Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần lipid, axit béo của san hô thủy tức Millepora thu thập tại vùng biển Việt Nam theo các tháng trong năm

Mục tiêu của đề tài là xác định hàm lượng lipid tổng của các mẫu Millepora platyphylla thu được trong 12 tháng; phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid của các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla thu thập được trong 12 tháng; phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất phospholipid của các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla thu thập được trong 12 tháng

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Đặng Thị Minh Tuyết

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIPID, AXIT BÉO CỦA SAN HÔ

THỦY TỨC MILLEPORA THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN

VIỆT NAM THEO CÁC THÁNG TRONG NĂM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - năm 2020

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Đặng Thị Minh Tuyết

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIPID, AXIT BÉO CỦA SAN HÔ

THỦY TỨC MILLEPORA THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN

VIỆT NAM THEO CÁC THÁNG TRONG NĂM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đặng Thị Phương Ly

Hà Nội - năm 2020

Lời cam đoan

Luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Đặng Thị Phương Ly

Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Đặng Thị Minh Tuyết

Lời cảm ơn

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Đặng Thị Phương Ly, người cô bằng cả tâm huyết của mình đã hướng dẫn và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (VAST), Trung tâm nghiên cứu Quốc gia về sinh vật biển – Phân viện Viễn Đông – LB Nga, GS.TS Phạm Quốc Long, PGS.TS Đoàn Lan Phương và các anh chị Phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp tôi về cơ sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm, các kiến thức thực nghiệm…để tôi hoàn thành tốt luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các thầy cô trong Học Viện Khoa học và Công nghệ, Khoa Hóa học đã giảng dạy, hỗ trợ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bàn bè, những người thân luôn động viên để tôi có động lực trong công việc và hoàn thành tốt luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt

aminoethylphosphonate

Ceramide aminoethylphosphonate

Danh mục bảng

Bảng 2.1 Các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla được nghiên cứu 18 Bảng 3.1 Hàm lượng lipid tổng của các mẫu san hô thủy tức Millepora

platyphylla được nghiên cứu 26

Bảng 3.2 Thành phần các lớp chất lipid trong lipid tổng của các mẫu san hô

thủy tức Millepora platyphylla 29

Bảng 3.3 Thành phần các lớp chất phospholipid của các mẫu san hô thủy tức

Millepora platyphylla 36

Bảng 3.4 Thành phần và hàm lượng các axit béo trong lipid tổng của các

mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla (%) 41

Danh mục hình

Hình 1.1 San hô thủy tức Millepora platyphylla 7

Hình 1.2 Sự phân bố các dạng phân tử alkenylacyl, alkylacyl và diacyl trong

một số lớp chất phospholipid chính của 3 loài san hô thủy tức MP: Millepora platyphylla; MD: Millepora dichotoma; AS: Allopora steinegeri và 5 loài san

hô mềm SM: Sinularia macropodia; CS: Capnella sp.; XS: Xenia sp.; GR: Gersemia rubiformis; GF: Gersemia fruticosa [25] 11

Hình 1.3 Hàm lượng (%) các axit béo C20 – C22 n-6, n-3 trong các mẫu san

hô thủy tức thu thập ở vùng biển Việt Nam và vùng biển Okhotsk [25] 12

Hình 1.4 Sự sử dụng các axit béo chìa khóa trong sinh tổng hợp các

phospholipid ở mẫu san hô thủy tức Millepora thu thập tại vùng biển Việt Nam và Allopora thu thập ở vùng biển Okhotsk [25] 12

Hình 3.1 Sắc kí đồ phân tích hàm lượng các lớp chất lipid bằng chương trình

phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga) 28

Hình 3.2 Sắc kí đồ phân tích hàm lượng các lớp chất phospholipid bằng

chương trình Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga) 35

Hình 3.3 Phổ GC methyl ester của axit béo trong lipid tổng mẫu san hô thủy

tức Millepora platyphylla Mp.1 40

Danh mục biểu đồ Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ hàm lượng lipid tổng tính trên trọng lượng khô / hàm lượng

lipid tổng trên trọng lượng tươi của các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 27

Biểu đồ 3.2 Hàm lượng lớp chất axit béo tự do (FFA) trong lipid tổng của

các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 30

Biểu đồ 3.3 Hàm lượng lớp chất sterol (ST) và lipid phân cực (PL) trong

lipid tổng các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 31

Biểu đồ 3.4 Hàm lượng lớp chất monoalkyldiacylglycerol (MADAG) và sáp

(W) trong lipid tổng các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 32

Biểu đồ 3.5 Hàm lượng lớp chất triacylglycerol (TAG) trong lipid tổng các

mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 33

Biểu đồ 3.6 Hàm lượng lớp chất phosphatidylinositol (PI) và

phosphatidylserine (PS) trong tổng phospholipid các mẫu san hô thủy tức

Millepora platyphylla 37

Biểu đồ 3.7 Hàm lượng lớp chất ceramide aminoethylphosphonate (CAEP)

trong tổng phospholipid các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 38

Biểu đồ 3.8 Hàm lượng lớp chất phosphatidylchonline (PC) và

phosphatidylethanolamine (PE) trong tổng phospholipid các mẫu san hô thủy

tức Millepora platyphylla 39

Biểu đồ 3.9 Hàm lượng axit béo no và axit béo không no trong lipid tổng các

mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 43

Biểu đồ 3.10 Hàm lượng axit béo 12:0, 14:0, 16:0, 18:0 trong lipid tổng các

mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 44

Biểu đồ 3.11 Tỉ lệ hàm lượng axit béo n-3/n-6 trong thành phần axit béo của

các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 45

Biểu đồ 3.12 Hàm lượng axit béo 20:4n-6, 20:5n-3, 22:5n-6, 22:6n-3 trong

thành phần axit béo của các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 46

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt iii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

Danh mục biểu đồ vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3

1.1.1.Giới thiệu về lớp Hydrozoa 3

1.1.2.Vài nét về san hô thủy tức Millepora 4

1.1.3.Tình hình nghiên cứu san hô thủy thức 7

1.2 GIỚI THIỆU VÀ Ý NGHĨA CỦA LIPID VÀ AXIT BÉO 13

1.2.1.Giới thiệu về lipid và axit béo 13

1.2.2.Ý nghĩa của việc nghiên cứu lipid, axit béo 15

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1.NGUYÊN LIỆU 18

2.2.SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU CHUNG 23

2.3.PHƯƠNG PHÁP 23

2.3.1 Phương pháp chiết lipid tổng 23

2.3.2 Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid 24

2.3.3.Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất phospholipid 24

2.3.4 Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng axit béo 25CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 263.1 HÀM LƯỢNG LIPID TỔNG TRONG CÁC MẪU SAN HÔ THỦY

TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA 26

3.2 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC LỚP CHẤT LIPID CỦA CÁC

MẪU SAN HÔ THỦY TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA 28

3.3 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC LỚP CHẤT PHOSPHOLIPID

CỦA CÁC MẪU SAN HÔ THỦY TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA 34

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

MỞ ĐẦU

Các rạn san hô là một phần không thể thiếu của đại dương, và hệ sinh thái rạn san hô Việt nam là một trong những khu vực có tính đa dạng cao nhất của vùng biển Ấn độ Thái Bình Dương Trong đó, san hô thủy tức Millepora

là một phần quan trọng của các quần xã rạn san hô, tương tự như san hô cứng, chúng góp phần đáng kể vào việc bồi tụ các rạn san hô Mặc dù san hô thủy tức Millepora cạnh tranh với các loài khác trong việc xây dựng các rạn san hô, nhưng chúng cũng góp phần vào việc ngăn chặn sự phát triển của loài sao biển gai Acanthaster - một yếu tố làm suy thoái các rạn san hô Chính vì vậy san hô thủy tức Millepora có vai trò quan trọng trong quá trình phục hồi rạn san hô Sự phát triển hay suy thoái của chúng ảnh hưởng trực tiếp tới sự phát triển của rạn san hô và quần thể các sinh vật biển sống trong rạn Mặc dù san

hô thủy tức Millepora có tầm quan trọng lớn trong bộ khung bền vững của các rạn san hô bên cạnh các loài san hô cứng khác và đối với việc bảo tồn rạn san

hô, nhưng những nghiên cứu về loài này vẫn còn chưa được thực hiện nhiều Thành phần lipid của đối tượng sinh vật là một thành phần hóa học quan trọng, các chỉ số về lipid ẩn chứa nhiều thông tin thú vị về sinh hóa của đối tượng được nghiên cứu, tuy nhiên nghiên cứu trong nước về lipid của đối tượng này hầu như chưa có

Sự biến đổi khí hậu toàn cầu do nhiệt độ bề mặt nước biển tăng cùng với nhiều hoạt động của con người về khai thác biển… đã gây ảnh hưởng lớn đến rạn san hô dẫn đến suy thoái, trắng hoá… Việc nghiên cứu sự biến động theo mùa của thành phần các lipid có vai trò đánh dấu sinh học ở rạn san hô Việt Nam trong điều kiện sống tự nhiên mới bắt đầu được thực hiện trong những năm gần đây và các số liệu hầu hết còn chưa hoàn thiện Việc nghiên cứu sự biến động các chỉ số phân tích về lipid của đối tượng này theo thời gian trong năm là rất cần thiết để nắm bắt phần nào quy luật phát triển của chúng Nghiên cứu những thay đổi về thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid, axit béo của san hô thủy tức giống Millepora, đánh giá sự biến động hoặc ổn định của thành phần lipid, axit béo của đối tượng nghiên cứu theo

mùa sẽ góp phần có thêm thông tin hữu ích, làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn và hướng tới những biện pháp bảo tồn và phát triển rạn san hô…

Do đó, chúng tôi quyết định lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần

lipid, axit béo của san hô thủy tức Millepora thu thập tại vùng biển Việt Nam theo các tháng trong năm” theo các nội dung sau:

- Xác định hàm lượng lipid tổng của các mẫu Millepora platyphylla thu

được trong 12 tháng

- Phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid của các mẫu san

hô thủy tức Millepora platyphylla thu thập được trong 12 tháng

- Phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất phospholipid của các

mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla thu thập được trong 12 tháng

- Phân tích thành phần và hàm lượng các axit béo của các mẫu san hô

thủy tức Millepora platyphylla thu thập được trong 12 tháng

- Đánh giá các kết quả thu được về tính biến động (hoặc ổn định) của thành phần các lớp chất lipid và axit béo của các mẫu san hô thủy tức theo 12 tháng trong năm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1 Giới thiệu về lớp Hydrozoa

Trong ngành Cnidaria (Ruột khoang) người ta phân biệt ra 4 lớp: Hydrozoa, Scyphozoa, Cubozoa và Anthozoa Trong đó, san hô thuộc Anthozoa, còn san hô thủy tức thuộc Hydrozoa Hydrozoa thuộc lớp động vật không xương sống, các loài thuộc đa số có kích thước nhỏ vài centimet trừ tập đoàn sứa ống dài vài chục mét Số lượng các loài Hydrozoa có trên khoảng

3100 loài và được chia thành 2 phân lớp là Hydroidea và Siphonophora Các loài thuộc Hydrozoa thường có hai dạng hình thái: dạng thuỷ tức (polyp) sống

cố định và dạng thuỷ mẫu (medusa) thì sống trôi nổi Dạng thủy tức có thể xuất hiện trong thời gian dài của chu trình sống hoặc trong suốt chu trình sống như ở

loài Pelmatohydra oligactic, chúng sống ở nước ngọt như ao, hồ nước sạch Dạng thuỷ mẫu (medusa) chỉ thấy ở các loài sống dưới biển Trong Hydrozoa

tồn tại hai dạng là cá thể và tập đoàn, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới Ở

Việt Nam, số loài thuộc Hydrozoa rất phong phú, nhất là ở Phú Quốc, Côn

Đảo, chủ yếu là dạng tập đoàn [1]

Vòng đời của Hydrozoa phức tạp và rất đa dạng Ở nhiều loài Hydrozoan, vòng đời của chúng bao gồm một ấu trùng planula (hình thành từ trứng thụ tinh) sống tự do biến đổi thành một polyp sơ cấp Các polyp sơ cấp nảy chồi các polyp khác để tạo ra giai đoạn cư trú sinh vật đáy Khi trưởng thành về mặt sinh sản, các polyp nảy chồi, cuối cùng hình thành giao tử và sinh sản trong cột nước Trong các Hydrozoan tồn tại một sự biến đổi bất thường trong vòng đời này, được phản ánh trong một loạt các hình thái đa dạng polyp, medusa cũng như mất hoặc giảm hoàn toàn giai đoạn polyp hoặc medusa ở một số loài Sự đa dạng về kích thước Hydrozoan liên quan đến sự thay đổi hình thái của các giai đoạn vòng đời này là thời điểm quan trọng để phân loại Các Hydrozoan thể hiện sự đa dạng của các quần thể khác nhau, từ các quần thể hình khối và giống như thảm, hay mọc thẳng đứng, phân nhánh không đều hoặc phân nhánh đều đặn… Dù ở cùng một loài nhưng hình dạng của tập đoàn cũng có thể khác nhau phụ thuộc vào điều kiện sinh trưởng và

sinh sống của tập đoàn đó, như cường độ ánh sáng thu nhận được hay ảnh hưởng của sóng và tốc độ chuyển động của nước [2]

Các xúc tu của polyp bẫy mồi bằng cách sử dụng các tế bào gai chứa chất độc làm tê liệt con mồi như sinh vật phù du, cá nhỏ và ấu trùng của các loài nhuyễn thể Khi có tiếp xúc chúng phản ứng rất nhanh bằng cách tiêm chất độc vào con mồi làm cho con mồi tê liệt hoặc chết Sau đó các xúc tu kéo con mồi vào trong dạ dày của polyp bằng một dải biểu mô co giãn Các chất độc này ở san hô lửa có thể đủ mạnh để gây tổn thương cho cả con người

1.1.2 Vài nét về san hô thủy tức Millepora

San hô thủy tức và san hô cứng thường có rất nhiều đặc điểm giống nhau cả về hình dạng và sinh thái Điều này một phần bắt nguồn từ môi trường sống đồng nhất trong rạn san hô Cả hai nhóm đều bao gồm các quần thể dạng đứng hoặc dạng quây với cấu trúc vôi góp phần tạo nên cấu trúc đá ngầm của rạn Cơ chế canxi hóa tế bào của hai nhóm cũng tương đồng

San hô thủy tức có hai họ khác nhau bao gồm: Milleporidae và Stylasteridae, đều hình thành bộ khung vôi hóa nhưng khác nhau về cấu trúc, hình thái polyp và sinh sản [3, 4] Họ Milleporidae chỉ chứa một giống duy nhất là Millepora phân bố rải rác ở khắp các vùng biển trên thế giới [4] Theo Veron và cộng sự, cho đến năm 2000, đã xác định được 50 loài thuộc giống Millepora, những năm sau đó tiếp tục định danh được thêm 11 loài ở vùng biển Thái Bình Dương và 6 loài ở Đại Tây Dương, nâng tổng sổ loài thuộc giống Millepora lên con số 67 loài Việc xác định gặp khó khăn do sự đa dạng trong cấu trúc của những quần thể san hô thủy tức này, chúng không có hình thái ổn định để nhận biết cũng như thiếu các đặc điểm phân biệt giữa các loài với nhau do thay đổi tùy theo điều kiện môi trường Với những nhược điểm

kể trên, các nghiên cứu khoa học cấp độ phân tử là cần thiết để hỗ trợ cho công tác giám định loài, ví dụ phân tích cấu trúc di truyền hoặc gần đây, kĩ thuật phân tích định dạng ADN đã hỗ trợ rất tốt cho các nhà khoa học để có thể phân biệt dễ dàng hơn

Đặc điểm cấu tạo

Các quần thể san hô thủy tức Millepora thường có cấu trúc phân nhánh thẳng đứng giống nhau và độ dài các nhánh dao động từ 30-60 cm Chúng cũng có thể phát triển dạng vòm và thường nằm trên bề mặt rạn san hô và các

bề mặt cứng khác, thường có màu vàng hoặc nâu Bề mặt bên ngoài của chúng thường có dạng nốt sần hoặc hình thoi Mỗi nốt sần bao gồm một tập hợp các kim tinh tròn (dactylostyles) [5] Dưới lớp đá vôi xốp bên ngoài là hệ thống các mao dẫn nội bộ phân bố dày đặc Khối lượng chính của khung xương đá vôi cấu tạo từ các cấu trúc đá vôi xốp bao gồm sợi tinh thể dày đặc được sắp xếp theo lớp mỏng, các sợi nằm chồng lên nhau ở mọi góc độ Cho đến nay mới có một vài nghiên cứu tốc độ sinh trưởng của san hô giống Millepora, Stromgren (1976) công bố một số loài vùng biển Jamaica phát triển nhánh san hô từ 5,4 – 19,8 mm/năm [6] Witman (1988) đã xác định

được tốc độ phát triển 8 mm/năm đối với loài M C omplanata ở Floria và trung

bình toàn quần thể phát triển được khoảng 130 cm2/năm [7]

Phổ dinh dưỡng của Millepora chủ yếu là các sinh vật phù du [8, 9, 10], Hoạt động kiếm ăn và phản ứng với các kích thích hóa học của các cá thể

thuộc loài M alcicornis và M complanata cũng tương tự như ở các

Hydrozoan khác [9] Các loài Millepora dùng miệng để kiếm ăn như lắc lư và

co rút chậm hoặc nhanh, khi tìm thấy thức ăn sẽ phản ứng bằng cách mở rộng miệng, lắc lư và khép miệng ngẫu nhiên khi con mồi chạm vào đĩa miệng Hầu hết san hô thủy tức kiếm ăn vào ban đêm Để bắt thức ăn chúng sử dụng các tế bào đốt được gọi là tế bào tuyến trùng (nematocyst) Những tế bào này nằm trong các xúc tu của polyp san hô và bên ngoài Đây là một tế bào đặc biệt được tìm thấy ở một số sinh vật đại dương - chẳng hạn như sứa biển, hải quỳ và san hô - có một ngạnh châm chích được bao phủ bởi nọc độc Tế bào hoạt động giống như một cây lao sống Trước khi tuyến trùng bắn ra, ngạnh của nó vẫn cuộn bên trong tế bào trong một khoang nơi nó được tắm trong nọc độc Khi tuyến trùng tiếp xúc với một thứ khác, chẳng hạn như cá - chiếc lao nhỏ này sẽ bắn ra, cắm vào mục tiêu và truyền nọc độc Nọc độc của tế bào có thể từ yếu đến mạnh San hô thủy tức cũng có tuyến trùng, chúng sử dụng vào ban đêm để bắt những sinh vật nhỏ trôi nổi trong nước, dùng các

xúc tu để giữ lại và làm tê liệt con mồi trong thời gian vài phút, sau đó sẽ chuyển vào các biểu bì để hấp thụ [11]

Các tập đoàn Millepora cũng là nơi sinh sống của tảo cộng sinh zooxanthellae, tuy nhiên mật độ của zooxanthellae trong Millepora thường thấp hơn so với san hô cứng [12] Dinh dưỡng tự dưỡng trong Millepora tương tự như san hô cứng, zooxanthellae cộng sinh sử dụng ánh sáng mặt trời

và CO2 để sản suất thức ăn và vật liệu tế bào Các chất dinh dưỡng được tổng hợp bởi zooxanthellae sẽ được vận chuyển đến vật chủ và cung cấp thức ăn cho các loài Millepora

Sinh sản

Millepora có hai hình thức sinh sản, đó là sự nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính Trong hai hình thức sinh sản, hình thức sinh sản phù hợp tùy thuộc vào từng loài, các nhân tố môi trường sống cũng như các yếu tố địa

lý

Sinh sản bằng nhân giống vô tính, là quá trình của sự phân mảnh để hình thành các tập đoàn mới khác được gây ra do giông bão, xâm thực sinh học và sự phá hoại của một số loài cá [13, 14] Sinh sản vô tính là hiện tượng bình thường đối với quần thể Millepora Các mảnh đơn giản mở rộng theo sự tăng trưởng và theo giai đoạn Ngoài ra, nhiều loài Millepora sinh sản hữu tính theo mùa, như vào tháng 4 và tháng 5 ở Đài Loan, giữa tháng 4 và tháng

7 ở Barbados và từ tháng 6 đến tháng 3 ở Curacao [11] Trứng và tinh trùng được phóng ra biển với một số lượng lớn vào ban đêm Trong một Nghiên cứu ở Ấn Độ Dương về sinh sản của ba loài sống trên các rìa rạn san hô của

đảo Reunion thuộc Ấn Độ Dương là: Millepora exaesa, Millepora platyphylla và Millepora tenera, thời kỳ sinh sản hữu tính từ tháng 11 đến

tháng 1, sự phát triển của các quần thể sinh vật có sự liên quan với nhiệt độ nước tăng theo mùa Theo như mô tả, trong mỗi cá thể có bộ phận sinh sản chính và bộ phận sinh sản phụ, và có sự khác biệt về kích thước, mật độ và sự phân bố của tuyến trùng của bộ phận sinh sản chính và bộ phận sinh sản phụ

của ba loài Quá trình theo dõi sự sinh sản hàng loạt đầu tiên ở M exaesa và M platyphylla đã cung cấp thêm thông tin về loài Millepora có vỏ

ngoài động vật ấu trùng Sinh sản luôn bắt đầu trước khi trời tối nhưng không

theo tuần trăng hoặc thủy triều [15]

Phân bố

Các san hô thủy tức Millepora phân bố ở nhiều vùng biển nhiệt đới trên

thế giới ở độ sâu 1-40m dưới mặt nước biển [16] Một số loài như M.

Complanata thường phát triển với mặt phẳng đối diện với hướng của sóng hay

dòng chảy nước biển Các hình thức phát triển dạng nhánh hoặc cành mỏng thường gặp ở những loài sống dưới vùng nước sâu hơn hoặc ở những rạn san

hô được che kín đáo

Tốc độ phát triển của các san hô thuộc giống Millepora rất nhanh, diễn

ra ở mọi độ sâu khác nhau và thường là bao phủ trên bề mặt đã chết của loài san hô khác [17, 18]

Hình 1.1 San hô thủy tức Millepora platyphylla

1.1.3 Tình hình nghiên cứu san hô thủy thức

Cho đến nay, những nghiên cứu hóa sinh được thực hiện trên các loài thuộc giống Millepora còn chưa nhiều Một số báo cáo nghiên cứu về tốc độ phát triển của san hô thủy tức, từ các kết quả nghiên cứu của Witman (1988),

Stromgren (1976), Rahav et al (1991) và Lewis (1991), các nhà khoa học nhận thấy tốc độ phát triển của san hô thủy tức tương đương với tốc độ phân nhánh và hình thành dạng đĩa của san hô cứng Bên cạnh đó, carotenoprotein

đã được chiết xuất từ các bộ khung canxi của tám loài Millepora từ vùng biển Caribbean [6, 7, 19] Những năm gần đây, các nhà khoa học đã thực hiện nhiều hơn các phân tích chỉ số nhận dạng (fingerprinter) như phenoloxidase

để phục vụ việc định dạng loài cũng như theo dõi tình hình sức khỏe của rạn san hô gồm nhiễm bệnh, trắng hóa … Các loài thuộc Millepora có thể gây ra các tác động có hại cho con người do độc tố của chúng Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng độc tố chứa trong các tế bào tuyến trùng từ các loài Millepora ngay lập tức gây đau rát, hình thành ban đỏ và mụn mủ trên da người khi tiếp xúc, thậm chí gây tử vong Trong nghiên cứu của Kazuo Shiomi và cộng sự vào năm 1989 đã chứng minh rằng độc tố của hai loài san hô thủy tức

Millepora platyphylla và Millepora dichotoma có thể gây tử vong, tan máu và

sưng phù cũng như xúc tác cho quá trình thủy phân phospholipid bởi

phospholipase A và acid phosphatase Độc tố của M platyphylla có khác biệt đáng kể so với độc tố của M dichotoma về độ ổn định; M platyphylla có tính

ổn định với sự đông lạnh, đông khô và bảo quản ở 4oC trái ngược với sự thiếu

ổn định của M dichotoma Độc tố của Millepora platyphylla gây ra hai dạng

tử vong ở chuột, tử vong nhanh và tử vong chậm kèm theo sự xuất hiện của

huyết sắc tố niệu, phụ thuộc vào liều sử dụng, trong khi đối với loài Millepora dichotoma chỉ có kiểu tử vong nhanh được quan sát thấy [20]

Năm 2006 Liat Abramovitch-Gottlib cùng cộng sự đã nghiên cứu một

vật liệu tinh thể có hoạt tính sinh học từ san hô thủy tức Millepora dichotoma Đây là lần đầu tiên M dichotoma được chế tạo và nhân bản sinh học trong

điều kiện phòng thí nghiệm để tìm ra chất có hoạt chất sinh học có nguồn gốc

từ sinh vật biển và có tiềm năng tạo xương Các ma trận sinh học ba chiều được tạo ra để chuyển đổi các tế bào gốc trung mô (MSCs) để mô tả kiểu hình nguyên bào nuôi Nhóm nhà khoa học đã nghiên cứu ảnh hưởng của ma trận sinh học đối với sự gia tăng và biệt hóa MSCs ở 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 28 và

42 ngày Các phân tích khác nhau đã được thực hiện MSCs được gieo trên

cây sinh học Millepora dichotoma cho thấy mức độ kết hợp canxi và phosphat

cao hơn và mức độ collagen loại I cao hơn so với cây sinh học Porites lutea

đối chứng Hoạt động của phosphatase kiềm cho thấy MSC được gieo trên ma

trận sinh học Millepora dichotoma có khả năng tạo xương cao so với những

MSC được gieo trên ma trận sinh học đối chứng Hàm lượng osteocalcin của

MSC được gieo trên Millepora dichotoma không đổi trong 2 tuần trước khi tăng lên vượt qua của ma trận sinh học của P lutea được gieo hạt sau 28 ngày Do đó, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ma trận sinh học của Millepora dichotoma tăng cường sự phân biệt của MSCs thành nguyên bào xương và có

tiềm năng tuyệt vời như việc sử dụng khung sinh học cho kỹ thuật mô cứng [21]

Năm 2012 García-Arredondo A và cộng sự đã phân lập được cấu trúc

của tế bào tuyến trùng từ loài san hô thuỷ tức Millepora alcicornis và Millepora complanata được thu thập ở vùng biển Caribbean Mexico Đặc điểm cấu trúc của các tuyến trùng thải ra và tích tụ từ các Millepora alcicornis và Millepora complanata, được kiểm tra bằng cách sử dụng kính

hiển vi điện tử truyền qua và kính hiển vi điện tử quét Trong nghiên cứu này

đã được phát hiện qua những hình ảnh về tuyến trùng được tìm thấy trong các loài có độc tố vùng Caribe Mexico Hai loại tuyến trùng đã được quan sát thấy ở cả hai loài, các tuyến trùng nhỏ được xác định là phong phú hơn so với các loại tuyến trùng lớn Các loại tuyến trùng nhỏ có kích thước trung bình (10,6 - 13,0 x 18,1 - 21,6 µm) và lớn (17,5 - 21,8 x 25,0 - 33,1 µm) trong khi các tuyến trùng lớn chỉ xuất hiện ở một kích thước (10,5 - 15,6 x 18,7 - 25,0 µm) Tuyến trùng nhỏ là một loại tuyến trùng chỉ được tìm thấy ở các loài Millepora và là một lý do để xếp nó vào một phân bộ riêng biệt Radwan đã

quan sát thấy rằng hai loài M.dichotoma và M platyphylla thu thập được ở

Biển Đỏ cũng xuất hiện loại tuyến trùng này [22]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính của san hô thủy tức Millepora Nhưng cho đến nay mới có một số ít những nghiên cứu về lipid, axit béo của các loài san hô thủy tức, trong đó có giống Millepora Một trong số các nghiên cứu về thành phần lipid của các mẫu thuộc loài Millepora được thực hiện bởi Andrey Imbs năm 2010 và 2013 [23, 24] Trong công

trình nghiên cứu 150 mẫu san hô và 2 loài san hô thủy tức Millepora thu thập

ở vùng biển nhiệt đới và nước lạnh, tác giả đã công bố số liệu về thành phần axit béo và các lớp chất lipid của các đối tượng này, cũng như dữ liệu về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến thành phần lipid này của các loài Các con đường có thể của quá trình sinh tổng hợp axit béo trong các đối tượng san

hô và san hô thuỷ tức cũng đã được thảo luận tới Qua kết quả thu được giúp cho các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cấu tạo hóa sinh, cơ chế trao đổi chất cùng nhiều thông tin hữu ích khác như dinh dưỡng, sức khỏe, ảnh hưởng đến rạn san hô v.v

Năm 2019, tác giả Andrey Imbs cùng cộng sự đã nghiên cứu lần đầu tiên các lipid phân cực của san hô, san hô thủy tức và so sánh thành phần axit béo, phospholipid của san hô, san hô thủy tức từ các vùng nhiệt đới và nước lạnh Cấu trúc và hàm lượng của các axit béo và thành phần dạng phân tử phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI), và ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) của 2 loài san hô thủy tức nhiệt đới

Millepora platyphylla và Millepora dichotoma thu thập tại Hòn Ré (Việt Nam) và loài san hô thủy tức nước lạnh Allopora steinegeri thu thập ở đảo

Kuril, Nga) đã được xác định bằng phổ khối và phổ khối phân giải cao [25]

Sự phân bố của các dạng phân tử alkenylacyl, alkylacyl và diacyl trong một

số lớp chất phospholipid chính được thể hiện trong hình 1.2

Lớp chất phosphatidylethanolamine bao gồm chủ yếu là các dạng phân

tử alkenylacyl, đặc biệt là ở 3 loài san hô mềm Xenia sp., Gersemia rubiformis và Gersemia fruticosa PE ở 3 loài san hô thủy tức có thêm 1 phần

đáng kể PE ở dạng diacyl Lớp chất phosphatidylcholine bao gồm các dạng

phân tử chủ yếu ở dạng alkylacyl, trừ lớp chất PC ở loài Allopora steinegeri

có phần chiếm ưu thế là các diacyl PC Lớp chất phosphatidylserine ở 3 mẫu san hô thủy tức toàn bộ là các dạng phân tử diacyl, ngược lại ở 2 loài san hô

Sinularia macropodia và Capnella sp ở lớp chất PS toàn bộ là các dạng phân

tử alkylacyl Đối với lớp chất phosphatidylinositol, qua đồ thị dễ dàng quan sát thấy các dạng phân tử PI diacyl chiếm ưu thế vượt trội trong hầu hết các

mẫu, trừ loài san hô Gersemia rubiformis có một phần đáng kể các dạng phân

tử PI alkylacyl

Hình 1.2 Sự phân bố các dạng phân tử alkenylacyl, alkylacyl và diacyl trong

một số lớp chất phospholipid chính của 3 loài san hô thủy tức MP: Millepora platyphylla; MD: Millepora dichotoma; AS: Allopora steinegeri và 5 loài san

hô mềm SM: Sinularia macropodia; CS: Capnella sp.; XS: Xenia sp.; GR:

Gersemia rubiformis; GF: Gersemia fruticosa [25]

Hàm lượng các axit béo chuỗi n-3 và n-6 trong các mẫu san hô thủy tức cũng đã được phân tích (hình 1.3) Ngược lại với hàm lượng rất cao của axit

béo 20:4n-6 trong mẫu san hô thủy tức Okhotsk Allopora, axit béo này có hàm lượng rất thấp hoặc vắng mặt hoàn toàn trong 2 mẫu Millepora Việt

Nam Dựa vào sự có mặt của các axit béo trong các dạng phân tử ở mỗi phân lớp phospholipid, có thể thấy rằng để tổng hợp các phosphatidylethanolamine

PE và phosphatidylchonline PC, san hô thủy tức Allopora sử dụng axit béo 20:4n-6 làm tiền chất, còn san hô thủy tức Millepora sử dụng axit béo C22

làm tiền chất

Hình 1.3 Hàm lượng (%) các axit béo C20 – C22 n-6, n-3 trong các mẫu

san hô thủy tức thu thập ở vùng biển Việt Nam và vùng biển Okhotsk [25]

Sơ đồ quá trình sử dụng các axit béo chìa khóa n-3, n-6 trong sinh tổng

hợp các dạng phân tử phospholipid ở các mẫu san hô thủy tức Allopora và Millepora có thể được mô tả theo sơ đồ trong hình 1.4 Hàm lượng cao của 22:5n-6 cho thấy, ở các mẫu san hô thủy tức Millepora đã có sự tham gia với

hoạt tính cao của enzyme hiếm delta-4 desaturase trong quá trình sinh tổng hợp các axit béo đa nối đôi C22

Hình 1.4 Sự sử dụng các axit béo chìa khóa trong sinh tổng hợp các

phospholipid ở mẫu san hô thủy tức Millepora thu thập tại vùng biển Việt

Nam và Allopora thu thập ở vùng biển Okhotsk [25]

So sánh hàm lượng các lớp chất lipid giữa san hô mềm và san hô thủy tức của 4 mẫu thu thập tại vùng biển Nha Trang ở các thời gian khác nhau được thực hiện bởi tác giả Nguyễn Bá Kiên và cộng sự: 2 mẫu san hô mềm

Sinularia brassica, Sinularia flexibilis, 2 mẫu thủy tức Millepora dichotoma, Millepora platyphylla đã cho thấy được sự khác biệt và đặc trưng riêng Hàm lượng lipid tổng của hai loài san hô mềm Sinularia brassica, Sinularia flexibilis cao hơn hàm lượng lipid tổng của các mẫu san hô cứng Millepora dichotoma, Millepora platyphylla Các lớp chất chính ở các mẫu san hô mềm

là lipid phân cực (PL), monoankyldiacylglycerol (MADAG), hydrocacbon và sáp (HW) Trong khi đó, ở các mẫu thủy tức các lớp chất chính là PL, triacylglycerol (TG), MADAG và HW Lớp chất diacylglycerol (DG) chỉ có

mặt trong loài san hô mềm Sinularia flexibilis và không xuất hiện ở các loài

san hô khác đã nghiên cứu [26]

Cho đến nay, các nhà khoa học cũng đã quan tâm nhiều hơn đến san hô thủy tức Millepora Tuy nhiên những nghiên cứu về thành phần lipid của san

hô thủy tức vẫn còn rất mới, số liệu về lipid của các loài thuộc Millepora còn chưa đáng kể để có thể hiểu rõ hơn về quá trình sinh tổng hợp và vận chuyển lipid Do đó, lĩnh vực này vẫn còn rất nhiều tiềm năng để nghiên cứu sâu hơn trong tương lai

1.2.GIỚI THIỆU VÀ Ý NGHĨA CỦA LIPID VÀ AXIT BÉO

1.2.1 Giới thiệu về lipid và axit béo

Lipid là những axit béo và các dẫn xuất axyl của chúng, như sáp (este của axit béo và rượu mạch thẳng), các este của sterol, triacylglycerol, monoalkyldiacylglycerol, các axit béo tự do, glycolipid, sphingolipid, phospholipid và phosphonolipid [5], chúng kết hợp với carbohydrate và protein để tạo thành thành phần chủ yếu của tất cả các tế bào thực vật và động vật Lipid không tan trong nước mà hòa tan trong các dung môi hữu cơ (ete, clofom, benzen, ete petrol, toluen…) Lipid là hợp chất cấu tạo quan trọng của màng sinh học, là nguồn cung cấp năng lượng (37,6.106 J/kg), nguồn cung cấp các vitamin A, D, E, F, K cho cơ thể sống Lipid góp phần tạo ra kết cấu cũng như tính cảm vị đặc trưng của rất nhiều thực phẩm

Dựa vào thành phần cấu tạo có thể chia lipid thành 2 nhóm:

 Lipid đơn giản: là ete của rượu và axit béo:

 Glycerophospholipid: trong phân tử có glixerin, axit béo và axit phosphoric Gốc axit phosphoric có thể được este hóa với một aminalcol như cholin, etanolamin, serin, inozitol

 Glyceroglucolipid: trong phân tử ngoài glixerin và axit béo còn

có mono hoặc oligosacarit kết hợp với glixerin qua liên kết glucozit

 Sphingoglucolipid: phân tử được cấu tạo tử sphingozin, axit béo

ra năng lượng và là chất thay thế quan trọng cho glucose về mặt này Là thành

phần cấu tạo của lipid phân cực và các lipid phức tạp khác, axit béo là thành phần quan trọng của màng tế bào, có tác dụng ảnh hưởng đến tính lưu động của màng và chức năng của protein màng thông qua các tác động lên môi trường màng

Trong sinh vật biển có đa dạng các loại axit béo và các loại axit béo thường gặp có số lượng nguyên tử cacbon từ C-12 đến C-30, trong đó có những dạng chỉ có đặc trưng trong sinh vật biển mà chưa hề gặp trên cạn, ví

dụ ở loài hải miên có các nguyên tử cacbon mạch dài lên tới C-24 đến C-30, còn ở các loài sinh vật biển khác có các nguyên tử cacbon từ C-12 đến C-24 Trong thành phần lipid của các sinh vật biển chứa lượng đáng kể các axit béo

đa nối đôi (Polyunsaturated Fatty Acids - PUFAs) Nhóm các axit béo Omega3 đa nối đôi thuộc nhóm những axit béo có nối đối đầu tiên ở vị trí số

3 tính từ nhóm metyl cuối cùng của mạch cacbon Đây là nhóm chất với cấu trúc phân tử đặc biệt có hoạt tính sinh học cao, nên có ứng dụng rất rộng trong thực tiễn

1.2.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu lipid, axit béo

Thành phần lipid, axit béo phản ánh đặc điểm dinh dưỡng

Việc nghiên cứu về thành phần lipid, axit béo để xác định các mối liên kết dinh dưỡng rất hữu hiệu đối với các loài sinh vật biển do sự khó khăn trong hoạt động nghiên cứu quan sát Khái niệm chất đánh dấu dinh dưỡng lipid, axit béo dựa trên cơ sở những nguồn dinh dưỡng ban đầu có chứa các lipid và axit béo tín hiệu đặc trưng, chúng sẽ được truyền sang các sinh vật tiêu thụ và đi vào chuỗi thức ăn, dù sẽ bị biến đổi tại mỗi bước nhưng chúng vẫn được duy trì với số lượng đáng kể Ví dụ, đối với các loài san hô vùng biển sâu thường không có vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae và sử dụng động thực vật phù du làm nguồn thức ăn chính, ngược lại san hô vùng nước nông thường sử dụng dưỡng chất nhận được từ các vi sinh vật cộng sinh

Trong những năm gần đây, sự biến đổi khí hậu dẫn tới những thay đổi lớn trong sự phân bố của các sinh vật phù du, và việc nghiên cứu các chất đánh dấu sinh học kết hợp với các thử nghiệm về dinh dưỡng sẽ giúp cho các

nhà khoa học xác định xem các đối tượng sinh vật có những thích nghi như thế nào với môi trường sống trước những thay đổi của thiên nhiên

Thành phần lipid, axit béo và phân loại sinh thái

Ngoài phần lớn lipid và các axit béo của sinh vật được đưa vào cơ thể thông qua con đường dinh dưỡng, ở một mức độ đáng kể, thành phần lipid, axit béo cũng được quy định bởi khả năng di truyền của các loài để sinh tổng hợp lên một số các axit béo nhất định Do vậy, axit béo được sử dụng như một công cụ hữu hiệu trong phân loại hóa học giữa các nhóm khác nhau, các hệ cộng sinh khác nhau; và góp phần vào nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp diễn ra trong cơ thể loài sinh vật

Thành phần lipid, axit béo phản ánh sức khỏe của quần thể rạn san hô

Khi điều kiện sống của môi trường bất lợi, như nhiệt độ nước biển tăng lên, sẽ xảy ra hiện tượng trắng hóa rạn san hô Chúng có thể bị trắng hóa một phần (còn khả năng phục hồi) hoặc hoàn toàn (không còn khả năng phục hồi)

So sánh lipid giữa rạn san hô khỏe mạnh và rạn san hô bị trắng hóa, các nhà nghiên cứu nhận thấy, các rạn san hô bị tẩy trắng hoàn toàn mất đi tới 75% tổng hàm lượng các axit béo không no đa nối đôi, đặc biệt là các axit béo đặc trưng của vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae, và điều đó thể hiện sự vắng mặt của chúng trong các đối tượng san hô bị trắng hóa

Trong thời gian gần đây, ở Việt Nam đã có những nghiên cứu chuyên sâu và có hệ thống về lipid sinh vật biển Những cơ sở dữ liệu về lipid các mẫu cũng như việc đánh giá tác động của môi trường sống lên thành phần lipid của các đối tượng sinh vật biển đã được các nhà khoa học bước đầu xây dựng Để có thêm được những thông tin cho hệ thống cơ sở dữ liệu đó thì việc tiến hành những nghiên cứu trên từng đối tượng cụ thể là rất cần thiết Những nghiên cứu chi tiết trên đối tượng san hô thủy tức thì hầu như chưa có một nghiên cứu nào Trong thành phần lipid của đối tượng sinh vật, có những lipid không có nguồn gốc từ vật chủ, mà được sinh tổng hợp từ các axit béo đưa vào từ nguồn thức ăn hoặc các vi sinh vật cộng sinh Do vậy, thành phần và hàm lượng các lipid này sẽ chịu sự ảnh hưởng không nhỏ của điều kiện môi

trường mà kèm theo đó là sự thay đổi của các yếu tố như thời gian, nhiệt độ, ánh sáng, các nguồn dinh dưỡng và chu kỳ sinh sản Việc nghiên cứu toàn diện sự biến động theo mùa của thành phần lipid ở đối tượng san hô thủy tức Việt Nam trong điều kiện sống tự nhiên hiện nay chưa được công bố So với các loài động vật biển khác tính chất ít di chuyển của chúng sẽ thuận lợi cho việc thu thập mẫu lặp lại để nghiên cứu

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

Các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla được thu thập trong 12

tháng liên tục tại các vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa (bảng 2.1) Mẫu được định tên bởi PGS TS Hoàng Xuân Bền và các cộng sự tại Viện Hải Dương học – Nha Trang

Các mẫu được thu thập bằng phương pháp lặn Mẫu sau khi thu được vận chuyển trong nước biển bằng thiết bị có mái che, nhằm tránh tiếp xúc nhiều với ánh nắng mặt trời và luôn duy trì ở nhiệt độ ổn định Sau quá trình thu mẫu, mẫu được đem về phòng thí nghiệm trong 1h, loại bỏ tạp/cặn bẩn và thực hiện chiết ra lipid tổng hoặc bảo quản ở nhiệt độ -18ºC Mẫu được lưu giữ tiêu bản tại Viện Hải dương học – Nha Trang

Bảng 2.1 Các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla được nghiên cứu

2 Mp.2

Tháng 2/2020

3 Mp.3

Tháng 3/2020

4 Mp.4

Tháng 4/2020

5 Mp.5

Tháng 5/2020

6 Mp.6

Tháng 6/2019

7 Mp.7

Tháng 7/2019

8 Mp.8

Tháng 8/2019

9 Mp.9

Tháng 9/2019

10 Mp.10

Tháng 10/2019

11 Mp.11

Tháng 11/2019

12 Mp.12

Tháng 12/2019

2.2 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU CHUNG

2.3 PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Phương pháp chiết lipid tổng

Chiết lipid tổng theo phương pháp của Folch J.F [27] – phương pháp được sử dụng thường quy cho san hô tại phòng thí nghiệm Hóa sinh hữu cơ – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Mẫu tươi san hô thủy tức Millepora platyphylla được rửa sạch, thấm

khô nước và chụp ảnh tiêu bản Mẫu được cắt nhỏ đến kích thước thích hợp Chiết mẫu bằng hệ dung môi CHCl3:MeOH tỉ lệ 2:1 (v:v) (1 kg mẫu tươi dùng 3 lit hỗn hợp dung môi) để ở 4oC, chiết lặp 2 lần Bổ sung 3 lit H2O và 3 lit CHCl3 để toàn bộ dịch chiết được phân lớp Lớp lipid (bên dưới) được thu hồi và làm khan bằng Na2SO4 trong 3h, lọc bỏ muối, dịch chiết thu được cô cạn loại bỏ dung môi bằng thiết bị quay cất chân không thu được dịch cô của lipid tổng Lipid tổng được bảo quản trong dung môi CHCl3 tại nhiệt độ-18oC

2.3.2 Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid

Phân tích định lượng sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng và chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga) [28]

Lipid tổng được được chấm trên bản mỏng 1 chiều silicagel (6 x 6 cm), chạy trên hệ dung môi n-hexane:Et2O:CH3COOH (80:20:1, v:v:v), hiện hình bằng H2SO4/MeOH 10% Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 2000C trong thời gian 15 phút, scan trê n máy Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Nhật Bản), với

độ phân giải theo kích thước tiêu chuẩn Phần trăm của các lớp chất trong lipid tổng được xác định dựa trên sự đo diện tích và cường độ màu trong chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga)

2.3.3 Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất phospholipid

Phân tích định tính các lớp chất phospholipid: các lớp chất

phospholipid được xác định bằng sắc ký lớp mỏng 2 chiều trên bản mỏng Sorbfil (6 cm x 6 cm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga), với hệ thứ nhất A: CHCl3:MeOH:C6H6:28%NH4OH (70:30:5:1, theo thể tích), chạy xong sấy

CHCl3:MeOH:(CH3)2CO:CH3COOH:H2O (70:30:5:5:2, theo thể tích) Sau khi sấy khô, hiện hình với thuốc thử ninhydrin 0,2% trong BuOH ở 100°C, xác định các lớp chất PE, PS, CAEP Tiếp theo sử dụng thuốc thử molybdate xác định các lớp chất PC, PI

Phân tích định lượng các lớp chất phospholipid: lipid tổng được phân

tích trên bản mỏng Sorbfil (10 cm x 10 cm, , Krasnodar, LB Nga); với hệ dung môi CHCl3:MeOH:C6H6:28%NH4OH (70:30:5:1, theo thể tích), hiện hình với thuốc thử H2SO4/MeOH 5% ở nhiệt độ 200°C Bản mỏng thu được được scan hình ảnh trên máy Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Nhật Bản) với độ phân giải và kích thước tiêu chuẩn Phần trăm của các lớp chất

phospholipid được xác định dựa trên sự đo diện tích và cường độ màu trong chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV, Krasnodar, LB Nga [28]

2.3.4 Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng axit béo

Axit béo được methyl hóa sang dạng methyl ester bằng tác nhân H2SO4/MeOH 2%, nhiệt độ 80°C trong vòng 2h, để nguội tới nhiệt độ phòng,

bổ sung thêm 1 ml H2O và 2 ml n-hexane để phân lớp, thu lớp dung môi phía trên, làm khan bằng Na2SO4, lọc bỏ muối và cất loại dung môi Hỗn hợp thu

được hòa tan trong n-hexane, tinh sạch hỗn hợp methyl ester của axit béo trên bản mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexane:Et2O (90:10, v:v) Hỗn hợp

methyl ester của axit béo được hòa tan trong n-hexane và phân tích trên máy sắc ký khí GC và sắc ký khí kết nối khối phổ GC-MS, hãng Shimadzu (Kyoto, Nhật Bản), sử dụng thư viện phổ chuẩn NIST để so sánh [28, 29]

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 HÀM LƯỢNG LIPID TỔNG TRONG CÁC MẪU SAN HÔ THỦY

TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA

Hàm lượng lipid tổng được xác định bằng phần trăm khối lượng lipid thu được so với khối lượng mẫu tươi/khô ban đầu Kết quả về hàm lượng lipid

tổng của mẫu Millepora platyphylla nghiên cứu được thu thập 12 tháng trong

năm được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Hàm lượng lipid tổng của các mẫu san hô thủy tức Millepora

platyphylla được nghiên cứu

Tháng Kí hiệu

mẫu

Hàm lượng tươi (%)

Hàm lượng Khô (%)

Nhiệt độ( o C)

tăng ở các tháng mùa hè và giảm vào các tháng mùa đông Hàm lượng lipid tổng cao nhất đạt được ở mẫu Mp.6 thu được vào tháng 6 và thấp nhất ở mẫu Mp.12 thu được vào tháng 12 Hàm lượng lipid tổng tính trên trọng lượng khô

và trọng lượng tươi có sự tỉ lệ thuận với nhau Tỉ lệ giữa hàm lượng lipid tổng/ trọng lượng khô và hàm lượng lipid tổng / trọng lượng tươi trong 12 tháng hầu như không có quá nhiều chênh lệch, dao động trong khoảng từ 1,22 đến 1,25 (biểu đồ 3.1)

Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ hàm lượng lipid tổng tính trên trọng lượng khô / hàm lượng

lipid tổng trên trọng lượng tươi của các mẫu san hô thủy tức Millepora

platyphylla

Tương tự như lipid của san hô tạo rạn [30], hàm lượng lipid tổng của

san hô thủy tức Millepora platyphylla cao nhất vào mùa hè, tối thiểu vào mùa

đông và có sự tương quan với nhiệt độ nước biển của môi trường thu mẫu Được biết, sự thay đổi hàng năm của nhiệt độ nước và bức xạ mặt trời khiến

hệ sinh thái rạn san hô thay đổi theo chu kỳ Tại Vịnh Nha Trang, nhiệt độ nước dao động trong khoảng 28 đến 30°С hầu hết trong năm (tháng 4 đến tháng 9) và giảm xuống 24–25°С vào tháng 12 đến tháng 1, trong khi bức xạ mặt trời cực đại quan sát được trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 4 [31] Ngoài ra, các cơn bão, gió mùa từ tháng 10 đến tháng 12 làm tăng mạnh

sự nhiễu loạn và độ đục ở các vùng nông của rạn san hô Những thay đổi của điều kiện môi trường sẽ là những yếu tố chi phối trực tiếp đến sự biến động

của hàm lượng lipid tổng trong mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

trong 12 tháng

3.2 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC LỚP CHẤT LIPID CỦA CÁC

MẪU SAN HÔ THỦY TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA

Trong lipid tổng của các mẫu nghiên cứu có mặt đầy đủ các lớp chất lipid cơ bản tương tự như ở các đối tượng san hô: các lớp chất lipid cấu trúc là lipid phân cực (PL), sterol (ST); các lớp chất lipid dự trữ triacylglycerol (TAG), monoalkyldiacylglycerol (MADAG), sáp (W); và axit béo tự do FFA Hình ảnh lớp chất lipid trên bản mỏng 1 chiều sau khi được scan với độ phân giải và kích thước tiêu chuẩn sẽ được phân tích bằng phần mềm chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga) (hình 3.1)

Hình 3.1 Sắc kí đồ phân tích hàm lượng các lớp chất lipid bằng chương trình

phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga) Kết quả thu được được thể hiện trong bảng 3.2 Xét theo giá trị trung bình của cả 12 tháng, chiếm hàm lượng lớn nhất trong lipid tổng các mẫu san

hô thủy tức Millepora platyphylla là lớp chất triglycerol, lớp chất sáp và

monoalkyldiacylglycerol có hàm lượng không quá chênh lệch, tiếp theo là hàm lượng lớp chất lipid phân cực, sterol, và nhỏ nhất là hàm lượng lớp chất

axit béo tự do Ngoài ra, kết quả phân tích cho thấy trong 12 tháng hàm lượng các lớp chất lipid trong lipid tổng có những thay đổi nhất định

Bảng 3.2 Thành phần các lớp chất lipid trong lipid tổng của các mẫu san hô

thủy tức Millepora platyphylla

Nhiệt

độ nước biển

Trong số các lớp chất lipid trong lipid tổng của các mẫu san hô thủy tức

Millepora platyphylla, lớp chất axit béo chiếm 1 tỉ lệ nhỏ không đáng kể, ở tất

cả 12 tháng đều dưới 2% lipid tổng Hàm lượng này có xu thế giảm trong các tháng mùa hè, giá trị thấp nhất ở mẫu Mp.7 (1,02%0,02) (biểu đồ 3.2) Hàm lượng lớp chất axit béo tự do trong lipid tổng của các mẫu san hô/san hô thủy tức thông thường luôn <5% Sự tăng bất thường về hàm lượng axit béo tự do trong thành phần lipid tổng của một mẫu san hô nào đó có thể dẫn đến giả thiết về một sự thiếu chính xác trong quy trình thu – bảo quản – vận chuyển – tách chiết, khiến quá trình thủy phân có điều kiện xảy ra và giải phóng thêm các axit béo tự do từ các lớp chất khác, khiến hàm lượng lớp chất này tăng cao Vì vậy, khi phân tích thành phần các lớp chất lipid, luôn cần chú ý tới hàm lượng của lớp chất này [32]

Biểu đồ 3.2 Hàm lượng lớp chất axit béo tự do (FFA) trong lipid tổng của

các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Cũng giống như lớp chất FFA, hàm lượng lớp chất sterol và lipid phân cực cũng đều có xu hướng thay đổi theo mùa, giảm vào các tháng mùa hè và tăng vào các tháng mùa đông

Lớp chất sterol trong lipid tổng của mẫu được nghiên cứu trong 12 tháng có hàm lượng dao động từ 6,81%0,09 đến 9,86%0,07, các mẫu thu