Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của thân rễ thổ phục linh (rhizoma smilacis)

Đề tài được thực hiện nhằm góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của thân rễ Thổ phục linh ở Lâm Đồng.. tại Lâm Đồng do BV Pharma cung cấp Phương pháp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-Ngô Văn Cường

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA

THÂN RỄ THỔ PHỤC LINH (Rhizoma Smilacis)

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Thành phố Hồ Chí Minh – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-Ngô Văn Cường

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA

THÂN RỄ THỔ PHỤC LINH (Rhizoma Smilacis)

Chuyên ngành: Dược liệu – dược cổ truyền

Mã số: 60.720406

Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM ĐÔNG PHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh – 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố

Tác giả

Ngô Văn Cường

TÓM TẮT

Luận văn thạc sĩ – Khóa: 2015 – 2017 Chuyên ngành: Dược liệu – dược cổ truyền – Mã số: 60.720406

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG

OXY HÓA CỦA THÂN RỄ THỔ PHỤC LINH (Rhizoma Smilacis)

NGÔ VĂN CƯỜNG Người hướng dẫn: TS PHẠM ĐÔNG PHƯƠNG

Mở đầu và đặt vấn đề: Thổ phục linh từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian để

chữa đau xương, giang mai, giải độc cơ thể Tại Lâm Đồng, Thổ phục linh được mua bán với lượng rất lớn nhưng hoàn toàn chưa được nghiên cứu Đề tài được thực hiện nhằm góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của thân rễ Thổ phục linh ở Lâm Đồng.

Đối tượng: Thân rễ Thổ phục linh (Smilax sp.) tại Lâm Đồng do BV Pharma cung cấp

Phương pháp nghiên cứu:

Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các cao toàn phần, các phân đoạn cao chiết và các chất phân lập được bằng phương pháp DPPH và TBA.

Sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt, phân bố lỏng-lỏng, sắc ký cột cổ điển, sắc ký cột bán điều chế và các phương pháp tinh chế khác để phân lập các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh.

Xác định cấu trúc của các chất đã phân lập bằng phương pháp phổ học (UV, MS, NMR).

Kết quả và bàn luận:

Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa:

Cao cồn 96% cho tác dụng chống oxy hóa mạnh hơn cao nước, cao cồn 50% và cao methanol Chiết ngấm kiệt bằng cồn 96%, phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được 5 phân đoạn:

cao ether, cao cloroform, cao ethyl acetat, cao n-butanol, cao nước và 2 tủa: tủa ethyl acetat, phần tủa

không tan trong nước.

Trong các phân đoạn trên, cao ethyl acetat và tủa ethyl acetat cho hoạt tính chống oxy hóa mạnh

nhất theo phương pháp DPPH, cao ether và cao n-butanol cho hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất

theo phương pháp TBA.

Phân lập và xác định cấu trúc:

Từ tủa cao ethyl acetat và cao n-butanol, bằng sắc ký cột cổ điển và HPLC bán điều chế đã phân

lập được 3 chất astilbin, isoengeletin và isoastilbin.

Theo phương pháp DPPH, astilbin và isoastilbin có EC 50 lần lượt là 13,45 và 11,43  g/ml, thấp hơn vitamin C (EC 50 3,54  g/ml) khoảng 3 lần Theo phương pháp định lượng MDA, astilbin có EC 50 là 51,7  g/ml, thấp hơn 3 lần so với vitamin C (18,5  g/ml).

Kết luận: Từ tủa ethyl acetat và phân đoạn n-butanol của dịch chiết cồn 96% đã phân lập được 3

chất tinh khiết: astilbin, isoengeletin và isoastilbin, trong đó astilbin và isoastilbin là những chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh.

Master’s thesis – Academic course: 2015 – 2017

Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Speciality code: 60.720406

BIOACTIVITY-GUIDED ISOLATION OF ANTIOXIDANT CONSTITUENTS FROM

THE RHIZOMES OF SMILAX SP (Rhizoma Smilacis)

NGO VAN CUONG Supervisors: Dr PHAM DONG PHUONG

Introduction: Smilax sp has been used widely for a long time in folk medicine to treat rheumatics,

syphilis, to detoxify, etc In Lam Dong, a large amount of Smilax sp have been sold and purchased,

but there is no research yet This thesis is carried out to isolate the components which have

antioxidant activities on DPPH and MDA assay in rhizomes of Smilax sp.

Materials: rhizomes of Smilax sp in Lam Dong were provided by BV Pharma.

Methods:

In vitro screening of extracts, fractions and isolated compounds for the antioxidant activity on

DPPH and TBA assay.

Using percolation, liquid-liquid distribution, column chromatography, semi-prep HPLC and other purification methods.

Structure determination was based on UV, MS and NMR spectrometric methods.

Results and Discussion:

Screening the antioxidant activity:

The ethanol 96% extract shows the highest activity in 4 extracts (water, ethanol 50%, ethanol 96% and methanol).

The ethanol 96% extract was distributed into 5 fractions: petroliumether, chloroform, ethyl acetate,

n-butanol and water fraction 2 precipitations (ethyl acetate and water’s precipitation) were collected.

Ethyl actetate fraction and it’s precipitation have the most potent antioxidant activities on the DPPH

method; ether and n-butanol fraction show the strongest antioxidant activities on the TBA method.

Isolation and structural determination:

From ethyl acetate’s precipitation and n-butanol fraction, by column chromatography and

semi-prep HPLC, 3 substances were obtained: astilbin, isoengeletin and isoastilbin.

According to the DPPH method, astilbin and isoastilbin have EC 50 values 13.45 and 11.43 μg/ml respectively, about three times lower than vitamin C (EC 50 3.54  g/ml) According to the TBA method, astilbin has EC 50 value 51.7 μg/ml, 3 times lower than vitamin C (18.5 μg/ml).

Conclutions: 3 compounds: astilbin, isoastilbin and isoengeletin were isolated from the ethylacetate’s

precipitation and n-butanol fraction, in which astilbin and isoastilbin are potent antioxidants.

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Smilax 2

1.1.1 Vị trí phân loại chi Smilax 2

1.1.2 Tổng quan về thực vật chi Smilax 2

1.1.3 Tổng quan về thành phần hóa học chi Smilax 3

1.1.4 Tổng quan tác dụng dược lý chi Smilax 3

1.2 Tổng quan về Thổ phục linh 4

1.2.1 Tổng quan về thực vật Thổ phục linh 4

1.2.2 Tổng quan thành phần hóa học Thổ phục linh 5

1.2.3 Tổng quan tác dụng dược lý Thổ phục linh 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Dung môi – hóa chất 16

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Soi bột dược liệu 18

2.2.2 Xác định độ tinh khiết 18

2.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 18

2.2.4 Thử tác dụng dược lý 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Soi bột dược liệu 22

3.2 Kết quả thử tinh khiết 23

3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 23

3.4 So sánh Thổ phục linh tại Lâm Đồng và Thổ phục linh miền Bắc bằng sắc ký lớp mỏng 25

3.5 Hoạt tính chống oxy hóa cao toàn phần 25

3.5.1 Phương pháp DPPH 26

3.5.2 Phương pháp định lượng MDA (phương pháp TBA) 27

3.6 Hoạt tính chống oxy hóa các cao phân đoạn 29

3.6.1 Chiết xuất và phân bố cao dược liệu 29

3.6.2 Hoạt tính chống oxy hóa các cao phân đoạn 31

3.7 Phân lập hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa 33

3.7.1 Phân lập 33

3.7.2 Xác định độ tinh khiết các chất phân lập được 38

3.7.3 Xác định cấu trúc 42

3.7.4 Hoạt tính chống oxy hóa các chất phân lập được 50

3.8 Bàn luận 51

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vị trí phân loại chi Smilax 2

Hình 2.1 Dược liệu Thổ phục linh 16

Hình 3.1 Hình soi bột dược liệu Thổ phục linh (vật kính 40X) 22

Hình 3.2 So sánh các loại Thổ phục linh bằng sắc ký lớp mỏng 25

Hình 3.3 Sơ đồ chiết xuất và phân bố cao cồn 96% 30

Hình 3.4 Sắc ký đồ kiểm tra các phân đoạn tủa EA 34

Hình 3.5 Sắc ký đồ phân lập tủa EA bằng sắc ký điều chế 35

Hình 3.6 Sắc ký đồ kiểm tra các phân đoạn cao n-butanol 36

Hình 3.7 Sắc ký đồ phân lập tủa BU1 bằng sắc ký điều chế 37

Hình 3.8 Độ tinh khiết trên SKLM của SG01, SG02 và SG05 38

Hình 3.9 Sắc ký đồ SG01 trên UPLC 39

Hình 3.10 Sắc ký đồ của SG02 40

Hình 3.11 Sắc ký đồ SG05 41

Hình 3.12 Cấu trúc SG01 43

Hình 3.13 Phổ UV của SG02 45

Hình 3.14 Phổ MS của SG02 45

Hình 3.15 Cấu trúc SG02 46

Hình 3.16 Phổ UV của SG05 48

Hình 3.17 Phổ MS của SG05 48

Hình 3.18 Cấu trúc của SG05 49

Hình 3.19 Hoạt tính chống oxy hóa của SG01 và SG05 phương pháp DPPH 51

Hình 3.20 Hoạt tính chống oxy hóa vitC và SG01 phương pháp TBA 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả tro toàn phần, tro không tan trong acid 23

Bảng 3.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 24

Bảng 3.3 Hiệu suất chiết của các cao toàn phần từ thân rễ Thổ phục linh 26

Bảng 3.4 HTCO cao toàn phần phương pháp DPPH 26

Bảng 3.5 EC50 cao toàn phần phương pháp DPPH 27

Bảng 3.6 HTCO cao toàn phần phương pháp TBA 28

Bảng 3.7 HTCO cao toàn phần theo phương pháp TBA 28

Bảng 3.8 Bảng tổng hợp hoạt tính chống oxy hóa của các cao toàn phần 28

Bảng 3.9 Các cao phân đoạn Thổ phục linh 29

Bảng 3.10 HTCO các cao phân đoạn theo phương pháp DPPH 31

Bảng 3.11 HTCO các cao phân đoạn thep phương pháp DPPH 31

Bảng 3.12 HTCO các cao phân đoạn theo phương pháp MDA 32

Bảng 3.13 Giá trị EC50 các cao phân đoạn theo phương pháp TBA 32

Bảng 3.14 HTCO các cao phân đoạn Thổ phục linh 33

Bảng 3.15 Kết quả phân lập trên SKC của tủa EA 34

Bảng 3.16 Bảng tổng kết các phân đoạn cao n-butanol 37

Bảng 3.17 Độ tinh khiết SG01 40

Bảng 3.18 Độ tinh khiết của SG02 41

Bảng 3.19 Độ tinh khiết SG05 42

Bảng 3.20 Phổ NMR của SG01 44

Bảng 3.21 Phổ NMR của SG02 47

Bảng 3.22 Phổ NMR của SG05 50

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

13 C-NMR 13C-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 13C 1

H-NMR 1H-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân proton

COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương quan 1H – 1H

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization

Transfer

Phổ DEPT

DPPH 2,2-Diphenil-1-Picrilhidrazile 2,2-Diphenil-1-Picrilhidrazil

EC Effective Concentration Nồng độ có hiệu quả HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ HMBC

HPLC High-performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSCCC High speed Counter-Current Chromatography Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ HSQC

HTCO Hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

SC Stimulation Concentration Nồng độ kích thích

UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi các thuốc tổng hợp hóa dược ngày càng bộc lộ nhiều tác dụng khôngmong muốn thì con người lại quay về với y học cổ truyền, sử dụng các thảo dược,

an toàn nhưng không kém phần hiệu quả

Rất nhiều loại dược liệu đã và đang được sử dụng để điều trị nhiều bệnh khác nhautại Việt Nam cũng như trên thế giới Trong số đó, phải kể đến các loài thực vật

thuộc chi Smilax.

Ở Việt Nam, Thổ phục linh (Smilax glabra) được sử dụng rộng rãi để làm thuốc

chữa giang mai, đau xương, lợi tiểu, giải độc cơ thể [10], [13] Tại Trung Quốc, Thổphục linh được dùng trị các chứng viêm như: viêm gan, viêm thận, viêm da và điều trịcác bệnh nhiễm khuẩn [53]

Tuy được sử dụng rộng rãi nhưng ở Việt Nam đến nay mới chỉ có một vài nghiêncứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý tập trung vào Thổ phục linh ở miềnBắc (Bắc Giang, Thái Nguyên) [6], [8] Ở một số tỉnh khu vực Tây Nguyên, chủyếu là Lâm Đồng, Thổ phục linh đang được khai thác tự nhiên với trữ lượng khá lớn(khoảng 200 tấn/năm) nhưng loài này chưa được nghiên cứu Để bổ sung cơ sở

khoa học, làm sáng tỏ tác dụng của loài Thổ phục linh này, đề tài “Nghiên cứu hóa

học hướng tác dụng chống oxy hóa của thân rễ Thổ phục linh (Rhizoma Smilacis)” được tiến hành với các mục tiêu sau:

- Khảo sát tác dụng chống oxy hóa của thân rễ Thổ phục linh

- Khảo sát thành phần hóa học và phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất ở cácphân đoạn có tác dụng chống oxy hóa

TỔNG QUAN

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Smilax

1.1.1 Vị trí phân loại chi Smilax

Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [16], chi Smilax có vị trí phân loại như sau:

Hình 1.1 Vị trí phân loại chi Smilax

1.1.2 Tổng quan về thực vật chi Smilax

Smilax cùng với Heterosmilax là 2 chi của họ Khúc khắc (Smilacaceae), một số tài

liệu cũ và hiện tại có thể xếp Smilax vào họ Liliaceae Tuy nhiên khác với các thực vật họ Liliacaeae có gân lá song song, họ Smilacaceae có gân lá hình mạng [54].

Trong họ Smilacaceae, Smilax phân biệt với Heterosmilax bởi đặc điểm của hoa Hoa của Smilax tràng rời, còn tràng hoa của Heterosmilax dính thành ống [54].

Ngành Ngọc lan Magnoliophyta

Giới Thực vật Plantae

Lớp Hành Liliopsida

Bộ Khúc khắc Smilacales

Họ Khúc khắc Smilacaceae

Chi Smilax

TỔNG QUAN

Chi Smilax có khoảng 300 loài, phân bố rộng rãi ở cả vùng nhiệt đới, cận nhiệt và

ôn đới [19] Theo Võ Văn Chi, ở Việt Nam có khoảng 14 loài [5], còn Phạm Hoàng

Hộ đã thống kê được 33 loài [7] Một số loài ở Việt Nam như: S pottingeri, S.

riparia (Kim cang bờ), S china, S davidiana, S petelotii, S feros, S aberrans

subsp aberrans (Kim cang lạc), S aberrans subsp retroflexa (Kim cang dội), S.

mernispermoides, S poilanei, S piumpellata (Kim cang hai tán), S glabra (Thổ

phục linh), S corbularia subsp corbularia (Kim cang thúng nhỏ), S corbularia subsp syandra (Kim cang liên hùng), S elegantissiama, S gagnepainii, S.

ovalifolia (Kim cang lá xoan), S bracteata, S luzonensis, S megacarpa (Kim cang

gai to), S banhinioides, S inversa (Kim cang đảo), S aspericaulis, S cambodiana,

S verticalis, S lanceifolia (Kim cang thon), S prolifera, S cuculloides, S perfoliata, S zeylanica, S melaganthera, S syphillitica.

1.1.3 Tổng quan về thành phần hóa học chi Smilax

Theo thống kê của Li-Wen Tian và cộng sự, từ năm 1967 đến 2016 đã có khoảng

104 saponin steroid được phân lập từ 20 loài khác nhau của chi Smilax, chủ yếu từ

S china, S officinalis, S menispermoides [31].

Flavonoid cũng được tìm thấy nhiều trong chi Smilax: pelargonidin 3-O-rutinosid, một anthocyanidin được tìm thấy trong S aspera; kaempferol, kaempferol-7-O-β-

D-glucopyranosid, quercetin, isorhamnetin, (+)-dihydrokaempferol, engeletin,

isoengeletin được phát hiện có trong S bockii; resveratrol, rutin được phát hiện trong S china [35].

Ngoài ra, trong chi Smilax còn có nhiều hợp chất phenol, lignan khác [25], [35].

1.1.4 Tổng quan tác dụng dược lý chi Smilax

Có nhiều loài thuộc chi Smilax được sử dụng trong y học dân gian ở các nước châu

Á, Mỹ Latin cũng như tại Việt Nam

Y học cổ truyền các nước Nam Mỹ và Mỹ Latin sử dụng nhiều cây thuộc chi Smilax

để điều trị bệnh như S officinalis ở Brazil được sử dụng điều trị gout [38]; S.

medica ở Mexico được dùng để chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm [34].

TỔNG QUAN

Ở Trung Quốc: phần dưới mặt đất của loài S sieboldii được sử dụng làm thuốc chữa viêm khớp, đau lưng và điều trị u nhọt [33]; phần củ của loài S.

menispermoidea được sử dụng làm thuốc giải độc, hỗ trợ điều trị ung thư [48]; thân

rễ của S riparia và S china được dùng làm thuốc lợi tiểu, chống viêm [49].

Người dân một số nước châu Á khác như Đài Loan, Philippin và Nhật Bản dùng củ

của loài S bracteata để chữa bệnh giang mai [39].

Ở nước ta, củ cây Kim cang lá bắc to (S bracteata) được sắc hoặc ngâm rượu có tác dụng lợi tiểu, tiêu độc, chữa đau nhức xương Thân củ Kim cang Campuchia (S.

cambodiana) dùng làm thuốc chữa thấp khớp, đau nhức xương, lá chữa bỏng [2].

Lá non Dây muôn hay Dây gạo (S corbularia) được dùng làm rau ăn, lá già làm

chè uống bổ gân cốt, phần củ chữa ngã bị thương, thấp khớp [3]

1.2 Tổng quan về Thổ phục linh

1.2.1 Tổng quan về thực vật Thổ phục linh

1.2.1.1 Danh pháp

- Tên khoa học: Smilax glabra Roxb.

- Tên khác: Thổ phục linh, Khúc khắc, Kim cang [4], [10], [13]

- Họ: Khúc khắc (Smilacaceae)

1.2.1.2 Mô tả thực vật

Cây có thân leo dài 4 – 5 m, nhỏ, nhẵn, không có gai Lá trái xoan thuôn, đỉnh nhọn,gốc nhọn, có 3 – 5 gân chính xuất phát từ gốc đến đỉnh lá Lá nhẵn, mặt dưới láthường có lớp sáp trắng, cuống lá dài 1 – 1,5 cm Lá kèm biến thành 2 tua cuốn.Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa tán mọc ở nách lá, cuống chung dài 2 – 5 mm,cuống hoa nhỏ dài 1 – 1,5 cm Cây ra hoa vào mùa hạ (tháng 5 - 6) Quả mọng, hìnhcầu đường kính 6 – 8 mm, màu đỏ [4], [10], [13]

1.2.1.3 Đặc điểm sinh thái – phân bố

Ở nước ta Thổ phục linh Smilax glabra mọc hoang ở các vùng đồi núi, cây ưa sáng

và chịu hạn tốt

TỔNG QUAN

Cây có thể nhân giống bằng đầu mầm thân rễ hoặc hạt vào đầu xuân Thu hoạch vàocuối thu, sang đông [4], [10], [13]

1.2.1.4 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến

Thân rễ cắt bỏ rễ nhỏ, rửa sạch, thái thành lát mỏng hoặc để nguyên phơi khô [4],[10], [13]

1.2.2 Tổng quan thành phần hóa học Thổ phục linh

Trong Thổ phục linh có nhiều flavonoid, các hợp chất phenol, lignan, acid hữu cơ,saponin… [41], [53]

- Nhóm taxifolin và dẫn chất: các flavonoid trong nhóm này là taxifolin và các

dẫn chất (glycosid) của taxifolin, bao gồm:

Trong các flavonoid trên, astilbin được coi là thành phần chính

- Nhóm dihydrokaempferon và các dẫn chất: Các flavonoid trong nhóm này

bao gồm dihydrokaempferon và các dẫn chất (glycosid) củadihydrokaempferon, gồm:

1.2.2.4 Phenylpropanoid

Trans-caffeic acid

Acid 5-O-caffeoylshikimic

Acid 3-O-p-coumaroylshikimic Smiglycerol

1-O-p-coumaroylglycerol Juncusyl ester B

TỔNG QUAN

Glucosyringic acid R 1 = CH 3 ,R 2 = glc,R 3 = OCH 3

Protocatechuic acid R 1 = R 2 = R 3 = H 3-Methoxygallic acid R 1 = CH 3 ,R 2 = H,R 3 = OH

1.2.2.6 Các acid hữu cơ và acid béo

2-Methylbutanedioic acid-4-ethyl ester Butan diacid Acid 2,2-dimethylsuccinic

1.2.2.7 Một số dẫn chất khác

Trong cây còn có triterpen (acid acetyl-11-keto-β-boswellic), các sterol (stigmasterol, β-sitosterol, daucosterol), saponin (smilagenin)

Ở Việt Nam, một số nghiên cứu về Thổ phục linh miền Bắc đã phân lập được:

- Flavonoid: astilbin, engeletin, smitilbin [6]

1.2.3 Tổng quan tác dụng dược lý Thổ phục linh

Ở Trung Quốc, Thổ phục linh có tác dụng giải độc, trừ thấp và lợi tiểu, được sửdụng làm thuốc trị các bệnh viêm da, giang mai, kiết lỵ, viêm thận cấp và mạn tính,vẩy nến, chàm [53] Tại Việt nam, dân gian dùng chữa giang mai, đau xương, giảiđộc cơ thể [10], [13] Nhiều nghiên cứu cho thấy Thổ phục linh có các tác dụngdược lý sau:

1.2.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Theo nghiên cứu của Gunhyuk Park và cộng sự, dịch chiết từ thân rễ Smilax glabra

có tác dụng ngăn chặn sự oxi hóa và lão hóa da bởi tia UVB Nghiên cứu bằng cáchcho các mẫu tế bào bình thường, mẫu có tiếp xúc với dịch Trà xanh và mẫu có tiếpxúc với dịch chiết Thổ phục linh phơi nhiễm với tia UV và H2O2 thì thấy mẫu tế bào

có tiếp xúc với dịch chiết Thổ phục linh 200 g/ml cho kết quả bảo vệ tương đươngTrà xanh ở nồng độ 100 g/ml Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết Thổ phục

linh Smilax glabra làm giảm các tác nhân gây oxy hóa và lão hóa da, giảm điện thế

màng ti thể, đồng thời làm tăng glutathion, NAD(P)H dehydrogenase và hemeoxygenase-1 [23]

1.2.3.2 Tác dụng chống viêm

Các hợp chất phenol và polysaccharid của Thổ phục linh có tác dụng chống viêm

TỔNG QUAN

nhờ ngăn chăn sự tạo ra các yếu tố tiền viêm như nitric oxid (NO), α-TNF,

interleukin-6 (IL-6) Thử nghiệm cho thấy phần cao giàu phenol toàn phần củaThổ phục linh ở nồng độ 40 g/ml cho hoạt tính thấp hơn 2 lần khi so sánh vớidexamethazol nồng độ 0,25 g/ml [20], [32]

1.2.3.4 Tác dụng ức chế khối u, chống ung thư

Ngiên cứu của Sameera R Samarakoon và cộng sự cho thấy cao chiết của hỗn hợp

hạt N sativa, rễ H indicus, và thân rễ S glabra ở liều 75 g/ml có tác dụng tănghoạt động gen p53 (ức chế khối u) và và p21 (ức chế cyclin kinase) ở tế bào gan

người (HepG2) in vivo và tế bào gan chuột in vitro qua đó gián tiếp thể hiện tác

dụng chống ung thư tế bào gan [40]

Một nghiên cứu khác của Tiantian She và cộng sự cũng cho thấy dịch chiết nướcThổ phục linh cho tác dụng ức chế tăng trưởng của tế bào ung thư bằng cách dừngpha S của chu kỳ phân bào hoặc gây ra quá trình tự diệt cho tế bào ung thư [44]

1.2.3.5 Tác dụng bảo vệ gan

Nghiên cứu của Daozong Xia và cộng sự cho thấy phần dịch chiết giàu flavonoidcủa Thổ phục linh ở nồng độ 100, 300 và 500 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, hạmen gan (ALT, AST), bảo vệ gan đáng kể khi thử nghiệm tác nhân gây độc ganCCl4 trên chuột [21]

1.2.3.6 Tác dụng kháng virus

Một protein trong Thổ phục linh, có tên là Smilaxin, được chứng minh có tác dụng

ức chế enzym phiên mã ngược HIV-1 (HIV-1-reverse transcriptase) [27] Ngoài ra

TỔNG QUAN

Thổ phục linh có tác dụng kháng virus hợp bào hô hấp (RSV) với (IC50) là 62,5

μg/ml, Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) với IC50 31,3 μg/ml [29], [30]

1.2.3.7 Tác dụng hạ acid uric máu và điều trị Gout

Nhóm nghiên cứu của Wen-Ai Xu và cộng sự cho thấy dịch chiết Thổ phục linh chochuột có nồng độ uric máu cao có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric máu đáng kểthông qua ức chế hoạt động của enzym xanthin oxidase [45]

1.2.3.8 Tác dụng chống dị ứng

Nghiên cứu của Kamonmas Srikwan và Arunporn Itharat cho thấy dịch chiếtethanol 95% với hàm lượng flavonoid cao cho tác dụng chống dị ứng cao hơn caocồn 50%, cao nước cho hoạt tính chống dị ứng thấp nhất, IC50 lần lượt là 5,74 

2,44, 23,54  4,75 và  100 μg/ml [28]

1.2.3.9 Tác dụng trên tim mạch và hệ tuần hoàn

Nghiên cứu cho thấy Thổ phục linh còn có tác dụng gây đông máu [29], [51].Nghiên cứu của Yueqin Cai và cộng sự cho thấy các flavonoid trong Thổ phục linh

có tác dụng chống phì đại cơ tim Phân đoạn cao chiết giàu flavonoid liều 0,5 đến

1.2.3.10 Độc tính

Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết nước Thổ phục linh hầu như không có độc tínhtrên chuột, không gây ra sự thay đổi nào về chức năng gan, thận, hình ảnh mô họcngay cả với liều dùng rất cao [11], [47]

Ở Việt Nam, một số nghiên cứu về tác dụng của Thổ phục linh miền Bắc như:

- Tác dụng chống oxy hóa: nghiên cứu của Trịnh Thị Thanh Vân và cộng sự cho

thấy dịch chiết ethyl acetat của S glabra có thành phần astilbin chiếm 41,5%, có tác

dụng chống oxy hóa cao với kết quả SC50 24,9 µg/ml (phương pháp DPPH), IC509,45 µg/ml (phương pháp TBARS) và ED50 25,25 µg/ml (phương pháp MTT) [43]

TỔNG QUAN

- Tác dụng hạ đường huyết: Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Xuân, Đào Văn Phan vàcộng sự cho thấy dịch chiết đông khô ethanol của Thổ phục linh có tác dụng hạđường huyết trên chuột bị đái tháo đường do làm tăng nhạy cảm của mô đích vớiinsulin Trên chuột nhắt uống liều duy nhất 1 g/kg, Thổ phục linh cho tác dụng hạđường huyết khoảng 10,58%, nếu dùng liên tục trong 7 ngày, tác dụng hạ đườnghuyết khoảng 26,78% [11], [12] Ngoài ra acid betulinic được phân lập từ dịch chiết

n-hexan Thổ phục linh có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase rất mạnh, với giá trị

IC50 là 72,1 µg/mL, mạnh hơn nhiều so với chứng acarbose [9]

ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

2.1.1 Nguyên liệu

- Phần thân rễ Thổ phục linh (Smilax sp.) được thu mua tại Lâm Đồng do công ty

BV Pharma cung cấp Dược liệu tươi được rửa sạch, thái lát, phơi hoặc sấy ở 70 oCđến khô Xay thành bột thô để chiết xuất và xay thành bột mịn để thử tinh khiết vàxác định hàm lượng chất chiết được

Hình 2.1 Dược liệu Thổ phục linh

(Thân rễ và thân rễ đã được thái mỏng)

2.1.2 Dung môi – hóa chất

2.1.2.1 Dùng cho chiết xuất-phân lập

- Dung môi: cồn 96%, methanol, n-hexan, cloroform, ethylacetat loại AR của

Xilong, Trung Quốc, methanol Labcan Thái Lan

- Hóa chất và thuốc thử: Dragendorff, Valse-Mayer, NaOH, FeCl3, H2SO4…

- Silica gel sắc ký cột kích thước hạt 0,04 – 0,063 mm của Merck

- Silica gel sắc ký lớp mỏng: bản nhôm tráng sẵn silica gel F254 của Merck

2.1.2.2 Dùng cho thử hoạt tính sinh học

- 2,2-Diphenil-1-Picrilhidrazil, vitamin C, quercetin mua của Sigma-Aldrich

- Hóa chất KCl, acid tricloacetic, acid thiobarbituric, kali monophosphat, kalidiphosphat loại AR của Xi long, Trung Quốc

- Cân phân tích Sartorius độ nhạy 0,1 mg

- Cân điện tử độ nhạy 0,1 g

- Cột thủy tinh dành cho sắc ký cột cổ điển và sắc ký cột nhanh

- Đèn soi UV hai bước sóng 254 nm và 365 nm

- Bình hút ẩm với chất hút ẩm là silica gel

- Tủ sấy hiệu Memmert (Đức)

- Lò nung Lenton (Anh)

- Máy cô quay IKA

- Bể siêu âm Elma S180

- Một số dụng cụ thường quy trong phòng thí nghiệm

2.1.3.2 Dùng trong thử nghiệm dược lý

- Pippetman thể tích tối đa 100-1000 µl, 20-200 µl (Hirschmann, Đức)

- Máy đo pH Eco Testr pH2 (Eutech & Oakton, Singapore)

- Cân kỹ thuật TE412 (Satorius, Đức)

- Cân phân tích CP225D (Satorius, Đức)

- Máy vortex VX100 (Labnet, Hoa Kỳ)

- Bếp cách thủy WB22 (Memmert, Đức)

- Máy li tâm Z206A (Hermle, Đức)

2.1.3.3 Các thiết bị sắc ký và phân tích cấu trúc

- Máy sắc ký lỏng bán điều chế

- Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC

- Máy đo khối phổ (Micromass Quattro microTM API – Waters)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) BRUKER - AV - 500, tại Viện hóahọc – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Soi bột dược liệu

Dược liệu được xay min, rây, quan sát dưới kính hiển vi

2.2.2 Xác định độ tinh khiết

2.2.2.1 Xác định độ ẩm

Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.6, PL-182

2.2.2.2 Xác định tro toàn phần

Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.8

2.2.2.3 Xác định tro không tan trong HCl

Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.7, phương pháp 1

2.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.3.1 Xác định sơ bộ thành phần hóa học

Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của toàn cây Thổ phục linh theo quy trình mô tảtrong giáo trình “Phương pháp nghiên cứu dược liệu” của Bộ môn Dược liệu, KhoaDược, Đại học Y Dược TP.HCM, năm 2013 [1]

2.2.3.2 Chiết xuất cho thử nghiệm sinh học

- Cân chính xác một lượng bột Thổ phục linh (4 mẫu), mỗi mẫu chiết bằng mỗidung môi khác nhau, bao gồm: methanol, cồn ethylic 90%, cồn ethylic 50%, nước.Thu hồi dung môi để thu được các cao methanol, cao cồn ethylic 90%, cao cồnethylic 50% và cao nước Tiến hành thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa đối vớimỗi loại cao Chọn dung môi để chiết xuất và nghiên cứu hóa học

- Chọn dung môi chiết xuất (dung môi có tác dụng chống oxy hóa tốt nhất đã chiết

và thử nghiệm ở trên), tiến hành chiết và thu hồi dung môi để được cao lỏng Lắcphân bố cao lỏng với các dung môi lần lượt là ether dầu hỏa, CHCl3, ethyl acetat, n-

BuOH và phần còn lại không phân bố vào các dung môi trên Bay hơi dung môi đểđược các cao tương ứng Tiến hành thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa đối với mỗi

ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

loại cao Chọn các phân đọan có tác dụng sinh học tốt để nghiên cứu hóa học vàphân lập các hợp chất tinh khiết trong các phân đoạn trên

2.2.3.3 Phân lập các phân đoạn bằng sắc ký

Nguyên tắc: dựa trên tính chất hấp phụ khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cầntách với chất hấp phụ (pha tĩnh), dùng dung môi thích hợp (pha động) chạy qua phatĩnh để giải hấp phụ, từ đó tách riêng được từng cấu tử trong hỗn hợp

- Sắc ký lớp mỏng: dùng để khảo sát, định tính

- Sắc ký cột nhanh hoặc sắc ký cột cổ điển để phân lập các chất từ các phân đoạn

- Sắc ký rây phân tử: tách các chất khác nhau về trọng lượng phân tử

- Sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

2.2.3.4 Tinh chế chất phân lập được

Phương pháp tinh chế áp dụng đối với chất rắn tan hoàn toàn trong dung môi thíchhợp có gia nhiệt, lọc và để lạnh cho kết tinh Rửa tinh thể bằng dung môi lạnh, lọclấy tinh thể và làm khô trong chân không Trong trường hợp vẫn chưa tinh khiết thìkết tinh lại vài lần để thu được hợp chất tinh khiết [1]

2.2.3.5 Xác định độ tinh khiết và hàm lượng chất phân lập được

 Sắc ký lớp mỏngXác định độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM: sản phẩm được chấm trên 3 bảnmỏng riêng biệt, khai triển với 3 hệ dung môi khác nhau, phát hiện bằng UV dướihai bước sóng 365 nm, 254 nm Phát hiện bằng thuốc thử VS: sau khi nhúng thuốcthử, để bản mỏng khô tự nhiên và hơ nóng để hiện màu, chụp ảnh sắc ký đồ bằngmáy ảnh kỹ thuật số Trong mọi trường hợp, các sản phẩm kết tinh đều phải cho duynhất 1 vết gọn trên sắc ký đồ [1]

 Sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLCTiến hành kiểm tra tinh khiết các chất phân lập được bằng UPLC theo điều kiện sắckí đã khảo sát

ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.3.6 Xác định cấu trúc chất phân lập được

Phổ UV của các sản phẩm kết tinh được đo trên máy UV Mẫu được hòa trong dungmôi, ghi nhận đỉnh hấp thu cực đại (λmax, nm)

Phổ khối của các hợp chất phân lập được đo phổ MS trên máy LC-MS Tín hiệu

được ghi nhận theo số khối (m/z) và cường độ tương đối (relative intensity, %)

Phổ NMR được đo với các kỹ thuật 1-D và 2-D (1H-NMR,13C-NMR, DEPT,HSQC, COSY, HMBC) Mẫu được hòa trong CDCl3, DMSO-d6 hoặc MeOD Độ dời hóa học tính theo thang δ (ppm) với δTMS = 0,00 ppm và tín hiệu đo dung môi

DMSO [δH = 2,50 ppm (s); δC = 39,5 ppm (t)], tín hiệu đo dung môi MeOD [δH =

3,31 ppm (s); δC = 49,0 ppm (t)] thực hiện trên máy AVANCE 500 Bruker tại Phòng

NMR, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Kết hợpcác dữ liệu ghi nhận được với các dữ liệu trong các tài liệu tham khảo để địnhhướng, biện giải, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

2.2.4 Thử tác dụng dược lý

2.2.4.1 Phương pháp bắt giữ gốc tự do DPPH

Nguyên tắc: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu

tía và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó

sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazin (DPPH-H), có màu vàng Đo độgiảm độ hấp thu ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chấtchống oxi hóa [18]

Tiến hành: Cho 1 ml dung dịch DPPH (nồng độ 0,2 mM trong methanol) vào 1 ml

dung dịch cao thử có nồng độ khác nhau trong methanol Hỗn hợp được lắc đều và

ủ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối Ðo độ hấp thu sau 30 phút ở bước sóng 517 nm.Mẫu chứng được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng không sử dụng cao

Tiến hành 3 lần, lấy giá trị trung bình

ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tính hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) theo công thức:

HTCO (%) = [(ODchứng - ODthử)/ODchứng] x 100

ODchứng: độ hấp thu của mẫu chứng

ODthử: độ hấp thu của mẫu thửThông qua phương trình hồi quy lập được, xác định EC50 của mẫu thử [18]

2.2.4.2 Phương pháp định lượng MDA (phương pháp TBA)

Nguyên tắc: Peroxid hóa lipid là một cơ chế thường gặp của những tế bảo bị tổn

thương trong thực vật và động vật, nó được coi như là chất chỉ thị của quá trìnhstress oxy hóa trong tế bào và mô Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid thôngqua việc xác định hàm lượng MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid,khi cho phản ứng với acid thiobarbiturric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân

tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thụ cực đại ở bước sóng 532 nm Phảnứng được thực hiện ở môi trường pH 2-3, ở nhiệt độ 90-100 oC trong vòng 10-15phút Sau đó đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu [17]

Tiến hành: Nghiền đồng thể gan chuột trong dung dịch KCl 1,15% (tỉ lệ 0,1 g/ml)

ở nhiệt độ 0-5 oC Cho 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ khác nhau phản ứng với 0,5

ml dịch đồng thể gan Thêm đệm phosphat 50 mM vừa đủ 2 ml, ủ hỗn hợp 15 phút

ở 37 oC và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10% Sau khi ly tâm 3000vòng trong 10 phút, lấy 1 ml dịch trong phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8%

ở 100 o

C trong 15 phút Làm lạnh, đo độ hấp thu bước sóng 532 nm

Mẫu chứng được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng không sử dụng cao

Thực hiện 3 lần, lấy giá trị trung bình

Tính hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) theo công thức:

HTCO (%) = [(ODchứng - ODthử)/ODchứng] x 100

ODchứng: độ hấp thu của mẫu chứng

ODthử: độ hấp thu của mẫu thửThông qua phương trình hồi quy lập được, xác định EC50 của mẫu thử [17]

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Soi bột dược liệu

Hình 3.1 Hình soi bột dược liệu Thổ phục linh (vật kính 40X)

A Tinh thể calci oxalat hình kim nằm rải rác

B Tinh thể calci oxalat hình kim trong tế bào

C Hạt tinh bột rời

D Hạt tính bột kép ba

E Hạt tinh bột kép đôi

F, G, H Mảnh mạch vạch

I Khối nhựa

K Tế bào mô cứng

L, M Sợi mô cứng

Bột màu nâu đỏ, quan sát dưới kính hiển vi thấy:

- Hạt tinh bột: rất nhiều, hạt đơn, hoặc dính vào nhau kép đôi, kép ba; hình cầu,hình đa giác, hình vuông hoặc hình chuông; tễ có dạng kẽ nứt, hình sao hoặc hìnhchữ Y, một số hạt không thấy tễ

- Tinh thể calci oxalat hình kim xếp thành bó nằm trong tế bào hoặc rải rác bênngoài tế bào

- Các tế bào mô cứng vách mỏng hoặc dày, các sợi mô cứng vách dày riêng lẻ hoặc

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

xếp thành đám

- Các mảnh mạch vạch, khối màu

3.2 Kết quả thử tinh khiết

Bảng 3.1 Kết quả tro toàn phần, tro không tan trong acid Lần thử P mẫu (g) Độ ẩm (%) Tro toàn phần (%) Tro không tan trong acid (%)

3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của Thổ phục linh như sau:

Dịch chiết cồn

Dịch chiết nước

Ghi chú: (–) không có, (+) có ít, (++) có, (+++) có nhiều

Có thể có phản ứng nhưng không thực hiện Không có mặt của nhóm hợp chất trong dịch chiết

Kết luận sơ bộ: thân rễ Thổ phục linh có chứa các nhóm hợp chất triterpenoid tự do,flavonoid, saponin, acid hữu cơ, chất khử

Hình 3.2 So sánh các loại Thổ phục linh bằng sắc ký lớp mỏng

(MB: Thổ phục linh Miền Bắc, DL: Thổ phục linh Lâm Đồng)

Kết quả: Thổ phục linh tại Lâm Đồng khác Thổ phục linh Miền Bắc khi so sánh trênsắc ký lớp mỏng

3.5 Hoạt tính chống oxy hóa cao toàn phần

Dược liệu được chiết xuất cho hoạt tính chống oxy hóa với điều kiện sau:

- Khối lượng dược liệu: 50 g, độ ẩm 8,83%

- Thể tích dung môi mỗi lần chiết: 200 ml

- Đun nhẹ trên cách thủy ở 80 oC trong 60 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ Lọc, lặp lạithêm 3 lần nữa

MB DL MB DL

UV 365 UV 254

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

- Gộp chung dịch lọc, cô dung môi để thu được cao chiết

Bảng 3.3 Hiệu suất chiết của các cao toàn phần từ thân rễ Thổ phục linh Cao toàn phần thu được từ 50 g dược liệu (độ ẩm 8,83%)

Dung môi Khối lượng cao (g) Độ ẩm cao (%) Hiệu suất chiết (%)

Mẫu thử: dung dịch nồng độ 1 mg/ml trong methanol của các cao toàn phần (cao

cồn 96%, cao cồn 50%, cao methanol, cao nước)

Dung dịch DPPH: 0,2 mM, pha trong methanol.

Tiến hành

- Cho 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM vào lọ chứa 1 ml mẫu thử, lắc đều, để trongtối Sau 30 phút đo OD ở bước sóng 517 nm (ODthử)

- Mẫu chứng: cho 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM vào lọ chứa 1 ml MeOH, lắc đều,

để trong tối Sau 30 phút đo OD ở bước sóng 517 nm (ODchứng)

Tính toán kết quả: HTCO (%) = [(ODchứng - ODthử)/ODchứng] x 100

Kết quả:

Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) của các cao toàn phần ở nồng độ

500 µg/ml được trình bày trong Bảng 3.4

Bảng 3.4 HTCO cao toàn phần phương pháp DPPH

Cao cồn 96% 96,70 Cao cồn 50% 95,81 Cao methanol 96,01

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

Kết quả cho thấy các cao trên có hoạt tính cao ở nồng độ 500 µg/ml Tiếp tục thửhoạt tính chống oxy hóa của các cao ở nồng độ thấp hơn để xây dựng đường tuyếntính, từ đó xác định giá trị EC50 chống oxy hóa của các cao trên Kết quả được sosánh với chất đối chiếu vitamin C Kết quả được trình bày ở Bảng 3.5

Bảng 3.5 EC50 cao toàn phần phương pháp DPPH

Mẫu thử Đường tuyến tính R 2 EC50 (µg/ml)

Mẫu thử: dung dịch nồng độ 1 mg/ml trong methanol của các cao toàn phần (cao

cồn 96%, cao cồn 50%, cao methanol, cao nước)

Hóa chất khác: đệm phosphat 50 mM, acid tricloacetic 10%, acid thiobarbituric

0,8% pha trong nước cất

Tiến hành

- Cho 0,1 ml mẫu thử phản ứng với 0,5 ml dịch đồng thể gan Thêm đệm phosphatvừa đủ 2 ml, ủ ở 37 oC trong 15 phút

- Thêm 1 ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 3000 vòng trong 10 phút

- Lấy 1 ml dịch trong phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở 100 oC trong 15phút Làm lạnh, đo độ hấp thu bước sóng 532 nm (ODthử)

Mẫu chứng được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng thay 0,1 ml mẫu thử bằng0,1 ml methanol (ODchứng)

Tính toán kết quả: HTCO (%) = [(ODchứng - ODthử)/ODchứng] x 100

Thực hiện 3 lần, lấy giá trị trung bình

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

Kết quả

Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp định lượng MDA của

các cao toàn phần ở nồng độ 50 µg/ml được trình bày trong Bảng 3.6.

Bảng 3.6 HTCO cao toàn phần phương pháp TBA Cao toàn phần HTCO (%)

Bảng 3.7 HTCO cao toàn phần theo phương pháp TBA Cao toàn phần Đường tuyến tính R 2 EC50 (µg/ml)

Cao cồn 96% y = 2,5928x + 22,313 0,9719 11,4

Cao cồn 50% y = 1,5071x + 29,88 0,9656 13,62 Cao methanol y = 1,281x + 34,523 0,9352 11,99 Cao nước y = 1,0839x + 32,391 0,9778 16,44 Quercetin y = 62,444x - 9,0644 0,9906 0,95

Nhận xét hoạt tính chống oxy hóa cao toàn phần

Bảng 3.8 Bảng tổng hợp hoạt tính chống oxy hóa của các cao toàn phần Cao EC 50 pp DPPH (g/ml) EC 50 pp TBA (g/ml)

3.6 Hoạt tính chống oxy hóa các cao phân đoạn

3.6.1 Chiết xuất và phân bố cao dược liệu

9 kg dược liệu được chiết ngấm kiệt bằng cồn 96%, sơ đồ chiết xuất và phân bố caocồn 96% như Hình 3.3 và Bảng 3.9

Bảng 3.9 Các cao phân đoạn Thổ phục linh Phân đoạn Khối lượng (g) Độ ẩm (%)