Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và phân lập chất tinh khiết từ dịch chiết của cỏ gấu biển (cyperus stoloniferus retz )

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  NGUYỄN THỊ PHƯƠNG OANH NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CỎ GẤU BIỂN C

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM



NGUYỄN THỊ PHƯƠNG OANH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN

HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT

TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CỎ GẤU BIỂN

(CYPERUS STOLONIFERUS RETZ.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

ĐÀ NẴNG, NĂM 2019

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM



NGUYỄN THỊ PHƯƠNG OANH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN

HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT

TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CỎ GẤU BIỂN

(CYPERUS STOLONIFERUS RETZ.)

Chuyên ngành : HÓA LÝ THUYẾT VÀ HÓA LÝ

Mã số : 60 44 01 19

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG

ĐÀ NẴNG, NĂM 2019

NGUYEN THl PHVONG OANH

Da N~ng, ngay 15 thang 12 nam 2019

(\) 8t-oj;;' n ~ P~ l-z '1J uC<f\L

N gU'iri th., c h i~n d ~ tili 6ng d§n

* Tir kh6a : CO GAu BruN , QUERCETIN, FLAVONOID , C Y PER U S STOLO N I F ER U S

RETZ , CSl.

- Ti~p t u c nghien ciru v~ tac dl,lng sinh hQc in vitro va in vivo (nhu tac dl,lng hl;tduang huy~t ,

tac dl,lng khang khu~n , tac dl,lng ch6ng viem ) cila co g~u bi€n va cac hOl;ttch~t philn l~p tir co g~u bi€n

bi€n

*Ynghia khoa hQCva thirc ti~n c u a d~ tai

D~ tai nay se giup g6p p h frn nang cao gia t ri khoa hoc va gia tri sir dung cua cay co g ~ bi€n trong y hoc, D 6ng thoi cung dp cac s6 lieu thuc nghiem cho cac nghien ciru sau hon v~ co g ~ b ien trong cac d~ tai ti~p theo

*Hirong nghien ciru ti~p thea cua d~ tai

- Ti~p t u c nghien ciru dfry du va sau hon v~ thanh phan h6a hoc trong c o g u bien ( Cy p e ru s

s toloniferusR etz.) , ho C6i (Cypeaceae).

- Ti~p t u c phan l~p va xac d inh c~u true h6a hoc cua mot s6 chat tinh khiet khac trong co g~u

Ten dStai : NGHIEN CIT CHIET TAcH, xAc DJNH THANH PUAN HOAHQCvA

PHAN L~P cHAT TINH KHIET TUDJCH CHIETC V A co GAu BIEN ( C Y PE RU S STOLO N IFER U S RETZ.)

Nganh: HOA LYTHUYET vA HOA LY

HQ va ten hoc vien: NGUYEN T H I P HVONG OANH

Nguoi huong d ~n khoa hoc : GS TS BAo HUNG CUONG

Co So' dao tao: Truong BHSP B a Niing

*Tom tit:

Trong qua trinh trien khai nghien ciru , d~ tai dii dat d uoc cac k~t qua nhir s au :

- Dii xac dinh duoc cac chi tieu hoa li : Xac dinh cac thong s6 hoa ly cua nguyen lieu: dQ ~ m cua bot nguyen lieu c o g~u biSn la 6 36 %; ham hrong tro la 2.3% , ham luong cac kim loai nang nam trong khoang cho phep thea quy dinh cua lieu chuan Viet Nam (TCVN)

- Bang phuong phap GC - MS , dii dinh danh duoc 44 du tll' trong cac dich chiet tir co g ~ u bien bao g6m cac Alca l oid Glycosid tim , Flavonoid, Saponin, Tanin, Acid amin , Ch ~ t beo, Sterol , Coumarin , Anthranoid , polysaccharid , Acid hiru co, Terpenoid Trong do , cac sterol va stanol nhir Stigmasterol , v - Sitosterol , Campesterol d~u la nhtrng hoat ch~t q u y co kha nang chong ung thu cao.

- B ang ph uong p h ap sic ky CQtsilicagel lap lai nhie u lfrn k~t hop vo i sic ky ban mong , dii phan lap diroc hop ch~t CS t tinh sach , Viec k~t hop cac ph u ong p h ap ph6 dii cho phep xac d inh du true cua hop ch~t phan l~p diroc Hop ch~t CSl la Quercetin - loai flavonoid c6 ch~t chong oxy h6a manh , h6 tro chong lai cac t~ bao g6c nr do Day Ia Ifrn dfru tien ch~t nay duoc phan lap tir c o g~u bi€n o ' Viet Nam

- C ontinue research on the biological effects in vitro an d in vivo (as hypoglycemic e f fects ,

antib a cterial, anti - inflammatory ) of sea grass and active b ear i so l ated from sea grass bears

* Ke y w ord s: SEA BEAR GRASS , Q UE RC E TIN , FLAV O NO ID , CY P E R US

ST OLO N I FE R U SRETZ , C Sl.

bear s.

N ame of thesis: EXTRACTION ST U DIES , CHEMICAL COMPOSITIO N

DETERMINATION AND PURIFIED S U BSTANCE ISOLATIO N F RO M EXT RAC TI ON

OF SEA B E AR GRASS (C Y P E R U S STOLO N I FE R U SRETZ.)

Major : TH E ORETICAL CHEMISTRY AND PHYSICAL CHEMISTR Y

F ull name of Master student: NGUYEN THI PH U ONG OANH

Supervisors : Prof DAO HUNG C U ONG

Training in s titution: The U ni v er s ity Of Sci e nce And Education

* Summary

In t he cour s e of conducting research , the topic has achieve d the following results :

- Identified the only digest point: I dentify the chemica l parameters of the material: the moisture

o f the p o wder m a terial in bear sea is 6 : 36 %; ash co n tent w as 2.3 %, the concentr a t on of heavy metal s

in t he r a ng e a llowed by the re g lations of Vietnam stan d ards (TCVN)

- B y the GC - MS method , the identifier was 44 in the extract i on of extract s from the S e a bear

g rass consisting of alkaloi d s Ca r diac glycosides , flavonoids, S aponin , tannin s, amino acid s, fat s,

s te r ol s, Coumarin , Anthranoi d , P olysaccharid , organic Aci d , Terpenoid In it , t h e sterols and stanol such a s Stig m aste r o l y - Sitosterol , Campesterol are bot h precio u s active sub s tances that are highly resi s tant to cancer.

- By co lu mn c h romatography o n s i lica g el r ep eated c h romatography combined wit h t hi n ,

isol a ted compo u d s p urified CS 1 The com b ination of spectrosco p ic metho d s allowed the struct u re determination of compo u nds i sola t e d CSI i s Qu erce t in com pound s - flavonoids w i th potent

a n tiox idant support against free radical cells This is the first time this s u bstance was isolated from sea

g r ass bear s in Vietnam

*Scientific and practical meanings of the to p ic

This topic will help to contrib u te to the enha n cement of scientific value and the value of use in medicin a l v egetat i on At the same time provide experimental figures for deeper research on Sea bear

gras s in subsequent topics

*The next research direction of the topic

- Continue to fully research and further the chemical composition of sea bear grass (C y perus

s tol o ni f erus Ret z ) , Sedge (Cype a cea e )

- Continue to i solate an d determine the chemica l st ru cture of some other reagent in sea gras s

Uri d~u tien , toi xin duoc bay to long biet on sau sac d~n GS.TS Dao Hun g

CUOng - nguoi th~y dang kinh di'i tnrc tiep hu6ng d~n , t~n tinh ch i bao , dong vien

va t<;10 moi dieu kien t6t nh~t d~ toi hoan thanh bai luan van nay

Sau 2 nam diroc hoc t~p tai khoa Hoa - Truong D<;1iHQc Su pham Da N~ng ,

toi dii ti~p thu duoc r~t nhieu kien tlnrc va kinh nghiem b6 ich d~ trang bi cho con dirong urong lai phia tnroc cua minh Toi xin giri loi cam on chan thanh d~n Ban giam hieu Truong D<;1iHQc Sir pharn Da N~g , d~c biet la cac thay co trong khoa Hoa , nhtrng nguoi luon an can , nhiet huyet chi bao va h6 tro chung toi r~t nhieu trong qua trinh hoc t~p va thuc hien de tai nay.

Toi cling xin giri loi cam on gia dinh , ban be va ngiroi than dii luon ben canh

c6 vii , dong vien va giup dO'toi hoan thanh luan van nay.

Vi thai gian va kha nang co han nen trong bai khoa luan nay khong tranh diroc nhfing thieu sot , toi r~t mong nhan diroc SlJ dong gop chan thanh cua th~y co va cac ban d~ bai luan van tro nen hoan chinh hon.

Cu6i cung, xin kinh chuc t~t ca cac thay co giao luon d6i dao sire khoe, cong tac t6t va thanh cong trong cong viec,

Toi xin chan thanh cam on!

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CYPERUS 4

1.1.1 Đặc điểm thực vật chung của chi Cyperus 4

1.1.2 Tác dụng sinh học của chi Cyperus 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ LOÀI CYPERUS STOLONIFERUS RETZ 7

1.2.1 Vị trí phân loại của loài Cyperus stoloniferus Retz 7

1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài Cyperus stoloniferus Retz 7

1.2.3 Phân bố và sinh thái 8

1.2.4 Tác dụng sinh học của loài Cyperus stoloniferus Retz 8

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÂY CỎ GẤU BIỂN (CYPERUS STOLONIFERUS RETZ) 10

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 10

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 21

2.1.1 Nguyên liệu 21

2.1.2 Hoá chất và thiết bị nghiên cứu 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lí 22

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật 24

2.2.3 Phương pháp định danh thành phần hóa học của các cao chiết 26

2.2.4 Phương pháp phân lập các hợp chất 26

2.2.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 28

2.3 SƠ ĐỒ CHIẾT TÁCH, ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC 29

2.4 PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT 31

2.4.1 Sơ đồ phân lập 31

2.4.2 Quy trình phân lập 31

2.4.3 Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất CS1 đã phân lập 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ SỐ VẬT LÝ 33

3.1.1 Độ ẩm 33

3.1.2 Hàm lượng tro 33

3.1.3 Hàm lượng kim loại 33

3.2 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾT CHƯNG NINH BẰNG METHANOL 34

3.2.1 Khảo sát giá trị nhiệt độ 34

3.2.2 Khảo sát tỉ lệ rắn - lỏng 34

3.2.3 Khảo sát giá trị thời gian 35

3.3 ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC - MS 36

3.3.1 Định danh thành phần các cấu tử trong dịch chiết n-hexane 36

3.3.2 Định danh thành phần các cấu tử trong dịch chiết chloroform 39

3.3.3 Định danh thành phần các cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate 43

3.3.4 Định danh thành phần các cấu tử trong dịch chiết ethanol 47

3.3.5 Định danh thành phần các cấu tử trong dịch chiết methanol 50

3.3.6 Tổng hợp thành phần hóa học được định danh trong các dịch chiết 52

3.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT TÁCH ĐƯỢC CS1 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 65

DMSO : Dimethyl sulfoxide

EC 50 : Effective concentration 50% - Nồng độ 50% tác dụng tối đa

ED 50 : Effective dose - Liều tác dụng tối đa trên 50% đối tượng thử

EtOAc : Ethyl acetate

FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy - Phổ hồng ngoại biến đổi

LD 50 : Lethal dose - Liều lượng gây chết trung bình

MeOH : Methanol

TLC : Thin layer chromatography - Sắc ký bản mỏng

R f : Retention factor - Thời gian lưu

s/d//m/t/ : Singlet/douplet//multiplet/triplet

dd/td/ddd : Douplet of douplet/triplet of douplet/douplet of douplet of douplet

3.3 Kết quả khảo sát hàm lƣợng một số kim loại nặng trong mẫu

3.7 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane 36 3.8 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform 40 3.9 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate 43 3.10 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol 47 3.11 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết methanol 50

3.12 Tổng hợp thành phần hóa học đƣợc định danh trong các dịch

chiết

52 3.13 So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất CS1 với Quercetin 57

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

hình vẽ Tên hình vẽ, đồ thị Trang

MỞ ĐẦU

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Việt Nam ta là một nước nhiệt đới, nóng, ẩm và mưa nhiều, có nguồn dược liệu rất phong phú, đa dạng và một nền y học dân tộc phát triển lâu đời Từ xa xưa, ông cha ta đã biết cách sử dụng nhiều loại thảo dược trong việc dưỡng thương, trị bệnh và bồi bổ cơ thể Như vậy, những cây thuốc dân gian đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người

Ngày nay, khi biệt dược của nền y học hiện đại được sử dụng rộng rãi, nhiều loài cây cỏ trong tự nhiên vẫn được sử dụng trong dân gian để chữa bệnh rất có hiệu quả Rất nhiều loại bệnh tật đã được chữa khỏi nhờ thảo dược, trong đó rất nhiều thực vật được dùng để chế biến thành thực phẩm chức năng quý giá Trong thời gian qua, những hợp chất tự nhiên được phân lập từ thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu

rõ về thành phần và cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc Trên cơ sở các nghiên cứu đó có thể tạo ra chất mới có hoạt tính sinh học cao như mong muốn để làm thuốc chữa bệnh, đặc biệt là các bệnh nan y

Cây cỏ gấu (hay còn gọi là củ gấu, hương phụ, cỏ cú) là một loại cỏ sống lâu năm, được sử dụng chủ yếu trong y học Theo kinh nghiệm dân gian cũng như các tài liệu nghiên cứu, thân rễ của cây cỏ gấu được dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau như: chữa kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, các bệnh của phụ nữ, viêm tử cung mạn tính, đau dạ dày, ăn không ngon, tiêu hóa kém, nôn mửa, cảm mạo,….Những bài thuốc có thành phần “hương phụ” ở Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ loài cỏ gấu biển; do cỏ gấu biển có nhiều hơn, củ to hơn, thu hái dễ dàng hơn so với cỏ gấu vườn

Tuy nhiên cho đến nay ở nước ta chưa có nhiều những nghiên cứu mang tính

cơ bản về thành phần, tính chất, khả năng ứng dụng của các hợp chất có trong cỏ

gấu biển Với những lí do trên, tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách,

xác định thành phần hóa học và phân lập chất tinh khiết từ dịch chiết của cỏ gấu

biển (Cyperus stoloniferus Retz.)” nhằm góp phần nâng cao giá trị khoa học và giá

trị sử dụng của cây cỏ gấu biển trong y học

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Cây cỏ gấu biển, được lựa chọn một cách ngẫu nhiên trên địa bàn thành phố

Đà Nẵng

2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu trên nguồn nguyên liệu tại thành phố Đà Nẵng

- Phân lập, tinh chế một số hợp chất hóa học có trong mẫu cao chiết từ cỏ gấu biển

- Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được

3 MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

3.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng qui trình chiết tách các hợp chất từ cỏ gấu biển

- Phân lập, tinh chế hợp chất hóa học từ dịch chiết của cỏ gấu biển

- Xác định cấu trúc của hợp chất đã phân lập được

3.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Nghiên cứu, xác định cấu trúc của hợp chất hóa học từ cỏ gấu biển

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để thực hiện đề tài này, tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:

4.1 Nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liên quan đến đề tài

- Hội thảo, trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và sinh viên

4.2 Phương pháp thực nghiệm

Phương pháp chọn mẫu:

- Xác định độ ẩm bằng phương pháp trọng lượng

- Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hoá mẫu

- Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

- Chiết trích ly bằng các dung môi hữu cơ khác nhau

- Khảo sát các điều kiện chiết thích hợp

- Xác định thành phần các hợp chất chính trong dịch chiết từ cỏ gấu với các dung

môi chiết khác nhau (n–hexane, clorofom, etylaxetat, metanol ) bằng phương pháp phổ hồng ngoại IR và sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS

- Phân lập, tách và tinh chế các chất bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng, các phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại

- Các phương pháp khảo sát cấu trúc: kết hợp các phương pháp đo phổ tử ngoại (UV - VIS), phổ hồng ngoại (FT–IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR): 1H–NMR, 13C–NMR và các phương pháp khác để xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được

5 BỐ CỤC LUẬN VĂN

Nội dung đề tài chia làm các phần:

- MỞ ĐẦU

- Chương 1 – TỔNG QUAN

- Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

- TÀI LIỆU THAM KHẢO

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CYPERUS

1.1.1 Đặc điểm thực vật chung của chi Cyperus

Trên thế giới, họ Cói (Cyperaceae) có 95 chi, 3800 loài Trong đó, chi

Cyperus là chi lớn nhất có 300 loài, phân bố rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới

Ở Việt Nam, họ Cói có 27-30 chi, 301 loài, chi Cyperus có 81 loài; phân bố

khắp nơi trong cả nước, có nhiều ở những nơi đất ẩm thấp [3], [8], [14], [15], [37]

Chi Cyperus là chi lớn nhất trong họ Cói (Hình 1.1) có nhiều đặc điểm điển

hình của họ:

- Cây thảo sống hàng năm, có thân ngầm ở dưới đất mọc lên thân khí sinh, thân có thiết diện 3 cạnh

- Lá: hình giải có bẹ ôm lấy thân

- Hoa: bông nhỏ có tiết diện dẹp, nhiều vảy; quả có tiết diện 3 cạnh; nhụy chẻ 3

Đây là những đặc điểm để phân biệt với các chi khác [3], [13], [18] Trong

chi Cyperus, có nhiều loài được dùng làm thuốc; trong đó, cỏ gấu vườn thường

được sử dụng nhiều hơn Tuy nhiên, gần đây nhiều nơi đã dùng cỏ gấu biển với công dụng như cỏ gấu vườn

Cyperus compactus Retz Cyperus compressus L Cyperus croceus Vahl

Cyperus difformis L Cyperus digitatus Roxb Cyperus exaltatus Retz

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài trong chi Cyperus L

1.1.2 Tác dụng sinh học của chi Cyperus

Theo Trương Phát Sơ, Trương Diệu Đức và Lưu Thiệu Quang (1935), cao lỏng hương phụ 5% có khả năng ức chế sự co bóp của tử cung, làm dịu sự căng thẳng của tử cung động vật Năm 1959, một số tác giả ở Quý Dương y học viện (Trung Quốc) đã chứng minh tác dụng giảm đau trên chuột nhắt trắng [16]

Theo N Prakas và B Ragavan [34], các dịch chiết khác nhau của Cyperus esculentus L như acetone, ethanol 50%, chloroform, ether dầu hỏa có hoạt tính kháng khuẩn với một số chủng vi khuẩn như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa và Citrobabacter freundii, bằng cách sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa Dịch chiết aceton cho thấy hoạt động ức chế mạnh nhất với S aureus, K pneumoniae và P vulgaris Dịch chiết ethanol 50% ức chế mạnh nhất với E coli, S aureus và Salmonella sp Dịch chiết chloroform ức chế mạnh nhất sự tăng trưởng của S aureus, trong khi đó dịch ether dầu hỏa cho kết quả tích cực đối với Salmonella sp Tất cả các dịch chiết rất nhạy cảm với C freundii

Theo V S Rakotonirina và cộng sự [41] dịch chiết tổng từ thân rễ của C articulatus dường như không có tác dụng gây mê hoặc gây tê Tuy nhiên, khi so sánh với diazepam, C articulatus dường như không có tác dụng giãn cơ Khi kết

hợp với natri thiopental hoặc diazepam, dịch chiết tổng gây cảm giác ngủ và tăng thời gian ngủ mà không có tác dụng giảm đau đồng thời Các nghiên cứu cho thấy

thân rễ của C articulatus có tính chất dược lí tương tự như các thuốc an thần

Theo H G Anwar và H J Khalid [30] dịch chiết nước - methanol của C scariosus có tác dụng bảo vệ gan với liều 500mg/kg Thí nghiệm được tiến hành

trên chuột, gây tổn thương gan bằng acetaminophen và CCl4

Theo E Ngo Bum và cộng sự [27] dịch chiết methanol từ thân rễ của

Cyperus articulatus có hoạt tính chống co giật ở chuột Liều ED50 để bảo vệ chống

co giật là 306 (154 - 541) mg/kg cho các thử nghiệm tiêm màng bụng pentylenetetrazol (gây ra cơn động kinh) và 1005 (797 - 1200) mg/kg cho gây sốc bằng điện

Theo S Kilani và cộng sự [40] dịch chiết ethyl acetate và các flavonoid của

C rotundus có hoạt tính chống oxy hóa, ức chế enzyme xanthine oxidase với giá trị

IC50 là 185 và 240 mg/ml; ức chế superoxide anion với IC50 là 150 và 215 mg/ml Ngoài ra, các tác giả còn đánh giá hoạt tính sinh học của catechin, acid ferulic và luteolin Kết quả cho thấy, luteolin có tác dụng mạnh nhất trên việc giảm sản xuất acid thiobarbituric (MDA=1,5nm), ức chế đáng kể sự gia tăng của các tế bào K562 (IC50 = 25mg/ml) và bảo vệ chống lại các tác nhân oxy hóa khử như H2O2/ UV

Theo G M Rukunga và cộng sự [28] hai sesquiterpene là corymbolone và

mustakone, được phân lập từ dịch chiết chloroform của thân rễ Cyperus articulatus

có hoạt tính chống Plasmodia Trong đó, mustakone có hoạt lực mạnh hơn corymbolone khoảng 10 lần đối với chủng Plasmodium falciparum

Theo C Thebtaranonth và cộng sự [26] các chất được phân lập từ thân rễ

Cyperus rotundus là patchoulenone, caryophyllene α - oxit, 10, 12 -

peroxycalamenene và 4, 7 - dimethyl - 1- tetralone có hoạt tính chống sốt rét với

EC50 = 10-4 - 10-6 M Endoperoxide và 10, 12 - peroxycalamene có tác dụng mạnh nhất tại EC50 = 2.33 x 10-6 M

Theo J S Eun và cộng sự [31] dịch chiết ethanol của C rotundus có tác

dụng chống kết tập tiểu cầu và phụ thuộc vào nồng độ collagen, thrombin và acid

arachidonic Trong tám hợp chất của C rotundus, (+)-nootkatone có tác dụng ức

chế mạnh nhất trên collagen, thrombin và acid arachidonic

A R Nishikant và cộng sự [21] đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của C rotundus trên alloxan gây tăng đường huyết ở chuột Kết quả cho chuột uống

500mg/kg dịch chiết (một lần một ngày, trong 7 ngày liên tiếp) làm giảm đáng kể lượng đường trong máu

Theo S J Uddin và cộng sự [39] dịch chiết methanol và ether dầu hỏa của

thân rễ C rotundus, dùng đường uống với liều 250 và 500 mg/kg thể trọng, cho

thấy có tác dụng chống tiêu chảy rõ rệt trên mô hình chuột gây tiêu chảy bằng dầu thầu dầu Phần dịch chiết ethyl acetate không có tác dụng này

Theo H Bae và cộng sự [29] đã nghiên cứu về phát triển dòng Th1/Th2 in vitro từ các tế bào lympho T thu được từ lá lách của chuột BALB/c cho thấy dịch chiết nước của củ gấu tăng cường phát triển dòng Th1 (tế bào hỗ trợ) bằng cách tăng tiết cytokine Th1 và làm giảm phát triển dòng Th2 bằng cách ức chế sản xuất cytokin

Th2 Vì vậy, dịch chiết củ gấu có thể ngăn ngừa dị ứng hoặc cải thiện các triệu

chứng dị ứng

Như vậy, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lí của chi

Cyperus bao gồm một số tác dụng như: giãn cơ trơn, giảm đau, kháng khuẩn, chống

oxy hóa, bảo vệ gan, an thần, chống co giật, chống tiêu chảy, hạ đường huyết, chống sốt rét, chống kết tập tiểu cầu, chống dị ứng

1.2 TỔNG QUAN VỀ LOÀI CYPERUS STOLONIFERUS RETZ

1.2.1 Vị trí phân loại của loài Cyperus stoloniferus Retz

Theo các tài liệu [6], [16], [23] cây cỏ gấu biển có:

- Tên khác: Cỏ cú, cú chồi, cú biển, cỏ biển, hương phụ biển, hải dương phụ

- Tên khoa học: Cyperus stoloniferus Retz

- Tên đồng nghĩa:

+ Cyperus arenarius Hance ex C.B.Clarke, nom Illeg

+ Cyperus bulbosostoloniferus Steud

+ Cyperus conjunctus Steud

+ Cyperus littoralis R.Br

+ Cyperus mayeri Kük

+ Cyperus spadiceus Lam

- Họ Cói: Cyperaceae

1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài Cyperus stoloniferus Retz

Cây cỏ sống dai, cao 15-30cm (Hình 1.2) Thân rễ nằm bò dưới mặt đất, từng đoạn phình thành củ hình trứng, từ củ mọc lên thân khí sinh (Hình 1.3) Thân nhẵn, hình 3 cạnh Lá rộng 2-3mm, gốc có bẹ ôm thân, đầu lá thuôn nhọn, gân chính rõ, cứng và bóng

Hình 1.2 Cây cỏ gấu biển Hình 1.3 Củ gấu biển

Cụm hoa ở đỉnh, phân nhánh nhiều thành những bông xếp dạng ngù, bông kép hay cờ không đều, mỗi bông có trục nhẵn mang 3-20 bông nhỏ, các bông nhỏ gồm nhiều hoa, trục bông nhỏ có cánh, mỗi hoa mọc ở kẽ một lá bắc còn gọi là vảy, các vảy có màu nâu đỏ xếp thành dãy ở trên trục, hình trái xoan tù, hoa không có đài và tràng, nhị 3, bao phấn hình dải thuôn; bầu thượng, có một ô, một noãn, vòi nhụy hình chỉ, đầu nhụy dài và chẻ 3 (Hình 1.4)

Quả bế có 3 cạnh, màu đen nhạt chứa 1 hạt

Mùa hoa quả: tháng 3-7 [16], [20]

Hình 1.4 Hoa của cỏ gấu biển

1.2.3 Phân bố và sinh thái

Cỏ gấu phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu

Âu, châu Á, châu Mỹ, châu Phi và châu Đại Dương Tuy nhiên cỏ gấu biển chỉ có ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và châu Đại Dương (Úc, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonexia, Malaysia, Pakistan, Thái Lan, Việt Nam, Madagascar, quần đảo Ấn Độ Dương, đảo Thái Bình Dương) [35], [37], [42] Ở Việt Nam, cỏ gấu có mặt ở khắp nơi, trừ vùng núi cao trên 2000m, cỏ gấu biển mọc tập trung trên các bãi cát, đất pha cát ven biển từ Móng Cái đến Hà Tiên, ở các đảo và quần đảo như Cát Bà, Hòn

Mê, Hòn Khoai, Phú Quốc, Côn Đảo, Trường Sa…[20]

Cỏ gấu biển ưa ánh sáng, có khả năng chịu hạn và chịu mặn tốt

Vị thuốc có tên “hương phụ” ở Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ thân rễ loài cỏ gấu biển Hàng năm, các vùng ven biển từ Thanh Hóa trở vào có khả năng cung cấp từ 50-100 tấn loại dược liệu này cho nhu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu

1.2.4 Tác dụng sinh học của loài Cyperus stoloniferus Retz

 Tác dụng gây độc của tinh dầu: Theo nghiên cứu của tác giả Vũ Văn Điền

[11], tinh dầu có khả năng gây độc trên chuột nhắt trắng, liều LD50 của tinh dầu củ

gấu biển là 12,1mL/kg

 Tác dụng ức chế thần kinh trung ương: Tinh dầu củ gấu, thí nghiệm trên

chuột nhắt trắng bằng đường tiêm phúc mạc với liều 0,03 ml/chuột, có tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của pentobarbital Trên thỏ thí nghiệm, tinh dầu củ gấu tăng cường tác dụng gây mê của scopolamin Về cơ chế tác dụng, qua thí nghiệm chứng

tỏ tinh dầu củ gấu ức chế chủ yếu quá trình dẫn truyền các xung thần kinh qua synap của tế bào vùng hải mã và bó tháp, còn đối với dẫn truyền qua sợi trục thần kinh thì không có tác dụng ức chế [20]

 Tác dụng chống oxy hóa: Theo C H Lee và cộng sự [25] thì dịch chiết

nước từ thân rễ củ gấu có vai trò chống thoái hóa thần kinh nhờ tác dụng chống oxy hóa và dọn các gốc tự do bằng mô hình dùng 6-hydroxydopamine gây bệnh Parkinson ở chuột, với liều 50 và 100 mg/kg

 Tác dụng trên cơ trơn:

- Theo “Cây thuốc và động vật làm thuốc”, cao lỏng củ gấu 5%, thí nghiệm trên tử cung cô lập chuột lang, thỏ, mèo và chó đều có tác dụng ức chế sự co bóp tử cung, đồng thời làm giảm trương lực Trên tử cung có thai cũng như trên tử cung bình thường, cao củ gấu đều có tác dụng ức chế So sánh với đương quy, tác dụng ức chế

co bóp tử cung của củ gấu yếu hơn Thành phần tinh dầu chiết từ củ gấu có tác dụng kiểu estrogen, nhưng không mạnh [20]

- Theo nghiên cứu của Vũ Văn Điền, nước sắc của củ gấu biển có tác dụng giãn cơ

tử cung cô lập trên chuột ở liều 0,5-2%; trên thỏ có chửa ở liều 5-6%; giãn cơ tử cung tại chỗ của thỏ ở liều 4-6g/kg [11]

 Tác dụng trên tim mạch: Theo tác giả Trần Văn Bính, chế phẩm hương

phụ biển có tác dụng làm giảm biên độ co bóp và hơi giảm nhịp tim ếch cô lập ở liều 1-4%, ở liều 5% tâm trương toàn bộ [4]

 Tác dụng hạ huyết áp: Theo luận án phó tiến sĩ năm 1994 của dược sĩ Vũ

Văn Điền, nước sắc hương phụ có tác dụng hạ áp nhẹ trên chó với liều 0,5g/kg qua đường tim tĩnh mạch [11]

 Tác dụng giảm đau: Nước sắc từ thân rễ củ gấu biển, thí nghiệm trên chuột

nhắt trắng được gây đau bằng tiêm phúc mạc chuột dung dịch acid acetic đã cho

thấy tác dụng giảm đau tương tự acid salicylic Trong nhóm hợp chất thì alcaloid có tác dụng giảm đau mạnh nhất, sau đó là tinh dầu, còn saponin và glycosid không thể hiện tác dụng [9]

 Tác dụng kháng khuẩn: Theo nghiên cứu của Vũ Văn Điền và Cao Văn Thu,

nước sắc của hương phụ biển dạng sống và dạng chế (nước gừng, đồng tiện) có tác

dụng kháng sinh trên 5 chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Sarcina lutea và Staphylococcus; trong đó, dạng sống tác dụng mạnh hơn

dạng chế Các nhóm hoạt chất toàn phần thì saponin không có tác dụng kháng khuẩn; alcaloid, glycosid tim và tinh dầu của củ gấu cũng có tác dụng kháng sinh trên 10 chủng vi khuẩn, trong đó glycosid có tác dụng mạnh hơn cả [10]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ

CÂY CỎ GẤU BIỂN (CYPERUS STOLONIFERUS RETZ)

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Theo “Dược Điển Việt Nam IV” và theo “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” [1], [20], thành phần hóa học của củ gấu biển gồm: tinh dầu 30,620%; alcaloid 0,128%; glycosid tim 0,77%; saponin 0,05%; flavonoid 0,78%

Cụ thể, tinh dầu chứa cyperen 8,90%; β - caryophylen 4,89%; 5β - H, 7β, 10α - selinen 4 (14) - 11 - dien 10,67%; cyperotundon 2,88%; cyperolon 1,39%; caryophylen oxyd 21,31%; 9H - cyclolongifolen - 8 - oxo 2,35%; patchoulenon 2,69%; α - cyperon 3,95% ; α - cyperol 4,73% ; đồng phân của cyperon 14,00%

Theo luận án phó tiến sĩ năm 1994 của dược sĩ Vũ Văn Điền [11], đã xác định được trong củ gấu biển có 0,62% tinh dầu theo phương pháp cất kéo hơi nước; 0,128% alcaloid theo phương pháp cân; 0,77% glycosid bằng phương pháp đo quang; 0,050% saponin theo phương pháp cân; 0,78% flavonoid bằng phương pháp

đo quang; 1,78% tanin bằng phương pháp chuẩn độ

Theo tác giả Nguyễn Xuân Dũng, Vũ Văn Điền, Vũ Ngọc Lộ [7] thì trong thành phần tinh dầu của cỏ gấu biển có 22 chất

Kết quả nghiên cứu của tác giả Trần Huy Thái, Trần Thị Ngọc Diệp [17] cho

thấy, hàm lượng tinh dầu từ thân rễ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) đạt

0,62% theo nguyên liệu khô Tinh dầu là chất lỏng màu vàng sẫm, có mùi thơm và nhẹ hơn nước Bằng phương pháp sắc khí khối phổ (GC-MS), 28 hợp chất trong

tinh dầu củ gấu biển được xác định, chiếm 86,27% tổng hàm lượng tinh dầu Thành phần chính của tinh dầu là các hợp chất sesquiterpenoid Thành phần hóa học chính

của tinh dầu là α-cyperon (32,37%), β-seline (3,74%), 1,4 octahydro-4-8-tetramethyl (6,1%), 2-cyclohexen-1-ol-2-methyl-5 (5,95%), caryophyllen oxid (3,68%)

methanoazulen-7-on-Tại Việt Nam các nghiên cứu về thành phần hóa học của củ gấu biển chỉ tập trung vào phần tinh dầu, gần như chưa có nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các chất trong thành phần

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của củ gấu Các nghiên cứu này cho thấy trong củ gấu có các lớp chất terpenoid, flavonoid, stilbenoid,

quinone… bên cạnh một số chất đã được phân lập từ các loài trong chi Cyperus L như: mustakone, α-cyperone β-selinene [5] có rất nhiều chất đã được phân lập từ loài Cyperus rotundus L Dưới đây là danh sách các chất đã được phân lập từ Cyperus rotundus L ( Bảng 1.1), [5]

Bảng 1.1 Danh sách các chất đã được phân lập từ Cyperus rotundus L

(oleanolic acid arabinoside)

 Các hợp chất monoterpenoid

 Các chất thuộc nhóm sesquiterpene

Có hơn 20 các chất thuộc nhóm sesquiterpene đã đƣợc phân lập từ Cyperus rotundus L bao gồm:

Ngoài ra còn có một số các hợp chất di- và triterpene:

 Các hợp chất stilbenoid

 Các hợp chất benzodihydrofuran

 Các hợp chất iridoid

 Các hợp chất phenylpropanoid

 Các dẫn xuất của hydroxycinnamic acid

 Các hợp chất phenolic acid

 Các hợp chất khác

Có khá nhiều tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của các chất trong cỏ gấu trên thế giới Tuy nhiên có rất ít nghiên cứu trên thế giới về phân lập và xác định cấu trúc của các chất trong cỏ gấu biển

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM

2.1.1 Nguyên liệu

Cỏ gấu biển ( hương phụ biển ) được thu hái tại Đà Nẵng, rửa sạch, phơi, sấy khô ở nhiệt độ 50-600C rồi xay thành bột mịn (Hình 2.1) để chiết lần lượt với các dung môi n–hexane, chloroform, ethyl acetate, ethanol và methanol

Dung môi dùng để chạy cột chính (n-hexane) được cất lại qua cột Vigereux trước khi sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm

Ngoài ra còn có các hóa chất khác dùng để làm khan, pha chế thuốc thử trong định tính các lớp chất và hiện màu bản mỏng

Sắc ký lớp mỏng (TLC): sử dụng bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck 60F254, có

độ dày 0.2 mm Sắc ký cột thường: silicagel cỡ hạt 197-400 mesh ( 0.040 – 0.063 mm)

Thiết bị cô quay chân không, tủ sấy, lò nung, cân phân tích (phòng thí nghiệm khoa Hoá, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng), máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS100 Perkin Elmer (Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – số 2 Ngô Quyền - Đà Nẵng) Máy đo sắc ký khí kết hợp khối phổ GC-MS (Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – số 2 Ngô Quyền -

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lí

Để xác định độ ẩm tiến hành sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ trong khoảng

950-1100C Tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu bột cỏ gấu khô và lấy kết quả trung bình Chuẩn bị các chén sứ có kí hiệu sẵn, các chén sứ được rửa sạch và được sấy khô trong tủ sấy, làm nguội đến nhiệt độ phòng, đem cân lại đến khối lượng không đổi m1

Mẫu bột cỏ gấu để xác định độ ẩm là mẫu đã qua xử lí Lấy vào mỗi chén sứ khoảng 3 g bột nguyên liệu (m2) theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ, sấy ở nhiệt độ trên, cứ sau 5 giờ lại lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân, đến khi khối lượng mẫu và cốc không đổi m3 Khối lượng ẩm của

mỗi mẫu là hiệu số giữa khối lượng mẫu trước và sau khi sấy m = (m1 + m2) – m3

Độ ẩm trung bình của các mẫu tính ra % theo khối lượng mẫu bột khô cỏ gấu ban đầu [1]

m

m m m

m2: Khối lượng mẫu bột khô cỏ gấu (g)

m3: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g)

W(%): Độ ẩm của mỗi mẫu

Wtb(%): Độ ẩm trung bình

Để xác định hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động vật, thực vật người ta dùng các phương pháp tro hóa mẫu

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp tro hóa mẫu bằng phương pháp khô – ướt kết hợp Các mẫu (khối lượng m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục được sử dụng để tro hóa Các mẫu đựng trong chén sứ được đun trên bếp điện, than hóa sơ bộ, sau đó cho vào lò nung và tiến hành tro hoá mẫu ở nhiệt độ 500-5500

C trong trong thời gian từ 4 - 6 tiếng, cho đến khi thu được tro trắng Các chất hữu cơ

bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi Khối lượng tro chính là phần chất còn lại sau khi nung [1]

Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng không đổi, có khối lượng m4

Công thức tính:

% tro = 4  1 100%

m m m

m4: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)

quang phổ hấp thụ nguyên tử

Tro thu được sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, định mức bằng nước cất và xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS [1]

Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành trong điều kiện như sau : Mẫu sau khi tro hoá được hoà tan bằng dung dịch HNO3 loãng và định mức đến 200 mL Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lượng một số kim loại tại Trung tâm

kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – số 2 Ngô Quyền - Đà Nẵng

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ, trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp chiết trích ly bằng các dung môi khác nhau:

Để thực hiện chiết trích ly với các dung môi khác nhau tôi thực hiện thu cao tổng methanol với một khối lượng nguyên liệu lớn bằng phương pháp chưng ninh

- Chiết chưng ninh với methanol: Cho m (gam) nguyên liệu bột cỏ gấu biển và V (mL) methanol vào một bình cầu có lắp sinh hàn hồi lưu Gia nhiệt hỗn hợp chiết trong một thời gian t (phút) Lọc nóng dịch chiết, sau đó làm bay hơi dung môi methanol thu được cao chiết m1 Bằng cách thay đổi các thông số nhiệt độ chiết, tỉ

lệ rắn lỏng và thời gian chiết ta tìm ra được các thông số thích hợp nhất để thu được lượng cao chiết methanol (m1) lớn nhất

- Chiết trích ly bằng các dung môi hữu cơ: Để chiết trích ly bằng các dung môi hữu

cơ đầu tiên tôi tạo dung dịch nước bằng cách cho 50 mL nước cất vào cao chiết methanol

- Thu cao chiết n-hexane: Cho 100 mL dung môi n-hexan vào dịch nước methanol, sau đó cho vào phễu chiết Lắc trộn phễu chiết nhiều lần, để yên phễu chiết cho hỗn hợp dịch chiết phân thành hai lớp Lấy phần dịch nước phía dưới vào cốc thủy tinh (dịch nước 1) và thu phần dịch chiết n-hexane phía trên Lặp lại thao tác này 3 lần,

gom dịch chiết n-hexane lại với nhau, làm khan bằng Na2SO4 và làm bay hơi dung môi n-hexane trên thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết n-hexane Cao chiết này được đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

- Thu cao chiết chloroform: Cho 100 mL dung môi chloroform vào dịch nước 1, sau

đó cho vào phễu chiết Lắc trộn phễu chiết nhiều lần, để yên phễu chiết cho hỗn hợp dịch chiết phân thành hai lớp Lấy phần dịch nước phía dưới vào cốc thủy tinh (dịch nước 2) và thu phần dịch chiết chloroform phía trên Lặp lại thao tác này 3 lần, gom dịch chiết chloroform lại với nhau, làm khan bằng Na2SO4 và làm bay hơi dung môi chloroform trên thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết chloroform Cao chiết này được đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

- Thu cao chiết ethyl acetate: Cho 100 mL dung môi ethyl acetate vào dịch nước 2, sau đó cho vào phễu chiết Lắc trộn phễu chiết nhiều lần, để yên phễu chiết cho hỗn hợp dịch chiết phân thành hai lớp Lấy phần dịch nước phía dưới vào cốc thủy tinh (dịch nước 3) và thu phần dịch chiết ethyl acetate phía trên Lặp lại thao tác này 3 lần, gom dịch chiết ethyl acetate lại với nhau, làm khan bằng Na2SO4 và làm bay hơi dung môi ethyl acetate trên thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết ethyl acetate Cao chiết này được đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

- Thu cao chiết ethanol: Cho 100 mL dung môi ethanol vào dịch nước 3, sau đó cho vào phễu chiết Lắc trộn phễu chiết nhiều lần, để yên phễu chiết cho hỗn hợp dịch chiết phân thành hai lớp Lấy phần dịch nước phía dưới vào cốc thủy tinh (dịch nước 4) và thu phần dịch chiết ethanol phía trên Lặp lại thao tác này 3 lần, gom dịch chiết ethanol lại với nhau, làm khan bằng Na2SO4 và làm bay hơi dung môi ethanol trên thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết ethanol Cao chiết này được đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

- Thu cao chiết methanol: Cho 100 mL dung môi methanol vào dịch nước 4, sau đó cho vào phễu chiết Lắc trộn phễu chiết nhiều lần, để yên phễu chiết cho hỗn hợp dịch chiết phân thành hai lớp Lấy phần dịch nước phía dưới vào cốc thủy tinh (dịch nước 5) và thu phần dịch chiết methanol phía trên Lặp lại thao tác này 3 lần, gom dịch chiết methanol lại với nhau, làm khan bằng Na2SO4 và làm bay hơi dung môi methanol trên thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết methanol Cao chiết này được đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

2.2.3 Phương pháp định danh thành phần hóa học của các cao chiết

Trong phạm vi đề tài này, thành phần hóa học của các cao chiết n–hexane, chloroform, ethyl acetate, ethanol và methanol từ củ gấu biển được đem đi định

danh bằng phương pháp GC –MS

Sử dụng thiết bị sắc ký khí ghép nối khối phổ GC-MS Agilent 7890A/5975C

để định danh thành phần hóa học của các cao chiết Cột tách mao quản HP - 5MS ( 5% Phenyl Methyl Silox): 30 m x 250 μm x 0,25 μm, nhiệt độ bắt đầu tại 70oC, tăng

20oC/phút đến 160oC, sau đó tăng 1oC/phút đến 180oC, tiếp tục tăng 3oC/phút đến

290oC kết thúc quá trình Nhiệt độ injector 300oC; nhiệt độ detector 280oC, khí mang He (20 mL/phút sau 2 phút ); áp suất : 8.1225 psi; thể tích bơm mẫu 1 μL, tỉ

lệ chia dòng 10:1, tốc độ dòng chia 9.4248 mL/phút Các thông số vận hành khối phổ (MS) là điện thế ion hóa 70 eV; nhiệt độ nguồn ion 230oC, khoảng khối lượng m/z 30-600

1 thời gian (có thể từ 5-10h) đến khi cột hấp phụ đã hoàn toàn ổn định

- Đưa mẫu vào cột:

+ Yêu cầu của việc đưa chất thử vào cột là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng

+ Trộn đều một lượng bột silicagel với dung dịch cắn toàn phần, để dung môi bay hơi rồi đưa mẫu lên cột, rãi thành một lớp đều đặn trên mặt chất hấp phụ

+ Hòa chất thử với một lượng vừa đủ dung môi Dùng pipet hút hết dung dịch thử cho nhẹ lên bề mặt chất hấp phụ Mở vòi cho dung dịch ngấm hết vào cột, dùng pipet hút lấy 1 ít dung môi rửa thành cột và cũng cho ngấm hết vào cột

- Rửa giải: Cho hệ dung môi rửa giải vào 1 bình cầu cổ nhỏ có van, rồi úp ngược lên cột sắc kí Kiểm soát tốc độ dòng chảy bằng cách đóng mở van có độ rộng thích hợp Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm Sau đó, kiểm tra các phân đoạn thu được bằng TLC, các phân đoạn cho sắc ký đồ giống nhau thì gộp thành một phân đoạn

- Tinh chế các chất phân lập: Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi ít hòa tan chất phân lập

- Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập: Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng TLC và được triển khai với nhiều hệ dung môi khác nhau

Hình 2.2 Cột sắc ký

 Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bảng

mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức) Các vết chất được phát hiện bằng cách dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên

bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi xuất hiện màu

2.2.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

Cấu trúc của hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT–IR), phổ khối (ESI-MS, HR- ESI- MS), phổ

tử ngoại (UV-Vis), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều như 1H–NMR, 13C–NMR, DEPT và hai chiều như HSQC, HMBC, COSY, NOESY [12], [19]

Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi sử dụng phổ hồng ngoại (FT–IR), phổ tử ngoại (UV-Vis) kết hợp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1H–NMR, 13C–NMR

2.3 SƠ ĐỒ CHIẾT TÁCH, ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Các quá trình thực nghiệm đƣợc mô tả theo Hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ chiết tách, định danh thành phần hóa học

Bay hơi dung môi

Bay hơi dung môi

Chiết trích ly với methanol Chiết trích ly với ethanol

Chiết trích ly với chloroform Chiết trích ly với ethyl acetate

Chiết trích ly với n-hexan

Cao ( H ) n- hexane

Cao ( C ) chloroform

Cao ( M ) methanol

Cao ( E ) ethanol

Cao ( A ) ethyl acetate

Độ ẩm Xác định các chỉ tiêu hóa lí

Tro

Kim loại nặng

Bay hơi dung môi