Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống

TỔNG QUAN

Xét nghiệm quan hệ huyết thống

Trong xã hội hiện đại, nhu cầu xác minh mối quan hệ huyết thống ngày càng gia tăng, phục vụ không chỉ cho cá nhân mà còn cho các mục đích pháp lý như khai sinh, nhập quốc tịch và định cư Xét nghiệm huyết thống cũng đóng vai trò quan trọng trong điều tra hình sự, giúp nhận diện cá thể Phương pháp xác định quan hệ huyết thống đã ra đời từ những năm 1920 dựa trên di truyền học, sử dụng các chỉ thị sinh học như nhóm máu, kháng nguyên bạch cầu HLA và các đoạn lặp đa hình để thực hiện việc này.

1.1.1 Xét nghiệm dựa trên nhóm máu Đầu những năm 1900 các nhà khoa học đã xác định được 4 nhóm máu cơ bản của con người là A, B, AB và O dựa trên một số chất cacbohydrat và protein đặc thù trên hồng cầu Đến những năm 1920, các nghiên cứu cho thấy nhóm máu được quyết định do gen Gen này quy định bởi 2 alen trội là I A , I B và 1 alen lặn i O , di truyền theo quy luật của Mendel [6] Do đó các nhà khoa học có thể dự đoán được nhóm máu của đứa trẻ dựa trên nhóm máu của cha mẹ Tuy nhiên việc sử dụng nhóm máu có những hạn chế nhất định do nó chỉ chính xác 30% và nó không phải là một công cụ hữu hiệu cho việc xác định mối quan hệ huyết thống Dựa trên nhóm máu này ta chỉ có thể khẳng định được một số trường hợp chắc chắn không phải là cha con

Ví dụ: Cha giả định có nhóm máu O (có cấu trúc gen i O i O ), mẹ ruột nhóm máu

Nếu con có nhóm máu A hoặc B, người cha giả định chắc chắn không phải là cha của con Tuy nhiên, nếu con có nhóm máu O, điều này vẫn không đủ để khẳng định mối quan hệ cha con, vì còn nhiều người đàn ông có nhóm máu O.

1.1.2 Xét nghiệm dựa trên hệ kháng nguyên bạch cầu (HLA)

Năm 1970, các nhà khoa học đã phát hiện ra kháng nguyên bạch cầu (Human Leucocyte Antigen - HLA), là các protein có mặt trên tất cả các tế bào trong cơ thể, ngoại trừ hồng cầu, và đặc biệt tập trung nhiều trên tế bào bạch cầu.

Bạch cầu là các protein kháng nguyên có mặt trên bề mặt tế bào, đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch và giao tiếp giữa các tế bào HLA được xác định thông qua các xét nghiệm huyết thanh và kháng thể đơn dòng có mặt trên tế bào bạch cầu lympho.

Có nhiều dạng HLA khác nhau, và sự hiện diện của chúng ở mỗi người cũng khác nhau, tuy nhiên, các gen quy định HLA di truyền theo quy luật Mendel Trẻ em khi sinh ra sẽ nhận một nửa kháng nguyên bạch cầu từ cha và nửa còn lại từ mẹ, điều này giúp xét nghiệm HLA trở thành công cụ xác định mối quan hệ huyết thống giữa cha và con Khi chỉ sử dụng xét nghiệm HLA, độ chính xác trong việc xác định mối quan hệ cha con đạt khoảng 80%, nhưng khi kết hợp với xét nghiệm nhóm máu và xét nghiệm huyết thanh, độ chính xác có thể lên tới 90%.

Xét nghiệm HLA không phải là công cụ lý tưởng để xác định mối quan hệ huyết thống vì yêu cầu lượng máu lớn và có thể gây khó chịu, nguy hiểm cho trẻ sơ sinh dưới 6 tháng tuổi Kết quả xét nghiệm có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như mẫu máu bị vỡ hồng cầu hoặc người làm xét nghiệm đã được truyền máu trước đó Hiện nay, xét nghiệm HLA chủ yếu được sử dụng để xác định tính tương hợp mô trước khi ghép tạng và tìm kiếm các HLA liên quan đến một số bệnh lý.

1.1.3 Xét nghiệm dựa trên đoạn lặp đa hình

1.1.3.1 Khái niệm đoạn lặp đa hình

DNA được cấu thành từ 4 loại nucleotide, và sự sắp xếp đa dạng của chúng tạo nên tính độc nhất của mỗi cá nhân Mỗi cơ thể chứa khoảng 3.2 tỉ cặp base, việc xác định sự khác biệt trong trình tự base giữa các cá nhân là rất phức tạp Năm 1984, Alec Jeffreys và các cộng sự đã phát hiện ra rằng trình tự base mã hóa cho hemoglobin trong máu người có các đoạn lặp lại từ 10-15 base, được gọi là các Tandem Repeat Sequence – đoạn lặp lại đa hình Những đoạn lặp lại này có tính đa hình về số lượng rất lớn và khác nhau giữa các cá nhân.

Trong một đơn vị lặp, có 5 số base, và chính sự đa hình này giúp phân biệt các cá thể trong loài cũng như giữa các loài khác nhau Dựa vào số lượng base trong đơn vị lặp, chuỗi lặp Tandem được chia thành 3 nhóm.

DNA vệ tinh (DNA satellite) là các đơn vị lặp lại từ một đến vài trăm base, với độ dài vùng lặp lại có thể lên tới vài Mb Chúng thường được tìm thấy xung quanh vùng tâm động của nhiễm sắc thể và có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào Sự phân bố của DNA vệ tinh liên quan đến việc liên kết các protein điều khiển, kiểm soát quá trình di chuyển của nhiễm sắc thể về cực của tế bào Mặc dù DNA vệ tinh ít được sử dụng làm chỉ thị phân tử nhận dạng cá thể, nhưng chúng thường được áp dụng trong việc lập bản đồ gen ở vùng gần tâm động.

DNA tiểu vệ tinh, hay còn gọi là DNA lặp lại ngẫu nhiên (VNTR), là một dạng DNA có số lượng base trong một đơn vị dao động từ 10-100 base và lặp lại từ 1-30 lần, với kích thước đoạn DNA từ 1-5kb, thậm chí có thể lên tới 20kb VNTR có thể phân bố tập trung hoặc rải rác trên nhiễm sắc thể, và dựa vào sự phân bố này, người ta chia DNA minisatellite thành hai loại.

DNA tiểu vệ tinh đa vị trí, hay còn gọi là mini satellite, xuất hiện rải rác ở nhiều vị trí trên bộ gen và đã được phát hiện lần đầu vào năm 1985.

DNA tiểu vệ tinh đơn vị trí (single-locus mini satellite) chỉ xuất hiện tại một vị trí cụ thể trên bộ gen và nhiều tiểu vệ tinh đơn vị trí này có giá trị quan trọng trong việc xác định dấu ấn DNA.

DNA vi vệ tinh (DNA microsatellite), hay còn gọi là single sequence repeat (SSRs) hoặc Short Tandem Repeat (STRs), là các đoạn DNA ngắn từ 1-6 base được lặp lại nhiều lần, tạo thành các đoạn khoảng 200 base Chúng phân bố rải rác hoặc tập trung trên nhiễm sắc thể và genome, với tính đa hình cao giữa các cá thể, do đó trở thành các chỉ thị phân tử phổ biến Ngoài ra, so với các DNA tiểu vệ tinh, DNA vi vệ tinh cho phép thiết kế phản ứng PCR để khuếch đại vùng gen chứa chúng.

Con cái nhận một nửa bộ nhiễm sắc thể từ cha và nửa còn lại từ mẹ, do đó các đoạn lặp đa hình cũng được di truyền Những đoạn lặp đa hình này phong phú hơn HLA và protein trong máu, tồn tại trong tất cả các tế bào của cơ thể Với những đặc điểm này, chúng trở thành chỉ thị phân tử lý tưởng cho xét nghiệm quan hệ huyết thống.

1.1.3.2 Các kỹ thuật xét nghiệm quan hệ huyết thống bằng đoạn lặp đa hình

- Xét nghiệm quan hệ huyết thống sử dụng kỹ thuật RFLP

Kỹ thuật PCR-STR

Kỹ thuật PCR - STR cho phép phân tích tính đa hình của DNA vi vệ tinh thông qua việc khuếch đại các vị trí STR bằng phản ứng PCR và phân tích kết quả bằng điện di mao quản.

Trong xét nghiệm quan hệ huyết thống, phản ứng PCR STR hiện nay sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để khuếch đại đồng thời từ 16 đến 24 vị trí STR Mỗi cặp primer tham gia phản ứng được gắn với các nhóm màu huỳnh quang khác nhau, giúp phân tích chính xác và hiệu quả hơn.

 Sau quá trình PCR, ta có hỗn hợp đoạn DNA khuếch đại các vị trí STR có màu huỳnh quang của primer tương ứng

Tiến hành điện di mao quản sản phẩm PCR kết hợp với allelic ladder, trong đó allelic ladder bao gồm tất cả các trường hợp lặp lại của các vị trí STR được đánh dấu bằng các màu huỳnh quang khác nhau Các vị trí mà primer khuếch đại gắn kết sẽ có cùng một màu huỳnh quang, giúp xác định chính xác sự hiện diện của các allele trong mẫu.

8 được phân tích cùng nhau cùng với ladder Số lần lặp lại của trình tự STR được xác định dựa trên allelic ladder được điện di cùng (hình 1.2)

Trước khi thực hiện điện di, cả mẫu và ladder sẽ được trộn với một lane chuẩn có màu huỳnh quang riêng biệt Phần mềm phân tích kết quả dựa vào màu huỳnh quang này để loại bỏ tín hiệu nhiễu, đồng thời so sánh sản phẩm PCR với allelic ladder nhằm xác định số lần lặp lại của vị trí STR.

The PowerPlex® Fusion System is a PCR STR amplification kit that enhances 24 STR loci using four sets of fluorescently labeled primers: Fluorescein, JOE, TMR-ET, and CXR-ET, along with a fifth fluorescent marker, WEN Internal Lane.

Kỹ thuật PCR tiên tiến, được phát triển từ multiplex PCR, kết hợp tín hiệu huỳnh quang trên trình tự primer, cho phép khuếch đại và phân biệt một lượng lớn các sản phẩm PCR đích khác nhau.

Nhược điểm của phương pháp này là kết quả đọc phụ thuộc vào cường độ màu huỳnh quang RFU (đơn vị phát quang tương đối) và kích thước sản phẩm, yêu cầu chất lượng phản ứng PCR rất cao Hơn nữa, trang thiết bị cần thiết cho phản ứng PCR thường có chi phí cao và khó sử dụng một cách phổ biến.

Hình 1.1: Kết quả hiển thị Liz scan -WEN Internal Lane Standard 500 [4]

Bảng 1.1: Các locus STR được phân tích trong bộ kit PowerPlex ® Fusion System [4]

STT STR locus Màu huỳnh quang Khoảng kích thước trên allelic ladder

25 WEN Internal Lane Standard 500 được gắn màu huỳnh quang thứ 5, chứa 21 đoạn DNA có kích thước:

Hình 1.2: Kết quả hiển thị cho Allelic ladder với 4 màu huỳnh quang [4]

Hình 1.3: Kết quả điện di STR bằng bộ kit PowerPlex ® Fusion System [4]

Các cải tiến trong DNA polymerase

Kỹ thuật PCR đã có những bước tiến đáng kể, đặc biệt là trong việc cải tiến DNA polymerase tham gia phản ứng Sự kiện quan trọng diễn ra vào năm 1976 khi Taq polymerase được cô lập thành công từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một enzyme chịu nhiệt, đã nâng cao hiệu quả của quy trình PCR Năm 1988, Kary Mullis cùng với Tổng công ty Cetus đã thương mại hóa Taq polymerase, mở ra cơ hội sử dụng rộng rãi và dẫn đến sự phát triển của hệ thống máy PCR.

Taq polymerase thế hệ đầu có nhiều khuyết điểm như hiệu suất thấp, dễ bị ức chế và thường xảy ra lỗi trong quá trình tổng hợp DNA, đặc biệt với các trình tự giàu GC và cấu trúc thứ cấp Sự phát triển của PCR đã trở thành yếu tố quan trọng trong hầu hết các nghiên cứu sinh học, đặc biệt là trong lĩnh vực xét nghiệm y học, do đó cần thiết phải phát triển các loại DNA polymerase thế hệ sau với hiệu suất vượt trội hơn.

Vào năm 1994, việc áp dụng kỹ thuật sử dụng kháng thể khóa enzyme polymerase đã giúp khắc phục tình trạng tổng hợp trình tự DNA không đặc hiệu ở nhiệt độ thấp Đến năm 2005, sản phẩm thương mại High-Fidelity DNA Polymerases được phát triển dựa trên công nghệ protein tái tổ hợp, mang lại hoạt tính polymerase 5´→ 3´ và exonuclease 3´→ 5´, cho hiệu suất tổng hợp cao gấp 50 lần so với taq thông thường, đồng thời cải thiện độ chính xác nhờ vào khả năng sửa sai.

Sự ra đời của nhiều loại DNA polymerase đã cho phép thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu DNA có tạp chất Năm 2009, nghiên cứu đã thành công trong việc tạo đột biến cho Taq DNA polymerase, giúp nó kháng lại các chất ức chế có trong máu Đến năm 2013, Miura và cộng sự đã khảo sát hiệu quả khuếch đại DNA của 6 loại direct DNA polymerase thương mại, và kết quả cho thấy cả 6 loại Taq đều có khả năng thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu DNA thô chứa nhiều chất ức chế.

Một số direct DNA polymerase trên thị thường hiện nay:

- KOD FX - Hãng Toyobo Life Science Deparment

- Mighty Amp - Hãng Takara Bio

- Hemo KlenTaq - Hãng New England Biolabs (NEB)

- Phusion Blood direct PCR kit – Hãng Thermo Fisher Scientific

- KAPA Blood PCR kit - Hãng Kapa Biosystems

Các phương pháp ly trích DNA

Nhiều phương pháp ly trích DNA được xây dựng, tuy nhiên các phương pháp đều gồm ba bước cơ bản:

Quá trình ly giải là bước đầu tiên trong việc phá hủy cấu trúc protein và giải phóng acid nucleic từ hạt nhân Thành phần của đệm ly giải bao gồm đệm pH, muối và chất phá màng.

- BƯỚC 2: Loại bỏ thành phần không phải DNA, chủ yếu là protein

Quy trình ly trích DNA đóng vai trò quan trọng trong phản ứng sinh học phân tử, với mục tiêu là dễ thao tác, giảm thiểu ngoại nhiễm, thu được nhiều DNA có độ tinh sạch cao, chi phí thấp và an toàn Tuy nhiên, việc phát triển một quy trình ly trích đáp ứng đầy đủ các tiêu chí này là một thách thức Do đó, việc lựa chọn phương pháp ly trích phù hợp cần dựa vào nguồn mẫu, yêu cầu về độ tinh sạch và lượng DNA cần thiết cho phản ứng.

Năm 1953, Grassmann và Deffner đã phát hiện ra rằng phenol là một chất lý tưởng để chiết xuất protein từ dung dịch nước Đến năm 1956, Kirby đã báo cáo rằng phenol ở các điều kiện pH khác nhau có khả năng phân tách DNA và RNA khỏi protein.

Năm 1957, Kirby phát hiện rằng muối anion như p-aminosalicylate và natri benzoate có tác dụng tăng cường lượng DNA và RNA trong quá trình ly trích Hiện nay, phương pháp Kirby vẫn được áp dụng, kết hợp với các chất hỗ trợ khác như chất tẩy rửa anion SDS, chloroform và isoamyl alcohol.

Ly trích bằng phenol là một trong những phương pháp ly trích sớm nhất và vẫn được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm Phương pháp này được coi là cơ bản và phù hợp cho nhiều loại mẫu khác nhau.

Phenol là một chất biến tính protein mạnh, có khả năng phá hủy các protein màng và enzyme phân hủy DNA, RNA Khi tiếp xúc với phenol, acid nucleic không hòa tan và tế bào sẽ bị phá vỡ, dẫn đến việc giải phóng các thành phần nội bào.

Sau khi ly tâm, mẫu xử lý sẽ phân tách thành hai lớp: lớp dưới là phenol và lớp trên là nước chứa DNA Phần protein bị biến tính sẽ nằm ở bề mặt phân cách giữa hai lớp và sẽ bị loại bỏ DNA trong phần dịch nổi sẽ được thu nhận bằng cách tủa với isopropanol có bổ sung sodium acetat Muối dư thừa được rửa sạch với ethanol 70%, sau đó ly tâm và hong khô bằng nhiệt để loại bỏ ethanol Cuối cùng, DNA được hòa tan với đệm TE hoặc nước cất vô trùng.

- Ưu điểm: Ly trích được DNA có kích thước lớn trên nhiều loại mẫu

- Nhược điểm: Mất nhiều thời gian, dễ gây ức chế phản ứng PCR do đó đòi hỏi cao ở tay nghề kỹ thuật viên, hóa chất sử dụng độc hại [22]

Năm 1990, Boom và cộng sự công bố phương pháp ly trích DNA bằng silica trong môi trường muối chaotropic [23]

Hạt silica tích điện dương có khả năng hấp thụ DNA tích điện âm, điều này diễn ra trong các điều kiện pH và thành phần muối khác nhau của môi trường đệm Quá trình ly trích DNA bao gồm bốn bước chính: ly giải tế bào, hấp thu acid nucleic, rửa và rửa giải, trong đó các yếu tố không cần thiết được loại bỏ dần qua các đệm chaotropic khác nhau.

Silica có mặt dưới dạng tinh thể SiO2 cũng như các dạng hóa học khác như oxit silic vô định hình, bột thủy tinh, alkylsilica, silicat nhôm (zeolit) và silica gắn nhóm.

NH 2 Quy trình hydrat hóa silica tạo hạt silica ngậm nước tích điện dương sử dụng cho ly trích DNA được đăng ký patent vào năm 1994 bởi Woodard và cộng sự [25]

Hình 1.4: Ly trích bằng silica [26]

Phương pháp Boom là một trong những phương pháp ly trích phổ biến, đã được cải tiến để khắc phục một số hạn chế của ly trích pha lỏng và giảm thiểu tình trạng ức chế Sự phát triển này mở ra nhiều lựa chọn cho các nhà nghiên cứu trong việc tối ưu hóa quy trình ly trích.

Quy trình ly trích có nhược điểm là bao gồm 4 giai đoạn thao tác: ly giải, hấp thu, rửa và rửa giải, dẫn đến việc thực hiện nhiều bước Điều này khiến kỹ thuật viên dễ mắc phải những nhầm lẫn và sai sót trong quá trình thao tác.

1.4.3 Ly trích bằng cột lọc

Cột ly tâm sử dụng chất bám silica (silica resin) để gắn chọn lọc DNA, ARN và plasmid Dưới các điều kiện môi trường đệm khác nhau, màng lọc silica giữ lại DNA/RNA, trong khi các thành phần không mong muốn được loại bỏ thông qua lực quay ly tâm.

Bộ kit ly trích tay thương mại hiện nay chủ yếu áp dụng phương pháp ly trích cột lọc, giúp giảm thiểu tối đa tình trạng ức chế so với các phương pháp như phenol hay Boom Với chi phí đầu tư thiết bị thấp và khả năng xử lý số lượng mẫu ly trích nhỏ, phương pháp này trở nên phổ biến trong nghiên cứu và xét nghiệm.

Nhược điểm của phương pháp này là yêu cầu thực hiện nhiều bước, sử dụng cột lọc và lực ly tâm, do đó không phù hợp cho việc xử lý số lượng mẫu lớn như mẫu mô hay mẫu bùn đất.

1.4.4 Phương pháp ly giải kiềm (alkaline)

Phương pháp Alkaline được mô tả lần đầu tiên bởi Birnboim và Doly năm 1979

[28] Phương pháp chuyên dùng để tách DNA plasmid từ vi khuẩn

Ly trích thô DNA bằng các chất biến tính protein

1.5.1 Ƣu thế của quy trình ly trích thô

Các quy trình ly trích DNA truyền thống gặp nhiều hạn chế như phức tạp, dễ xảy ra sai sót do kỹ thuật viên, yêu cầu tay nghề cao để tránh ngoại nhiễm và ức chế mẫu, sử dụng hóa chất độc hại, và hệ thống ly trích tự động khó thiết kế với chi phí cao Để cải thiện chất lượng quy trình xét nghiệm, cần phát triển một quy trình ly trích nhanh với nhiều ưu điểm.

- Thực hiện đơn giản, từ một đến hai bước thao tác giúp tránh sai sót, nhầm lẫn trong ly trích

- Giảm vật tư tiêu hao, giảm giá thành ly trích

- Mở ra tiềm năng thiết kế hệ thống ly trích tự động chi phí thấp

1.5.2 Một số chất biến tính protein

Nhu cầu xây dựng quy trình ly trích nhanh DNA luôn hiện hữu, nhưng trước đây, công nghệ sinh học chưa đủ phát triển để áp dụng quy trình này Hiện nay, nhờ vào sự tiến bộ của công nghệ polymerase tái tổ hợp, chúng ta có thể xem xét một số quy trình ly trích nhanh DNA sử dụng các chất biến tính protein Các chất biến tính protein này hoạt động theo nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm chất chaotropic như phenol và chloroform, cũng như chất tẩy rửa như SDS, Triton và NaOH.

Chất chaotropic, như muối hoạt động bề mặt, có khả năng làm mất tính bền vững của liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước, dẫn đến những thay đổi đáng kể trong cấu trúc protein Những thay đổi này có thể gây ra ly giải màng tế bào, biến tính protein, DNA và các đại phân tử khác, bất hoạt enzyme nuclease, cũng như thúc đẩy quá trình gắn acid nucleic vào silic.

Butanol, Ethanol, Guanidinium chloride, Magnesium chloride, Phenol, Propanol, Sodiumperchlorat (NaClO 4), Sodium iodide(NaI)…

Công thức hóa học: C 6 H 5 OH

Phenol là một chất biến tính protein mạnh, có khả năng tan vô hạn ở 66°C và thuộc loại không phân cực Trong khi đó, acid nucleic là chất phân cực, nên không hòa tan trong phenol Khi phân tách, phenol tạo ra hai pha: pha hữu cơ ở dưới chứa các protein biến tính và thành phần khác của tế bào, trong khi pha nước ở trên chứa acid nucleic.

Phenol thường được kết hợp với chloroform để tạo ra sự tách biệt rõ ràng giữa pha nước và pha hữu cơ Sự kết hợp này giúp cải thiện hiệu quả trong quá trình chiết xuất và phân tách các hợp chất hóa học.

Chất tẩy rửa là các phân tử hóa học có cấu trúc đặc biệt, bao gồm một đuôi không phân cực kị nước (hydrophob) và một đầu phân cực ưa nước (hydrophil) Việc phân loại chất tẩy rửa dựa trên tính chất của đầu ưa nước, giúp xác định khả năng tương tác và ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực khác nhau.

 Chất hoạt hóa ion: Đầu phân cực bị ion hóa, tích điện dương, âm, hoặc cả hai

 Chất hoạt hóa phi ion: đầu phân cực không bị ion hóa

Hình 1.5: Cấu tạo hóa học chất tẩy rửa [31]

Chất tẩy rửa như SDS và Triton X 100 được sử dụng để làm gián đoạn các liên kết ưa nước và kỵ nước trên màng sinh học, từ đó hỗ trợ trong quá trình ly giải tế bào, bước đầu quan trọng trong việc ly trích DNA.

SDS là một chất hoạt hóa ion có đầu phân cực âm, có khả năng xen kẽ đuôi kỵ nước vào cấu trúc protein Điều này dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc không gian của protein, gây ra tình trạng bất hoạt cho protein đó.

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học SDS [32]

Chất tẩy rửa phi ion có cấu trúc đuôi kỵ nước cứng nhắc, không thâm nhập vào protein hòa tan trong nước Triton được sử dụng trong quá trình ly trích protein, và nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào quy trình ly trích thô bằng Triton, vì lượng Triton dư thừa trong dịch ly trích không ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme DNA polymerase.

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học triton X100 [33]

NaOH là một chất hóa học có tính kiềm mạnh, thường được dùng để phá vỡ màng tế bào và biến tính sợi DNA Trong phương pháp kiềm, NaOH được kết hợp với SDS để ly trích plasmid.

Tế bào niêm mạc miệng- nguồn mẫu DNA ưu thế trong xét nghiệm huyết thống

1.6.1 Đặc điểm tế bào niêm mạc miệng

Khoang miệng được bao quanh bởi môi ở phía trước, má hai bên, lưỡi ở phía dưới và vòm hầu ở phía sau Niêm mạc miệng là lớp tế bào bao phủ khoang miệng và lưỡi, mang DNA đặc trưng của từng cá thể Tế bào niêm mạc miệng có nhiều ưu điểm nổi bật.

- Dễ bong tróc do đó dễ dàng thu nhận để làm xét nghiệm DNA

- Thao tác thu mẫu đơn giản, không xâm lấn

- Các tế bào niêm mạc miệng là những tế bào bong tróc rời rạc => dễ ly trích DNA [24]

Hình 1.8: Tế bào niêm mạc miệng dưới kính hiển vi [24]

1.6.2 Tế bào niêm mạc miệng - nguồn mẫu DNA ƣu thế cho xét nghiệm huyết thống

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng của việc thu thập DNA từ niêm mạc miệng Lee Moore và cộng sự (2001) đã khảo sát các phương pháp thu nhận tế bào niêm mạc miệng cùng với các yếu tố ảnh hưởng đến lượng DNA thu được Kết quả cho thấy mẫu niêm mạc miệng cung cấp một lượng DNA dồi dào, rất phù hợp cho các phản ứng phân tích.

Mẫu DNA niêm mạc miệng có thể được bảo quản hiệu quả trong điều kiện nhiệt độ thấp, với thời gian lưu trữ lên tới 6 tháng mà vẫn đảm bảo chất lượng.

[35] Heath và cộng sự (1992) cũng có kết luận tương tự là niêm mạc miệng cung cấp DNA phù hợp cho các xét nghiệm lâm sàng và nghiên cứu [36]

Niêm mạc miệng không chỉ là nguồn mẫu cho xét nghiệm nhận dạng cá thể STR mà còn phục vụ cho nhiều xét nghiệm khác Hiện nay, có một số bộ kit như BodeElute™ DNA Elution Reagent kit, QuickExtract™ DNA Extraction Solution và BuccalAmp™ DNA Extraction Kits cho phép ly trích nhanh DNA từ mẫu niêm mạc miệng Các sản phẩm này nổi bật với thời gian ly trích ngắn, thao tác đơn giản và hiệu quả cao Mặc dù giá thành của các bộ kit ly trích nhanh khá cao, nhưng chúng vẫn được ưa chuộng do yêu cầu chính xác trong các xét nghiệm, đặc biệt là trong xét nghiệm STR Thao tác đơn giản giúp giảm thiểu rủi ro nhầm lẫn và sai sót trong quá trình ly trích.

1.6.3 Các nghiên cứu ly trích thô DNA

Xét nghiệm nhận diện cá thể yêu cầu độ chính xác cao do tính chất nhạy cảm của nó Quy trình xét nghiệm STR cần giảm thiểu rủi ro trong quá trình ly trích Hiện nay, các bộ kit xét nghiệm STR đều khuyến cáo sử dụng enzyme DNA polymerase có tính kháng ức chế, cho phép thực hiện PCR trên mẫu DNA có nhiều tạp chất Điều này cho thấy đã có đủ điều kiện để áp dụng quy trình ly trích thô DNA từ mẫu niêm mạc miệng cho xét nghiệm STR.

Nhiều quy trình ly trích nhanh niêm mạc miệng đã được đề xuất, nhưng chúng tôi tập trung vào quy trình sử dụng NaOH và Triton X100 do tính chất phù hợp cho ly trích nhanh Phenol không thích hợp vì ở nhiệt độ 66°C, nó tan trong nước và có thể gây ức chế phản ứng do tồn dư trong dịch ly trích DNA Ngược lại, NaOH và Triton X100 có ưu điểm là nếu còn sót lại trong dịch ly trích, chúng không ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme polymerase.

- Quy trình ly trích nhanh bằng NaOH

Brenda Richards đã tiến hành ly trích niêm mạc miệng bằng NaOH [36] Quy trình thực hiện như sau:

 Cho tăm bông lấy mẫu niêm mạc miệng

 Vortex mạnh mẫu tăm bông trong 600μL dung dịch NaOH 50mM

 Hút cạn dịch lỏng trong tube sang tube mới, trung hòa bằng 60 μl 1M Tris- HCl pH8

Sản phẩm DNA ly trích đã được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR multiplex, trong đó khuếch đại 5 vị trí exon trên gen CFTR Kết quả cho thấy chất lượng DNA thu được đủ khả năng tham gia vào phản ứng PCR multiplex.

Tác giả Amy H Walker và các cộng sự (1999) đã chứng minh rằng DNA được chiết xuất từ mẫu niêm mạc miệng theo quy trình đã nêu có khả năng tham gia vào phản ứng PCR với tỷ lệ thành công lên tới 92%.

- Quy trình ly trích nhanh bằng Triton X100

Trong nghiên cứu Daniel và cộng sự (1995), tác giả tiến hành ly trích nhanh bằng quy trình sử dụng Triton X 100 [37] Quy trình thực hiện như sau:

 Cho mẫu vào dung dịch biến tính protein (1% triton X100, 10mM Tris-HC1 pH8, EDTA 0.1mM)

 Ly tâm 12000g/10 phút, hút dịch nổi

Kết quả cho thấy sản phẩm DNA ly trích bằng Triton không gây ức chế phản ứng

- Quy trình ly trích nhanh bằng NaOH và SDS

Trong báo cáo của cKlintschar M và cộng sự (2000), quy trình alkalin (NaOH và SDS) được áp dụng để ly trích DNA cho phản ứng PCR STR Quy trình này đảm bảo hiệu quả trong việc thu nhận DNA cần thiết cho các nghiên cứu di truyền.

 Cho mẫu vào dung dịch biến tính protein (50mM NaOH, SDS 0.025%)

 Trung hòa bằng 60 μl 1M Tris HCl pH8

 Ly tâm mạnh, hút dịch nổi chạy PCR

Nghiên cứu cho thấy việc ly trích thô DNA từ niêm mạc miệng là khả thi, và chất lượng DNA thu được đáp ứng yêu cầu cho một số phản ứng PCR.

Cải tiến taq polymerase với hoạt tính kháng ức chế đã mở ra cơ hội ứng dụng quy trình ly trích thô DNA trong thực tiễn Việc thực hiện quy trình ly trích niêm mạc miệng đơn giản chỉ với một đến hai bước thao tác sẽ giúp giảm thiểu sai sót, đồng thời tiết kiệm chi phí và thời gian Do đó, nghiên cứu này nhằm khảo sát và cải tiến một số quy trình ly trích thô DNA đã công bố trên đối tượng niêm mạc miệng, nhằm ứng dụng hiệu quả trong xét nghiệm quan hệ huyết thống.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sơ đồ nội dung nghiên cứu

- Trên cơ sở hiểu biết cơ bản về chất ly giải, lựa chọn nguồn hóa chất phổ biến

Chúng tôi đã tiến hành so sánh ba quy trình ly trích thô DNA đã được báo cáo, bao gồm SDS, NaOH và Triton X100, với quy trình ly trích đối chứng sử dụng bộ ly trích cột OMEGA trên mẫu niêm mạc miệng Qua đó, chúng tôi lựa chọn quy trình ly trích phù hợp nhất cho xét nghiệm.

DNA trên cơ sở thỏa mãn yêu cầu sau:

 Rút ngắn được thời gian ly trích, thao tác đơn giản so với bộ ly trích đối chứng

 Sản phẩm DNA thu được phù hợp cho phản ứng PCR multiplex trên bộ kit

- Cải tiến quy trình được chọn

- Đánh giá hiệu quả của quy trình đã cải tiến:

 So sánh quy trình đã cải tiến với quy trình ly trích thương mại trên 10 mẫu

 Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu

Hình 2.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu

Ly trích so sánh với bộ ly trích thương mại- 10 mẫu Đánh giá hiệu quả của quy trình đã cải tiến

Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu

Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp

Quy trình đối chứng: Bộ ly trích E.Z.N.A ® Forensic DNA

Vật liệu

- Máy ủ nhiệt Benchmark: Xuất xứ Mỹ

- Máy PCR ASTEC: Xuất xứ Nhật Bản

- Hệ thống điện di mao quản ABI 3130 Genetic Analyzer: Xuất xứ Mỹ

- Tăm bông y tế 5mm - Bạch Tuyết: Xuất xứ Việt Nam

- Bộ kit ly trích cột E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit: Hãng sản xuất – OMEGA, xuất xứ -Mỹ

- Bộ kit PowerPlex ® Fusion System: Hãng sản xuất Promega, xuất xứ -Mỹ

- Hi-Di™ Formamide: Hãng sản xuất ABI, xuất xứ - Mỹ

- Các hóa chất ly trích:

 Tris-HCl (pH8, 1M) – hãng Sigma Aldrich

Thu nhận mẫu

- Phương pháp thu mẫu: Theo hướng dẫn của Michael S Adamowicz và cộng sự

 Yêu cầu: Người cung cấp mẫu không ăn uống bất kỳ thứ gì trong vòng 30 phút trước khi lấy mẫu

 Dùng tăm bông y tế quệt vào thành bên trong miệng 30 lần, xoay tròn tăm bông trong quá trình quệt

 Cho đầu tăm bông vào tube vô trùng , bổ sung 500μl dung dịch TE1X (Tris-HCl 10mM pH8, EDTA 0.1mM)

 Vortex mạnh, đặt vào máy lắc, lắc 10 phút ở tốc độ 900 vòng / phút để phóng thích các tế bào biểu mô

 Hút cạn dịch lỏng sang tube mới

 Mẫu lấy nhiều tăm bông thực hiện tương tự cho mỗi tăm bông Hút toàn bộ dịch lỏng dồn vào 1 tube lớn

- Số lượng mẫu thu nhận: 211 mẫu Lựa chọn đối tượng thu mẫu theo bảng 2.1

- Thời gian thu mẫu: 1 tháng

Bảng 2.1: Danh sách đối tượng thu mẫu

Nhóm Đối tƣợng thu mẫu Số lƣợng mẫu cần Số tăm bông thu/ 1 mẫu

4 10 cặp không cha con 20 mẫu 1

Ly trích khảo sát - Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp

Chúng tôi đã tiến hành so sánh quy trình ly trích DNA bằng Triton, NaOH, và NaOH kết hợp SDS với bộ ly trích thương mại E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit Mục tiêu là xác định quy trình ly trích phù hợp nhất cho xét nghiệm quan hệ huyết thống.

Dùng mẫu niêm mạc miệng thuộc nhóm 1(bảng 2.1), ly trích theo 4 phương pháp, mỗi phương pháp lặp lại 5 lần

- Ly trích bằng Triton X100 (bảng 2.2)

- Ly trích bằng NaOH (bảng 2.3)

- Ly trích bằng NaOH + SDS (bảng 2.4)

- Ly trích đối chứng bằng bộ E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit (bảng 2.5)

Bảng 2.2: Quy trình ly trích bằng Triton X100

Quy trình A: Ly trích bằng Triton X100 theo Daniel (1995) [37]

Công thức pha đệm ly giải:

- Ủ 100 μl mẫu với 500μl dịch ly giải ở

95 o C/ 30 phút => Tạo hỗn hợp có nồng độ Triton X100 là 1%

- Hút dịch nổi, pha loãng 5 lần trong TE1X

Bảng 2.3: Quy trình ly trích bằng NaOH

Quy trình B: Ly trích bằng NaOH theo Brenda (1992) [36]

- 500μl NaOH (60mM) + 100 μl mẫu => Tạo hỗn hợp có nồng độ NaOH là 50mM

- Trung hòa bằng 60 μl 1M Tris HCl pH8

- Pha loãng 5 lần trong TE1X

Bảng 2.4: Quy trình ly trích bằng NaOH - SDS

Quy trình C: Ly trích bằng NaOH + SDS [39]

- Cho 500μl dịch ly giải vào 100 μl mẫu => Tạo hỗn hợp có nồng độ : NaOH 50mM SDS 0.025%

- Trung hòa bằng 60 μl 1M TrisCl H pH8

- Pha loãng 5 lần trong TE1X

Bảng 2.5: Quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng bằng bộ ly trích cột E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit

Quy trình đối chứng: Ly trích bằng bộ E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit

Tài liệu tham khảo: Hướng dẫn sử dụng cung cấp bởi nhà sản xuất

 Cho 225 μl BL buffer vào mẫu => ủ 60 o C/10 phút

 Hút toàn bộ dịch vào cột

 Rửa lần 1 bằng 500 μl HBC buffer => Ly tâm 13000 RPM/1phút

 Rửa 2 lần bằng 700 μl DNA wash buffer

 Chuyển cột vào tube sạch

 Cho 200 μl elution buffer vào tube

 Ly tâm 13000 RPM/1phút => thu dịch

 Pha loãng 5 lần trong TE1X => Chạy PCR STR

2.4.2 Chạy PCR – phân tích kết quả

- Mix PCR STR được pha theo hướng dẫn của tài liệu Technical manual- Powerplex Fusion của Promera Bộ hóa chất sử dụng PowerPlex ® Fusion System (bảng 2.6)

Bảng 2.6: Công phức pha mix PCR-STR [4]

Hóa chất Thể tích/ 1 mix

PowerPlex ® Fusion 5X Primer Pair Mix 5μl

- Điện di trên hệ thống điện di mao quản ABI 3130 Genetic Analyzer:

 Cho vào plate chạy mẫu điện di hỗn hợp: 0.5μl WEN ILS 500 + 9.5 μl Hidi +

 Điện di kèm với một ladder: 0.5μl WEN ILS 500 + 9.5 μl Hidi + 1 μl PowerPlex® Fusion Allelic Ladder Mix

 Biến tính mẫu ở 95 o C/ 3 phút, chuyển ngay vào đá lạnh trong 3 phút

 Đặt vào máy ABI 3130 Genetic Analyzer, tiến hành điện di [4]

2.4.3 Phân tích kết quả lựa chọn quy trình ly trích phù hợp

Kết quả phân tích bằng phần mềm GeneMapper ID V3.2 cho thấy có sự so sánh với bộ đối chứng OMEGA, trong đó ghi nhận số mẫu bị ức chế, dẫn đến không có sản phẩm PCR.

29 trăm vị trí locus STR lên đủ peak, chiều cao peak (RFU) trung bình trên tổng số peak lên

Phương pháp ly trích ưu thế là phương pháp có:

- Số mẫu ức chế thấp nhất

- Chiều cao trung bình peak cao nhất

- Phần trăm số vị trí STR lên đủ peak cao nhất

2.5 Cải tiến trình ly trích phù hợp

- Dùng 1 mẫu niêm mạc miệng thuộc nhóm 1 (bảng 2.1)

Quy trình ly trích mẫu sử dụng NaOH-SDS với nồng độ NaOH cố định 50mM và các nồng độ SDS lần lượt là 0.045%, 0.035%, 0.025%, 0.015%, 0.01% và 0.005% Mỗi nồng độ SDS được thực hiện lặp lại 5 lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

- Chạy PCR STR, điện di phân tích kết quả theo hướng dẫn mục 2.4.2

- Phân tích kết quả bằng phần mềm Gene Mapper ID v3.2

Bảng kết quả phân tích STR cho mỗi quy trình cho thấy số lượng mẫu bị ức chế (không có sản phẩm PCR) và số vị trí STR có peak đầy đủ Đồng thời, nó cũng cung cấp thông tin về chiều cao peak trung bình (RFU) trên tổng số peak đã ghi nhận.

- Nồng độ SDS phù hợp là nồng độ tại đó, kết quả phân tích cho thấy:

 Không có mẫu ức chế

 Cường độ huỳnh quang trung bình của peak cao nhất

 Lên đủ peak ở 100% các vị trí STR

2.6 Đánh giá hiệu quả của quy trình cải tiến

2.6.1 So sánh quy trình đã cải tiến với quy trình ly trích thương mại

- Số mẫu thực hiện: 10 mẫu thuộc nhóm 2 (bảng 2.1)

- Từ quy trình ly trích xây dựng được ở mục 2.5, tiến hành ly trích song song với quy trình ly trích thương mại E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit

- Từ bảng kết quả phân tích STR của mỗi mẫu trên hai phương pháp ly trích ghi nhận:

 Số mẫu bị ức chế (không có sản phẩm PCR)

 Phần trăm số peak lên

 Số mẫu có tín hiệu peak thấp dưới 50 RFU

Quy trình ly trích đã được cải tiến và cho kết quả phân tích tương đồng với bộ đối chứng, với số lần lặp lại của trình tự STR đạt yêu cầu Đặc biệt, không xuất hiện tín hiệu peak nào dưới 50 RFU.

Bảng 2.7: Công thức pha đệm ly giải ở các nồng độ SDS khác nhau

Công thức pha đệm ly giải

Nồng độ SDS khảo sát Nồng độ SDS tương ứng trong dịch ly giải

2.6.2 Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu

- Số mẫu thực hiện: 160 mẫu thuộc nhóm 2, 10 cặp mẫu có quan hệ huyết thống cha con - nhóm 3, 10 cặp mẫu không có quan hệ huyết thống cha con - nhóm 4 (bảng 2.1)

- Ly trích theo quy trình ly trích xây dựng được ở mục 2.5

Bảng kết quả phân tích STR cho thấy số lượng mẫu bị ức chế (không có sản phẩm PCR), số mẫu đạt đủ peak ở 24 vị trí STR và chiều cao peak của từng mẫu.

Quy trình ly trích đạt yêu cầu, có thể áp dụng trong thực tế khi:

 100% mẫu lên đủ peak ở 24 vị trí STR

 Trên 90% peak có cường độ huỳnh quang > 100RFU

 100% peak có cường độ huỳnh quang > 50RFU

 Trên 10 cặp mẫu đã biết có quan hệ huyết thống cha con, kết quả phân tích cũng phải có quan hệ huyết thống

 Trên 10 cặp mẫu đã biết không có quan hệ huyết thống cha con, kết quả phân tích cũng phải không có quan hệ huyết thống.

Đánh giá hiệu quả của quy trình ly trích đã cải tiến