Thực tập tốt ngiệp: Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp

Thực tập tốt ngiệp "Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp" được nghiên cứu với mục đích: Thực tập quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật QF-PCR, hiểu và phân tích kết quả QF-PCR sau khi tiến hành điện di mao quản, đánh giá độ chính xác của kỹ thuật QF-PCR. Để hiểu rõ hơn về đề tài này mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.

MỞ ĐẦU

Một đứa con sinh ra khỏe mạnh, thông minh, hoàn thiện về mặt tinh thần và thể chất là điều ao ước của biết bao bà mẹ Tuy nhiên, không phải tất cả những đứa trẻ sinh ra đều được bình thường, có những đứa trẻ sinh ra đã bị dị tật, dị dạng khiến chúng không thể sống sót khi được sinh ra hoặc có thể sống nhưng lại trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ dị tật bẩm sinh trên thế giới chiếm 1,73% Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy

tỷ lệ dị tật bẩm sinh là 1,5 – 3%, trong đó 20 – 40% nguyên nhân là do các rối loạn nhiễm sắc thể Các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp ở trẻ sinh ra sống phần lớn có liên quan đến các nhiễm sắc thể 21, 18, 13 và nhiễm sắc thể giới tính Đây cũng là nguyên nhân của một số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể thường gặp như hội chứng Down, hội chứng Edwards, hội chứng Patau và một số hội chứng bất thường của nhiễm sắc thể giới tính như Klinefelter, Turner Vì vậy, chẩn đoán trước sinh đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm các dị tật bẩm sinh để có thể can thiệp ở giai đoạn bào thai nhằm giảm tỉ lệ trẻ sơ sinh mắc các rối loạn di truyền

Với sự tiến bộ của y học, nhiều kỹ thuật chẩn đoán trước sinh đã ra đời Từ năm 1966, kỹ thuật nuôi cấy tế bào và phân tích nhiễm sắc thể đồ (karyotype), gọi tắt

là karyotyping, ra đời và được đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong lĩnh vực chẩn đoán trước sinh Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế như thời gian thực hiện dài (14 – 21 ngày), thao tác phức tạp, tốn nhiều công lao động Do đó, nhu cầu xuất hiện các kỹ thuật khác nhanh hơn và giúp giảm đáng kể thời gian lo lắng cho các bậc cha mẹ là cần thiết Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH) đã được giới thiệu với độ nhạy cao và thời gian trả kết quả ngắn hơn đáng kể Ngay sau đó, một kỹ thuật mới khác đã ra đời, kết hợp các đặc tính của PCR và đánh dấu huỳnh quang được gọi là kỹ thuật QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật QF-PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn FISH là có thể tự động hóa cùng lúc nhiều mẫu, chi phí thấp hơn và tốn ít nhân công lao động hơn Từ năm 1993, kỹ thuật QF-PCR được chứng minh có thể áp

dụng vào chẩn đoán một số rối loạn số lượng nhiễm sắc thể thường gặp nên đã được

áp dụng tại nhiều nước trên thế giới

Hiện nay ở Việt Nam, tại một số bệnh viện lớn như bệnh viện Từ Dũ, bệnh viện Hùng Vương và bệnh viện Phụ sản Trung ương đã triển khai áp dụng kỹ thuật QF-PCR vào chẩn đoán trước sinh Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học của bệnh viện

Từ Dũ được đánh giá là đơn vị đi đầu cả nước về di truyền người và chẩn đoán trước sinh, đã ứng dụng thành công các kỹ thuật di truyền phân tử để chẩn đoán các dị tật bẩm sinh trong đó phải kể đến kỹ thuật QF-PCR Do đó, trong hai tháng tại khoa Xét nghiệm Di truyền Y học của bệnh viện Từ Dũ, chúng tôi đã thực hiện đề tài thực tập:

“Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp” với các mục tiêu như sau:

1 Thực tập quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật QF-PCR

2 Hiểu và phân tích kết quả QF-PCR sau khi tiến hành điện di mao quản

3 Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật QF-PCR

1.1 GIỚI THIỆU SƠ NÉT VỀ CÁC RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ

THƯỜNG GẶP

Bộ nhiễm sắc thể (NST) của người bình thường bao gồm 22 cặp NST thường

và 1 cặp NST giới tính, XX ở người nữ và XY ở người nam Công thức NST hay còn

gọi là NST đồ (karyotype) được viết dưới dạng: 46,XX hoặc 46,XY Bất kỳ một thay đổi nào có liên quan đến số lượng hoặc cấu trúc NST so với công thức NST chuẩn được gọi là rối loạn NST Rối loạn NST là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến thai dưới ba tháng bị chết lưu Rối loạn NST có thể là do di truyền từ bố mẹ, hoặc đột biến trong quá trình tạo noãn, tạo tinh trùng, thụ tinh và phát triển của phôi Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy tỷ lệ rối loạn NST tăng lên rõ rệt theo tuổi của người mẹ

Lệch bội, sự mất đi hoặc tăng thêm một hoặc một vài NST là nguyên nhân phổ biến của rối loạn NST ở người Một NST thêm vào gọi là “tam nhiễm sắc thể” (trisomy) là nhóm chiếm nhiều nhất trong các bất thường NST (chiếm khoảng 90%)

và là một trong những nguyên nhân quan trọng của dị dạng bẩm sinh cũng như chậm phát triển tâm thần vận động Trisomy của NST 13 (hội chứng Patau), 18 (hội chứng Edwards), và 21 (hội chứng Down) là một mối quan tâm lớn trong chẩn đoán trước sinh bởi vì chúng là ba NST thường được tìm thấy với tần số cao ở các bất thường của các ca sinh sống [26], [27] Ngoài ra, sự không phân tách của các nhiễm sắc thể giới tính trong quá trình giảm phân ở người gây ra một số nhiễm sắc thể bất thường như:

XO (hội chứng Turner), XXY (hội chứng Klinefelter),…Sự không phân tách cũng có thể xảy ra trong nguyên phân gây ra các thể khảm ở các tế bào bình thường và lệch bội

1.1.1 Hội chứng Down

Hội chứng (HC) Down lần đầu tiên được mô tả bởi bác sĩ Iohn Langdon Down vào năm 1887 Đến năm 1959, nguyên nhân về mặt di truyền của HC Down đã được phát hiện là do thừa một NST số 21 trong bộ NST nên còn được gọi là trisomy 21 HC Down chiếm tỷ lệ 1/700 – 1/800 ở trẻ sơ sinh còn sống và tỷ lệ này tương tự giống nhau ở các nước và các chủng tộc khác nhau trên thế giới [33]

Trẻ mắc HC Down thường có biểu hiện lâm sàng: cơ thể thấp bé, đầu bé, chẩm dẹt, lỗ mũi rộng, lưỡi dày có xu thế thò ra ngoài, vành tai biến dạng, ngón tay ngắn biến dạng, đường vân tay thay đổi rõ rệt, nhược cơ, tăng động khớp và chậm phát triển trí tuệ [1] Bên cạnh đó, trẻ mắc HC Down thường kèm theo dị tật ở tim, dị tật tiêu hóa,…Khoảng 15 – 20% trẻ mắc HC Down chết sớm do bệnh tim bẩm sinh, một số ít

có thể sống đến 50 – 60 tuổi nếu không kèm theo các dị tật nguy hiểm

Hình 1.1 Karyotype và hình ảnh của trẻ mắc HC Down

(Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, [9])

Nguyên nhân chính xác gây ra tình trạng rối loạn này vẫn chưa được xác định

cụ thể ở từng người Tuy nhiên, thống kê thấy rằng phụ nữ từ 35 tuổi trở lên có nguy

cơ sinh con bị HC Down tăng lên rõ rệt thể hiện ở hình 1.2 Ở phụ nữ 30 tuổi nguy cơ sinh con mắc HC Down là 0,2% nhưng tăng lên 0,8% ở tuổi 40 và 3,6% ở tuổi 45

Hình 1.2 Đồ thị biểu diễn mối liên hệ giữa tuổi mẹ và HC Down [24]

1.1.2 Hội chứng Edwards

HC Edwards được bác sĩ John Hilton Edwards mô tả lần đầu vào tháng 4/1960 trên tạp chí y học Lancet HC Edwards xảy ra khi bệnh nhân bị thừa một NST số 18 nên còn gọi là trisomy 18, đây là trisomy phổ biến đứng hàng thứ hai sau HC Down với tỉ lệ khoảng 1/3.000 trẻ sơ sinh [11]

Trẻ mắc HC Edwards thường có các đặc điểm kiểu hình như: đầu nhỏ, cằm nhọn, trán hẹp, tai thấp, tay bất thường, ngón tay co quắp, chân khoèo,…và 90% trẻ

có dị tật tim đi kèm [2] HC Edwards thường gây chết thai hoặc tử vong sớm sau sinh Khoảng 80% trẻ bị HC Edwards chết trong tuần đầu tiên sau sinh Một số ít có thể sống hơn một tháng Khoảng 5 - 10% có thể sống hơn một năm tuổi [3]

Hình 1.3 Karyotype và hình ảnh tay bất thường của trẻ mắc HC Edwards

(Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, [9])

Nguyên nhân chủ yếu của HC này là do trong quá trình phát sinh giao tử ở bố hoặc mẹ cặp NST 18 không phân ly tạo ra các tinh trùng hoặc trứng thừa một NST 18 Khi tế bào sinh dục bất thường thụ tinh với tế bào sinh dục bình thường sẽ tạo nên hợp

tử có bộ NST bất thường Khoảng 95% các trường hợp dạng trisomy 18 thuần và khoảng 5% là thể khảm hoặc các thể phối hợp khác như chuyển đoạn [4]

1.1.3 Hội chứng Patau

So với hai HC Down và Edwards, HC Patau được quan sát sớm hơn vào năm

1657 nhưng mãi đến năm 1960, cơ chế di truyền của HC này mới được bác sĩ Klaus Patau mô tả đầy đủ HC Patau là một dạng rối loạn NST nặng nên khả năng sống sót của thai nhi mắc HC này là rất thấp, do đó tần số xuất hiện ở trẻ sơ sinh chỉ khoảng 1/10.000

Đặc điểm kiểu hình của HC Patau bao gồm: tật dư ngón tay, ngón chân, chân bị khuyết tật, đầu nhỏ, mắt nhỏ, mũi dị dạng, hở vòm miệng,…Đa số trẻ bị tổn thương hệ thần kinh, bị các dị tật như: dị tật tim (chiếm 80%), dị tật hệ bài tiết (trên 60%) và dị tật ở cơ quan sinh sản (75%) Do có quá nhiều dị tật nặng nề nên những trẻ mắc HC Patau không sống được lâu khoảng 90% chết trong vòng 1 tuổi [4]

Hình 1.4 Karyotype và hình ảnh của trẻ mắc HC Patau

(Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, [9])

Giống với HC Down và Edwards, hơn 90% nguyên nhân của HC Patau là do

sự thừa một NST 13, nên được gọi là trisomy 13, phần còn lại ở dạng thể khảm hoặc chuyển đoạn

Hiện tượng rối loạn NST không chỉ xảy ra ở các cặp NST thường mà còn gặp ở các NST giới tính

1.1.4 Một số rối loạn nhiễm sắc thể giới tính

Người mắc HC Klinefelter thường vô sinh, chỉ số IQ hơi thấp hơn bình thường, phát triển các đặc điểm thiên về nữ giới như vú phát triển, lông mu mọc theo kiểu nữ,

thừa da cổ, tóc mọc thấp, cẳng tay cong ra ngoài [31] Các bất thường này là do mất một phần hoặc toàn bộ một NST giới tính X trong bộ NST

HC Turner do mất hoàn toàn một NST X và bộ NST chỉ còn duy nhất một NST giới tính X là nguyên nhân thường gặp nhất chiếm khoảng 50% Trường hợp này còn gọi là monosomy X và kí hiệu là 45,X hoặc 45,XO Khoảng 1/3 các trường hợp nữ bị

HC Turner do mất đoạn xảy ra trên một NST X Ngoài ra, HC Turner còn xuất hiện ở thể khảm và những trường hợp này thường gây rối loạn nhẹ hơn monosomy X [34]

Hình 1.6 Karyotype và hình ảnh của người mắc HC Turner [9]

Với mục tiêu nâng cao chất lượng dân số, hạn chế những hậu quả nặng nề do dị tật bẩm sinh gây ra, giảm thiểu số người tàn tật, thiểu năng trí tuệ trong cộng đồng, chương trình sàng lọc và chẩn đoán trước sinh ngày càng được quan tâm ở nước ta

1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC TRƯỚC SINH

Sàng lọc trước sinh là chương trình thực hiện xét nghiệm thường quy cho phụ

nữ mang thai 3 tháng đầu (quý 1), 3 tháng giữa (quý 2) để phát hiện sớm các thai kỳ

có nguy cơ về bệnh lý di truyền như thiếu men G6PD, bệnh về NST như HC Down và

các dị tật bẩm sinh khác Sàng lọc trước sinh là một bước quan trọng cần phải thực hiện để có thể phát hiện sớm các hiện tượng bất thường của thai nhi nhằm đưa ra các biện pháp chăm sóc hay điều trị phù hợp và kịp thời Các bước sàng lọc trước sinh nên thực hiện gồm siêu âm thai, xét nghiệm Double test và Triple test

1.2.1 Siêu âm thai

Siêu âm là phương pháp sàng lọc không xâm lấn đến thai nhi nên có thể được xem là công cụ an toàn để phát hiện các dị tật của thai nhi

Khi thai nhi được 11 tuần – 13 tuần 6 ngày tuổi, siêu âm cho phép đánh giá tuổi thai và đo độ mờ da gáy (nuchal translucency – NT) Độ mờ da gáy là chiều rộng lớn nhất của khoang dịch nằm giữa da và đốt sống cổ của thai nhi Chỉ số bình thường của

NT là < 3mm, nếu NT  3mm là có nguy cơ cao [7] Ngoài ra, siêu âm còn giúp xác định xương mũi của thai nhi, nếu xác định không thấy xương mũi của thai nhi thì nguy cơ trẻ mắc HC Down càng cao

Vào tuần thứ 21 – 25 của thai kỳ, kết quả siêu âm có thể cho biết hầu hết các bất thường về hình thái thai nhi như: sứt môi, hở hàm ếch, dị tật của các cơ quan khác,…Đây là siêu âm quan trọng vì nếu cần đình chỉ thai kỳ thì phải thực hiện trước tuần thứ 28 [35]

1.2.2 Xét nghiệm máu

Việc xác định nồng độ một số chất trong máu có thể giúp phát hiện các thai nhi

có nguy cơ bị dị tật như thai vô sọ, nứt đốt sống, một số rối loạn NST,…Có 2 xét nghiệm tầm soát phổ biến là Double test được thực hiện ở quý 1 và Triple test ở quý 2 của thai kỳ Giống như siêu âm, cả hai xét nghiệm Double test và Triple test là các xét nghiệm không xâm lấn và không có ảnh hưởng đến mẹ và thai nhi

1.2.2.1 Xét nghiệm Double test

Xét nghiệm Double test là xét nghiệm sinh hóa lấy máu mẹ để thực hiện 2 xét nghiệm: định lượng PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A) và -hCG

(beta-human chorionic gonadotropin) PAP-A là protein được sản xuất bởi nhau thai

ở giai đoạn sớm của thai kỳ -hCG là hormone cũng được tạo ra bởi nhau thai ở giai đoạn sớm của thai kỳ [7] Cả hai chất trên đều do thai nhi sản xuất và xuất hiện ở máu mẹ Do đó, nếu thai nhi có hiện tượng lệch bội NST thì nồng độ của các chất này

sẽ thay đổi trong máu mẹ và việc định lượng chúng kết hợp với kết quả siêu âm có thể giúp đánh giá nguy cơ dị tật bẩm sinh của thai nhi Theo nghiên cứu của Wald và cộng sự, tỷ lệ phát hiện dị tật bẩm sinh của xét nghiệm Double test là 75% [30] Tuy nhiên, xét nghiệm này không có khả năng phát hiện tất cả dị tật của thai nhi mà chỉ cảnh báo thai có nguy cơ cao với một số dị tật như HC Down, HC Edwards và HC Patau Nếu kết quả chỉ ra nguy cơ dị tật bẩm sinh cao, cần phải tiến hành các xét nghiệm chẩn đoán Nếu thai có nguy cơ dị tật ở mức ranh giới, cần thử tiếp Triple test ở quý 2 của thai kỳ để đánh giá mức độ nguy cơ rõ ràng hơn

1.2.2.2 Xét nghiệm Triple test

Khi thai được 14 – 22 tuần tuổi, Triple test sử dụng máu mẹ để đo mức độ của

3 chất trong huyết thanh gồm AFP, -hCG và Estriol Trong đó, AFP feroprotein) là protein từ thai nhi, -hCG là hormone do nhau thai sản xuất và Estriol

(alpha-là hormone nhóm estrogen do cả nhau và thai tạo ra Nồng độ AFP tăng gợi ý thai có nguy cơ bị dị tật ống thần kinh như cột sống chẻ đôi và vô sọ Nồng độ AFP giảm nếu kết hợp với nồng độ -hCG và Estriol giảm thì thai có nguy cơ cao bị HC Down, HC Edwards hoặc bất thường NST khác Để ước tính chính xác mức độ nguy cơ bị dị tật của thai nhi cần kết hợp kết quả của Triple test với nhiều yếu tố khác như tuổi mẹ, chủng tộc, tiền sử người mẹ, số thai, tuổi thai và tiền sử sản khoa [3] Xét nghiệm Triple test giúp khẳng định lại kết quả của xét nghiệm Double test

Nếu xét nghiệm Double test và Triple test có kết quả cho thấy thai có nguy cơ cao bị một hoặc nhiều rối loạn NST thì cần tiến hành chẩn đoán trước sinh bằng các thủ thuật xâm lấn như chọc ối hoặc sinh thiết gai nhau

1.3 CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH RỐI LOẠN NHIỄM

SẮC THỂ

Một lĩnh vực đặc biệt quan trọng đối với y học cộng đồng là công tác chẩn đoán trước sinh đối với các bất thường NST, nhất là khi việc kiểm soát dân số và phát triển kinh tế cũng như dân trí khiến những người làm bố mẹ ngày càng quan tâm hơn đến đứa con mà họ sẽ sinh ra Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh là những thủ tục chẩn đoán chuyên sâu có nguy cơ gây sẩy thai và tốn kém về mặt kinh tế nên chỉ được khuyến cáo áp dụng cho những thai phụ có nguy cơ cao mang thai bị rối loạn NST Do đó, các cặp vợ chồng nên được tư vấn và thảo luận kỹ trước khi quyết định thực hiện các thủ thuật chẩn đoán

1.3.1 Kỹ thuật thu mẫu tế bào thai nhi

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều phương pháp để thu nhận tế bào thai như phương pháp chọc hút dịch ối (amniocentesis), sinh thiết gai nhau (chorionic villus sampling – CVS), lấy máu thai nhi từ cuống rốn [28]

1.3.1.1 Chọc hút dịch ối

Chọc hút dịch ối hay còn gọi chọc ối là phương pháp được lựa chọn nhiều nhất hiện nay Chọc ối cho phép thu nhận tế bào thai nhi bằng cách đưa kim vào buồng ối dưới sự chỉ dẫn của siêu âm để hút dịch ối Thời điểm chọc ối lý tưởng là ở tuần thai

16 đến 18 vì khi đó tỷ lệ dịch ối/thai là lớn nhất [17]

Các tế bào trong dịch ối có nguồn gốc từ nhiều mô khác nhau của thai nhi như: màng ối, da, đường tiết niệu, đường hô hấp, đường tiêu hóa và tế bào tạo máu thai Lượng tế bào trong dịch ối thay đổi tùy theo thai kỳ

Chẩn đoán trước sinh dựa trên tế bào ối có độ chính xác cao vì nguy cơ ngoại nhiễm tế bào mẹ thấp Tuy nhiên, chọc ối là một trong những thủ thuật xâm lấn trước sinh nên có thể dẫn đến một số tai biến không mong muốn như: sẩy thai (khoảng 1/200), khuyết tật thai, nhiễm trùng mẹ, rỉ ối [8]

1.3.1.2 Sinh thiết gai nhau

Sinh thiết gai nhau hiện là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất trong chẩn đoán 3 tháng đầu của thai kỳ Dưới sự chỉ dẫn của siêu âm, kỹ thuật này thu nhận mẫu bánh nhau từ tử cung Mẫu bánh nhau sẽ được lấy bằng catheter (một ống dài) hoặc sử dụng kim chọc qua đường bụng hay đường âm đạo Kỹ thuật này cho phép chẩn đoán dị tật thai nhi sớm hơn chọc ối nhưng kèm theo rủi ro cao hơn (tỷ lệ sẩy thai khoảng 1,9 – 2,1%) [8], [17]

1.3.1.3 Chọc hút máu cuống rốn

Đây là kỹ thuật lấy máu thai nhi qua đường dây rốn dưới sự chỉ dẫn của siêu

âm, được thực hiện vào tuần thai 18 Kỹ thuật này ít được áp dụng hơn so với hai kỹ thuật chọc ối và sinh thiết gai nhau vì khả năng tai biến cao như: sẩy thai, chảy máu kéo dài, chảy máu từ thai sang mẹ, bất thường cấu trúc thai, thai chậm phát triển, nang nước [2]

Các tế bào của thai nhi sau khi thu nhận bằng những kỹ thuật trên sẽ được sử dụng cho các kỹ thuật di truyền để phân tích các bất thường của NST

1.3.2 Kỹ thuật lập nhiễm sắc thể đồ (karyotype)

Năm 1952, kỹ thuật karyotype đã được sử dụng trong nghiên cứu di truyền tế bào và đến nay qua nhiều đợt cải tiến, kỹ thuật này trở thành một công cụ không thể thiếu trong việc phân tích các rối loạn di truyền ở người Karyotype được các nhà nghiên cứu đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán trước sinh những bất thường của NST

Karyotype dựa trên nguyên tắc khảo sát bộ NST của tế bào ở kỳ giữa (metaphase) hoặc kỳ giữa sớm (pro-metaphase) Karyotype được thực hiện bằng cách nuôi cấy tế bào trong môi trường dinh dưỡng đặc biệt Sau thời gian thích hợp, tế bào được thu hoạch, trải lên lam sau đó tiến hành nhuộm GTG (Giemsa Trypsin G-banding) để phân tích bộ NST

Karyotype có thể xác định bất thường về số lượng lẫn cấu trúc các NST với độ chính xác lên đến 99,4 – 99,8% và rất đáng tin cậy [4], [10] Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích đáng kể mà karyotype mang lại thì kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế như thời gian trả kết quả dài từ 14 – 21 ngày do thời gian nuôi cấy ít nhất phải mất 10 ngày [19] Điều này dẫn đến một tâm lý bất an kéo dài đối với thai phụ và khiến cho việc chấm dứt thai kỳ nếu có trở nên phức tạp và nguy hiểm hơn Ngoài ra, karyotype đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ và chuyên môn trong việc nuôi cấy, nhuộm

và phân tích bộ NST Một nhược điểm khác của karyotype là không thể phát hiện các bất thường cấu trúc NST nhỏ hơn 5 Mb [4]

1.3.3 Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH)

Kỹ thuật FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) ra đời từ năm 1989, là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và sinh học phân tử Nguyên tắc của kỹ thuật là

sử dụng các đầu dò đặc hiệu được đánh dấu chất phát huỳnh quang lai với NST ở kỳ giữa (metaphase), và/hoặc nhân tế bào ở gian kỳ (interphase) Dưới kính hiển vi quang học, các vị trí lai sẽ được phát hiện, số lượng tín hiệu huỳnh quang trong mỗi nhân tế bào đại diện cho số lượng bản sao NST Nếu có 2 tín hiệu là bình thường, 1 tín hiệu là monosomy và 3 tín hiệu là trisomy [5], [21]

Kỹ thuật FISH là một kỹ thuật mới có giá trị sàng lọc cao, được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện các lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trên nhân tế bào ở gian kỳ không cần trải qua thời gian nuôi cấy tế bào nên có ưu điểm hơn kỹ thuật karyotype là cho kết quả xét nghiệm nhanh chỉ trong vòng 2 – 3 ngày Đây là bước tiến lớn trong việc giảm thời gian chờ đợi cho thai phụ cũng như giảm bớt khó khăn trong các trường hợp thai bất thường cần đình chỉ [5] Mặc dù nhanh và đáng tin cậy nhưng chi phí cho hóa chất xét nghiệm còn khá cao và tốn nhiều công lao động nên kỹ thuật này vẫn chưa được áp dụng rộng rãi ở nước ta

Hình 1.7 Hình ảnh minh họa kết quả FISH của thai nhi mắc hội chứng Patau

(Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ)

1.3.4 Kỹ thuật QF-PCR

Khắc phục nhược điểm thời gian thực hiện dài của karyotype, chí phí cao và tốn nhiều công thao tác của FISH, kỹ thuật QF-PCR đã ra đời và lần đầu tiên được áp dụng để phát hiện các rối loạn NST vào năm 1993 [18] Đến nay, kỹ thuật này đã trở thành phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu quả và được ứng dụng ở nhiều nơi trên thế giới

1.3.4.1 Khái niệm

Kỹ thuật QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction) được gọi là phản ứng chuỗi polymer huỳnh quang định lượng, dùng để khuếch đại các đoạn DNA ngắn đặc hiệu (STR), đánh dấu bằng tín hiệu huỳnh quang và định lượng bằng điện di mao quản [23]

STR (short tandem repeat) hay microsatellite là các trình tự lặp lại song song ngắn có tính đa hình rất cao do số lần lặp lại khác nhau giữa các cá thể STR chứa trình tự lặp lại gồm 2 – 6 nucleotide STR cũng đặc trưng cho từng NST nên các NST khác nhau chứa các trình tự STR khác nhau Trong kỹ thuật QF-PCR, STR đóng vai trò là các marker để khuếch đại một số locus nhất định trên các NST 13, 18, 21, X và

Y, qua đó xác định được số lượng các alen thông qua hình ảnh điện di Ngoài ra, STR được lựa chọn làm marker phải có mức độ dị hợp tử cao vì kết quả với nhiều alen

đồng hợp tử thì không có ý nghĩa chẩn đoán và kích thước trong khoảng 100 – 400 bp nhằm đảm bảo phản ứng khuếch đại PCR sẽ thực hiện hiệu quả hơn [4], [25], [32]

1.3.4.2 Nguyên tắc của kỹ thuật QF-PCR

QF-PCR sử dụng các cặp mồi gắn chất phát huỳnh quang để khuyếch đại các marker đa hình STR sau đó sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR sẽ được định lượng trên hệ thống điện di mao quản để xác định số lượng NST [25] Nguyên tắc của QF-PCR dựa trên cơ sở, trong giai đoạn đầu của sự khuếch đại, lượng DNA tạo ra từ các alen của 1 locus sẽ tỷ lệ thuận với DNA mục tiêu trong mẫu ban đầu Do đó, ở các trường hợp dị hợp tử bình thường, sản phẩm QF-PCR của một STR đặc trưng NST sẽ hiển thị 2 đỉnh huỳnh quang với tỷ lệ 1:1 Ở trường hợp trisomy sẽ xuất hiện 3 đỉnh huỳnh quang với tỷ lệ 1:1:1 (trisomy 3 alen) hoặc 2 đỉnh với tỷ lệ 2:1 (trisomy 2 alen) Trường hợp đồng hợp tử sẽ hiển thị 1 đỉnh huỳnh quang duy nhất [12]

Hình 1.8 Hình ảnh mô tả nguyên tắc kỹ thuật QF-PCR [20]

1.3.4.3 Tình hình ứng dụng kỹ thuật QF-PCR ở một số nước trên thế giới

Việc có nên thay thế kỹ thuật karyotype truyền thống bằng kỹ thuật QF-PCR vẩn còn tranh cãi ở nhiều nơi trên thế giới Tại Anh, kỹ thuật QF-PCR được sử dụng độc lập để chẩn đoán rối loạn số lượng NST trước sinh mà không cần karyotype Trong khi đó, ở Mỹ và Canada, các kết quả QF-PCR phải được kiểm tra lại bằng

Disomy

Trisomy

Trisomy

Không có ý nghĩa

karyotype Ở Hà Lan, Thụy Điển và Phần Lan, những thai có nguy cơ do tuổi mẹ, xét nghiệm sàng lọc huyết thanh dương tính và kết quả siêu âm có dấu hiệu gợi ý thì được

đề nghị áp dụng kỹ thuật QF-PCR còn những thai có bất thường hình thái khi siêu âm thì nên thực hiện karyotype [4]

Bổ sung nước cất hai lần cho đủ 500ml

 Kit InstaGene Matrix (Bio Rad)

2.1.2.2 Hóa chất trong điện di mao quản

 Kit Devyser Complete và Devyser Resolution (Devyser AB)

 Hi-DiTM Formamide (Applied Biosystems)

 560 SIZER ORANGE (Applied Biosystems)

 GeneScan 500 ROX (Applied Biosystems)

 Pop 7, 3500 (Applied Biosystems)

 Buffer Anode, Cathode (Applied Biosystems)

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị và phần mềm cho kỹ thuật QF-PCR

 Tube vô trùng 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml

 Micropipette các loại với thể tích từ 0,2 – 1000 l (Eppendorf)

 Đầu tip vô trùng các loại với thể tích từ 0,2 – 1000 l

 Đĩa PCR 96 giếng (Axygen)

 Máy ly tâm ống 15 ml

 Máy ly tâm tube 1,5 ml (Eppendorf)

 Máy vortex (Eppendorf)

 Máy khuấy từ (Heidolph)

 Máy ủ nhiệt khô có lắc (Eppendorf)

 Máy luân nhiệt theo chu kỳ Mastercycler Pro S (Eppendorf)

 Hệ thống giải trình tự ABI 3500 (Applied Biosystems)

 Phần mềm phân tích đoạn DNA GeneMarker (SoftGenetics)

 Tủ mát 4OC (Sanyo)

 Tủ lạnh -20OC (Sanyo)

Ngoài ra còn có một số dụng cụ cơ bản khác: găng tay vô trùng, bình cồn, khay

để tube, dụng cụ mở nắp tube,

Micropipette Tip Tube

mao quản

InstaGene Matrix Hi-DiTM Formamide Kit Devyser

Hình 2.1 Một số hình ảnh minh họa dụng cụ, thiết bị, hoá chất cho kỹ thuật QF-PCR

2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

Các bước chính trong quy trình thực hiện kỹ thuật QF-PCR có thể tóm tắt theo

sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Quy trình thực hiện kỹ thuật QF-PCR

2.2.1 Phương pháp ly trích DNA từ dịch ối bằng kit Instagen Matrix

Các bước chính được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất [6]

- Sau khi nhận mẫu dịch ối, ly tâm 1.500 rpm trong 5 phút để kiểm tra chất lượng mẫu Nếu mẫu lẫn máu nhiều sẽ được chuyển sang bước cấy để nuôi cấy tế bào ối

- Chuẩn bị các tube 1,5 ml đánh số tương ứng với mã số bệnh nhân

- Đổ bớt dịch ối đến thể tích 2 ml thì ngừng Sử dụng micropipette hút

200 l cặn dịch ối sang tube đã chuẩn bị sẵn

- Ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút loại bỏ dịch nổi

- Bổ sung 200 l dung dịch PBS Vortex Ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút thu cặn, loại bỏ dịch nổi

- Tùy theo lượng cặn ối tiến hành bổ sung 100 – 200 l InstaGene Matrix

- Vortex sau đó tiến hành spin

- Ủ trong 8 phút ở 99 - 100OC

Ly trích DNA tổng số

Thực hiện phản ứng luân nhiệt – PCR

Phân tích kết quả Điện di mao quản

Ly tâm

Vortex

Hút bỏ dịch nổi

- Vortex ở tốc độ cao Ly tâm 12.000 rpm trong 2 phút

Những bước chính trong ly trích DNA bằng kit InstaGene Matrix được tóm tắt theo sơ đồ 2.2

Spin

Ly tâm Mẫu dịch ối

Hút cặn dịch ối và rửa

với dung dịch PBS

Bổ sung dung dịch InstaGene Matrix

2.2.2 Quy trình phản ứng luân nhiệt – PCR

Ứng với mỗi mẫu DNA sau khi được ly trích sẽ được chạy 2 phản ứng PCR đa mồi riêng biệt trong bộ kit Devyser Complete

Thành phần phản ứng PCR 1 gồm có:

PCR Activator Devyser Complete Mix 1

Thành phần phản ứng PCR 2 gồm có:

PCR Activator Devyser Complete Mix 2

Devyser Complete Mix 1 gồm các cặp mồi được đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho 14 marker đặc trưng trên các NST 13, 18, 21 Tương tự, Devyser Complete Mix 2 gồm các cặp mồi được đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho 19 marker đặc trưng trên các NST 13, 18, 21, X, Y và đặc biệt trong đó có 2 marker là T1, T3 được

sử dụng để đếm số lượng NST X Các marker được trình bày trong bảng 2.1 và 2.2

Bảng 2.1 Các marker được sử dụng trong phản ứng PCR 1 [13]

Kí hiệu Tên Marker Vị trí trên NST Độ dài (bp) Màu huỳnh quang

Bảng 2.2 Các marker được sử dụng trong phản ứng PCR 2 [13]

Kí hiệu Tên Marker Vị trí trên NST Độ dài (bp) Màu huỳnh quang