Tóm tắt Luận án tiến sĩ Y học: Xác định thành phần loài và một số đặc điểm sinh học phân tử của sán lá gan lớn tại Việt Nam

Mục tiêu của luận án là xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn tại Việt Nam bằng phương pháp hình thái học. Xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam.

VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG

ĐỖ NGỌC ÁNH

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA

SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Ký sinh trùng Y học

Mã số: 62 72 01 16

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2017

Công trình hoàn thành tại HỌC VIỆN QUÂN Y

Cán bộ hướng dẫn khoa hoc:

1 PGS.TS Nguyễn Khắc Lực

2 PGS.TS Trần Thanh Dương

Phản biện 1: PGS.TS Lê Thanh Hòa

Cơ quan: Viện CNSH, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS Đoàn Huy Hậu

Cơ quan: Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương vào hồi

Có thể tìm thấy luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương

F hepatica và F gigantica có thể được phân biệt dựa vào hình thái nhưng

phương pháp hình thái bộc lộ nhiều hạn chế Dạng trung gian (Fasciola sp.) với hình thái và kiểu gen hỗn hợp của F hepatica và F gigantica, xuất hiện ở nhiều

nơi trên thế giới bao gồm Việt Nam, rất khó xác định loài bằng hình thái Vì vậy,

ở những nơi tồn tại dạng trung gian, trong giám định loài SLGL, bên cạnh

phương pháp hình thái học, ứng dụng sinh học phân tử là rất cần thiết

Hiện nay, dữ liệu hình thái và phân tử của SLGL ở Việt Nam còn rất hạn chế

Vì vậy, nghiên cứu về hình thái và phân tử của SLGL là rất cần thiết Đó là lý do

chúng tôi tiến hành đề tài “ t v t s s

t s t t

2 Mục tiêu nghiên cứu

1 Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn tại Việt Nam bằng phương pháp hình thái học

2 Xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam

3 Tính khoa học, tính mới và tính thực tiễn của đề tài

- Bằng việc kết hợp hình thái học và sinh học phân tử với cả gen nhân và gen

ty thể để nhận dạng, xác định loài SLGL thập tại các vùng địa lý khác nhau ở Việt Nam nên các kết quả giám định loài khách quan, chính xác, tin cậy

- Đề tài đã chỉ ra được SLGL ở Việt Nam có tính đa hình về hình thái và di

truyền với F gigantica và dạng trung gian Fasciola sp cùng tồn tại ở cả 3 khu

vực địa lý và các vật chủ khác nhau

- Bước đầu chỉ ra được tần suất của F gigantica và dạng trung gian Fasciola

sp ở Việt Nam mà trước đó chưa nghiên cứu nào công bố

- Cung cấp dữ liệu ban đầu, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo tìm hiểu

những khác biệt về bệnh học, đáp ứng miễn dịch… ở vật chủ nhiễm F gigantica

và dạng trung gian Fasciola sp

4 Bố cục luận án

Luận án gồm 151 trang, gồm: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (36 trang); Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (29 trang); Kết quả nghiên cứu (43 trang); Bàn luận (36 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang); 40 bảng số liệu, 29 hình và 146 tài liệu tham khảo

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sán lá gan lớn Fasciola spp và bệnh do sán lá gan lớn (Fasciolosis)

1.1.1 Đặc điểm sinh học của Fasciola spp

- Các loài sán lá gan lớn và phân bố của chúng

Sán lá gan lớn (SLGL) thuộc ngành giun dẹt, lớp sán lá, giống Fasciola Hiện tại, giống Fasciola gồm có 4 loài: F hepatica (Linnaeus, 1758), F gigantica (Cobbold, 1855), F nyanzae (Leiper, 1910) và F jacksoni (Cobbold, 1869) Trong đó, F hepatica và F gigantica là 2 loài gây bệnh chủ yếu ở người và động vật F hepatica phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, trong khi F gigantica phân

bố chủ yếu ở khu vực có khí hậu nhiệt đới như Châu Á, Châu Phi

- Đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn

Hì t sán trườ t : F hepatica trưởng thành có kích thước 8 - 15 x 20 –

30 mm F gigantica khá giống F hepatica, tuy nhiên chiều dài có thể tới 75 mm

F gigantica thường thon và dài, trong khi F hepatica thường ngắn và rộng

Hì t trứ : Trứng F hepatica rất giống với trứng của F gigantica Trứng F

hepatica (150 x 90 μm) nhỏ hơn trứng của F gigantica (200 x 100 μm)

- Vòng đời sinh học: Vòng đời của SLGL rất đặc biệt trong lớp sán lá Chúng chỉ

có 1 vật chủ phụ là ốc, sau đó hình thành nang ở thực vật thủy sinh trước khi nhiễm vào vật chủ theo con đường ăn uống Trong khi đó, hầu hết các loại sán lá khác vòng đời qua 2 vật chủ phụ trước khi xâm nhập vào vật chủ chính

Hình 1.2 Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn

- Các yếu tố ảnh hưởng tới vòng đời của sán lá gan lớn

Sự phát triển các giai đoạn vòng đời của SLGL phù thuộc rất nhiều vào các điều kiện môi trường và vật chủ trung gian Trung gian truyền bệnh SLGL là các

loài ốc thuộc họ Lymnaeidae Sự phân bố của các loài ốc là vật chủ trung gian

hoàn toàn phù hợp với sự phân bố của SLGL Ở Việt Nam, 2 loài ốc nước ngọt

Lymaea viridis và Lymaea swinhoei được xác định là vật chủ trung gian chủ yếu

của SLGL

- Quá trình sinh sản, vấn đề lai và chuyển gen ở sán lá gan lớn

Theo K Cwilinski và CS (2016), SLGL 3 hình thức sinh sản: tự giao phối, giao phối chéo và sinh sản vô tính Các hình thức sinh sản này gặp cả ở trong tự nhiên và trên thực nghiệm Ở một số quốc gia như Nhật Bản, Việt Nam và Hàn

Quốc, dạng trung gian Fasciola sp với các các thể mang kiểu gen pha trộn của 2

loài hoặc các cá thể lai với gen nhân của loài này còn gen ty thể của loài kia đã được xác định (còn gọi là các cá thể chuyển gen) Dạng trung gian cũng được ghi nhận gây bệnh ở cả người và động vật

1.1.2 Triệu chứng, chẩn đoán bệnh do Fasciola spp

- Triệu chứng lâm sàng: Các triệu chứng của bệnh do SLGL ở người thường xuất

hiện sau khi bị nhiễm ấu trùng 2 tuần và phụ thuộc vào số lượng sán ký sinh Bệnh được chia làm 4 thời kỳ: ủ bệnh, toàn phát, tiềm tàng và mạn tính Thời kỳ toàn phát với những biểu hiện rõ ràng nên bệnh nhân thường đi khám và được phát hiện bệnh Thời kỳ này kéo dài 2 - 4 tháng với các triệu chứng cơ năng thường gặp là: sốt, đau bụng vùng hạ sườn phải, rối loạn tiêu hóa, nổi mề đay, gan lách to…

- Đặc điểm cận lâm sàng: Các xét nghiệm có giá trị chẩn đoán là: tăng bách cầu

ái toan trên 5 %, có khi lên đến 83 %; Siêu âm gan thấy tổn thương hình tổ ong Xét nghiệm ELISA máu dương tính với kháng thể kháng sán lá gan; Tìm trứng có giá trị chẩn đoán quyết định nhưng tỷ lệ dương tính rất thấp (< 5 %)

1.2 Tỷ lệ nhiễm SLGL ở người và động vật

- Trên thế giới: Nhiễm SLGL ở động vật ăn cỏ rất phổ biến trên toàn thế giới, tỷ

lệ nhiễm trung bình từ 30 % đến 50 % Ở người, theo Mas-Coma S và CS (2004),

trên toàn thế giới có khoảng 2,4 đến 17 triệu người có nguy cơ nhiễm SLGL, tập trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Phi Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ít nhất 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL

- Ở Việt Nam: Theo một số nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu, bò

dao động trong khoảng từ 30 đến 60% Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu thường cao hơn

ở bò và mùa mưa tỷ lệ nhiễm thường cao hơn mùa khô Ở người, theo Đặng Thị Cẩm Thạch (2008), tính đến tháng 3 năm 2008 số bệnh nhân nhiễm SLGL là > 5.000 người Còn theo Nguyễn Văn Đề và CS (2012), tính đến năm 2012, bệnh SLGL ở Việt Nam lưu hành ở ít nhất 52 tỉnh/thành với số người mắc > 20.000 người

1.3 Các phương pháp xác định loài Fasciola spp

1.3.1 Các phương pháp xác định loài Fasciola sp

2 phương pháp xác định loài chủ yếu được sử dụng là hình thái học và sinh học

phân tử dựa trên các chỉ thị phân tử gen ty thể và gen nhân tế bào

* Phương pháp hình thái học

Theo Periago và CS (2008), dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), SLGL được phân loại thành: nhóm giống với F hepatica (1,65 - 2,76), nhóm giống F gigantica (3,43 - 5,50) và nhóm Fasciola sp (2,77 - 3,42)

Theo Srimuzipo P và CS (2000), dựa vào chiều dài SLGL được chia làm 3 nhóm:

nhóm nhỏ (< 25 mm), nhóm trung bình (25 - 35 mm) và nhóm lớn (> 35 mm)

* Phương pháp sinh học phân tử

RFLP-PCR và giải trình tự là các công cụ thường được lựa chọn Các chỉ thị

cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể, các vùng giao gen ITS1, ITS2 và 28S thuộc hệ

gen nhân thường được sử dụng Simsek và CS (2011) đã sử dụng gen cox1 và các enzyme RsaI và AluI để phân biệt F gigantica và F hepatica Ichikawa M và CS (2010) sử dụng vùng gen chứa đoạn giao gen ITS1 và enzyme RsaI để phân biệt

F hepatica, F gigantica và dạng trung gian Dạng trung gian được xác định có

nhiều bất thường cả về hình thái và phân tử theo hướng phù hợp với cả 2 loài nên

khó có thể xếp loại là F hepatica hay F gigantica Vì thế, Mas-Coma và CS

(2009) cho rằng, nếu chỉ dựa vào một trong 2 hệ gen nhân hoặc hệ gen ty thể để giám định loài SLGL sẽ không chính xác mà cần kết hợp cả 2 hệ gen

1.3.2 Tính đa hình di truyền di truyền ở sán lá gan lớn

- Tính đa hình của một số gen thuộc hệ gen ty thể: Tính đến hết năm 2016, đã

có 5 hệ gen ty thể hoàn thiện của SLGL được giải mã và công bố trên ngân hàng

gen Chiều dài toàn bộ hệ gen ty thể của Fasciola sp là 14453 bp, F hepatica

14462 bp và F gigantica 14478 bp, bao gồm 12 gen, 2 vùng mã hóa rRNA, 22

vùng mã hóa tRNA, một vùng không mã hóa và một số tiểu phần khác

- Tính đa hình của một số gen thuộc hệ gen nhân tế bào: Các vùng giao gen

ITS-1 (khoảng 430 bp) và ITS2 (khoảng 360 bp) là những chỉ thị phân tử quan

trọng để xác định loài SLGL Trên đoạn ITS-2, F hepatica và F gigantica có 6 vị trí khác biệt và một trong số đó bị khuyết ở F gigantica Trên đoạn ITS-1, F

gigantica có 5 vị trí khác biệt so với F hepatica Dạng trung gian của SLGL có

trình tự ITS-1, ITS-2 giao thoa, pha trộn của cả F hepatica và F gigantica

1.3.3 Tình hình nghiên cứu xác định loài sán lá gan lớn ở Việt Nam

Trước đây, bằng phương pháp giám định hình thái học, một số tác giả cho

rằng F hepatica và F gigantica đều có mặt ở Viêt Nam Tuy nhiên, với sự hỗ trợ

của sinh học phân tử hầu hết các nghiên cứu sau này cho rằng SLGL ở Việt Nam là

F gigantica và dạng trung gian Các nghiên cứu sinh học phân tử chủ yếu lựa chọn

gen nad1 hoặc cox1 thuộc hệ gen ty thể và ITS1, ITS2 thuộc hệ gen nhân Do ở Việt

Nam tồn tại các cá thể dạng trung gian (bao gồm các cá thể lai) nên một số nghiên cứu chỉ sử dụng đơn thuần hệ gen ty thể hoặc hệ gen nhân có thể đã kết luận chưa

thực sự đầy đủ, cụ thể về thành phần loài của SLGL

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nghiên cứu hình thái: 316 cá thể SLGL trưởng thành thu từ trâu, bò, dê, cừu và

01 cá thể SLGL thu từ người

- Nghiên cứu xác định loài và phân tích đặc điểm phân tử: gen cox1, nad1 thuộc

hệ gen ty thể và các vùng giao gen ITS-1, ITS-2 thuộc hệ gen nhân

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

* Địa điểm thu thập mẫu: Miền Bắc (4 tỉnh): Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Giang,

Điện Biên; Miền Trung-Tây Nguyên (gọi tắt là Miền Trung, 6 tỉnh): Nghệ An, Quảng Nam, ĐắkLắk, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận; Miền Nam (4 tỉnh): Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Tháp, Cần Thơ;

* Địa điểm phân tích hình thái và phân tử: Học viện Quân y, Hà Nội;

2.1.3 Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2013 đến 1/2017

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả có phân tích dựa trên kết quả các

đặc điểm hình thái và phân tử của SLGL

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

 , tham khảo giá trị tỷ số chiều dài/chiều rộng trong nghiên cứu của

Wannasan A và CS (2014) ở quần thể SLGL tại Thái Lan tính được n = 211 Thực

tế, tổng số 317 cá thể SLGL toàn vẹn được đo đạc các chỉ số hình thái

- Chọn mẫu và thu thập mẫu SLGL: mỗi cá thể vật chủ trâu, bò, dê, cừu thu thập ngẫu nhiên từ 2 đến 20 con SLGL Các mẫu sán được thu thập là các cá thể sán có hình thái toàn vẹn Trong đó, Miền Bắc 121 cá thể, Miền Trung 137 cá thể

và Miền Nam 59 cá thể; 126 cá thể sán thu từ 15 cá thể bò, 178 sán từ 16 cá thể trâu, 6 sán từ 2 cá thể dê, 6 sán từ 2 cá thể cừu và 1 cá thể sán thu từ người

- Ghi nhãn mẫu SLGL: mẫu sán được dán nhãn và ký hiệu với 4 thông tin: năm thu thập, vật chủ, địa điểm thu thập và thứ tự mẫu ở địa điểm đó Ví dụ: mẫu 15Tr-HN1, thu thập năm 2015 từ trâu (Tr = trâu; B = Bò; C = cừu; D = Dê) tại Hà Nội Đây là cá thể SLGL đầu tiên được ghi mẫu năm 2015 tại Hà Nội

2.2.2.2 Cỡ mẫu giám định loài và phân tích đặc điểm sinh học phân tử

- Cỡ mẫu giám định loài

+ Số lượng SLGL: 224 cá thể sán ở động vật và 01 ở người SLGL ở động vật được lựa chọn sao cho thuộc cả 3 khu vực địa lý và ở các vật chủ khác nhau

+ Chọn mẫu giám định loài bằng sinh học phân tử: Mỗi cá thể vật chủ tiến hành giám định loài không quá 10 con sán Số lượng sán ở mỗi loại vật chủ như sau: bò

106 cá thể, trâu 108 cá thể sán, dê 6 cá thể, cừu 4 cá thể và người 1 cá thể

- Cỡ mẫu xác định các đặc điểm phân tử: 17 trình tự gen cox1, 8 trình tự

gen nad1, 16 trình tự ITS1 và 16 trình tự ITS2 Cụ thể trong Bảng 2.1:

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu và gen đích giải trình tự

TT Ký hiệu thu thập Năm Nơi thu thập Vật chủ Gen được giải trình tự

cox1 nad1 ITS1 ITS2

2.2.3 Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu hình thái

- Các chỉ số/chỉ tiêu hình thái được khảo sát, xác định: chiều dài cơ thể (BL),

chiều rộng cơ thể (BW), tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), khoảng cách từ giác bụng tới cuối thân (VS-P)

- Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: Vật liệu bảo quản và làm

tiêu bản sán, vật liệu đo đạc kích thước sán

- Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: Kỹ thuật làm tiêu

bản sán lá gan lớn bằng thuốc nhuộm Carmin; Xác định các chỉ số hình thái theo

phương pháp của Periago và CS (2006, 2008)

- Phân nhóm sán lá gan lớn theo hình thái: theo Srimuzipo và CS (2000) dựa

vào chiều dài và theo Periago và CS (2008) dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng

2.2.4 Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong giám định loài, phân tích các đặc điểm phân tử

2.2.4.1 Các chỉ số/chỉ tiêu nghiên cứu về sinh học phân tử: kích thước sản phẩm

PCR; số lượng, kích thước các mảnh cắt giới hạn; tỷ lệ tương đồng nucleotide; số nucleotide (nu), acid amin (aa) sai khác; tỷ lệ các nucleotide A, T, G, C

2.2.4.2 Hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Các sinh phẩm chạy PCR; Các enzyme RsaI, AluI, MspI, KpnI (Thermo,

Mỹ); Các hóa chất chạy điện di và tách chiết ADN

- Các thiết bị chủ yếu được sử dụng trong nghiên cứu gồm: buồng mix PCR, máy PCR, máy ly tâm lạnh, máy vortex, máy điện di, máy chụp gel…

2.2.4.3 Các phương pháp, kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu

- Kỹ thuật tách chiết và kiểm tra nồng độ ADN tổng số từ SLGL trưởng thành

- Khuyếch đại gen của SLGL bằng phản ứng PCR: Phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl được thực hiện với chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 94 o

C/10 phút, tiếp theo

là 35 chu kỳ [94 oC/30 giây, 53oC với gen cox1, 55 oC/45 giây với các gen khác,

72 oC trong 40 giây], sau đó là 1 chu kỳ 72 oC/10 phút và cuối cùng 1 chu kỳ 4 oC

- Cắt giới hạn sản phẩm PCR (RFLP): Tổng thể tích cắt giới hạn là 16 μl,

gồm: 5 μl sản phẩm PCR, 1 μl enzyme giới hạn, 1 μl đệm 10X, 9 μl H2O Hỗn dịch được ủ ở 37 oC có lắc trong 2 - 12 giờ rồi ghi hình trên máy UVP (Canada)

- Điện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt giới hạn trên gel Agarose

- Đọc và phân tích trình tự bằng máy ABI 3130xl Gentic Analyzer

2.2.4.4 Phân loại sán lá gan lớn bằng kỹ thuật PCR-RFLP

- Phân loại SLGL theo Simsek S và CS (2011) dựa vào kết quả PCR-RFLP

với cặp mồi JB3, JB4.5 và các enzyme RsaI, AluI như dưới đây

- Phân loại SLGL theo Ichikawa M và CS (2010) dựa vào kết quả PCR-RFLP

với cặp mồi ITS1-F, ITS1-R và enzyme RsaI như dưới đây

Bảng 2.4 Kích thước sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R và kích thước

các mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI

- Cá thể được xác định là F hepatica hoặc F gigantica nếu cả chỉ thị phân tử

hệ gen ty thể và hệ gen nhân của cá thể đó đều thuộc 1 loài

- Cá thể dạng trung gian được phân loại làm 2 nhóm theo K Cwiklinski và CS (2016), bao gồm: Nhóm các các thể có kiểu gen hỗn hợp (hệ gen nhân có dạng tổ

hợp của 2 loài F hepatica và F gigantica) và nhóm các cá thể lai (cá thể có hệ

gen nhân thuộc loài này còn hệ gen ty thể thuộc loài kia)

2.2.4.5 Xác định đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn dựa vào sự đa hình của kiểu gen đơn bội (haplotype): Kiểu gen đơn bôi của các gen nghiên cứu được xác

định dựa vào so sánh với các trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen

2.3 Đạo đức và y đức trong nghiên cứu: Các vấn đề nghiên cứu được Hội đồng

khoa học và Hội đồng y đức của Viện SR - KST - CT Trung ương thông qua và cho phép tiến hành Nghiên cứu bảo đảm vấn đề đạo đức và y đức trong nghiên cứu y sinh học, tuân thủ các nguyên tắc bảo mật thông tin của đối tượng nghiên cứu Các số liệu, dữ liệu nghiên cứu đảm bảo đầy đủ, khách quan, trung thực

2.4 Xử lý và phân tích kết quả nghiên cứu

2.4.1 Xử lý số liệu hình thái: Số liệu hình thái được đo đạc, tính toán và phân

loại dựa vào kích thước chiều dài theo Srimuzipo và CS (2000) và tỷ số chiều dài/chiều rộng theo Periago và CS (2008)

2.4.2 Xử lý số liệu về sinh học phân tử: Trình tự các mẫu được so sánh và phân

tích trên ngân hàng gene, cây phả hệ và phân tích trình tự trên các phần mềm Maga 6, mức độ tương đồng và thành phần các nu A, C, G, T trên đoạn gen được tính toán bằng công cụ nucleotide composition của phần mềm Bioedit

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại SLGL vào hình thái học 3.1.1 Xác định một số chỉ số hình thái của sán lá gan lớn

3.1.1.1 Kết quả x t s ỉ s ì t s

- Đối với sán lá gan lớn thu thập từ động vật

Trong 316 cá thể SLGL thu ở động vật có 120 cá thể ở Miền Bắc (37,97 %),

137 cá thể ở Miền Trung (43,36 %) và 59 cá thể ở Miền Nam (18,67 %)

Hình 3.2 Chiều dài SLGL thu từ Điện Biên và Bắc Giang năm 2010

(a: Mẫu SLGL ở bò Điện Biên; b: mẫu SLGL ở bò Bắc Giang)

Bảng 3.1 Một số chỉ số hình thái của SLGL tại các khu vực nghiên cứu Chỉ số hình

thể (mm) Giá trị Miền Bắc ( n= 120 )

Miền Trung (n = 137)

Miền Nam (n = 59)

Chung (n=316)

BL Min - Max 16,00 - 36,00 13,00 - 46,00 18,00 - 45,00 13,00 - 46,00

X ± SD 26,55 ± 3,70 26,78 ± 5,02 30,96 ± 6,96 27,47 ± 5,27

BW Min - Max 6,00 - 12,00 6,50 - 15,00 5,00 - 13,00 5,00 - 15,00

X ± SD 9,87 ± 1,15 9,21 ± 1,32 9,05 ± 1,91 9,43 ± 1,43 BL/BW Min - Max 1,73 - 4,46 1,69 - 6,57 1,58 - 5,83 1,58 - 6,57

X ± SD 2,72 ± 0,46 2,95 ± 0,63 3,51 ± 0,86 2,97 ± 0,68 VS-P Min - Max 14,50 - 33,00 12,00 - 43,50 16,00 - 42,00 12,00 - 43,50

X ± SD 23,38 ± 3,50 24,13 ± 4,96 28,21 ± 6,81 24,61 ± 5,18

SLGL có chiều dài trung bình 27,47 ± 5,27 mm (13,00 - 46,00 mm) Chiều rộng 9,43 ± 1,43 mm (5,00 - 15,00 mm) Tỷ số chiều dài/chiều rộng 2,97 ± 0,68 (1,58 -

6,57) Khoảng cách giác bụng - cuối thân 24,61 ± 5,18 mm (12,00 - 43,50 mm)

Bảng 3.2 Một số chỉ số hình thái của SLGL của các vật chủ khác nhau Chỉ số

(mm) Giá trị Bò

(n = 126)

Trâu (n = 178)

Dê (n = 6)

Cừu (n = 6)

Chung (n=316)

BL Min - Max 18,00 - 45,00 13,00 - 41,00 19,00 - 46,00 21,00 - 43,00 13,00 - 46,00

X ± SD 29,24 ± 5,68 25,97 ± 3,92 33,00 ± 11,02 29,50 ± 8,75 27,47 ± 5,27

BW Min - Max 5,00 - 13,00 5,50 - 12,00 6,50 - 15,00 6,0 - 10,5 5,00 - 15,00

X ± SD 9,62 ± 1,57 9,35 ± 1,19 8,75 ± 3,19 8,33 ± 1,97 9,43 ± 1,43 BL/BW Min - Max 1,96 - 5,83 1,58 - 4,43 2,53 - 6,57 3,13 - 4,10 1,58 - 6,57

X ± SD 3,12 ± 0,81 2,81 ± 0,46 3,96 ± 1,56 3,52 ± 0,38 2,97 ± 0,68 VS-P Min - Max 15,50 - 42,00 12,00 - 37,00 17,00 - 43,50 19,00 - 41,00 12,00 - 43,50

X ± SD 26,06 ± 5,77 23,29 ± 3,74 30,83 ± 10,71 27,08 ± 9,02 24,61 ± 5,18

Chiều dài của SLGL ở dê lớn nhất 33,00 ± 11,02 mm, thấp nhất ở trâu 25,97 ± 3,92 mm Chiều dài/chiều rộng của SLGL ở dê cao nhất, với 3,96 ± 1,56

d

Hình 3.3 Kích thước SLGL thu từ dê (a), cừu (b), trâu (c) tại Ninh Thuận và

Nghệ An (2015) và con SLGL thu từ người (d)

- Đối với mẫu SLGL thu ở người: chiều dài 30,50 mm, chiều rộng 9,50 mm,

chiều dài/chiều rộng 3,21 và khoảng cách giác bụng – cuối thân 26,50 mm Quan sát trong tử cung của mẫu sán này không thấy trứng

- So sánh hình thái của F gigantica và Fasciola sp ở Việt Nam

Bảng 3.7 So sánh hình thái của F gigantica và Fasciola sp ở Việt Nam

Chỉ số hình

Chung (n = 224)

Các chỉ số chiều dài, chiều rộng và khoảng cách giác bụng – cuối thân ở F

gigantica lớn hơn ở Fasciola sp nhưng không có ý nghĩa thống kê Chiều

dài/chiều rộng ở F gigantica lớn hơn một cách có ý nghĩa so với Fasciola sp

3.1.2 Phân loại SLGL dựa vào một số chỉ số hình thái

Bảng 3.8 Phân nhóm SLGL tại các khu vực địa lý theo chiều dài cơ thể

Ở cả 3 khu vực, SLGL chủ yếu thuộc nhóm có kích thước trung bình (197

mẫu, 62,34 %) Nhóm kích thước nhỏ chiếm 29,4 3%, lớn chiếm 8,23 %

Bảng 3.9 Phân nhóm SLGL thu thập ở động vật dựa vào chiều dài cơ thể

Bảng 3.11 Phân nhóm SLGL theo tỷ số chiều dài/chiều rộng

(SL, tỷ lệ %) Miền Bắc Miền Trung Miền Nam

Theo tỷ số chiều dài/ chiều rộng có 140 cá thể (44,30 %) thuộc nhóm giống

với F hepatica, 54 cá thể (17,09 %) giống với F gigentica, còn lại 122 cá thể (38,61 %) thuộc nhóm giống với Fasciola sp

3.2 Xác định loài và phân tích một số đặc điểm phân tử SLGL ở Việt Nam 3.2.1 Kết quả xác định loài và phân loại sán lá gan lớn ở Việt Nam

3.2.1.1 Kết quả k uế e , s bằ PCR-RFLP dự

v ỉ t e ty t cox1 và các enzyme RsaI, AluI

Tất cả các mẫu ADN tổng số của SLGL đều được khuếch đại thành công bằng cặp mồi JB3, JB4.5 cho band khoảng 450 bp

+ Với enzyme RsaI: 215/225 (95,56 %) mẫu PCR bị cắt với RsaI, trong đó có

mẫu SLGL thu ở người, 10 mẫu PCR còn lại (4,44 %) không bị cắt

1 2

Hình 3.6 (1) và Hình 3.7 (2) Sản phẩm PCR (với các mồi JB3, JB4.5) và các

mảnh cắt giới hạn bằng enzyme RsaI và AluI của một số mẫu SLGL

Hình 3.6a: giếng 1-7: sản phẩm PCR; M: thang DNA chuẩn 50bp; Hình 3.6b: giếng 1-7 sản phẩm cắt giới hạn; giếng M: thang DNA chuẩn 50bp

Hình 3.7a: giếng 1-4: sản phẩm cắt với RsaI, M: thang DNA 50bp; Hình 3.7b: giếng 1-4: sản phẩm cắt với AluI, M: thang DNA 50bp; giếng 5: chứng âm

+ Với enzyme AluI: Cả 225 mẫu sản phẩm PCR không bị cắt bởi enzyme

AluI, phù hợp với F gigantica

- Kết quả thẩm định một số cá thể SLGL dựa vào so sánh trình tự nucleotide

đoạn gen cox1 với ngân hàng gen

So sánh trình tự nucleotide chứa 1 phần gen cox1 với ngân hàng gen cho thấy,

cả 17 trình tự đều phù hợp với F gigantica Đoạn gen cox1 này có 5 nhóm kiểu

gen đơn bội, đa số thuộc nhóm H8-CO1.FgVN (11 trình tự: HN1, VP1, 15Tr-DT2, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 10B-NA1.2, 16D-NT1, 16D-NT2, 16C-NT1, 16C-NT2 và SLGL-N); còn lại thuộc nhóm H9-CO1.FgVN (1 trình tự, 15Tr-KH1); H5-CO1.FgVN (1 trình tự, 09B-TN1.1); H4-CO1.FgVN (1 trình tự, 15Tr-NA5) và H3-CO1.FgVN (3 trình tự, 15Tr-DT1, 09B-QN1.1, 14B-CT2)

15Tr Kết quả phân tích quan hệ phả hệ của SLGL Việt Nam dựa vào chỉ thị cox1

Hình 3.8 (a) và Hình 3.10 (b) Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các

chủng Fasciola spp dựa trên trình tự đoạn gen cox1 (447 bp) và gen nad1 (535bp),

xây dựng bằng chương trình MEGA6.06, sử dụng phương pháp kết nối liền kề NJ

(Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại