẪU 40
3.5.XÁCĐỊNHKHOẢNGNỒNGĐỘĐỊNHLƯỢNG 46
Trang 7
3.6 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG AM, AT,
O-AT,P-ATTRONGHUYẾTTƯƠNGNGƯỜIBẰNGLC-MS/MS 46
3.7 DỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN, ATORVASTATIN VÀ HAI CHẤT CHUYỂN HÓA O-AT, P-AT TRONG HUYẾTTƯƠNGNGƯỜIBẰNGKỸTHUẬTLC-MS/MS 55
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 59
4.1.KỸTHUẬTPHÂNTÍCHÁPDỤNGCHOQUYTRÌNH 59
4.2 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG AM, AT, O-AT, P-AT TRONG HUYẾT TƯƠNGNGƯỜI 59
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64
5.1.KẾTLUẬN 64
5.2.KIẾNNGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
Trang 8
o-AT Ortho-hydroxy atorvastatin
p-AT Para-hydroxy atorvastatin
Cmax Maximum plasma concentration Nồng độ đỉnh trong huyết tương
CV Coefficient of variation Hệ số phân tán
EMA European Medicines Agency Cơ quan Dược phẩm châu Âu
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HQC High quality control Kiểm chứng nồng độ cao
Trang 9
LC-MS/MS Liquid chromatography - tandem
mass spectrometry
Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ
LLE Liquid-liquid extraction Chiết lỏng-lỏng
LLOQ Lower limit of quantitation Giới hạn định lượng dưới
LQC Low quality control Kiểm chứng nồng độ thấpMF
MQC
Matrix FactorMedium quality control
Hệ số ảnh hưởng nền mẫuKiểm chứng nồng độ trung bình
ULOQ Upper Limit of Quantitation Giới hạn định lượng trên
RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
TBE Tert-butyl methyl ether
Trang 10
Trang
Bảng 1.1 So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA 19
Bảng 1.2 Nồng độ tối đa (Cmax) của AM, AT, o-AT, p-AT trong huyết tương người theo tài liệu tham khảo 22
Bảng 1.3 Tóm tắt các quy trình định lượng đồng thời amlodipin và atorvastatin trong huyết tương người 23
Bảng 2.1 Dung môi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 25
Bảng 2.2 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 25
Bảng 2.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 26
Bảng 2.4 Cách pha hỗn hợp chuẩn 26
Bảng 2.5 Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương người 29
Bảng 3.1 So sánh hiệu suất chiết với 2 dung môi tủa protein 41
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát các dung môi chiết 42
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tỉ lệ hỗn hợp dung môi chiết 43
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát nồng độ H3PO4 thêm vào 43
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát số lần chiết 44
Bảng 3.6 Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương 46
Bảng 3.7 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống 46
Bảng 3.8 Kết quả xác định tính đặc hiệu 47
Bảng 3.9 Mối tương quan giữa giá trị nồng độ và tỷ số diện tích pic (S/SIS) 48
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát tính tương thích của phương trình hồi quy và ý nghĩa của các hệ số của phương trình hồi quy 49
Bảng 3.11 Kết quả kháo sát độ đúng và độ chính xác trong ngày và giữa các ngày 50
Bảng 3.12 Tỷ lệ thu hồi của các chất phân tích trong huyết tương người (n = 6) 51
Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ ổn định của các chất phân tích trong huyết tương người (n=6) 52
Trang 11
Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch gốc các chất phân tích và
chuẩn nội được bảo quản ở nhiệt độ -20 oC (n=6) 53
Bảng 3.15 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu 53
Bảng 3.16 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất mang 54
Bảng 3.17 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 56
Bảng 3.18 Nồng độ giai mẫu chuẩn 56
Bảng 3.19 Nồng độ lý thuyết của giai mẫu chuẩn và mẫu kiểm chứng 57
Trang 12
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Công thức cấu tạo amlodipin 3
Hình 1.2 Công thức cấu tạo atorvastatin 5
Hình 1.3 Công thức cấu tạo ortho-hydroxy atorvastatin 8
Hình 1.4 Công thức cấu tạo para-hydroxy atorvastatin 9
Hình 1.5 Kỹ thuật ion hóa phun điện tử 10
Hình 1.6 Bộ tách khối phổ một tứ cực 11
Hình 1.7 Bộ tách khối phổ hai tứ cực 12
Hình 1.8 Bộ phận phân tích khối phổ máy Shimadzu LCMS-8040 13
Hình 3.1 Phổ khối của AM (A), AT (B), o-AT (C), p-AT (D), RSU (E), felodipin (F) 34
Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát chất chuẩn nội 34
Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát với hệ pha động methanol - đệm amoni format 10 mM pH 3,5 với các tỉ lệ 52:48 (A), 76:24 (B), 80:20 (C), hệ pha động ACN - đệm amoni format 10 mM pH 3,5 tỉ lệ 52:48 (D) 35
Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát với hệ pha động ACN - đệm amoni format pH 3,5 có nồng độ thay đổi 5 mM (A), 10 mM (B), 15 mM (C), 20 mM (D) 36
Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát với hệ pha động ACN - đệm amoni format 10 mM có pH thay đổi: pH 5 (A), pH 4 (B), pH 3,5(C), pH 3 (D) 37
Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát với hệ pha động ACN - đệm amoni format 10 mM pH 3,5 sử dụng các cột khác nhau: 38
Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ cột thay đổi: 30 oC (A), 35 oC (B), 40 oC (C) 39
Hình 3.8 Sắc ký đồ khảo sát tủa bằng acetonitril (A), tủa bằng methanol (B) 41
Hình 3.9 Sắc ký đồ khảo sát với nồng độ H3PO4 2% 44
Hình 3.10 Sắc ký đồ huyết tương trắng (A), nồng độ MQC các chất phân tích (B) theo quy trình chiết đề xuất 45
Trang 13
LLOQ (B) 48
Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ các chất phân tích trong huyết tương và tỷ số diện tích pic 49
Trang 14
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, bệnh tim mạch đã và đang là một gánh nặng cho xã hội với tỷ lệ tử vongcao hàng đầu trên toàn thế giới và chiếm nhiều nhất ở các nước đang phát triển.Tăng huyết áp và rối loạn lipid máu là hai trong số các yếu tố nguy cơ gây bệnh timmạch phổ biến nhất và thường xảy ra đồng thời Hơn 64% bệnh nhân tăng huyết ápcũng có rối loạn lipid máu; ngược lại, khoảng 47% bệnh nhân bị rối loạn lipid máu
Hiện nay, thị trường Việt Nam đang lưu hành thuốc kết hợp amlodipin vàatorvastatin được sản xuất trong nước với giá thành rẻ hơn so với các thuốc ngoạinhập Để đánh giá khả năng thay thế thuốc phát minh bằng bất kỳ thuốc tương đồngnào khác cần thử nghiệm chứng minh tương đương sinh học với thuốc biệt dượcgốc [3] Nồng độ amlodipin, atorvastatin và các chất chuyển hóa rất thấp tronghuyết tương người đòi hỏi phương pháp định lượng phải có độ nhạy cao, đặc hiệu,chính xác
Trên thế giới đã có một số công trình định lượng đồng thời amlodipin, atorvastatin
và chất chuyển hóa trong huyết tương người bằng các kỹ thuật khác nhau[10],[15],[20],[22],[27],[28] Tuy nhiên cho đến nay chưa có phương pháp địnhlượng đồng thời amlodipin, atorvastatin và chất chuyển hóa trong huyết tương
Trang 15
người được công bố ở Việt Nam Vì những lý do trên, đề tài “XÂY DỰNG QUY
TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN, ATORVASTATIN VÀ
HAI CHẤT CHUYỂN HÓA ORTHO-HYDROXY ATORVASTATIN,
PARA-HYDROXY ATORVASTATIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ
THUẬT LC-MS/MS” được thực hiện để góp phần vào việc đánh giá tương đương
sinh học của các chế phẩm chứa amlodipin và atorvastatin Mục tiêu của đề tài là:
- Xác định điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ thích hợp
- Xây dựng quy trình chiết amlodipin, atorvastatin và hai chất chuyển hóa hydroxy atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin trong huyết tương người.
ortho Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời amlodipin, atorvastatin và
hai chất chuyển hóa ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin trong
huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS Việc thẩm định được thực hiện theotài liệu hướng dẫn của FDA và EMA về thẩm định phương pháp phân tích mẫu sinhhọc [13],[14]
Trang 16
Công thức cấu tạo [17]:
Hình 1.1 Công thức cấu tạo amlodipin
Công thức phân tử: C20H25ClN2O5
Danh pháp: 2-[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2-clorophenyl)-1,4-dihydro-6-
methyl-3,5-pyridinedicarboxylic acid 3-ethyl 5-methyl ester
Khối lượng phân tử: 408,88 g/mol.
Khối lượng chính xác: 408,15 g/mol.
Dẫn xuất benzensulfonat của amlodipin:
+ Tên thường: Amlodipin besylat
+ Công thức phân tử: C20H25ClN2O5 C6H5SO3H
+ Khối lượng phân tử: 567,1 g/mol
1.1.2 Tính chất lý hóa amlodipin besylat
Mô tả: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng [17].
Tính tan: Dễ tan trong methanol, tan hạn chế trong ethanol, khó tan trong nước và
Trang 17Độ ổn định:
Amlodipin có cấu trúc 1,4-dihydropyridin, bị oxy hóa khi tiếp xúc với ánh sáng trựctiếp tạo ra một dẫn chất pyridin Hàm lượng dẫn chất xuất hiện trong nguyên liệuamlodipin là 10% sau 8 giờ tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên và sau 5 giờ tiếp xúc vớiánh sáng nhân tạo Với dạng viên nén chứa amlodipin, hàm lượng amlodipin sẽgiảm 10% sau khi tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên 46 giờ và ánh sáng nhân tạo trong
Có thể dùng amlodipin để điều trị tăng huyết áp ở người bệnh đái tháo đường.Amlodipin có tác dụng chậm nên ít có nguy cơ hạ huyết áp cấp hoặc nhịp nhanhphản xạ [2]
Amlodipin có tác dụng chống đau thắt ngực, thời gian chống đau kéo dài 24giờ Người bệnh có thể dùng phối hợp với thuốc chẹn beta và nitrat trong điều trịđau thắt ngực [2]
Dược động học
Sau khi uống, amlodipin được hấp thu tốt, sinh khả dụng của amlodipin khi uốngkhoảng 60-80% và không bị ảnh hưởng bởi thức ăn Nồng độ đỉnh trong huyếttương đạt được sau 6 đến 12 giờ Nửa đời trong huyết tương từ 30-40 giờ Nồng độ
ổn định trong huyết tương đạt được 7 đến 8 ngày sau khi uống thuốc mỗi ngày mộtlần Thể tích phân bố xấp xỉ 21 lít/kg thể trọng và thuốc liên kết với protein huyết
Trang 18
tương cao (trên 98%) Ðộ thanh thải trong huyết tương tới mức bình thường vàokhoảng 7 ml/phút/kg thể trọng do bài tiết chủ yếu thông qua chuyển hóa trong gan.Các chất chuyển hóa qua gan bị mất hoạt tính và bài tiết qua nước tiểu Ở người suygan, thời gian bán hủy của amlodipin tăng, vì vậy có thể cần phải giảm liều hoặckéo dài thời gian giữa các liều dùng [2]
Người lớn: Điều trị bệnh đau thắt ngực và cao huyết áp với liều khởi đầu thường là
5 mg x 1 lần/ngày; Có thể tăng đến liều tối đa đến 10 mg tùy theo đáp ứng của bệnhnhân Bệnh nhân suy gan liều điều trị thấp hơn Không cần điều chỉnh liều khi dùngđồng thời với thuốc lợi tiểu, thuốc ức chế beta và thuốc ức chế men chuyển [2]
Chống chỉ định
Quá mẫn với amlodipin hoặc các dẫn xuất dihydropyridin
Phụ nữ có thai và cho con bú [2]
1.2 TỔNG QUAN VỀ ATORVASTATIN
1.2.1 Cấu trúc
Công thức cấu tạo[17]:
Hình 1.2 Công thức cấu tạo atorvastatin
Trang 19Khối lượng chính xác: 558,25 g/mol.
Dạng muối của atorvastatin:
+ Tên thường: atorvastatin calci
+ Công thức phân tử: C66H68CaF2N4O10
+ Khối lượng phân tử: 1155,36 g/mol
1.2.2 Tính chất lý hóa atorvastatin calci
Mô tả: Bột tinh thể màu trắng hoặc gần như trắng; Có thể tồn tại ở trạng thái kết
tinh hoặc vô định hình; Dạng kết tinh ổn định hơn dạng vô định hình [17]
Tính tan: Rất ít tan trong nước, ít tan trong ethanol 96%, acetonitril, dễ tan trong
methanol, aceton, cloroform, thực tế không tan trong methylen clorid [17]
1.2.3 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng
Tác dụng dược lý
Atorvastatin thuộc nhóm statin, ức chế HMG-CoA reductase Statin là những chất
ức chế cạnh tranh với hydroxyl-methylglutaryl coenzym (HMG-CoA) reductase,làm ngăn cản sự chuyển HMG-CoA thành mevalonat, tiền chất của cholesterol.Atorvastatin có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol, làm giảm cholesteroltrong tế bào gan, kích thích tổng hợp thụ thể LDL và qua đó làm tăng vận chuyểnLDL từ máu Kết quả cuối cùng là giảm nồng độ cholesterol trong huyết tương [2].
Trang 20
Dược động học
Atorvastatin hấp thu nhanh sau khi uống Thời gian đạt nồng độ đỉnh 1-2 giờ Trong
cơ thể, atorvastatin được chuyển hóa mạnh lần đầu ở gan bởi cytocrom P450
(CYP), chủ yếu do isoenzym CYP 3A4 thành các chất có hoạt tính là ortho-hydroxy atorvastatin và para-hydroxy atorvastatin Chất chuyển hóa ortho-hydroxy
atorvastatin xuất hiện sớm trong máu với nồng độ đỉnh đạt được thấp hơn 2-3 lần sovới atorvastatin và tăng không đáng kể khi dùng nhiều lần Trong khi đó nồng độ
đỉnh của para-hydroxy atorvastatin đạt được thấp hơn 50 lần so với atorvastatin và
đạt được chậm hơn nhiều sau liều duy nhất, đặc biệt với liều 40 mg atorvastatin[25]
Trong thử nghiệm in vitro, sự giảm ức chế HMG-CoA reductase bởi 2 thành phần
chuyển hóa này là tương tự như atorvastatin Khoảng 70% ức chế HMG-CoA là do
tác động của hai chất chuyển hóa ortho-hydroxy atorvastatin và para-hydroxy
atorvastatin
Atorvastatin liên kết > 98% với protein huyết tương, phân bố chủ yếu ở gan, ngoài
ra còn phân bố ở lách và tuyến thượng thận [2]
Atorvastatin và các chất chuyển hóa được thải trừ chủ yếu qua mật sau quá trìnhchuyển hóa mạnh ở gan Thời gian bán thải trong huyết tương dài khoảng 14 giờnên atorvastatin có thể tích lũy trong huyết tương Atorvastatin đào thải qua thận <2% [2],[6]
Chỉ định
Giảm nồng độ cholesterol toàn phần ở người tăng cholesterol máu
Ngăn ngừa các biến cố tim mạch, giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim và làm chậm quátrình xơ vữa mạch vành [2]
Trang 21Có thể uống thuốc vào bất kỳ thời điểm nào trong ngày nhưng thường uống vàobuổi tối để tăng hiệu lực điều trị Bệnh nhân cần tuân theo chế độ ăn chuẩn ítcholesterol trước khi uống thuốc và duy trì chế độ ăn này trong suốt thời gian điềutrị Tránh phối hợp với dẫn xuất acid fibric Điều chỉnh theo nhu cầu và đáp ứng củabệnh nhân [2]
Chống chỉ định
Mẫn cảm với thành phần của thuốc
Chưa xác định mức độ an toàn và hiệu lực điều trị ở trẻ dưới 9 tuổi
Không dùng cho phụ nữ mang thai và cho con bú
Không dùng với bệnh nhân bị bệnh gan tiến triển, tăng men gan không rõ nguyên
nhân [2].
1.2.4 Chất chuyển hóa của atorvastatin
Ortho-hydroxy atorvastatin
Công thức cấu tạo [9]:
Hình 1.3 Công thức cấu tạo ortho-hydroxy atorvastatin
Công thức phân tử: C33H35FN2O6
Danh pháp:
7-[2-(4-fluorophenyl)-4-[(2-hydroxyphenyl)-C-hydroxy-carbonimido-yl] -3-phenyl-5-(propan-2-yl)-1H-pyrrol-1-7-[2-(4-fluorophenyl)-4-[(2-hydroxyphenyl)-C-hydroxy-carbonimido-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic acid
Khối lượng phân tử: 574,64 g/mol.
Khối lượng chính xác: 574,25 g/mol.
Tính chất lý hóa
- Mô tả: Bột tinh thể màu vàng nhạt.
- Tính tan: Rất ít tan trong nước, ít tan trong ethanol 96%, tan trong methanol [9],
Trang 22- Giá trị pKa: 4,35 [32].
Para-hydroxy atorvastatin
Công thức cấu tạo [9]:
Hình 1.4 Công thức cấu tạo para-hydroxy atorvastatin
Công thức phân tử: C33H35FN2O6
Danh pháp:
7-[2-(4-fluorophenyl)-4-[(4-hydroxyphenyl)carbamoyl]-3-phenyl-5-(propan-2-yl)-1H-pyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic acid
Khối lượng phân tử: 574,64 g/mol.
Khối lượng chính xác: 574,25 g/mol.
Tính chất lý hóa
- Mô tả: Bột tinh thể màu vàng nhạt.
- Tính tan: Rất ít tan trong nước, ít tan trong ethanol 96%, tan trong methanol [9],
Trang 23
Để khắc phục khó khăn trên, cần phải sử dụng giao diện là bộ phận tạo nguồn ion
Có nhiều kỹ thuật tạo nguồn ion như ion hóa bằng bắn phá điện tử (EI), ion hóa hóahọc (CI), bắn phá nhanh nguyên tử dòng liên tu ̣c (CF – FAB), ion hóa phun điện tử(ESI), ion hóa hóa ho ̣c ở áp suất khí quyển (APCI), ion hóa trường (FI), … Tùythuộc vào khối lượng phân tử và đặc tính lý hóa của chất phân tích sẽ chọn bộ phậnion hóa thích hợp [4]
1.3.2 Kỹ thuật ion hóa
Giao diện thông dụng cho hệ thống LC-MS/MS là ESI và APCI Trong đề tài này,
kỹ thuật ion hóa phun điện tử sẽ được áp dụng
Kỹ thuật ESI (Electrospray Ionization)
Trong kỹ thuật ESI, dòng chất lỏng đi ra từ máy sắc ký lỏng sẽ được phun qua mộtống mao quản dưới dạng hạt rất nhỏ (phun sương) bởi dòng khí N2, quá trình phunsương được áp thế rất cao và tạo thành các mảnh ion Khi dung môi bay hơi ở ápsuất thường bởi dòng khí khô N2 , ion phân tích sẽ tách khỏi các hạt bởi lực tĩnhđiện và được đưa đến bộ phận tách ion [4],[11] (hình 1.5)
Ion
Ống mao quản Khí phun sương Khí nitơ
Hình 1.5 Kỹ thuật ion hóa phun điện tử
- Các yêu cầu đối với chất phân tích khi áp dụng kỹ thuật ESI [4],[11]:
+ Chất phân tích nhất thiết phải tồn tại dạng ion, tan trong dung dịch dùng để phunsương
+ Chất phân tích không cần bay hơi
+ Chất phân tích không cần bền với nhiệt
Trang 24
1.3.3 Bộ phận tách ion
Các ion tạo thành ở bộ phận ion hóa có m/z khác nhau sẽ được tách theo số khốinhờ bộ phận từ trường, điện trường Một số loại tiêu biểu như sau:
- Khối phổ bẫy ion IT (Ion trap)
- Khối phổ TOF (Time of flight)
- Khối phổ tứ cực (Quadrupole)
Trong đề tài này, bộ phận tách ion kiểu tứ cực đã được sử dụng
Bộ phận tách khối một tứ cực (Single quadrupole)
Gồm 2 cặp thanh hình trụ được đặt song song, từng cặp 2 thanh chéo nhau được nốiđiện với nhau Một hiệu điện thế gồm vừa điện một chiều (U) và điện xoay chiều(V.cos.ωt) được tạo thành, những ion có động năng thích hợp mới đi qua thanh trụđến bộ phận nhận tín hiệu, những ion có động năng khác sẽ va chạm vào thanh trụ[4],[21] (hình 1.6)
Bộ phận tách khối hai tứ cực (Triple quadrupole)
Gồm ba bộ tứ cực nối với nhau (Q1Q2Q3) trong đó Q1 và Q3 có cấu trúc giốngnhau như một tứ cực, có tác dụng chọn lọc ion Tại Q2 (có vai trò tạo ra sự phân lyion do va chạm), các ion ban đầu sẽ bị va chạm tạo thành các ion phân mảnh [21](hình 1.7)
3 310 10 Nguồn
Ion cộng hưởng Ion không cộng hưởng
Hiệu điện thế một chiều và xoay chiều
Đầu dò
Ion không cộng hưởng
Hình 1.6 Bộ tách khối phổ một tứ cực
Trang 25
331010
Bộ phận phun sương
Ống mao quản
Buồng chân không
Bộ phận phát hiện
Buồng va chạm (Q2)
Hình 1.7 Bộ tách khối phổ hai tứ cực 1.3.4 Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ
Kỹ thuật full scan
Khi thao tác với kỹ thuật full scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để chophổ khối toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thườngdùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Mỗi pic trênsắc ký đồ đều có một phổ khối Kỹ thuật này có độ nhạy không cao, nhiễu đườngnền có thể lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, kỹ thuật full scan thường được
lựa cho ̣n để khảo sát ion phân tử (parent ion) [21]
Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM – Selected ion monitoring)
Trong kỹ thuật SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưngcho chất cần xác định Phổ khối SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọntrước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn
Kỹ thuật SIM làm giảm bớt nhiễu đường nền so với kỹ thuật full scan nên làm tăng
SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh
ra, cô lập 1 mảnh ion phân mảnh cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện [19]
MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mă ̣t kỹ thuâ ̣t đối với phân tích vi lượng nên các
Trang 26
ion phân mảnh cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vâ ̣y kỹ thuâ ̣t ghi phổ MRMthông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lâ ̣p ion cần cho ̣n (ion phân tử) ở tứ cực thứ nhất,phân mảnh ion cô lâ ̣p đó ta ̣i tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va cha ̣m) thu được cácion phân mảnh, cô lập 2 hoă ̣c nhiều ion phân mảnh cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và
đưa vào đầu dò để phát hiê ̣n MRM giảm đáng kể nhiễu đường nền, giúp xác địnhcấu trúc và định lượng tốt hơn trên các nền mẫu phức tạp [8]
1.3.5 Vài nét về máy Shimadzu LCMS-8040
LCMS-8040 sử dụng công nghệ UFsweeper II Collision Cell là một tế bào va chạmhình chữ nhật cho phép cải thiện hiệu suất của sự va chạm, cho tín hiệu ion phânmảnh (product ion) nhanh hơn và tốt hơn, mang lại độ chính xác định lượng cao và
độ tin cậy ngay cả ở các mức phát hiện thấp [33]
Tối ưu hóa MRM trong các hệ thống LCMS của Shimadzu được dựa trên một loạtcác phân tích tự động và chỉ cần vài phút để thực hiện Nhiều hợp chất có thể đượctối ưu hóa liên tiếp mà không cần giám sát [33]
Trong LCMS-8040, nhiệt độ và tốc độ dòng khí dễ dàng được kiểm soát thông quaphần mềm Vị trí kim ESI được cài đặt và điều chỉnh dễ dàng bằng nút bấm màkhông cần dụng cụ đặc biệt hoặc tháo gỡ các đầu dò Ngoài ra, các ống mao quảnđược thiết kế dạng hình nón để làm giảm sự tắc nghẽn mẫu, cho kết quả kiểm tra độnhiễu và tín hiệu phân tích chính xác [33]
3
310
10
Q1 Ion không cộng hưởng
3
310
10 Ion
Khí nitơ
Ion không cộng hưởng
Đầu dò
Ion không cộng hưởng Ion
Ống mao quản
Khí phun sương
Khí nitơĐầu dò
Ống mao quản
Buồng va chạm
Khí nitơ
Bộ phận phun sương
Bộ phận phun sương
Ống mao quản
Buồng chân không
Q1 Chọn lọc ion phân tử (parent ion)
Bộ phận phát hiện
Buồng va chạm (Collision Cell)
Q3 Chọn lọc ion phân mảnh (product ion)
Ống mao quản
Hình 1.8 Bộ phận phân tích khối phổ máy Shimadzu LCMS-8040
Trang 27
1.4.1.2 Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu là khả năng phương pháp phân tích có thể phân biệt và xác định đượcchất phân tích trong nền mẫu gồm nhiều thành phần khác nhau Để xác định tínhđặc hiệu, tiến hành phân tích các mẫu trắng từ ít nhất 6 nguồn cung cấp dịch sinhhọc thích hợp (huyết tương, nước tiểu hoặc những loại dịch sinh học khác) Mỗimẫu trắng nên được kiểm tra về độ nhiễu ở giới hạn định lượng dưới (LLOQ) [14].Các chất gây nhiễu trong dịch sinh học bao gồm các thành phần nội sinh, các chấtchuyển hóa, các sản phẩm phân hủy hay các thuốc dùng đồng thời với thuốc đangnghiên cứu nếu có [14]
1.4.1.3 Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ thu hồi của một chất phân tích trong định lượng là đáp ứng ghi nhận được từmột lượng chất phân tích biết trước thêm vào và chiết ra từ nền mẫu dịch sinh học,được so sánh với đáp ứng từ nồng độ thực của chất phân tích Tỷ lệ thu hồi là hiệusuất chiết của phương pháp phân tích trong một giới hạn nhất định Tỷ lệ thu hồicủa chất chiết được không nhất thiết phải là 100% nhưng phải đúng và có tính lặplại
Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh tín hiệu đáp ứng của chất phân tích chiếtđược từ mẫu thử tự tạo ở 3 mức nồng độ: nồng độ thấp (LQC) gấp 3 lần LLOQ,nồng độ trung bình (MQC) ở giữa đường chuẩn, và nồng độ cao (HQC) có giá trị
Trang 28
khoảng 75-80% của ULOQ với tín hiệu đáp ứng của mẫu chuẩn không chiết (mẫuđối chiếu có nồng độ tương ứng được pha trong dung môi) [14]
1.4.1.4 Tính tuyến tính và đường chuẩn
Đường chuẩn phản ánh mối quan hệ định lượng giữa đáp ứng của thiết bị phát hiện
và nồng độ biết trước của chất phân tích [13],[14]
Để xây dựng đường chuẩn cho từng chất phân tích, các mẫu thử cần được chuẩn bịtrên cùng một loại nền mẫu dịch sinh học như mẫu thử trong nghiên cứu bằng cáchtrực tiếp thêm chất phân tích và chuẩn nội đã biết trước nồng độ vào nền mẫu Nồng
độ của chất đối chiếu dùng xây dựng đường chuẩn phải dựa vào phạm vi định lượngđược dự đoán trong nghiên cứu thực tế [13],[14]
Một giai mẫu của đường chuẩn bao gồm từ 6 đến 8 mẫu không bao gồm mẫu trắng(nền mẫu được xử lý không có chuẩn nội) và mẫu không (nền mẫu được xử lý cócho thêm chuẩn nội) nhưng bao gồm giới hạn định lượng dưới (LLOQ) Mối quan
hệ tuyến tính này được thể hiện bằng một mô hình toán học phù hợp và đơn giảnnhất có thể [13],[14] EMA quy định các đường chuẩn xây dựng được trong suốtquá trình thẩm định phải được báo cáo Mẫu chuẩn ở nồng độ LLOQ có yêu cầu độlệch không quá 20% so với nồng độ lý thuyết và không quá 15% ở các nồng độkhác [14]
Tiêu chuẩn chấp nhận hoặc loại bỏ: Yêu cầu ít nhất 4 trong số 6 mẫu chuẩn (khácmẫu trắng và mẫu không) phải đáp ứng yêu cầu về độ lệch này, bao gồm cả LLOQ
và ULOQ Có thể loại bỏ các mẫu chuẩn không đạt mà không làm thay đổi mô hìnhtuyến tính đã được xây dựng [14]
Trang 29
dựng Giá trị trung bình đo được phải nằm trong giới hạn ± 15% giá trị thực biếttrước ở 3 mức nồng độ LQC, MQC, HQC và ± 20% ở mức nồng độ LLOQ [13]
Độ chính xác
Độ chính xác của một phương pháp phân tích phản ánh sự sát gần của từng giá trị
đo đơn lẻ của chất phân tích được đo lặp lại nhiều mẫu bằng phương pháp đượcchọn từ một mẫu chung đồng nhất [13]
Độ chính xác được xác định bằng cách phân tích ít nhất 5 lần trên mỗi nồng độ, ở 4mức nồng độ (LLOQ, LQC, MQC, HQC) trong khoảng xác định nồng độ được xâydựng Các giá trị đo cho độ phân tán không quá 15% ở 3 mức nồng độ LQC, MQC,HQC và không quá 20% ở mức nồng độ LLOQ [13]
Độ đúng và độ chính xác được xác định ở 2 yêu cầu: trong ngày và giữa các ngày
để đánh giá độ lặp lại của phương pháp theo thời gian và ảnh hưởng của các yếu tố
về kiểm nghiệm viên, thiết bị, hóa chất, thuốc thử và phòng thí nghiệm… đếnphương pháp [13]
Độ đúng và độ chính xác có thể được xác định cùng lúc với cùng một mẫu, sử dụng
hệ số phân tán (CV) hay độ lệch chuẩn tương đối (RSD) để đánh giá độ chính xác
1.4.1.6 Giới hạn định lượng dưới
Điểm thấp nhất của đường chuẩn nên được chấp nhận như giới hạn định lượng dướinếu như tín hiệu đáp ứng của nó so với tín hiệu đáp ứng của mẫu trắng ít nhất bằng
5 lần (tỉ lệ tín hiệu/nhiễu 5), và có thể xác định với độ chính xác trong khoảng20% và độ đúng từ 80 – 120% [14]
1.4.1.7 Độ ổn định của mẫu
Độ ổn định của thuốc trong dịch sinh học phụ thuộc vào điều kiện bảo quản và địnhlượng, tính chất hóa học của chất phân tích, môi trường sinh học và đồ chứa Độ ổnđịnh cần được khảo sát ở các điều kiện và thời gian tương tự như thực tế trong suốtquá trình từ thu thập mẫu, bảo quản, rã đông, xử lý và phân tích với sự đánh giángắn hạn (để trên bàn mẫu, để ở nhiệt độ phòng) và độ ổn định dài hạn (mẫu trữđông ở nhiệt độ mong muốn) hoặc độ ổn định sau các chu trình đông-rã đông mẫuphân tích
Trang 30
Độ ổn định trong dung dịch gốc của chất phân tích và chuẩn nội cần được đánh giá
ở nhiệt độ phòng ít nhất 6 giờ Nếu dung dịch gốc được bảo quản ở điều kiện lạnhhoặc đông trong một thời gian nhất định thì cũng phải chứng minh được độ ổn định.Sau thời gian bảo quản nhất định, độ ổn định được kiểm tra bằng cách so sánh độđáp ứng của dung dịch sau thời gian bảo quản với dung dịch gốc ngay khi đượcchuẩn bị
Độ ổn định trong huyết tương
- Độ ổn định ngắn hạn
Thực hiện trên 3 mẫu khác nhau ở mỗi nồng độ cao và thấp, sau khi rã đông ở nhiệt
độ phòng (25 oC) và giữ ở nhiệt độ này từ 4 – 24 giờ, sau đó xử lý mẫu [14]
- Độ ổn định dài hạn
Thời gian bảo quản trong đánh giá độ ổn định dài hạn nên lớn hơn khoảng thời gian
từ lúc lấy mẫu đến ngày phân tích mẫu cuối cùng Độ ổn định dài hạn được xác địnhbằng cách bảo quản ít nhất 3 mẫu ở hai nồng độ thấp và cao ở nhiệt độ bảo quản dựkiến (-20 oC hoặc -70 oC) Thể tích mẫu phải đủ cho phân tích ở 3 lần khác nhau,nồng độ của mẫu sau mỗi lần xác định được so sánh với giá trị trung bình của nồng
độ tương ứng ở ngày bắt đầu thử nghiệm độ ổn định dài hạn [14]
- Độ ổn định đông và rã đông
Độ ổn định của chất phân tích được xác định sau 3 chu kỳ làm lạnh và rã đông.Thực hiện ít nhất 3 mẫu ở hai nồng độ cao và thấp được đông lạnh ở nhiệt độ bảoquản dự kiến trong 24 giờ và rã đông ở nhiệt độ phòng, khi rã đông hoàn toàn cácmẫu được đông lạnh trở lại trong vòng 12 – 24 giờ giống lần đầu, sau 3 chu kỳ nhưthế mẫu được xử lý Nếu một chất phân tích không ổn định ở nhiệt độ dự kiến, mẫunên được đông lạnh ở -70 oC trong ba chu kỳ đông và rã đông [14]
Trang 31
- Độ ổn định sau khi xử lý mẫu
Độ ổn định của mẫu đã xử lý là độ ổn định sau khoảng thời gian từ khi đã xử lýxong đến lúc phân tích, ví dụ chờ ở khay tiêm mẫu tự động trong hệ thống sắc kýlỏng Độ ổn định của chất phân tích và chuẩn nội phải được đánh giá qua thời giannày bằng cách so sánh với nồng độ ban đầu sau khi xử lý với nồng độ sau một thờigian để ở nhiệt độ của bộ phận tiêm mẫu [14]
1.4.1.8 Ảnh hưởng của nền mẫu (matrix effect) và chất mang (carry over)
Ảnh hưởng của nền mẫu và chất mang nên được nghiên cứu khi phân tích mẫutrong dịch sinh học bởi vì nó có thể ảnh hưởng đến độ tuyến tính và độ chính xáccủa phương pháp dẫn đến kết quả thay đổi mặc dù không quá nhiều [13]
Hướng dẫn FDA 2013 có đề cập về ảnh hưởng của nền mẫu Theo hướng dẫn này,đường chuẩn trong dịch sinh học nên được so sánh với đường chuẩn trong dung môi
để phát hiện ra ảnh hưởng của nền mẫu Song song với việc pha loãng mẫu thử nênpha loãng mẫu chuẩn để phát hiện ảnh hưởng của nền mẫu Các chất mang khôngđặc hiệu cũng nên được định lượng [14]
Trong hướng dẫn của EMA 2015 có qui định cụ thể hơn:
- Ảnh hưởng của nền mẫu nên được đánh giá khi sử dụng phương pháp khối phổ,đánh giá trên 6 lô mẫu khác nhau, ở hai mức nồng độ thấp và cao
- Với mỗi chất phân tích và IS, các hệ số ảnh hưởng của nền mẫu (MF) được xácđịnh cho từng lô mẫu bằng cách lập tỉ số diện tích pic của chất phân tích trong nềnmẫu (định lượng chất phân tích được thêm vào nền mẫu đã được xử lý) với diệntích pic của chất khi không có nền mẫu (chất phân tích trong dung môi) Tỷ số MFcủa chất phân tích và IS cũng nên được tính với giá trị CV tính từ 6 lô mẫu khônglớn hơn 15%
- Nếu phương pháp trên không thể áp dụng được, như trong trường hợp chuẩn bịmẫu trực tuyến (on-line), thì đánh giá MF bằng cách phân tích ít nhất 6 lô mẫu đượcthêm vào chất phân tích ở hai mức nồng độ cao và thấp Báo cáo thẩm định nên baogồm diện tích pic của chất phân tích, IS và nồng độ tính toán cho mỗi mẫu độc lập
Giá trị CV tính cho mỗi nồng độ không được lớn hơn 15% [13]
Trang 32
1.4.2 So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA
Khi so sánh với quy định của US-FDA, quy định EMA có một số điểm khác biệtsau:
Bảng 1.1 So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA
Ảnh hưởng nền mẫu Đường chuẩn trong dịch sinh
học được so sánh với đườngchuẩn trong dung môi
Tỉ số diện tích pic củachất phân tích trong nềnmẫu đã được xử lý vớidiện tích pic của chấtphân tích trong dung môi
và chuẩn nội UK-52,829-42 trong huyết tương người được chiết bằng dung môimethyl-t-butyl ether, tạo dẫn xuất với trimethylacetyl clorid và chất này được địnhlượng trong khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,2-50 ng/ml Phân tích atorvastatin vàchuẩn nội đồng vị atorvastatin-d5 trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký
Trang 33
lỏng ghép khối phổ, cột Jones Chromatography Genesis C18 (50 x 2,1 mm; 4 μm),đầu dò khối phổ PE SCIEX API 3000, MRM (m/z) 559,3 → 440,2 và 564,3 →445,3 cho atorvastatin và atorvastatin-d5, định lượng trong khoảng nồng độ tuyếntính 0,25-100 ng/ml Atorvastatin và chuẩn nội đồng vị atorvastatin-d5 trong huyếttương người được chiết bằng kỹ thuật SPE [10]
Năm 2011, Qi Yu và cộng sự đã phân tích đồng thời amlodipin và atorvastatin tronghuyết tương của bệnh nhân tăng huyết áp, sử dụng dung môi chiết methanol chứaacid formic 0,1%, chuẩn nội nitrendipin Mẫu được phân tích trên hệ thống máyHPLC Agilent 1200 ghép đầu dò khối phổ hai tứ cực Agilent 6410B, nguồn ion hóaESI, cột HPLC Agilent Eclipse XDB-C18 (100 x 2,1 mm; 3,5 μm), pha động acidformic 0,1% trong nước và acetonitril, rửa giải gradient, tốc độ dòng 0,4 ml/phút[22]
Năm 2011, Nageswara Rao Pilli và cộng sự đã phân tích đồng thời amlodipin,atorvastatin, ramipril và benazepril trong huyết tương người bằng LC-MS/MS ứngdụng cho nghiên cứu dược động học trên người Phương pháp phân tích sử dụngchuẩn nội nevirapin Hoạt chất trong huyết tương người được chiết bằng phươngpháp chiết lỏng-lỏng với dung môi chiết ethyl acetat Mẫu được phân tích trên hệthống HPLC Shimadzu LC-20 AD ghép khối phổ MDS Sciex API-4000, nguồn ionhóa Turboionspray, cột Agilent Zorbax-SB C18 (50 x 4,6 mm; 5 μm), pha độngacid formic 0,1%-acetonitril (15:85), tốc độ dòng 1 ml/phút Phương pháp đượcthẩm định theo hướng dẫn của US-FDA [20]
Năm 2013, Mahmoud Yacoub và cộng sự đã công bố nghiên cứu xác định đồng
thời amlodipin, atorvastatin với dẫn xuất ortho-hydroxy atorvastatin và
para-hydroxy atorvastatin trong huyết tương người bằng LC-MS/MS Mẫu huyết tươngngười được xử lý bằng phương pháp tủa protein với acetonitril, sử dụng chuẩn nộinatri pravastatin Mẫu được phân tích trên hệ thống máy sắc ký lỏng DionexUltimate 3000 RS ghép đầu dò khối phổ ion trap Thermo SCIENTIFIC LCQFLEET, nguồn ion hóa ESI, cột sắc ký Phenomenex Synergi 4u polar-RP 80A (150
x 4,6 mm; 4 μm), pha động nước-methanol (14:86) được điều chỉnh bằng acid
Trang 34
tricloroacetic đến pH 3,2; tốc độ dòng 0,5 ml/phút Đánh giá tương đương sinh họcđược thực hiện trên hai sản phẩm thương mại đơn liều amlodipin 10 mg vàatorvastatin 80 mg [27]
Năm 2013, Ying Zhou và cộng sự đã xây dựng và thẩm định phương pháp
HPLC-MS/MS định lượng đổng thời amlodipin, atorvastatin và hai dẫn xuất ortho-hydroxy atorvastatin và para-hydroxy atorvastatin trong huyết tương người để ứng dụng
trong nghiên cứu tương đương sinh học Mẫu được chiết bằng phương pháp chiếtlỏng-lỏng với hỗn hợp dung môi methyl tert-butyl ether và ethyl acetat (50:50).Mẫu được phân tích trên hệ thống máy HPLC Agilent 1200 ghép đầu dò khối phổhai tứ cực Applied Biosystems API 4000, nguồn ion hóa ESI, cột HPLCCAPCELLPAK CR 1:4 (150 x 2,0 mm; 5 μm), pha động acetonitril-dung dịch đệmamoni acetat 20 mM chứa acid formic 0,3% (50:50) Đánh giá tương đương sinhhọc được thực hiện trên hai sản phẩm có hàm lượng 5 mg amlodipin/10 mgatorvastatin [28]
Năm 2016, Hossein Danafar và Mehrdad Hamidi đã phân tích đồng thời amlodipin,atorvastatin trong huyết tương người bằng LC-MS ứng dụng cho nghiên cứu dượcđộng học trên người Hoạt chất trong huyết tương người được chiết bằng phươngpháp chiết lỏng-lỏng với dung môi chiết ethyl acetat Mẫu được phân tích trên hệthống HPLC Agilent LCMS-6410 tứ cực, cột Zorbax XDB-ODS C18 (30 x 2,1 mm;3.5 μm), pha động acetonitril – nước (CH3COONH4 10 mM, pH 3,0) (70:30), tốc độdòng 0,15 ml/phút Phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn của US-FDA[15]
Trong nước
Cho đến nay, chưa có công trình công bố phương pháp phân tích đồng thời
amlodipin, atorvastatin và hai chất chuyển hóa ortho-hydroxy atorvastatin,
para-hydroxy atorvastatin trong huyết tương người
Trang 35
theo tài liệu tham khảo
GC-ECDLC-MS/MS[10] 10 80 T: 6,63
R: 6,58
T: 25,5R: 27,1
GC-ECDLC-MS/MS[27] 10 80 T: 8,396
R: 7,898
T: 84,057R: 81,336
LC-MS/MS
R: 3,59
T: 2,81R: 3,01
T: 1,89R: 1,87
T: 0,16R: 0,17
LC-MS/MS
T: Thuốc thử; R: Thuốc đối chứng.
Nhận xét: Để phân tích AM, AT, o-AT, p-AT trong dịch sinh học, phương pháp sắc
ký lỏng pha đảo với cột C-18 hay cột phenyl đã được sử dụng Trong đó, pha độngthường bao gồm hỗn hợp acetonitril và acid formic 0,1% hoặc dung dịch đệm, rửagiải đẳng dòng Đầu dò sử dụng là đầu dò MS/MS với giới hạn định lượng rất nhỏ,
đủ nhạy để phân tích các chất này trong dịch sinh học, như ortho-hydroxy
atorvastatin (Cmax trong huyết tương người 1,9 ng/ml), para-hydroxy atorvastatin
(Cmax trong huyết tương người 0,2 ng/ml) [28]
Phương pháp chiết lỏng – lỏng hoặc kết tủa protein thường được chọn trong xử lýmẫu huyết tương, cho hiệu suất chiết cao Các hợp chất này có thể được chiết bằngphương pháp chiết lỏng - lỏng với hỗn hợp dung môi methyl tert-butyl ether vàethyl acetat (50:50) [28], methyl tert-butyl ether tạo dẫn xuất với trimethylacetylclorid [10], hay sử dụng dung môi chiết ethyl acetat [20] cho hiệu suất chiết trên80% Đơn giản hơn, phương pháp tủa protein cũng được áp dụng với các tác nhângây tủa là methanol, acetonitril [27], hoặc hỗn hợp methanol-acetonitril (1:1) chohiệu suất chiết trên 75%, đặc biệt khi tủa bằng acid formic 0,1% trong methanol chohiệu suất chiết cao 94 – 102% [22] Tuy nhiên dịch ly tâm thu được sau khi tủa íttinh khiết và bị pha loãng nhiều hơn so với phương pháp chiết lỏng-lỏng do đó cóthể làm giảm độ nhạy của phương pháp
Trang 36
Bảng 1.3 Tóm tắt các quy trình định lượng đồng thời amlodipin và atorvastatin
trong huyết tương người
SPE
J&W DB-17HT (15 m x 0,32 mm; 0,15 μm)
Jones graphy Genesis C18 (50 x 2,1 mm; 4 μm)
Chromato-Acid acetic 0,1% trong nước và acetonitril (70:30) Tốc độ dòng 0,2 ml/phút Rửa giải gradient.
Phenomenex Synergi 4u polar-
RP 80A (150 x 4,6 mm; 4 μm).
Nước-methanol (14:86) được điều chỉnh bằng acid tricloroacetic đến pH 3,2.
Tốc độ dòng 0,5 ml/phút.
Rửa giải isocratic.
- MS bẫy ion, ESI+
Capcellpak CR 1:4 (150 x 2,0 mm; 5 μm)
Acetonitril - dung dịch đệm amoni acetat 20 mM chứa 0,3% acid formic (50:50) Tốc độ dòng 0,45 ml/phút.
Rửa giải isocratic.
Agilent Eclipse XDB-C18 (100 x 2,1 mm; 3,5 μm)
Acid formic 0,1% trong nước và acetonitril.
Tốc độ dòng 0,4 ml/phút.
Rửa giải gradient.
- Hai tứ cực Agilent 6410B, ESI+
Agilent
Zorbax-SB C18 (50 x 4,6 mm; 5 μm)
Acid formic 0,1% acetonitril (15:85).
-Tốc độ dòng 1 ml/phút.
Rửa giải isocratic.
- Hai tứ cực 4000
Zorbax ODS C18 (2.1
XDB-mm × 30 XDB-mm, 3,5 μm)
Acetonitril
-CH 3 COONH 4 10 mM pH 3.0 (70:30)
Tốc độ dòng 0,15 ml/phút.
Rửa giải isocratic.
- Hai tứ cực Agilent LCMS-
6410, ESI+, MRM
[15]
Trang 37
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu huyết tương người tự tạo chứa hỗn hợp thuốc amlodipin, atorvastatin và
hai chất chuyển hóa ortho-hydroxy atorvastatin và para-hydroxy atorvastatin.
2.1.2 Chất chuẩn
Amlodipin besylat
Nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM
Lô: QT145 090516 Hàm lượng: 100,43 % trên nguyên trạng
Atorvastatin calci
Nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM
Lô: QT164 091015 Hàm lượng: 94,65 % trên nguyên trạng
Lô: 1-EOD-50-1 Hàm lượng: 95,00 % trên nguyên trạng
Rosuvastatin calci (dùng làm chất chuẩn nội - IS)
Nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM
Lô: QT182 030715 Hàm lượng: 95,93 % trên nguyên trạng
Felodipin (dùng làm chất chuẩn nội - IS)
Nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
Lô: WS.0107222 Hàm lượng: 99,30 % trên nguyên trạng
Trang 38
2.1.3 Dung môi, hóa chất
Bảng 2.1 Dung môi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu
Huyết tương trắng
Bệnh viện Truyền máuhuyết học TP.HCM
2.1.4 Trang thiết bị thí nghiệm
Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểmnghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh với các trang thiết bị liệt kê trong bảng 2.2
Bảng 2.2 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
Cân kỹ thuật (d=0,01 g) JP 802-G Metler Toledo (Thụy Sĩ)
Cân phân tích (d=0,01 mg) AB 265-S Metler Toledo (Thụy Sĩ)
Máy ly tâm lạnh Mikro 220R Hettich (Đức)
Máy lắc ống nghiệm Advanced Talboys (Mỹ)
Máy lắc vòng Advanced 3500 Talboys (Mỹ)
Tủ đông -70 oC EMS 690 Froilabo (Pháp)
Cột sắc ký C18 (150 x 2
Các thiết bị đã được hiệu chuẩn theo GLP/ISO 17025 đến thời hạn 09/2017
Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu chính xác dùng trong phân tích
Thiết bị phân tích sắc ký LC-MS/MS
Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ được sử dụng trong nghiên cứu là hệ ShimadzuLC-MS 8040 với các bộ phận cấu thành như sau: hệ thống bơm dung môi LC-30AD, hệ thống loại khí chân không DGU-20A3, máy sinh khí nitơ Peak Scientific
Trang 39
NM 32 LA, bộ phận tiêm mẫu tự động SIL-30AC, buồng ổn nhiệt cho cột 20AC và đầu dò khối phổ LC-MS 8040 Hệ thống được điều khiển bằng phần mềmLabSolutions phiên bản 5.0
CTO-2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Chuẩn bị mẫu
2.2.1.1 Dung dịch chuẩn gốc
Cân chính xác khoảng một lượng chất chuẩn, cho vào các bình định mức riêng biệt,hòa tan bằng dung môi thích hợp để thu được các dung dịch chuẩn gốc có nồng độtương ứng với từng chất như bảng 2.3, sau đó bảo quản ở nhiệt độ -20 oC, để ở nhiệt
Lượng cân (mg)
2.2.1.2 Hỗn hợp chuẩn và mẫu giả lập
Chuẩn bị hỗn hợp chuẩn để thăm dò các điều kiện sắc ký có nồng độ mỗi chất gấp
20 lần nồng độ tối đa (Cmax) trong huyết tương người theo tài liệu tham khảo
Cách tiến hành: lấy chính xác từng thể tích của các dung dịch chuẩn gốc, cho vàobình định mức sạch có nắp đậy, như bảng 2.4 dưới đây
+ dung môi pha mẫu (methanol) vừa đủ 10 ml
Trang 40
Từ hỗn hợp chuẩn này, thêm vào huyết tương trắng với tỷ lệ 5% thể tích để thuđược mẫu giả lập Theo đó, nồng độ của từng hoạt chất trong mẫu giả lập có nồng
độ xấp xỉ nồng độ Cmax được báo cáo trong các tài liệu tham khảo
2.2.1.3 Dung dịch chuẩn nội
Cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn nội, cho vào bình định mức 100 mL, hòa tantrong methanol để thu được dung dịch có nồng độ 100 µg/ mL
2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng AM, AT, o-AT, p-AT bằng phương pháp
LC-MS/MS
2.2.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ
Quy trình phân tích định lượng được thực hiện trên máy LC-MS/MS Shimadzu
8040 ở các điều kiện như sau:
- Nitơ: 6,5 lít/phút; Áp suất khí phun: 25 psi; Cone voltage: 4000 V
- Chế độ ESI, MRM: Khảo sát mảnh ion phân tử, mảnh ion định lượng của các chất
- Khảo sát và tối ưu điều kiện khối phổ bằng phần mềm tối ưu hóa tự độngOptimize Voltage để thay đổi các thông số thế phân mảnh và năng lượng va đập saocho thu được tín hiệu các mảnh ion có tỉ số khối lượng/điện tích (m/z) của ion đạtcao nhất
2.2.2.2 Khảo sát chất chuẩn nội cho phương pháp LC-MS/MS
Một số yêu cầu trong chọn lựa chất chuẩn nội:
- Có tính chất lý, hóa giống với chất phân tích
- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử
- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm
Dựa vào các tài liệu tham khảo và điều kiện sẵn có, tiến hành khảo sát 2 chất chuẩnnội là rosuvastatin và felodipin
2.2.2.3 Khảo sát điều kiện sắc ký
Quy trình phân tích định lượng được thực hiện trên máy LC/MS-MS Shimadzu
8040 ở các điều kiện cố định như sau: