Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định và phân tích trình tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh của giống lợn Ỉ tại Việt Nam

Kết cấu nội dung của luận văn gồm có phần mở đầu, nội dung, phần kết luận và danh mục tài liệu tham khảo. Luận văn gồm 3 chương. Chương 1: Tổng quan. Chương 2: Đối tượng và phương pháp. Chương 3: Kết quả và thảo luận.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Đức Hiếu

XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ

HỆ GENE TY THỂ HOÀN CHỈNH CỦA

GIỐNG LỢN Ỉ TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội –2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Đức Hiếu

XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ

HỆ GENE TY THỂ HOÀN CHỈNH CỦA

GIỐNG LỢN Ỉ TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Lời cảm ơn

Trước tiên, tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới TS Võ Thị Bích Thủy và TS

Hoàng Thị Mỹ Hạnh những người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu, thực hiện luận văn thạc sĩ này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Nghiêm Ngọc Minh, người đã

luôn tạo điều kiện nghiên cứu tốt nhất cho tôi, cũng như luôn quan tâm, giúp đỡ và trao đổi những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Nguyễn Lai Thành, người đã giúp

đỡ, định hướng ban đầu cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, và bạn bè tôi vì đã luôn bên tôi trong công việc cũng như ngoài cuộc sống

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên cao học

Nguyễn Đức Hiếu

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về giống lợn Ỉ 2

1.1.1 Nguồn gốc giống vật nuôi 2

1.1.2 Giống lợn nhà (Sus scrofa) 2

1.1.3 Giống lợn Ỉ 3

1.2 Tầm quan trọng của các nghiên cứu về lợn tại Việt Nam 6

1.3 Marker trong nghiên cứu đa dạng di truyền 7

1.3.1 Cấu trúc hệ gen ty thể 9

1.3.2 Ty thể trong nghiên cứu đa dạng di truyền 10

1.4 Phương pháp giải trình tự Sanger 12

1.5 Phương pháp phân tích sự chủng loại phát sinh 17

1.5.1 Cây chủng loại phát sinh 17

1.5.2 Phương pháp Bayesian 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 Đối tượng 21

2.2 Vật liệu và trang thiết bị 21

2.3 Phương pháp 21

2.3.1 Thu mẫu 21

2.3.2 Tách chiết mẫu DNA tổng số (với nguồn mẫu là máu) 21

2.3.3 Thiết kế mồi 22

2.3.4 Khuếch đại trình tự hệ gen ty thể bằng kỹ thuật PCR 23

2.3.5 Giải trình tự trên máy ABI 3500 24

2.3.6 Xử lí kết quả giải trình tự 25

2.3.7 Phân tích trình tự 26

2.3.8 Phân tích sự chủng loại phát sinh 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Thu thập và giải trình tự hệ gen ty thể lợn Ỉ 27

3.1.1 Thu mẫu 27

3.1.2 Tách chiết DNA tổng số 27

3.1.3 Khuếch đại hệ gen ty thể 28

3.1.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 31

3.1.5 Kiểm tra kết quả giải trình tự 32

3.2 Phân tích hệ gen ty thể lợn Ỉ 32

3.2.1 Dự đoán gen ty thể 33

3.2.2 Kết quả sắp xếp trình tự 42

3.2.3 Cây chủng loại phát sinh sử dụng trình tự hoàn chỉnh 46

3.2.4 Cây chủng loại phát sinh sử dụng trình tự D loop 47

3.2.5 Sự chủng loại phát sinh ở Sus scrofa 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 65

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Khối lượng lợn Ỉ và Ỉ pha qua các mốc tuổi (kg) 4

Bảng 1.2 Khối lượng lợn Ỉ pha và Ỉ mỡ 5

Bảng 2.1 Trình tự mồi PCR 22

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 24

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng giải trình tự 25

Bảng 3.1 Cấu trúc của hệ gen ty thể lợn Ỉ 34

Bảng 3.2 Khu vực địa lý và các thông số thành phần trình tự của các giống lợn 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của ba loại đường năm carbon ribose, deoxyribose và

dideoxyribose 13

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng giải trình tự Sanger Ở đây, các mồi giải trình tự được gắn phóng xạ và các phản ứng tạo ra các đoạn trình tự bổ sung với khuôn DNA 14

Hình 1.3 Cấu trúc và phổ phát xạ huỳnh quang của bốn loại dye succinylfluorescein được phát triển bởi DuPont 15

Hình 1.4 Sơ đồ biểu diễn của một hệ thống giải trình tự DNA mao quản 16

Hình 3.1 Hình ảnh các cá thể lợn Ỉ 27

Hình 3.2 DNA tổng số được tách từ mẫu máu lợn Ỉ 28

Hình 3.3 Sản phẩm PCR khuếch đại các mồi 1-30 với nhiệt độ gắn mồi 54 o C 29

Hình 3.4 Sản phẩm PCR khếch đại tại nhiệt độ gắn mồi 53 o C và 51 o C 30

Hình 3.5 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR hệ gen ty thể 31

Hình 3.6 Ví dụ cho phần kết quả giải trình tự đủ độ tin cậy và được lựa chọn 32

Hình 3.7 Cấu trúc dạng vòng của hệ gen ty thể lợn Ỉ được xây dựng bởi phần mềm GenomeVX 33

Hình 3.8 Cấu trúc bậc hai của 22 loại tRNA được mã hóa trên hệ gen ty thể lợn Ỉ 41

Hình 3.9 Một phần trình tự D loop của lợn Ỉ và các giống lợn đã được công bố sau khi tiến hành sắp xếp 43

Hình 3.10 Một phần trình tự hoàn chỉnh của lợn Ỉ và các giống lợn đã được công bố sau khi tiến hành sắp xếp 44

Hình 3.11 Cây chủng loại phát sinh sử dụng trình tự hoàn chỉnh được phân tích theo phương pháp Bayesian 47

Hình 3.12 Cây chủng loại phát sinh sử dụng trình tự D loop được phân tích theo phương pháp Bayesian 49

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Lợn Ỉ đã từng là một giống lợn được nuôi rất phổ biến tại các tỉnh Bắc Bộ của Việt Nam Giống lợn này mang nhiều đặc điểm di truyền quý như mắn đẻ, khả năng chống chịu bệnh tốt, chất lượng thịt thơm ngon Tuy nhiên do kích thước nhỏ, tốc độ sinh trưởng chậm, không kinh tế, vì vậy số lượng lợn Ỉ được nuôi đang ngày một giảm

đi và giống này có nguy cơ sẽ biến mất Là một trong những nghiên cứu đầu tiên về di truyền phân tử đối với giống lợn Ỉ, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể làm công cụ nghiên cứu nguồn gốc di truyền của lợn Ỉ Hệ gen ty thể rất dễ khuếch đại, kích thước nhỏ, bên cạnh đó chúng còn được coi là dấu hiệu phân tử (marker) trong lĩnh vực đa dạng sinh học Những kết quả trong nghiên cứu này sẽ trở thành cơ sở phân phục vụ cho các hoạt động bảo tồn nguồn gen cũng như các nghiên cứu sâu hơn về di truyền phân tử trên đối tượng lợn Ỉ Mục tiêu và

phương pháp này đã được chúng tôi thực hiện trong đề tài “Xác định và phân tích trình

tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh của giống lợn Ỉ tại Việt Nam”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về giống lợn Ỉ

1.1.1 Nguồn gốc giống vật nuôi

Quá trình thuần hóa vật nuôi được diễn ra khoảng 8,000 - 10,000 năm trước tại Tây Nam Á, Đông Á và Châu Mỹ, [16] Điều này không hoàn toàn là ngẫu nhiên bởi tại thời điểm đó, sau khi Kỷ băng hà (12,200–11,100 năm trước) kết thúc, khí hậu bắt đầu trở nên ấm hơn và theo mùa hơn Một số quần thể người bắt đầu phát triển nhanh chóng và trở thành các trung tâm dân cư, hình thành nên các khu vực quan trọng Quá trình định cư này thường diễn ra tại các khu vực đất đai màu mỡ tự nhiên, thích hợp cho nông nghiệp, hoặc tại các vị trí nằm giữa các vùng đất rộng lớn, đóng vai trò liên kết các vùng đất này lại với nhau, và là điểm dừng chân của những người di cư Sự tăng lên của cả dân số bản địa và di cư đã khiến nhu cầu cung cấp thực phẩm tăng lên, kích thích kinh tế nông nghiệp và các quá trình thuần hóa các giống nông nghiệp [43,

72, 82]

Ba khu vực Tây Nam Á (Vùng Trăng lưỡi liềm màu mỡ và rìa phía đông của nó, hướng về phía lưu vực Ấn Độ) [77], Đông Á (Trung Quốc và các nước phía nam Trung Quốc) và khu vực dãy Andean của Nam Mỹ [16] được coi là các khu vực chính diễn ra quá trình thuần hóa giống vật nuôi Gia súc, cừu, dê, lợn và trâu được thuần hóa tại hai khu vực châu Á, trong khi lạc đà không bướu và lạc đà Alpaca được thuần hóa ở Nam

Mỹ Ngựa là ngoại lệ, chúng được thuần hóa tại các khu vực độc lập phía bắc, ngoài ra ngựa dường như là loài gia súc lớn được thuần hóa gần đây nhất (khoảng 6000 năm trước) [39, 93]

1.1.2 Giống lợn nhà (Sus scrofa)

Giống lợn nhà hiện nay (Sus scrofa) bắt nguồn từ hai nhóm lợn rừng hoang dại

Đó là lợn rừng Châu Âu (Sus scrofaferus) và lợn rừng Châu Á (Sus orientalis, Sus

cristatus sus vittatus) được con người thuần hoá trong thời gian dài mà thành Căn cứ

vào hình dáng của tai, người ta chia cả hai nhóm lợn nguyên thuỷ Châu Âu và Châu Á

Luận văn thạc sĩ

thành hai loại: Lợn tai dài và lợn tai ngắn Giống lợn lai cổ đại là do giống lợn nguyên thuỷ Châu Âu và nguyên thuỷ Châu Á tạp giao mà thành Giống lợn này được nuôi chủ yếu tại các nước dọc theo Địa Trung Hải Trong đó lấy giống lợn lông xoăn Roman và lợn ở bán đảo Balkan lai với lợn Trung Quốc là giống thành thục sớm, phẩm chất thịt ngon, mềm, ở đời sau cho tự giao và hình thành giống lợn lai cổ đại Các giống lợn nhà nuôi hiện nay là do các giống lợn Cổ đại trước kia thông qua các phương pháp tạp giao cải lương khác nhau mà dần hình thành nên [5]

Trước những năm 70 lợn Ỉ được nuôi hầu như ở khắp các tỉnh đồng bằng Bắc bộ như Nam Định, Hà Nam, Hà Tây, Hưng Yên, Hà Nội, Vĩnh Phúc, Hải Dương, Thái Bình, Quảng Ninh, Ninh Bình, Thanh Hoá, Hải Phòng Vị trí phổ biến của nó dần dần phải nhường cho lợn Móng Cái có sức sinh sản tốt hơn, và từ cuối những năm 70 lợn Ỉ thu hẹp dần lại số lượng như ngày nay, chỉ còn sót lại ở một số xã của tỉnh Thanh Hoá

b Đặc điểm sinh học

pha

Lợn Ỉ mỡ: Lợn Ỉ mỡ cũng có lông da đen bóng, đa số có lông nhỏ thưa, một số

có lông rậm (lông móc) như Ỉ pha Đầu hơi to, khi béo trán dô ra, mặt nhăn nhiều, nọng

cổ và má sệ từ khi lợn 5-6 tháng tuổi, mắt híp, mõm to bè và ngắn, môi dưới thường dài hơn môi trên, lợn nái càng già mõm càng dài và cong lên nhưng luôn ngắn hơn Ỉ pha Vai nở, ngực sâu, thân mình ngắn hơn Ỉ pha, lưng võng, khi béo thì trông ít võng

hơn, bụng to sệ, mông nở từ lúc 2-3 tháng, phía sau mông hơi cúp Chân thấp hơn Ỉ pha, lợn thịt hoặc hậu bị có hai chân trước thẳng, hai chân sau hơi nghiêng, lợn nái thì thường đi chữ bát, hai chân sau yếu

Lợn Ỉ pha: Lợn Ỉ pha có lông da đen bóng, đa số có lông nhỏ thưa, một số có lông rậm lông móc) Đầu to vừa phải, trán gần phẳng, mặt ít nhăn, khi béo thì nọng cổ

và má chảy sệ, mắt híp Mõm to và dài vừa phải, lợn nái càng già mõm càng dài và cong lên Vai nở vừa phải, từ 8-9 tháng vai bằng hoặc lớn hơn mông, ngực sâu Thân mình dài hơn so với ỉ mỡ, lưng đa số hơi võng, khi béo thì trông phẳng, bụng to, mông lúc nhỏ hơi lép về phía sau, từ 6-7 tháng mông nở dần Chân thấp, lợn thịt hoặc hậu bị thì hai chân trước tương đối thẳng, hai chân sau hơi nghiêng, lợn nái thì nhiều con đi vòng kiềng hoặc chữ bát [1]

c Khả năng sản xuất

Khả năng sinh trưởng và tầm vóc của hai nòi lợn Ỉ pha và Ỉ mỡ là tương đương nhau, chúng được thể hiện qua khối lượng và kích thước các chiều của chúng ở các bảng sau (bảng 1.1 và 1.2):

Bảng 1.1 Khối lượng lợn Ỉ và Ỉ pha qua các mốc tuổi (kg) [1]

Luận văn thạc sĩ

Bảng 1.2 Khối lượng lợn Ỉ pha và Ỉ mỡ [1]

(kg)

Cao (cm)

Dài thân (cm)

Vòng ngực (cm)

ml, thời gian sử dụng đực giống tốt nhất trong 2 - 3 năm

Lợn cái Ỉ 4 - 5 tháng tuổi là động dục và có khả năng thụ thai, tuy nhiên tuổi phối giống tốt nhất là khoảng 7 tháng tuổi Chu kỳ động dục của lợn Ỉ trung bình trong khoảng 19 - 20 ngày (biến động từ 17 đến 24 ngày) Thời gian động dục trung bình 3 -

4 ngày, thời điểm phối giống tốt nhất là ngày động dục thứ hai Thời gian mang thai trung bình trong khoảng 110 - 115 ngày

Ở đàn lợn Ỉ Thanh Hóa, lợn cái thành thục về tính sớm, lúc 3 tháng tuổi có biểu hiện động dục, 4 tháng tuổi có khả năng thụ thai Chu kỳ động dục thường từ 19 - 21 ngày, thời gian động dục kéo dài 4 - 5 ngày (biến động 3 - 8 ngày) Tuổi phối giống đầu tiên tốt nhất là 8 tháng tuổi, lúc đó khối lượng cơ thể đạt 35 - 40 kg Thời gian

mang thai trung bình là 110 ngày, số con đẻ ra trung bình đạt 8.8 - 11.3 con/ lứa và con cái có tuổi sử dụng có thể tới 10 - 11 năm [1]

1.2 Tầm quan trọng của các nghiên cứu về lợn tại Việt Nam

Việt Nam là một nước nông nghiệp với 80% dân số sống ở nông thôn và 70% lấy nông nghiệp làm nguồn kinh tế chính của họ [62] Trong lĩnh vực nông nghiệp, trồng lúa nước và chăn nuôi lợn được liên kết chặt chẽ với đời sống của người nông dân Việt Nam Chăn nuôi luôn chiếm một vị trí quan trọng trong hệ thống nông nghiệp Việt Nam nói chung và ở các gia đình nông thôn nói riêng [21]

Chăn nuôi lợn là một nghề truyền thống ở Việt Nam, đóng một vai trò chủ chốt đối với đời sống kinh tế và văn hóa của người nông dân [49] Lợn được nuôi giữ lâu đời và vô cùng phổ biến, trở thành một trong những giống vật nuôi quan trọng nhất Phần lớn chăn nuôi lợn ở Việt Nam là chăn nuôi nhỏ Có tới 80% sản lượng thịt lợn đến từ các cơ sở chăn nuôi nhỏ với một đến hai lợn nái và dưới mười con lợn nuôi lấy thịt [48] Trong khu vực chăn nuôi, nuôi nhỏ lẻ tại miền Bắc Việt Nam chiếm tới 41% tổng thu nhập từ lợn, đóng góp chủ yếu từ các khu vực dân tộc thiểu số [38]

Lợn được nuôi nhỏ lẻ vừa để bán vừa để phục vụ tiêu dùng cho chính các hộ gia đình Do đó, chúng quan trọng ở nhiều khía cạnh như cung cấp hàng hóa cho kinh tế, tăng cường thu nhập, tạo công ăn việc làm bảo đảm sinh kế cho người nông dân, cải thiện chất lượng bữa ăn cho gia đình Tại các khu vực miền núi, nuôi lợn gắn bó chặt chẽ với văn hóa truyền thống, phong tục tập quán của các dân tộc thiểu số, như các ngày lễ hội đón năm mới hay các dịp đặc biệt trong suốt một năm [35]

Số lượng lợn tại Việt Nam trong những năm gần đây đã tăng lên nhanh chóng Năm 2001, số lượng lợn được nuôi là khoảng 21,8 triệu con, và đạt xấp xỉ 24,7 triệu con vào năm 2005, tăng bình quân 6,3% một năm Năm 2005, 2,3 triệu tấn thịt lợn được tạo ra, và 2006 là 2,4 triệu tấn, chiếm lần lượt 81% và 71,5% tổng sản lượng thịt của các năm tương ứng [71] Hơn 90% lượng thịt lợn được cung cấp trong nước bởi các hộ nông dân và hơn 98% các hộ gia đình Việt Nam tiêu thụ sản phẩm thịt lợn [6]

Luận văn thạc sĩ

Đặc biệt là tại các hộ gia đình ở các tỉnh miền núi, phần lớn các hộ đều sử dụng chính sản phẩm thịt họ nuôi

Một số nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá hiệu suất của các giống lợn tại các trang trại và các trung tâm giống về các giống ngoại lai, các giống lai và một số đặc điểm của các giống bản địa như khả năng sinh sản, sinh trưởng, cũng như phần trăm thịt nạc [2-4] Do điều kiện chăn nuôi nhỏ, hiệu suất của chăn nuôi lợn tại Việt Nam nhìn chung vẫn ở mức thấp

Những thông tin di truyền về các giống lợn bản địa Việt Nam còn khá hạn chế Mặc dù việc phân biệt các giống bản địa Việt Nam có thể được thực hiện thông qua các đặc điểm hình thái rất riêng biệt của chúng, nhưng thông tin về di truyền vẫn hết sức quan trọng Chúng giúp kiểm soát tốt hơn, chính xác hơn các giống và có thể tìm ra mối liên hệ giữa chúng với các tính trạng quý Ngoài ra, những nghiên cứu đánh giá năng suất, chất lượng thịt và liên hệ chúng với sự đa dạng di truyền của các giống lợn vẫn chưa được thực hiện nhiều ở Việt Nam

1.3 Marker trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Việc áp dụng di truyền phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền có thể tác động lớn tới hiểu biết của chúng ta về những sự kiện đã từng diễn ra Cụ thể, các nghiên cứu gần đây cho phép tìm ra tổ tiên của các loài gia súc hiện nay cũng như quá trình phát triển chăn nuôi trong hàng ngàn năm qua [56, 77] Những thông tin thú vị này đã cho chúng ta hiểu biết thêm về sự sống, đặc biệt là cách thức con người tạo nên

sự đa dạng sinh học nông nghiệp trong một khoảng thời gian tương đối ngắn Hơn nữa, kết hợp các nghiên cứu tiến hóa ở người [30], vật nuôi [73, 80] và cây trồng [77] có thể cung cấp cho chúng ta một cái nhìn toàn diện về xã hội loài người trên khắp thế giới

Cho đến nay vẫn có rất nhiều tranh luận giữa các nhà khảo cổ học động vật về thời điểm xuất hiện và thời gian của những thay đổi trong cấu trúc tuổi, giới tính của các quần thể động vật thuần hóa [7, 101] Điều này để lại những câu hỏi mở về những quần thể dưới loài hoặc thậm chí các loài tổ tiên hoang dã đã được thuần hóa và mức

độ đóng góp của chúng vào nguồn gen hiện đại ngày nay Nghiên cứu phân tử cho phép trả lời các câu hỏi đó, các dấu hiệu DNA có thể được áp dụng và nghiên cứu chủng loại phát sinh, đa dạng quần thể, xác định di truyền của cá thể, được phát triển từ những năm 1970 [41, 86] nhưng chỉ được áp dụng phổ biến cho các nghiên cứu động vật thuần hóa và đa dạng từ những năm đầu thập niên 1990 [54, 56]

Một trong những mối quan tâm toàn cầu hiện nay là sự mất dần của đa dạng sinh học nông nghiệp khi phải đối mặt với những áp lực ngày càng tăng của quá trình canh tác hiện đại Việc xây dựng các khái niệm về tạo giống hiện đại từ giữa những năm 1800 đã gây ra nhưng thay đổi đáng kể trong lĩnh vực chăn nuôi, đặc biệt là ở mức

độ quy mô lớn [66] Hệ quả là người nông dân dần dần thay thế các giống vật nuôi bản địa ít hiệu quả bằng các giống quốc tế có năng suất cao., do vậy một lượng đáng kể gia súc đã biến mất hoặc đang bị đe dọa [90] Những dữ liệu này cũng cho thấy tầm quan trọng của việc quản lý và bảo tồn các nguồn gen động vật và thực vật ngày nay Nhiều

sự đa dạng đang mất đi mà không rõ nguyên nhân, bao gồm số lượng lớn các giống vật nuôi, mà không hề được quản lý và thống kê tại thời điểm hiện tại trong khi sự đa dạng sinh học này có thể chứa những vật liệu di truyền (ví dụ như các loài thích nghi bản địa) có giá trị cho sản xuất trong tương lai Có khả năng là một lượng lớn các giống đang và sẽ tiếp tục biến mất trước khi các đặc điểm cũng như tiềm năng của chúng được nghiên cứu và đánh giá Do đó, trong hoàn cảnh này, những chiến lược để bảo tồn đa dạng gia súc là rất quan trọng và các dữ liệu nghiên cứu phân tử của các giống vật nuôi có thể sẽ trở thành cơ sở hỗ trợ việc bảo tồn sự đa dạng [16]

Để xác định được nguồn gốc thuần hóa của một loài vật nuôi, các nhà khoa học phải dựa vào một số dấu hiệu phân tử Các marker này cần có một số đặc điểm, đầu tiên, nó nên đủ bảo thủ để cho phép xác định các đơn vị phân loại hoặc quần thể từ mức loài trở xuống Thứ hai, nó vẫn đủ đa dạng theo phạm vi địa lý của loài để có thể xác định gần đúng sự phân bố của quá trình thuần hóa Thứ ba, các dấu hiệu phân tử nên tiến hóa nhưng với tỉ lệ không đổi, cho phép xác định thời điểm nguồn gốc của một

Luận văn thạc sĩ

đa hình Do đáp ứng được các yêu cầu này, hiện nay DNA ty thể là một công cụ được

sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu về quá trình thuần hóa

1.3.1 Cấu trúc hệ gen ty thể

Hệ gen ty thể của động vật có vú bao gồm một DNA mạch vòng có kích thước 16.6 kb Hai sợi trên mạch kép của DNA ty thể được phân biệt thành hai sợi sợi nặng (H) và sợi nhẹ (L) dựa theo tỷ lệ thành phần các nucleotide [42] Hầu hết thông tin được mã hóa trên sợi nặng, với gen mã hóa cho hai rRNA, mười bốn tRNA, và mười hai protein Sợi nhẹ mã hóa cho tám tRNA và một protein lớn Tất cả các sản phẩn protein là thành phần của các phức hợp enzyme tham gia vào quá trình phosphoryl oxy hóa [19] Các gen không chứa intron và ngoại trừ một số vùng điều hòa, trình tự intergentic thường không tồn tại hoặc chỉ có giới hạn ở một số vùng Cả hai loại phân

tử tRNA và rRNA đều có kích thước nhỏ bất thường [97] Một số gen mã hóa protein nằm chồng chéo và trong nhiều trường hợp, một phần của bộ ba kết thúc tuy không được mã hóa nhưng được tạo ra sau khi phiên mã bởi quá trình gắn đuôi polyA sau phiên mã [63]

Với những trình tự DNA ty thể đã được nghiên cứu, so sánh các chuỗi protein ty thể cho thấy những khác biệt so với mã di truyền chuẩn và có những thay đổi trong việc quy định mã bộ ba đã được tìm ra ở những loài khác nhau [64] Ví dụ, trong hệ gen ty thể của hầu hết các loài, TGA được sử dụng như mã bộ ba mã hóa cho Tryptophan chứ không phải là stop codon Tương tự, AGR (R=A, G) mã hóa cho mã

bộ ba kết thúc ở hệ gen ty thể của động vật có xương sống, serine ở hệ gen ty thể động vật da gai và mã hóa cho Arginine ở hệ gen ty thể nấm men cũng như bộ mã di truyền chuẩn

Một đặc điểm đáng ngạc nhiên của hệ thống di truyền ty thể đó là sử dụng một

cơ chế mã hóa đơn giản, cho phép dịch mã các codon với ít hơn 32 loại tRNA, điều này

là do việc sử dụng chỉ một tRNA duy nhất với nucleotide tại vị trí đầu tiên (vị trí biến đổi) là Uracil để nhận biết tất cả các bộ ba của một họ gồm có 4 bộ ba mã hóa [11] Ty

thể của nấm sử dụng Uracil tại vị trí biến đổi để đọc hai họ bộ ba mã hóa với một purine nằm tại vị trí thứ ba của mã bộ ba [36] Cơ chế này ngăn ngừa việc đọc sai của hai họ mã bộ ba bằng cách sử dụng một Pyrimidine tại vị trí thứ ba và nó được coi là không thay đổi ở các hệ gen ty thể của động vật có xương Hơn nữa với bộ ba AGR ở động vật có xương đóng vai trò bộ ba kết thúc, đồng thời việc biến đổi mã khởi đầu cho phép chỉ cần 22 tRNA là đủ để dịch mã tất cả 13 gen mã hóa cho protein của hệ gen ty thể [60, 64]

Ở các tế bào động vật có xương sống diễn ra quá trình trao đổi chất, có một tỷ lệ lớn các DNA ty thể có chứa cấu trúc sợi ba, được gọi là vòng lặp thay thế hoặc D loop, trong đó bao gồm một cấu trúc sợi nucleic acid ngắn, bổ sung với sợi L và chiếm chỗ

của sợi H [42] Vùng D loop nằm giữa các gen mã hóa cho tRNA Phe and tRNA Pro

và đóng vai trò vị trí kiểm soát chính quá trình biểu hiện của DNA ty thể, chứa vị trí khởi đầu tái bản và các promoter chính của quá trình phiên mã [94]

Ty thể không thể trực tiếp tự vận hành Quá trình tái bản và phiên mã phụ thuộc vào các yếu tố được mã hóa trong nhân Các tRNA ty thể được điều khiển với các enzyme amino acyl-tRNAsynthases và trong các động vật có xương sống tất cả các protein của ribosome ty thể đều được mã hóa và tổng hợp bên ngoài bào quan Các enzyme của các con đường dị hóa khác nhau nằm trong ty thể cũng như các các thành phần của ty thể đều được mã hóa trong DNA nhân Thậm chí cả các phức hợp enzyme của hệ thống phosphoryl oxy hóa cũng có nguồn gốc di truyền kết hợp từ cả DNA ty thể và nhân [75]

1.3.2 Ty thể trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Hệ gen ty thể mặc dù có kích thước rất nhỏ trong kích thước toàn bộ hệ gen của sinh vật nhưng nó lại được coi là một marker đa dang phân tử phổ biến nhất ở động vật trong suốt nhiều thập kỷ qua Đã có rất nhiều những nhà di truyền học quần thể và hệ thống học áp dụng công cụ này trong nghiên cứu của họ [8, 59]

Luận văn thạc sĩ

Trong các nghiên cứu về về nguồn gốc của các giống lợn bản địa, Fernández (2008, 2011) đã tiến hành nghiên cứu mối quan hệ giữa đa hình DNA ty thể và chất lượng thịt ở giống lợn Iberia Kết quả đã phát hiện một số đa hình đóng vai trò như các chỉ thị phân tử đóng góp vào quá trình chọn giống lợn này [25, 26] Năm 2008, Wu và

cs cũng sử dụng các phân tích đa hình DNA ty thể như một công cụ để xác định nguồn gốc của các giống lợn bản địa phân bố ở khu vực sông Mê Kông và các vùng trung và

hạ lưu sông Dương Tử [25] Xác định trình tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh của giống lợn Visayan, lợn Java với tổng 16.475 bp cho thấy nó có cấu trúc đặc trưng của 13 gen mã hóa protein, 2 gen rRNA, 22 gen tRNA và một vùng điều khiển không mã hóa D-loop

Sự sắp xếp của các gen này tương tự như ở các giống lợn khác Hệ gen ty thể phân tích

ở đây sẽ cung cấp nguồn tài nguyên di truyền mới để khám phá sự phát triển của lợn [23, 52]

Những lý do của việc DNA ty thể trở thành một lựa chọn tốt cho marker phân tử

đó là: DNA ty thể tương đối dễ khuếch đại bởi nó có nhiều bản sao trong tế bào, trình

tự gen ty thể được bảo tồn rất mạnh giữa các loài động vật, với rất ít sự trùng lặp, không chứa intron, các vùng intergenic ngắn [28] DNA ty thể có độ đa dạng cao trong quần thể tự nhiên do tỷ lệ đột biến lớn, điều này có thể trở thành các bằng chứng cho lịch sử phát triển của quần thể Các vùng biến đổi (Ví dụ vùng D loop) thường đặt giữa các vùng bảo tồn cao (DNA ribosome), ở đó các mồi PCR có thể được thiết kế Quá trình khuếch đại không đặc hiệu chỉ xảy ra khi các cặp mồi PCR khuếch đại cả những vùng gen ty thể đã được chuyển vào hệ gen nhân ở một số loài Rõ ràng, DNA ty thể là một giải pháp tiện lợi nhất và rẻ nhất cho việc khám phá gen của các loài mới trong tự nhiên

Vùng D loop không mã hóa cho bất kì một protein nào và có tốc độ tiến hóa cao hơn nhiều so với các các khu vực khác của hệ gen ty thể Trong suốt hai mươi năm qua, D loop đã được sử dụng trong các phân tích chủng loại phát sinh Sự khác biệt của chuỗi D loop giữa các giống bò thuộc châu Âu, Phi và Ấn Độ giúp tìm ra nguồn gốc