Tổng hợp và tiêu chuẩn hóa tạp chất liên quan a và g của amlodipin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ DIỂM TRANG TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA TẠP CHẤT LIÊN QUAN A VÀ G CỦA AMLODIPIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành ph

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ DIỂM TRANG

TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA TẠP CHẤT LIÊN

QUAN A VÀ G CỦA AMLODIPIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ DIỂM TRANG

TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA TẠP CHẤT LIÊN

QUAN A VÀ G CỦA AMLODIPIN

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và

chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Lê Thị Diểm Trang

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Tổng hợp và tiêu chuẩn hóa tạp chất liên quan A à G củaamlodipin” được thực hiện tại khoa Thiết lập chất chuẩn - chất đối chiếu,Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh Để hoàn thành luận văn, tôi đãnhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ của các cá nhân và tập thể

Đầu tiên, tôi chân thành cám ơn người thầy đã nhiệt tình hướng dẫn tôitrong thời gian qua, người thầy đã tạo cho tôi niềm tin và động lực, PGS.TS

Hà Diệu Ly và TS Lê Thị Thu Cúc Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cám ơn đếncác anh chị khoa Thiết lập chất chuẩn - chất đối chiếu và khoa Vật lý đolường, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ vàtạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến ban lãnh đạo của Viện Kiểm nghiệmthuốc TP Hồ Chí Minh, ban lãnh đạo trường Đại học Y Dược TP Hồ ChíMinh, và các thầy cô đã giảng dạy, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình họctập

Sau cùng, tôi gửi lời cảm ớn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn

bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiêncứu của mình

TÁC GIẢ

Lê Thị Diểm Trang

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình, sơ đồ, đồ thị

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tạp chất 3

1.1.1 Nguồn gốc tạp chất 3

1.1.2 Phân loại tạp chất 4

1.1.3 Các qui định về tạp chất 4

1.1.3.1 Qui định về tạp chất trong dược chất theo ICH Q3A(R2) 5

1.1.3.2 Qui định về tạp chất trong dược phẩm theo ICH Q3B(R2) 6

1.2 Tổng quan về amlodipin besilat 7

1.2.1 Tính chất vật lý 8

1.2.2 Tác dụng dược lý 8

1.2.3 Dược động học 9

1.2.4 Các tạp chất liên quan trong nguyên liệu amlodipin besilat theo Dược điển Anh 9

1.3 Tổng quan về tạp A của amlodipin (phthaloyl amlodipin) 11

1.4 Tổng quan về tạp G của amlodipin 14

1.5 Qui trình kiểm nghiệm tạp chất liên quan của amlodipin trong nguyên liệu amlodipin theo Dược điển Anh 2016 18

1.6 Chất đối chiếu 19

1.6.1 Định nghĩa 19

1.6.2 Phân loại 20

1.6.3 Các phương pháp sử dụng để định danh chất đối chiếu 20

1.6.4 Các phương pháp xác định độ tinh khiết chất đối chiếu 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất và dung môi 22 20 2.1.3 Trang thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Qui trình tổng hợp tạp A và tạp G của amlodipin 24

2.2.1.1 Qui trình tổng hợp tạp A 24

2.2.1.2 Qui trình tổng hợp tạp G 27

2.2.2 Thử tinh khiết 28

2.2.3 Xác định cấu trúc 29

2.2.4 Hiệu suất phản ứng 29

2.2.3 Xây dựng qui trình định lượng tạp A và tạp G bằng HPLC 29

2.2.3.1 Xây dựng qui trình định lượng tạp A và tạp G 29

2.2.3.2 Thẩm định qui trình định lượng tạp A và tạp G 30

2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho tạp A và tạp G 33

2.2.5 Thiết lập chất đối chiếu tạp A và tạp G 34

2.2.5.1 Đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ 34

2.2.5.2 Đánh giá chất chuẩn thông qua liên phòng thí nghiệm 35

2.2.5.3 Phương pháp xử lý số liệu – Xác định giá trị ấn định 35

2.2.6 Ứng dụng chất đối chiếu tạp A và G đã tổng hợp để kiểm nghiệm tạp chất A và G trong nguyên liệu amlodipin besilat 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38

3.1 Tổng hợp tạp A của amlodipin 38

3.1.1 Qui trình tổng hợp tạp A 38

3.1.2 Tinh chế sản phẩm tổng hợp 43

3.1.3 Xác định sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp 44

3.1.4 Xác định cấu trúc của sản phẩm tổng hợp 45

3.1.5 Xác định độ tinh khiết của tạp A tổng hợp 50

3.1.6 Xác định hàm ẩm tạp A tổng hợp bằng phương pháp TGA 51

3.1.7 Hiệu suất 52

3.2 Tổng hợp tạp G của amlodipin 52

3.2.1 Qui trình tổng hợp tạp G 52

3.2.2 Tinh chế sản phẩm tổng hợp 53

3.2.3 Xác định sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp 54

3.2.4 Xác định cấu trúc của sản phẩm tổng hợp 55

3.2.5 Xác định độ tinh khiết tạp G tổng hợp 60

3.2.6 Xác định hàm ẩm tạp G tổng hợp bằng phương pháp TGA 61

3.2.7 Hiệu suất 62

3.3 Xây dựng qui trình định lượng tạp A và G bằng HPLC 62

3.3.1 Thẩm định qui trình định lượng tạp A bằng HPLC 62

3.3.2 Thẩm định qui trình định lượng tạp G bằng HPLC 70

3.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho tạp chất A và G của amlodipin 78

3.5 Thiết lập chất đối chiếu tạp A và tạp G 78

3.5.1 Tạp A 78

3.5.1.1 Đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ 78

3.5.1.2 Đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm 80

3.5.1.3 Xác định giá trị ấn định – giá trị công bố 81

3.5.2 Tạp G 82

3.5.2.1 Đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ 82

3.5.2.2 Đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm 84

3.5.2.3 Xác định giá trị ấn định – giá trị công bố 86

3.6 Ứng dụng chất đối chiếu tạp A và G đã tổng hợp để kiểm nghiệm tạp chấtA và G trong nguyên liệu amlodipin besilat 86

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 90

4.1 Tổng hợp tạp chất A và G của amlodipin 90

4.1.1 Tổng hợp tạp chất A amlodipin 90

4.1.2 Tổng hợp tạp chất G amlodipin 92

4.2 Tinh chế sản phẩm 95

4.3 Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng và xác định độ tinh khiết tạp chất A và G của amlodipin 95

4.4 Xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập chất đối chiếu tổng hợp 95

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANAD : Abbreviated New Drug Application

BP : British Pharmacopoeia (Dƣợc điển Anh)

CAS : Chemical Abstracts Service (mã tra cứu hóa học)

DSC : Differential Scanning Calorimetry (quét nhiệt vi sai)

dt : Doulet triplet (mũi đôi ba)

EP : European Pharmacopoeia (Dƣợc điển Châu Âu)

FDA : Food and Drug Administration (Cục quản lí Thực

phẩm và Dƣợc)

GC : Gas chromatography (sắc ký khí)

GLP : Good laboratory practice (thực hành tốt phòng thínghiệm)

HPLC : High Performance Liquid Chromatography (sắc ký

lỏng hiệu năng cao)ICH : International Council for Harmonisation of Technical

Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (Tổchức quốc tế về việc hòa hợp các tiêu chuẩn về Dƣợcphẩm)

IEC : International Electrotechnical Commission (Ủy ban kỹ

thuật điện quốc tế)

IR : Infrared (hồng ngoại)

ISO : International Organization for Standardization (Tổ

chức tiêu chuẩn hóa quốc tế)

MS-ESI : Mass Spectrum – Electrospray Ionization (khối phổ

-ion hóa điện tử)

NMR : Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)PDA : Photo Diode Array (Dãy diod quang)

RSD : Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tương đối)

Rf : Retention factor (hệ số lưu giữ)

SD : Standard deviation (độ lệch chuẩn)

Tạp A : 3-ethyl 5-methyl

(4RS)-4-(2-chlorophenyl)-2-[[2-(1,3-methyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate,

dioxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)ethoxy]methyl]-6-(Phthaloyl amlodipin)

Tạp G : dimethyl

4-(2-chlorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylateTGA : Thermo Gravimetric Analysis (phân tích nhiệt trọnglượng)

UV : Ultraviolet (tử ngoại)

UV-Vis : Ultraviolet – Visible (tử ngoại - khả kiến)

δC (δH) : Độ dịch chuyển hóa học của carbon (proton)

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.2 Ngƣỡng báo cáo, định tính, định lƣợng dành cho tạp chất của

Bảng 1.3 Các ngƣỡng báo cáo, định danh và định tính cho tạp chất của

thuốc thành phẩm theo tổng số liều dùng hàng ngày (TDI) 7

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát phản ứng chuyển hóa amlodipin besilat thành

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát điều kiện 1 và 2 của phản ứng tổng hợp tạp A 39

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp và dữ liệu phổ NMR

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống qui trình định lƣợng tạp

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng tạp A

Bảng 3.22 Kết quả phân tích ANOVA đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng

Bảng 3.28 Kết quả phân tích ANOVA đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng

Bảng 3.30 Kết quả tính tương thích hệ thống của qui trình xác định tạp

chất A và G trong nguyên liệu amlodipin besilat 87

Bảng 3.31 Kết quả xác định tạp chất liên quan A và G của amlodipin

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.5 Biểu đồ khảo mô tả % diện tích pic tạp A theo tỷ lệ mol anhydrid

Hình 3.7 Kết quả sắc ký đồ tổng hợp tạp A sau 4 giờ trong acid acetic so

Hình 3.8 Sắc ký đồ AmA2 và tạp A chuẩn EP với 3 hệ dung môi trên sắc

Hình 3.18 Kết quả sắc ký đồ tổng hợp tạp G bằng phương pháp đun hồi

Hình 3.19 Sắc ký đồ AmG2 và tạp G chuẩn EP với 3 hệ dung môi trên sắc

Hình 3.21 Phổ IR của AmG2 so với tạp G chuẩn EP 55

Hình 3.23 Công thức cấu tạo của tạp G và

2,6-dimethyl-3,5-dimethylcarbonyl-4-(o-methoxylphenyl)-1,4-dihydropirydin theo tài liệu

Hình 3.30 Sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống của qui trình định

Hình 3.37 Biểu đồ minh họa độ tinh khiết của pic tạp G trong mẫu thử (a)

Hình 3.38 Phổ UV-Vis của pic tạp G trong mẫu thử (a) và mẫu chuẩn (b) 73 Hình 3.39 Đường biểu diễn diện tích pic theo nồng độ trong phương pháp

Hình 3.40 Kết quả sắc ký đồ tính đặc hiệu của qui trình kiểm tạp A và G

trong nguyên liệu amlodipin besilat bằng phương pháp HPLC 88

Sơ đồ 1.1 Một số con đường tổng hợp dẫn xuất 1,4-DHP bằng phản ứng

Sơ đồ 4.3 Cơ chế phản ứng tạo thành sản phẩm trung gian (II) trong

Sơ đồ 4.4 Cơ chế tổng hợp chất trung gian imono-Knoevenagel và sản

MỞ ĐẦU

Theo dự báo của Hội tim mạch học Việt Nam, đến năm 2017, Việt Nam sẽ có1/5 dân số mắc bệnh tim mạch và tăng huyết áp Đặc biệt, trong những nămgần đây, bệnh lý tăng huyết áp đang được trẻ hóa với rất nhiều đối tượngtrong độ tuổi lao động Tại Việt Nam, tỷ lệ tăng huyết áp ở những người từ 25tuổi trở lên chiếm 25,1%

Trong các nhóm thuốc điều trị tim mạch, nhóm chẹn kênh calci, điển hình làamlodipin, đã được Bộ Y tế đưa vào danh mục thuốc thiết yếu và chỉ địnhthường quy trong điều trị tăng huyết áp, đau thắt ngực Nên amlodipin làthuốc được nhiều công ty dược phẩm trong nước sản xuất Tuy nhiên, nguồnnguyên liệu đầu vào vẫn còn phụ thuộc nhiều từ nước ngoài

Theo thông tư 22/2009 của Cục Quản lý Dược Việt Nam, tất cả các nguyênliệu đầu vào cũng như thành phẩm trước và trong quá trình lưu hành cần đượckiểm soát chặt chẽ, đặc biệt là các tạp chất liên quan Hiện nay ở nước tanhiều tạp chuẩn vẫn chưa được sản xuất trong nước, mà phải mua từ nướcngoài với giá rất cao Điển hình là nguyên liệu amlodipin besilat, theo Dượcđiển Anh 2016, có 7 tạp chất liên quan trong nguyên liệu amlodipin besilatcần được kiểm đó là: tạp A, B, D, E, F, G, H Tuy nhiên, thực tế ở Việt Namchỉ mới sản xuất được tạp chất D Vì thế, gây không ít khó khăn cho công táckiểm nghiệm

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẨN HÓATẠP CHẤT LIÊN QUAN A VÀ G CỦA AMLODIPIN” được thực hiện vớimong muốn cung cấp thêm qui trình tổng hợp tạp chất nhóm 4-dihydropyridin(tạp chất của nhóm tim mạch như amlodipin ) và thiết lập chất đối chiếu tạpchất tổng hợp amlodipin tạp chất A và G, nhằm ứng dụng vào việc kiểm trachất lượng của nguyên liệu đầu vào

Mục tiêu của đề tài là:

- Tổng hợp tạp A và tạp G của amlodipin ở qui mô phòng thí nghiệm.

- Xây dựng bộ dữ liệu chuẩn cho 2 tạp chất A và G của amlodipin

- Thiết lập chất đối chiếu theo WHO và ISO13528

- Kiểm tra tạp chất A, G trong nguyên liệu amlodipin besilat theo quiđịnh của Dược điển Anh 2016, sử dụng tạp đã tiêu chuẩn hóa làm chấtđối chiếu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tạp chất

1.1.1 Nguồn gốc tạp chất [4]

Các tạp chất có thể có nhiều nguồn gốc khác nhau Hầu hết tạp chất xuất hiện

là do qui trình tổng hợp, các sản phẩm phụ và chất trung gian có thể bị lưu giữcùng hoạt chất mới được tổng hợp, chúng chính là tạp chất hoặc trở thànhnguồn gốc của các tạp chất khác Tạp chất nào hiện diện trong nguyên liệuban đầu cũng có khả năng xuất hiện cùng với dược chất Ngoài ra, những tạpchất liên quan đến các thành phần trơ (tá dược) hoặc các dung môi được sửdụng trong qui trình tổng hợp cũng được quan tâm đến Các tạp chất có thểđược tạo ra trong suốt các giai đoạn bào chế dược phẩm Những tạp chất này

có thể xuất hiện trong thành phẩm cuối

Những tạp chất trong dược phẩm không chỉ do dược chất hoặc các thành phầntrơ sử dụng trong công thức bào chế, mà chúng có thể xuất hiện thông qua quitrình bào chế hoặc bằng việc tiếp xúc với bao bì đóng gói Tất cả các tạp chất

có khả năng làm thay đổi các dạng bào chế thông qua các phản ứng hóa họchoặc biến đổi vật lý Hơn nữa, một số tạp chất có thể gây độc, hoặc có thểkhông gây ảnh hưởng trực tiếp đến đến độ ổn định hoặc hiệu quả điều trị,nhưng cũng cần phải được kiểm soát để tạo ra một dược phẩm an toàn

Tóm lại, các tạp chất có thể có nguồn gốc sau:

- Tạp chất liên quan đến quá trình kết tinh

- Tạp chất liên quan đến cấu trúc lập thể

- Nguyên liệu ban đầu dùng tổng hợp

- Dung môi tồn dư

- Các chất trung gian và sản phẩm phụ

- Các tạp chất liên quan đến công thức bào chế

- Các tạp chất xuất hiện trong quá trình bảo quản

1.1.2 Phân loại tạp chất [4],[11]

Theo Dược điển Mỹ, tạp chất được mô tả bằng các thuật ngữ sau:

- Các thành phần đi cùng: là các thành phần đi kèm theo hoạt chất, ví dụ:các đồng phân hình học và quang học, chất bảo quản…

- Các chất ngoại lai: là các vật liệu xuất hiện do sự nhiễm bẩn hoặc pha trộn,

và không phải là kết quả của công thức bào chế

- Các tạp chất thông thường: là loại tạp chất vô hại và không gây nguy hiểmkhi hiện diện với số lượng nhất định

- Các tạp hữu cơ dễ bay hơi: là các dung môi tồn dư được phát hiện trongdược chất

- Các tạp nổi trội: các tạp này khác so với các tạp thông thường, chúng cần

có các phép thử định danh và định lượng riêng biệt Các tạp này gồm các tạpliên quan đến qui trình sản xuất hoặc các sản phẩm phân hủy

- Các tạp có độc tính: các tạp này có hoạt tính sinh học không mong muốn,thậm chí là các phân tử nhỏ, và yêu cầu phải có các phép thử định danh vàđịnh lượng chuyên biệt

Theo ICH, các tạp chất trong dược chất mới được tạo ra bằng con đường tổnghợp hóa học có thể phân thành ba loại sau:

- Tạp hữu cơ: các nguyên liệu ban đầu, các sản phẩm liên quan đến qui trìnhtổng hợp, các sản phẩm trung gian, các sản phẩm phân hủy

- Tạp vô cơ: các loại muối vô cơ, các chất xúc tác, các phối tử, các kim loạinặng hoặc các kim loại còn dư khác

- Dung môi tồn dư: các chất lỏng vô cơ hoặc hữu cơ sử dụng trong suốt quitrình tổng hợp và/hoặc kết tinh lại

1.1.3 Các qui định về tạp chất

Việc mô tả các tạp chất trong cả quá trình phát triển dược phẩm được quản lýchủ yếu thông qua hướng dẫn ICH và FDA Qui định về chất lượng được ban

hành bởi ICH trình bày một trong những sổ tay hướng dẫn được viết nghiêmngặt và xuyên suốt nhất cho việc phát triển dược phẩm Các hướng dẫn khácnhau về tạp chất được trình bày trong bảng 1.1.

Bảng 1.1 Các hướng dẫn qui định về tạp chất của FDA và ICH [4],[17]

Q1A(R2) Thử độ ổn định của các dược chất mới và dược phẩm mới ICH

Q6A Bản chi tiết kỹ thuật: Các qui trình thử và tiêu chuẩn chấp

nhận đối với các dược chất mới và dược phẩm mới: Các hợp chất

hóa học

Q7M Các tạp chất gây độc gen và tế bào

ICH

ICH

1.1.3.1 Qui định về tạp chất trong dƣợc chất theo ICH Q3A(R2) [11]

Q3A(R) cung cấp các hướng dẫn để đăng ký về thành phần và định tính cáctạp chất trong các dược chất mới được sản xuất bằng con đường tổng hợp hóahọc và chưa được đăng ký trước đây Không áp dụng đối với các dược chấtmới được sử dụng trong giai đoạn nghiên cứu lâm sàng

Các nghiên cứu được thực hiện để xác định đặc điểm cấu trúc của các tạp chấthiện diện trong các hoạt chất mới ở nồng độ lớn hơn ngưỡng định danh ởbảng 1.2 cần được mô tả Tạp chất nào có nồng độ lớn hơn ngưỡng định danhtrong bất kỳ lô nào được sản xuất với mục đích thương mại hóa nên đượcđịnh danh

Các qui trình phân tích tạp chất cần được thẩm định phù hợp để phát hiện và

định lượng các tạp chất (xem hướng dẫn thẩm định các qui trình phân tíchQ2A và Q2B của ICH) Giới hạn định lượng của qui trình phân tích khônglớn hơn ngưỡng báo cáo.

Các qui định về ngưỡng báo cáo, ngưỡng định tính và ngưỡng định lượngđược trình bày đầy đủ ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Ngưỡng báo cáo, định tính, định lượng cho tạp chất của dược chất Liều tối đa

Ngƣỡng báo cáo2,3

≤ 2g/ngày 0,05 % 0,10 % hay liều 1,0

mg/ngày (bất kể giá trịnào thấp hơn)

0,15 % hay liều 1,0mg/ngày (bất kể giátrị nào thấp hơn)

3

Các ngưỡng có thể thấp hơn nếu tạp chất có độc tính bất thường

1.1.3.2 Qui định về tạp chất trong dƣợc phẩm theo ICH Q3B(R2) [12]

Q3B(R2) hướng dẫn về việc định lượng và định tính các tạp chất trong cácthuốc thành phẩm được sản xuất từ các dược chất tổng hợp hóa học

Hướng dẫn này chỉ bàn luận các tạp chất trong thuốc thành phẩm được phânloại như là các sản phẩm phân hủy của dược chất hoặc các sản phẩm tươngtác của dược chất với tá dược và/hoặc với bao bì trực tiếp Tạp chất có mặttrong dược chất không cần phải được theo dõi tiếp trong thành phẩm trừ khichúng là các sản phẩm phân hủy trong quá trình sản xuất Các tạp chất phátsinh từ các tá dược hay bao bì của dược phẩm mới cũng không được đề cậptrong hướng dẫn này

Các qui trình phân tích được thẩm định và thích hợp cho việc phát hiện và

định lượng các sản phẩm phân hủy Các mẫu để thẩm định được bảo quảndưới các điều kiện khắc nghiệt: ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, thủy phân bằngacid/base, oxy hóa Giới hạn định lượng của qui trình phân tích không đượclớn hơn ngưỡng báo cáo.

Các qui định về ngưỡng báo cáo, ngưỡng định tính và ngưỡng định lượng củacác sản phẩm phân hủy trong thuốc thành phẩm được trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Các ngưỡng báo cáo, định tính và định lượng cho tạp chất của

thuốc thành phẩm theo tổng số liều dùng hàng ngày (TDI)

< 1 mg 1,0 % hay 5 µg TDI, (bất kể giá trị thấp hơn)

1 mg – 10 mg 0,5 % hay 20 µg TDI, (bất kể giá trị thấp hơn)

> 10 mg – 2 g 0,2 % hay 2 mg TDI, (bất kể giá trị thấp hơn)

< 10 mg 1,0 % hay 50 µg TDI, (bất kể giá trị thấp hơn)

10 mg – 100 mg 0,5 % hay 200 µg TDI, (bất kể giá trị thấp hơn)

> 100 mg – 2 g 0,2 % hay 3 mg TDI, (bất kể giá trị thấp hơn)

1.2 Tổng quan về amlodipin besilat [1]

Công thức phân tử: C20H25ClN2O5,C6H6O3S

Cấu trúc phân tử:

Số CAS: 111470-99-6

1.2.1 Tính chất vật lý [1], [8]

Bột màu trắng hoặc gần như trắng

Tan nhẹ trong nước và 2-propanol, tan tốt trong methanol, ít tan trongethanol

Amlodipin có tác dụng chống tăng huyết áp bằng cách trực tiếp làm giãn cơtrơn quanh động mạch ngoại biên và ít có tác dụng hơn trên kênh calci cơ tim

Vì vậy thuốc không làm dẫn truyền nhĩ thất ở tim kém đi và cũng không ảnhhưởng xấu đến lực co cơ Amlodipin cũng có tác dụng tốt là giảm sức cảnmạch máu thận, do đó làm tăng lưu lượng máu ở thận và cải thiện chức năngthận Vì vậy thuốc cũng có thể dùng để điều trị người bệnh suy tim còn bù.Tác dụng chống đau thắt ngực: Amlodipin làm giãn các tiểu động mạch ngoại

biên, do đó làm giảm toàn bộ lực cản ở mạch ngoại biên (hậu gánh giảm) Vìtần số tim không bị tác động, hậu gánh giảm làm công của tim giảm, cùng vớigiảm nhu cầu cung cấp oxy và năng lượng cho cơ tim Ðiều này làm giảmnguy cơ đau thắt ngực Ngoài ra, amlodipin cũng gây giãn động mạch vành cảtrong khu vực thiếu máu cục bộ và khu vực được cung cấp máu bình thường.

Sự giãn mạch này làm tăng cung cấp oxy cho người bệnh đau thắt ngực thể cothắt (đau thắt ngực kiểu Prinzmetal) Ðiều này làm giảm nhu cầu nitroglycerin

và bằng cách này, nguy cơ kháng nitroglycerin có thể giảm Thời gian tácdụng chống đau thắt ngực kéo dài 24 giờ Người bệnh đau thắt ngực có thểdùng amlodipin phối hợp với thuốc chẹn beta và bao giờ cũng dùng cùng vớinitrat (điều trị cơ bản đau thắt ngực)

1.2.3 Dƣợc động học [2]

Khả dụng sinh học của amlodipin khi uống khoảng 60 - 80% và không bị ảnhhưởng bởi thức ăn Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được sau khi uốngliều khuyến cáo 6 đến 12 giờ Thời gian bán thải từ 30 - 40 giờ Nồng độ ổnđịnh trong huyết tương đạt được 7 đến 8 ngày sau khi uống thuốc mỗi ngàymột lần Thể tích phân bố xấp xỉ 21 lít/kg thể trọng và thuốc liên kết vớiprotein - huyết tương cao (trên 98%) Ðộ thanh thải trong huyết tương tớimức bình thường vào khoảng 7 ml/phút/kg thể trọng do bài tiết chủ yếu thôngqua chuyển hóa trong gan Các chất chuyển hóa mất hoạt tính và bài tiết quanước tiểu

Ở người suy gan, thời gian bán thải của amlodipin tăng, vì vậy có thể cần phảigiảm liều hoặc kéo dài thời gian giữa các liều dùng

1.2.4 Các tạp chất liên quan trong nguyên liệu amlodipin besilat theo Dƣợc điển Anh [7]

- Các tạp chuyên biệt: A D, E, F

- Các tạp khác: B, G, H

H 3 C

Tạp A amlodipin: 3-ethyl 5-methyl

dioxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)ethoxy]methyl]-6-methyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat

(4RS)-4-(2-clorophenyl)-2-[[2-(1,3-Tạp B amlodipin: 3-ethyl 5-methyl

(4RS)-4-(2-clorophenyl)-6-methyl-2-[[2-[[2- (methylcarbamoyl)benzoyl]amino]ethoxy]methyl]-1,4-dihydro-pyridin-3,5- dicarboxylat

Tạp D amlodipin: 3-ethyl 5-methyl

clorophenyl)-6-methylpyridine- 3,5-dicarboxylat

Tạp G amlodipin: dimethyl

4-(2-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat

clorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-1.3 Tổng quan về tạp A của amlodipin (phthaloyl amlodipin)[7]

Công thức phân tử: C28H27ClN2O7

[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2-Tạp H amlodipin:

2-[[2-[[(4RS)-4-(2- clorophenyl)-3-(ethoxycarbonyl)-5-( methoxycarbonyl)-6-methyl-1,4-dihydropyridin-2-yl]methoxy]ethyl]carbamoyl]benzoic acid

Tên khoa học: 3-ethyl 5-methyl 1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)ethoxy]methyl]-6-methyl-1,4-dihydropyridin-

(4RS)-4-(2-clorophenyl)-2-[[2-(1,3-dioxo-3,5-dicarboxylat (Phthaloyl amlodipin)

Khối lượng phân tử: 538,98

Số CAS: 88150-62-3

Một số công trình điều chế phthaloyl amlodipin :

Theo bằng sáng chế của Mỹ số 4572909, phthaloyl amlodipin thu được bằngcách ngưng tụ anhydrid phtalic với amin tương ứng hoặc ngưng tụ 2-clorobenzaldehyd, 4-[2- (thalimido)ethoxy]acetoacetat và methyl-3-aminocrotonat [8] Theo bằng sáng chế WO00/24714, điều chế phthaloylamlodipin bằng phản ứng của ethyl-3-amino-4-(2-phthalimidoetoxy)crotonat

và methyl-2-(2-clorobenzyliden)acetoacetat [10]

Tạp chất carbomethoxy-6-methyl-1,4-dihydropyridin] có thể thu được theo con đườngngưng tụ anhydrid phtalic với animoethanol ở nhiệt độ 160 o

[2-(2-phthalimidoethoxy)methyl-3-carboethoxy-1-(clorophenyl)-5-C tạo thành hydroxyetthyl)phthalimid (I) (I) phản ứng với 4-cloroethyl acetoacetat xúctác natri hydrid ở nhiệt độ -11oC tạo thành II (ethyl-4-[2-phthalimido)ethoxyacetoacetat

N-(2-Tiếp tục phản ứng II với orthobenzaldehyd trong pyridin và methylaminocrotanat trong acid acetic, nhiệt độ phản ứng 20-40 oC tạo thành sảnphẩm thô tạp A của amlodipin [15] Qui trình tổng hợp tạp A được mô tả chitiết sau đây:

+ Bước 1: Ngưng tụ monoethanol amin với anhydrid phtalic

NCH2CH2OH O

O

i O O

O

I (Anhydrid phtalic) II

NCH2CH2OCH2COCH2COOCH2CH3O

O NCH2CH2OH

O Cl

N O

O

iii

III

IV

Bước 3: Ngưng tụ IV với methylaminocrotonat trong acid acetic

O

OCH2CH3O

O

Cl

N O

O O

V iiii

iiii= ngưng tụ với methylaminocrotonat trong acid acetic trong 16 giờ

Sản phẩm V thu được hòa tan trong aceton thêm nước để tinh chế thu đượctạp A của amlodipin [15]

Ngoài ra, các tài liệu nghiên cứu tổng hợp tạp A đều từ tổng hợp amlodipinvới qui trình tương tự

Trong quá trình tổng hợp tạp D của amlodipin, Lê Minh Trí và cộng sự đãtổng hợp chất trung gian là phthaloyl amlodipin (tạp A) từ amlodipin besilat

và anhydrid phtalic trong toluen và AlCl3 [3]

K F Hamak cũng đã tổng hợp các dẫn xuất phtalimid thông qua phản ứnggiữa anhydrid phtalic và các amin tương ứng trong môi trường acid acetic[13]

Ngoài ra, trong nghiên cứu tổng hợp các tetrahydro-β-carbolin từ anhydridphtalic và triptamin, các điều kiện khác nhau của phản ứng ngưng tụ giữaanhydrid phtalic và triptamin được khảo sát Kết quả cho thấy việc ngưng tụdưới điều kiện xúc tác và dung môi là acid acetic cho hiệu suất cao nhất [19]

1.4 Tổng quan về tạp G của amlodipin [7]

Công thức phân tử: C17H18ClNO4

Số CAS: 43067-01-2

Cho đến nay chưa có công bố về tổng hợp tạp G của amlodipin Các công bố

về tổng hợp các dẫn xuất 1,4-dihydropyridin được nghiên cứu nhằm khảo sátđiều kiện xúc tác cho phản ứng tổng hợp Hantzsch

Tổng hợp dẫn xuất 1,4-dihydropyridin bằng phương pháp ngưng tụ Hantzsch

Dẫn xuất 1,4-dihydropyridin (1,4-DHPs) được biết như là tiền chất cho tổnghợp các thuốc điều trị tim mạch huyết áp như nifedipin, felodipin, nicardipin

và amlodipin đã được thương mại hóa trên thị trường và liên quan đến tácdụng dược lý là kết hợp với L-type của kênh calci và làm giảm chuyển hóaion calci hay làm giãn cơ trơn quanh động mạch ngoại biên và ít có tác dụnghơn trên kênh calci cơ tim và giảm áp lực máu [6]

Phản ứng Hantszch được báo cáo lần đầu tiên bởi Arthur Hantszch trong

Justus Liebigs Annalen der Chemie năm 1882 Phản ứng Hantszch tạo ra các

dẫn xuất 1,4 dihydropyrin, gồm 1 đương lượng của aldehyd thơm, 2 đươnglượng của β-ketoacetat và 1 đượng lượng của amoniac hoặc muối amoni,được đun hồi lưu trong dung môi là một alcol [20]

H

Benzaldehyd Ethyl acetoacetat Dẫn xuất 1,4-DHPsMột số con đường tổng hợp dẫn xuất 1,4-DHP bằng phản ứng Hantzsch đượctrình bày ở sơ đồ 1.1 [14]

CH3

CO2R

O

CHO X

2

C I

H

Sơ đồ 1.1 Một số con đường tổng hợp dẫn xuất 1,4-DHP bằng phản ứng

Hantzsch

Từ sơ đồ tổng hợp trên cho thấy dẫn xuất 1,4-DHP (I) được tạo thành bằng

nhiều cách, trong đó phương pháp A và C chỉ áp dụng để tổng hợp các dẫn xuất 1,4-DHP đối xứng, phương pháp B qua 2 giai đoạn tổng hợp, phương pháp D thì phải cần sự tham gia của 3 thành phần để đóng vòng ngưng tụ.

M Filipan-Litvic và cộng sự đã báo cáo qui trình tổng hợp Hantszch các dẫnxuất của 1,4-dihydropyridin, khi tổng hợp các dẫn xuất 1,4-DHP đối xứng

theo con đường C thu được kết quả sau (sơ đồ 1.2): trường hợp tác chất

benzaldehyd mang nhóm thế ở vị trí meta và para thì sản phẩm thu được như

mong đợi là II (dẫn xuất 1,4-DHP đối xứng) Trường hợp tác chất benzaldehyd mang nhóm thế ở vị trí ortho thì sản phẩm chính thu được là I

(1-amino-2-methoxycarbonyl-3,5-bis-(ortho-methoxy-phenyl)-4-oxa-cyclohexan-1-en) [15]

Sơ đồ 1.2 Phản ứng Hantzsch tổng hợp dẫn xuất 1,4-DHP theo con đường C

Cũng trong nghiên cứu trên, khi tổng hợp theo con đường A (sơ đồ 1.3) với

tác chất benzaldehyd mang nhóm thế ở vị trí ortho thì dễ dàng thu được dẫn

xuất 1,4-DHP như mong đợi và không xuất hiện tạp chất I như trên [15].

H3COOC

H3C N

H

COOCH3OCH3

Methoxybenzaldehyd Methylacetoacetat dẫn xuất 1,4- DHP*

*Dimethyl-(2-methoxyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat.

Sơ đồ 1.3 Phản ứng Hantzsch tổng hợp dẫn xuất 1,4-DHP theo con đường A

A Debache và cộng sự đã tổng hợp các dẫn xuất của 1,4-dihydropyridin

I

II

thông qua phản ứng Hantszch với tác nhân xúc tác là triphenylphosphin đạthiệu suất cao [9].

Shu-Xiang Wang và cộng sự đã ngưng tụ các aldehyd, ethyl acetoacetat vàamoni acetat để tạo ra các dẫn xuất 1,4-dihydropyridin dưới sóng siêu âm màkhông cần dung môi và chất xúc tác Phương pháp phản ứng bằng sóng siêu

âm có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp truyền thống, đó là: điều kiệnphản ứng nhẹ nhàng, thời gian phản ứng rút ngắn hơn và hiệu suất cao [21]

1.5 Qui trình kiểm nghiệm tạp chất liên quan trong nguyên liệu amlodipin theo Dƣợc điển Anh 2016 [4]

Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Pha động: dung dịch amoni acetat 2,3 g/l – methanol (30:70, v/v)

Dung dịch thử(a): Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong pha động, pha loãng

thành 50,0 ml với cùng dung môi

Dung dịch thử (b): Pha loãng 5 ml dung dịch thử (a) thành 100 ml với pha

động

Dung dịch đối chiếu (a): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử (a) thành 10,0 ml

bằng pha động Hút chính xác 1,0 ml dung dịch thu được pha loãng thành100,0 ml bằng pha động

Dung dịch đối chiếu (b): Hòa tan 5 mg tạp B và 5 mg tạp G trong pha động,

pha loãng thành 50 ml cùng dung môi Hút chính xác 1,0 ml dung dịch thuđược pha loãng thành 10,0 ml bằng pha động

Dung dịch đối chiếu (c): Hòa tan 5 mg chuẩn amlodipin (có chứa tạp D, E và

F) trong 10 ml pha động

Không dung môi

Dung dịch đối chiếu (d): Hòa tan 5 mg tạp A trong acetonitril, pha loãng

thành 5,0 ml cùng dung môi Hút chính xác 1,0 ml dung dịch thu được phaloãng thành 100,0 ml bằng pha động Tiếp tục pha loãng 1 ml dung dịch thuđược thành 10,0 ml bằng pha động

1.6.3 Các phương pháp sử dụng để định danh chất đối chiếu [22]

Đối với một hợp chất được đã được định nghĩa rõ ràng về cấu trúc, việc địnhdanh có thể được chấp nhận bằng cách so với phổ IR của một hợp chất xácthực Ngoài ra, có thể dùng các phương pháp khác như phổ NMR, MS để sosánh Việc định danh một hợp chất với mục đích thay thế chất chuẩn hóa học

đã được thiết lập trước đó thường được thực hiện bằng cách so sánh phổ hấpthu IR

Tuy nhiên, đối với trường hợp không có sẵn hợp chất xác thực để so sánh, vàcác dữ liệu về các đặc tính của nó không đầy đủ, thì việc định danh bằng cách

áp dụng các phương pháp phân tích hiện nay để tiêu chuẩn hóa các hợp chấtmới như: các phân tích nguyên tố, các nghiên cứu tinh thể học, MS, phổNMR, phân tích các nhóm chức, phổ IR, phổ UV, cũng như các phương phápthử bổ sung khác cũng được yêu cầu cho việc tiêu chuẩn hóa

1.6.4 Các phương pháp xác định độ tinh khiết chất đối chiếu [22]

Các phương pháp xác định độ tinh khiết chất đối chiếu hóa học được chiathành ba nhóm lớn: các phương pháp yêu cầu so sánh với một chất đối chiếu(như các phương pháp sắc ký hoặc quang phổ), các phương pháp dựa vào đặctính động học (như phân tích độ hòa tan, quét nhiệt vi sai) và các phươngpháp khác

- Các kỹ thuật phân tách:

Các phương pháp phân tích dựa trên phân tách sắc ký đặc biệt hữu ích choviệc phát hiện và xác định các tạp chất trong chất đối chiếu hóa học Phương

pháp HPLC được sử dụng rộng rãi nhất, bên cạnh đó là SKLM và GC Độchọn lọc của phương pháp HPLC và GC vượt trội hơn SKLM Phương phápHPLC và GC thuận lợi trong việc định lượng , nhưng đòi hỏi các thiết bị phứctạp.

Phương pháp HPLC với đầu dò UV giúp phát hiện cả thành phần chính và cáctạp chất của nó Sắc ký lỏng với đầu dò MS giúp định danh các tạp chất đượcphân tách và thành phần chính, và đặc biệt quan trọng đối với các chất đốichiếu hóa học không có chất chuẩn hoặc phổ IR chuẩn

Phương pháp GC sử dụng cho định lượng, cũng như xác định các tạp chấtgiống sắc ký lỏng Tuy nhiên, phương pháp GC giúp phát hiện và xác địnhcác tạp chất bay hơi, các dung môi tồn dư trong chất đối chiếu hóa học

SKLM là phương pháp đơn giản, rẻ tiền và dễ dàng thực hiện Trong phươngpháp này, tất cả thành phần của chất cần phân tích sẽ xuất hiện ở một số vị trítrên sắc ký đồ Tuy nhiên, đôi khi phương pháp này không phát hiện được hếtcác tạp chất có trong chất đối chiếu Thường áp dụng SKLM để xác định độtinh khiết một cách sơ bộ trước khi thực hiện các phương pháp đòi hỏi kỹthuật cao hơn

- Phương pháp dựa trên đặc tính nhiệt động học

Phương pháp quét nhiệt vi sai (DSC) được sử dụng để xác định tổng số lượngtạp chât rắn Việc đánh giá độ tinh khiết dựa trên sự nóng chảy của chất cầnphân tích và sự thay đổi điểm chảy của nó gây ra bởi sự hiện diện của các tạpchất Phương pháp này có thể thực hiện nhanh chóng và độ chính xác cao.Tuy nhiên, nó không áp dụng đối với các hợp chất bị phân hủy bởi nhiệt vàcác chất dạng lỏng

- Các phương pháp khác

Các phương pháp quang phổ: UV, IR và NMR đôi khi cũng được áp dụng đểxác định độ tinh khiết

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

-Tạp A: 3-ethyl 5-methyl (4RS)-4-(2-clorophenyl)-2-[[2-(1,3-dioxo- dihydro-2H-isoindol-2-yl)ethoxy]methyl]-6-methyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat

-1,3 Tạp G: dimethyl 4-(2-clorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin- dicarboxylat

-3,5-2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất và dung môi

Amlodipin besilat chuẩn do Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM cung cấp:

- Số kiểm soát: QT145 090516

- Hàm lượng: 100,43% tính trên chế phẩm nguyên trạng

- Điều kiện bảo quản: Đựng trong lọ thủy tinh nâu, nút kín Bảo quản ở

Nguyên liệu amlodipin besilat :

- Nhà sản xuất: Công ty dược phẩm Cadila -Ấn Độ

- Số lô: ALK5APJ19B

- Hàm lượng: 99,95% tính trên chế phẩm nguyên trạng

- Hạn dùng: 8/3/2019

Bảng 2.1 Hóa chất, thuốc thử, dung môi sử dụng

Dicloromethan J.T Baker Tinh chế, SKLM ≥ 99,5%

Methyl acetoacetat Sigma aldrich Tổng hợp ≥ 99%

- C n p n t c 5 số l Mettler Toledo XPE 205, Thụy Sĩ

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao S imadzu LC-20A , detector PDA, Nhật

- Máy đo k ối phổ Shimadzu LC/MS IT-TOF, Nhật

- Máy quang phổ cận hồng ngoại Nicolet iS50 FT-IR, Thermo Scientific,Mỹ

- Hệ t ống quét n iệt vi sai DSC Q20, bộ p ận p n t c mẫu DSC Q20, ệ

t ống làm lạn RCS 40, TA Intrusments, Mỹ

- Máy n iệt trọng lượng TGA/DSC 2, Mettler Toledo, T ụy Sĩ

- Máy đo p ổ cộng ưởng từ hạt nhân AVANCE III, Bruker BioSpin, Thụy

Sĩ, 1

H NMR (500 MHz) và 13C NMR (125 MHz), Viện Hóa học, Viện Hànlâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy cô quay Heidolp , Đức

- Tủ sấy c n k ông VO200, Memmert, Đức

- ể si u m Branson, Mỹ

- Buồng soi UV 2 bư c sóng 254/365 nm, Spectroline, Mỹ

- Cột sắc k : cột Gemini-NX C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) và cột Gemini –NXC18 (150 x 4,6 mm; 5 µm)

- ản sắc k l p mỏng silica gel 60 254 ALUGRAM, Đức

- Silica gel cỡ hạt 40 – 63 µm (Merck) d ng c o sắc k cột

Thiết bị p n t c đã được kiểm tra và hiệu chuẩn theo qui định GLP vàISO/IEC 17025

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Qui trình tổng hợp tạp A và tạp G

2.2.1.1 Qui trình tổng hợp tạp A

 Giai đoạn 1: Chuyển amlodipin besilat thành dạng base [3]