LUẬN văn THẠC sĩ CÔNG NGHỆ SINH học (FULL) nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi streptomyces phân lập tại thái nguyên và định hướng ứng dụng

Chính vì vậy, việc sửdụng các loại VSV đối kháng, các chất sinh họcdiệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau củacây trồng đã và đang là đích mà các nhà khoa họchướng đến, và xạ khuẩn s

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các kí hiệu, viết tắt vi

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình vẽ viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN 3

1.1.1 rí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

1.1.2 ặc điểm sinh học của xạ khuẩn 4

1.1.3 ặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 6

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN 7

1.2.1 Phương pháp phân loại truyền thống 7

1.2.2 Phương pháp phân loại dựa vào chỉ thị phân tử gene 16S rRNA 9

1.3 SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 12

1.3.1 Cơ chế sinh tổng hợp các chất kháng sinh 12

1.3.2 yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 13

1.3.3 chiết chất kháng sinh 15

1.4 XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 16

1.4.1 ấm là nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh hại cây trồng 16

1.4.2 khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật 17

1.5 XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG 19

iii

1.5.1 ển chọn xạ khuẩn sinh enzyme 19

1.5.2 số enzyme chủ yếu ứng dụng trong bảo vệ môi trường 20

Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 sinh vật kiểm định 23

2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ MÔI TRƯỜNG 23

2.2.1 Hóa chất 23

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 24

2.2.3 trường nghiên cứu 24

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 26

2.3.2 Phương pháp đếm số lượng tế bào 26

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 27

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 28

2.3.5 Phương pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme 28

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 28

2.3.7 Phương pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA 30

2.3.8 Nghiên cứu bước đầu quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh 33

2.3.9 Phương pháp tách chiết chất kháng sinh 33

2.3.10 Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt 34

2.3.11 Phương pháp xử lý số liệu 34

Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 SỰ PHÂN BỐ VÀ TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN 35

3.1.1 phân bố của xạ khuẩn trong đất 35

3.1.2 đa dạng sinh học của xạ khuẩn 36

3 2 Hoạt tính kháng sinh và chọn lọc chủng xạ khuẩn có HTKS cao 37

3.2.1 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập 37

3.2.2 ển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao 41

3.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI 2 CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 44

3.3.1 Đặc điểm hình thái 2 chủng xạ khuẩn HT 17.8 và HT19.1 44

3.3.2 ểm nuôi cấy 45

3.3.3 ểm sinh lý, sinh hóa 46

3.3.4 Phân loại 2 chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT19.1 51

3.4 NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẤT KHÁNG SINH CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 59

3.4.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh 59

3.4.2 chiết và xác định một số tính chất của chất kháng sinh chủng HT17.8.62 3.5 TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH ENZYME 64

3.5.1 Hoạt tính enzyme của xạ khuẩn 64

3.5.2 Khả năng chịu nhiệt của enzyme 66

3.6 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CKS TRONG DỊCH NUÔI CẤY CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 TỚI KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT 68

KẾT LUẬN 71

KIẾN NGHỊ 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

và gây ô nhiễm môi trường Chính vì vậy, việc sửdụng các loại VSV đối kháng, các chất sinh họcdiệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau củacây trồng đã và đang là đích mà các nhà khoa họchướng đến, và xạ khuẩn sinh kháng sinh là đốitượng trung tâm trong cuộc tìm kiếm này [22].

Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ(Prokaryote) với số lượng loài lớn và phân bố ởnhiều vùng sinh thái khác nhau Chúng ngày càngđược biết đến rộng rãi với nhiều ứng dụng thực

tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổithứ cấp có giá trị sử dụng cao như CKS, chấtchống ung thư, chất kích thích sinh trưởng vànhiều hợp chất y dược khác Thêm vào đó, XKcòn khả năng sinh các enzyme ngoại bào nênđược sử dụng rộng rãi làm các chế phẩm sinh học

tỉnh rất giàu tiềm năng về

nông, lâm nghiệp nên có

trung Điển hình là khu

vực núi Pháo thuộc xã Hà

Thượng, huyện Đại Từ và

khu vực thị trấn Trại Cau

hưởng của hoạt động

khai khoáng tới sự phát triển và đa dạng của các

hệ động, thực vật nhưng lại chưa có

nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động này tới sự phân bố và các hoạt tính sinh học đến hệ VSV đất tại những khu vực này.

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đặt ra như trên, cũng như để góp phần khai thácnguồn VSV vô cùng phong phú của Thái Nguyên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện

đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces phân lập tại Thái Nguyên và định hướng ứng dụng”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát sự phân bố, đặc điểm hình thái của XK trong các mẫu đất thu tạicác địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các chủng XK phân lập được để từ đó cóthể tuyển chọn ra một số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế, đặc biệt

là trong công tác bảo vệ thực vật và môi trường

3 Nội dung nghiên cứu

- Lấy mẫu, phân lập và thuần khiết XK từ các mẫu đất

- Kiểm tra HTKS của các chủng đã phân lập được với các VSV kiểm định đểtuyển chọn ra các chủng có HTKS cao

- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa và phân loạimột số chủng XK có hoạt tính kháng nấm đã được tuyển chọn

- Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKS của các chủng XK lựa chọn

- Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào và nghiên cứu tuyển chọn ra một sốchủng có hoạt tính enzyme cao, có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN

1.1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn G (+) và XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ (Prokaryota).

Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ

Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và khoảng hơn 1.000 loài.

Trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại

được xếp vào nhóm XK hiếm [58], [5]

Tên xạ khuẩn – Actinomycetes – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và

“mykes” (nấm) và ban đầu XK được coi là vi nấm vì chúng sinh trưởng giống với

nấm Tuy nhiên, đến nay, XK đã được chứng minh là thuộc nhóm vi khuẩn G(+), có

tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA [60]

Xạ khuẩn là một nhóm VSV rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí,hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nước, không khí, xác thực vật Nhưng chủyếu XK phân bố nhiều ở trong đất Số lượng XK trong đất không chỉ phụ thuộcvào thành phần, tính chất của đất mà còn phụ thuộc vào độ ẩm, mức độ canh tác

và khả năng che phủ của thảm thực vật Xạ khuẩn phân bố nhiều hơn ở trong lớpđất đất tơi, xốp, có độ ẩm thích hợp, giàu chất hữu cơ và chất khoáng Số lượng

XK có thể đạt tới 9.800.000 – 80.000.000 CFU trong 1 gam đất [33]

Sự phân bố của XK trong đất còn phụ thuộc nhiều vào pH của đất Xạkhuẩn phân bố nhiều trong các loại đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu, có

pH khoảng 6,8 – 7,5 Trong các lớp đất kiềm hay axit ít gặp XK và càng hiếm gặphơn trong các lớp đất có độ kiềm mạnh Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30ºC và

pH trung tính là điều kiện tối ưu cho XK phát triển Mặc dù vậy, nhiều loài XK đã

được phân lập ở các môi trường khắc nghiệt ví dụ như loài Arthrobacter ardleyensis

ưa lạnh được phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [27] và

loài Nocardiopis alkaliphila được phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH

9,5 - 10 [32]

Xạ khuẩn là nhóm VSV đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên Chúngtham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp

trong đất mà nhiều VSV khác không hấp thu được Các XK chi Streptomyces đặc

biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơbằng các enzyme ngoại bào Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phânhủy như axit humic trong đất [5] Nhiều chủng XK có khả năng hòa tan lignin bằngcách sinh các enzyme thủy phân cellulase, hemicellulase ngoại bào có ý nghĩa quantrọng đối với công nghiệp và bảo vệ môi trường Thực tế, mùi mốc đặc trưng củanhiều loại đất liên quan đến sự sản sinh hợp chất hữu cơ dễ bay hơi có tên làgeosmin [57], [25], [44]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Đặc điểm nổi bật của XK là có hệ khuẩn ty (mycelium) phát triển, phân nhánh

và không có vách ngăn Đường kính của khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2 µm– 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm Kích thước và khối lượng khuẩn ty thường không ổn định và phụ thuộc vào từng loại điều kiện nuôi cấy

Theo ISP, màu sắc KTKS của các chủng XK được chia thành 8 nhóm màu:White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhómvàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, vànhóm màu không xác định (X) [5], [40]

Khi nuôi cấy trong môi trường dịch thể, XK tạo thành dạng bông, khi già tạothành kết tủa lắng xuống đáy, phần kết tủa này bao gồm các hạt liti, đó là sản phẩmphân hủy của màng nguyên sinh chất và vách tế bào [19]

Khi nuôi cấy trên môi trường đặc khuẩn ty của XK phát triển thành 2 loại.Một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất -substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề

mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năngchủ yếu là

sinh sản [41] Nhiều loại XK, các KTKS phát triển theo hình phóng xạ, tạo thànhnhiều vòng tròn đồng tâm Bản chất của hiện tượng này vẫn chưa được giải thíchmột cách thỏa đáng [19].

Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của KTKS sẽ xuất hiện các cuống sinhbào tử – là cơ quan sinh sản đặc trưng của XK Trên mỗi CSBT mang từ 30 ÷ 100bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử, nhưng cũng có khi chỉ mang một bào tửhoặc hai bào tử CSBT là một trong những đặc điểm rất quan trọng để phân loại

XK Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, đặc điểm này không được ổn định mà vẫn

có thể thay đổi theo môi trường nuôi cấy

Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình trụ, hình ovan, hình

cầu, hình que với kích thước trung bình khoảng 0,7 ÷ 0,9 × 0,7 ÷ 1,9 µm Bề mặtbào tử XK có thể nhẵn (Sm - Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty),nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair like Nhìn chung, trong cùng mộtloài, hình dạng bào tử XK tương đối ổn định, vì vậy có thể xem đây là một trongnhững đặc điểm quan trọng để phân loại XK [47]

Hình thái của khuẩn lạc XK rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng

có thể thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi Khuẩn lạc thường cóđường kính 0,5 ÷ 2 mm, nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính đạt tới 1 cm hoặclớn hơn nữa Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, không trơn ướt hay trong suốt như của

vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thô ráp, xù xì, có dạng vôi với nhiềumàu sắc khác nhau và có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ

1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

XK thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ,lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, sử dụng muốinitrat, muối amôn, urê, pepton để làm nguồn nitơ Tuy nhiên khả năng hấp thụ cácchất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau

Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ấm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thíchhợp cho sự sinh trưởng là 25 - 300C Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp

CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 280C Độ ẩm thích hợp đối với XK dao động trong khoảng 40 - 50%, pH thích hợp trong khoảng 6,8 - 7,5 [9], [3], [10].

Xạ khuẩn có hệ enzyme vô cùng phong phú Chúng có khả năng phân hủy và

sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như axit humic trong đất đến các hợp chấthữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, các pectin, cellulose… chứng tỏ rằng XKphải có khả năng sinh những hệ enzyme tương ứng Điều đó cho phép mở ra khảnăng tìm kiếm và chọn lựa những phức hệ enzyme cần thiết phục vụ cho các nhucầu công nghệ khác nhau, đặc biệt là các nhóm enzyme không thể khai thác được từnguồn động vật và thực vật

Ngoài ra, XK được đặc biệt quan tâm là do khả năng sinh ra các hợp chất thứsinh có giá trị ứng dụng cao Trong các hợp chất tự nhiên do VSV sinh ra đã đượccông bố sử dụng trên toàn thế giới thì 45% được sinh ra từ XK, 38% từ nấm và 17%

từ vi khuẩn đơn bào [48]

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có khoảng 60 – 70% XK phân lập từ đất cókhả năng sinh CKS Trong số 8.000 CKS đã được biết thì có tới hơn 80% là có

nguồn gốc từ XK mà phần lớn là XK thuộc chi Streptomyces [39] Một số hợp

chất của XK đã được công bố như: aminoglycoside, anthracyclin, glycopeptide, lactam, macrolides, nucleoside, polyene, polyeste, actinomycin, tetracycline Cáchợp chất này đã được sử dụng thành công làm thuốc diệt cỏ, thuốc chống ung thư,các chất điều hòa miễn dịch, các chất chống ký sinh trùng [18], [42]

β-Ngoài ra, trong quá trình sống, XK còn sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chấtquan trọng như một số vitamin nhóm B, một số axit hữu cơ như các axit lactic,axit axetic, axit sucxinic… các axit amin như axit glutamic, metionin, alanin,valin chất kích thích sinh trưởng và sắc tố melanin [52]

Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như CKS, độc tố, enzyme… có thểđược tích lũy trong sinh khối tế bào hay được tiết ra môi trường nuôi cấy KTCC cóthể tiết vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen…

có sắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [5], [53]

1.1.3 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Trong số hơn 1.000 loài XK đã được mô tả thì có tới 478 loài thuộc chi

Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được xếp vào nhóm XK hiếm.

XK hiếm chia thành hơn 50 chi khác nhau và gồm nhiều loài chưa công bố Chúngthường sinh trưởng chậm, tạo thành khuẩn lạc nhỏ, thường khó bảo quản và nuôicấy trong môi trường nhân tạo Thêm vào đó, mật độ XK hiếm trong tự nhiên ít

hơn nhiều so với chi Streptomyces và phải sử dụng các phương pháp phân lập đặc

hiệu nên thường ít được quan tâm nghiên cứu hơn [47] Trong khi đó, XK thuộc chi

Streptomyces lại rất thuận tiện cho việc tìm kiếm và sàng lọc CKS Chúng đặc biệt

nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằngcác enzyme ngoại bào

Streptomyces là chi XK bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm

1943, có số lượng loài được mô tả nhiều nhất Các đại diện của chi này có hệ KTKS

và hệ KTCC rất phát triển và phân nhánh Để phân loại chi Streptomyces đến loài,

các nhà phân loại đã phải sử dụng nhiều khoá phân loại khác nhau như:Craxilnhicôp (1970), Gause và cộng sự (1983), Bergey (1989)

Các XK chi Streptomyces (loài chuẩn Streptomyces albus) có cấu tạo giống

vi khuẩn G (+), tỷ lệ G + C trong DNA là 69 – 78% Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là

25 - 35 oC, pH tối ưu là 6,5 - 8,0 Chúng có KTCC phân nhánh nhiều lần, ít khi đứtđoạn, đường kính 0,5-2,0 μm.m KTKS ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đếnnhiều bào tử Các khuẩn lạc ban đầu thường trơn nhẵn nhưng sau đó KTKS sẽ pháttriển rất mạnh mẽ tạo khuẩn lạc gồ ghề, thô ráp Chúng sinh nhiều loại sắc tố khácnhau và có khả năng khuếch tán ra môi trường [56], [60]

Chi Streptomyces được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh kháng sinh của

chúng và thường được gọi là “các nhà máy sản xuất kháng sinh” Rất nhiều chủng

sản sinh ra một hoặc nhiều loại CKS CKS do XK nói chung và từ Streptomyces nói

riêng thường có hoạt phổ rộng, có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn và đặc biệtmột số loại kháng sinh được sử dụng trong điều trị bệnh ung thư [3]

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN

1.2.1 Phương pháp phân loại truyền thống

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hiện nay, có nhiều khóa phân loại khác nhau được đưa ra nhằm mục đíchphân loại XK tới chi và loài, như các khóa phân loại của Waksman (1916, 1919,1961), của Craxilnhicop (1949, 1970), của Flaig - Kutzner (1954, 1960), của Gause(1957), Pridham (1972), Bergey (1989), Goodfellow (2000)… [53] Đồng thời đểthống nhất trong cách mô tả XK, chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) đã đưa ra cácphương pháp chung và môi trường chuẩn để phân loại nhóm VSV này Đánh giácủa ISP dựa trên các đặc điểm về hình thái, đặc điểm nuôi cấy, các đặc điểm sinh lý,sinh hóa của XK trên các môi trường từ ISP1 đến ISP9 [47]

Ngày nay, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của một số ngành như: sinh học phân

tử, hóa sinh học, lý sinh học… những kiến thức về phân loại học XK đã có nhiềuthay đổi Do số lượng các loài XK mới được mô tả ngày càng nhiều nên để cho việcphân loại được nhanh và chính xác tới mức độ phân tử, ngoài các phương phápphân loại truyền thống, người ta còn sử dụng kết hợp với các phương pháp phânloại bằng sinh học phân tử

 Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là những chỉ tiêu quan trọng được sửdụng trong phân loại XK Hầu hết các chi XK được mô tả hiện nay được phân loạitheo các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy như: màu sắc của hệ KTKS,KTCC, màu sắc của sắc tố hòa tan, hình dạng và kết cấu bề mặt của bào tử, hìnhdạng của CSBT, sự phân đốt của khuẩn ty

Tuy nhiên, cũng như các VSV khác, XK rất không bền vững về mặt di truyền,thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA Trong cùng một loài có thểbiểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau vềhình thái Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêmcác chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch hay sinhhọc phân tử

 Phân loại theo đặc điểm hóa phân loại

Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và địnhlượng thành phần hóa học của tế bào VSV Trong đó việc phân tích cấu trúc mạch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

tetrapeptide của peptydoglycan được xem là tiêu chuẩn hóa phân loại thiết yếu nhấtcho nhóm vi khuẩn G (+), trong đó có XK Các đồng phân của diaminopimelic(DAP) trong thành phần peptydoglycan là một trong những axit amin có ý nghĩaquan trọng trong phương pháp phân loại này

 Phân loại theo đặc điểm sinh lý – sinh hóa:

Người ta có thể nuôi cấy các chủng XK cần định loại trên các môi trườngdinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định để nghiên cứucác đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa thườngđược sử dụng như: khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, khả năng phânhủy các cơ chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme, nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt

độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, tính chất đốikháng và nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổichất đặc trưng khác của XK… [19]

Tuy nhiên, phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy

dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại Do vậy, ngày nay những nguyêntắc trong việc sử dụng các đặc điểm sinh lý – sinh hóa để phân loại XK cũng có sựthay đổi [17]

Tóm lại, có nhiều phương pháp truyền thống khác nhau được sử dụng trongnghiên cứu phân loại VSV nói chung và XK nói riêng nhưng không có phươngpháp nào tỏ ra vạn năng, thích hợp cho mọi đối tượng VSV Vì vậy, để đảm bảotính chính xác cần phải kết hợp đồng thời nhiều phương pháp khác nhau, trong đóđặc biệt quan tâm tới các phương pháp phân loại hiện đại khi phân loại VSV

1.2.2 Phương pháp phân loại dựa vào chỉ thị phân tử gene 16S rRNA

Trong một số trường hợp, phương pháp phân loại truyền thống gặp trở ngại

do một số các đặc tính dùng cho nhóm VSV này nhưng lại không có ý nghĩa vớinhóm VSV khác Điều này dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loạicủa một số VSV Mặt khác, đối với những loài có độ tương đồng cao về mặt hìnhthái thì phương pháp phân loại truyền thống sẽ khó có thể đạt được hiệu quả Nhược

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

điểm này của phân loại truyền thống hoàn toàn có thể bổ sung nhờ phân loại họcphân tử Ngày nay, phần lớn các nhà khoa học đều thống nhất rằng, phân loại họcphải dựa vào rất nhiều tiêu chí phân loại kết hợp cả phương pháp phân loại truyềnthống và phương pháp phân loại hiện đại, trong đó nhấn mạnh vai trò của phươngpháp phân loại bằng sinh học phân tử [25] Hiện nay, đại đa số các nhà khoa họcđồng ý với quan niệm 2 chủng được coi là 2 loài riêng biệt nếu chúng giống nhaudưới 70% khi tiến hành lai DNA Keswani và cộng sự (2001) đã chứng minh rằngnếu sự tương đồng giữa hai trình tự rRNA 16S thấp hơn 98.6% thì xác suất để mức

độ giống nhau trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tươngđồng 98.6% của trình tự rRNA 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khácnhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [36]

Trong những năm gần đây, với sự ra đời của nhiều kỹ thuật sinh học phân tử,

đã giúp việc phân loại các VSV trở nên dễ dàng và có tính chính xác cao hơn Ngàynay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xácđịnh mối quan hệ trên cây tiến hóa của các VSV Phân tử rRNA là thành phần cấutạo nên các tiểu phần ribosome có mặt ở tất cả các loại VSV, có chức năng xác định

và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm VSV.Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinhchủng loại và phân loại các chủng VSV

Khác với các VSV nhân chuẩn (eukaryotes), ribosome chứa 4 loại phân tửrRNA là: 5S, 5,8S, 28S và 18S Đối với các VSV nhân sơ (prokaryotes), ribosomechỉ chứa 3 loại phân tử rRNA là: 5S, 16S, 23S Trong đó, gene 16S rRNA mã hóacho phân tử rRNA loại 16S được xem là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phânloại các VSV nhân sơ, bao gồm cả XK Gene mã hóa cho 5S rRNA có kích thướckhoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệtmột cách chi tiết giữa các chủng Ngược lại, gene mã hóa cho 23S rRNA lại có kíchthước lớn, khoảng 3.000 nucleotide, do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và

so sánh trình tự Chỉ có gene 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa

đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng và cũng không gây khó khăn trong nghiêncứu nên được ưu tiên lựa chọn trong phân loại prokaryotes Thêm vào đó, trên gene

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

16S rRNA có chứa các vùng biến đổi (variable) và vùng bán bảo tồn (semi conserved) cho phép xác định tính đặc trưng ở mức độ chủng, loài [27] Do vậy,gene 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và đã thiết lập đượcrất nhiều cặp mồi để nhân đoạn gene này bằng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợilớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên các gene mã hóa 16S rRNA Ngoài ra,người ta còn sử dụng vùng đệm giữa gene 16S rRNA và 23S rRNA để nghiên cứu

-đa dạng của prokaryotes [34], [37]

Theo Ludwing và Schleifer (2000) đã có tới 16.000 gene 16S rRNA từ cácchủng VSV được giải trình tự nucleotide Vì vậy, khi phân lập được chủng mới,bằng việc so sánh trình tự gene 16S rRNA của có thể cho chúng ta biết nó thuộcloài nào, có họ hàng như thế nào và vị trí phân loại của nó [44]

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu áp dụng cách phân loại này để địnhtên các chủng VSV như: Kataoka và cộng sự (1997) đã ứng dụng vùng bất biến củagene 16S rRNA tạo ra một chỉ thị so sánh để định loại các loài trong chi

Streptomyces [35] Takeuchi và cộng sự (1996) đã phân tích sự phát sinh loài của 12

chủng XK thuộc chi Streptomyces gây bệnh nấm vẩy ở khoai tây dựa trên 16 trình

tự 16S rRNA [48]

Ở Việt Nam cũng có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng trình tự gene 16SrRNA để định tên VSV, nhất là các loài có khả năng sản sinh ra các chất có hoạt tínhsinh học như XK Dựa vào trình tự gene 16S rRNA, Đỗ Thu Hà và cộng sự (2001) đã

định loại chủng XK Streptomyces ĐN – 05 sinh CKS có hoạt phổ rộng phân lập từ

đất Quảng Nam – Đà Nẵng [9] Bùi Thị Việt Hà và cộng sự (2006) đã tiến hành xácđịnh các đặc điểm hình thái, sinh lý - sinh hóa kết hợp với việc phân tích trình tự

gene 16S rRNA định tên được 3 chủng XK: Streptomyces antimycoticus T-41,

Streptomyces diastatochromogenes D-42 và Streptomyces hygroscopicus TC-54 đều

có phổ kháng sinh rộng, có khả năng sinh CKS chống vi khuẩn G(+), vi khuẩn G(-)

và nấm gây bệnh thực vật [10] Nghiên cứu về một số hoạt chất có khả năng khángVSV và kháng dòng tế bào ung thư từ XK, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên và cộng sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

(2011) đã phân loại được 5 chủng XK hiếm đều thuộc chi Nonomuraea [18] Trên cơ

sở kết hợp phương pháp phân loại truyền thống và phương pháp phân loại dựa vàotrình tự gene 16S rRNA, Vi Thị Đoan Chính và cộng sự (2011) đã định tên được

chủng XK Streptomyces kurssanovii K4 phân lập ở Thái Nguyên có khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn Staphylococcucs aureus và Pseudomonas aeruginosa

gây nhiễm trùng bệnh viện [3]

1.3 SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN

1.3.1 Cơ chế sinh tổng hợp các chất kháng sinh

1.3.1.1 Con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh

Chất kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp của VSV Chúng không cóchức năng rõ ràng trong sự trao đổi chất của tế bào, nghĩa là tế bào vẫn có thể tồntại và phát triển bình thường khi không có hợp chất này Mặc dù các CKS có cấutrúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng rất đa dạng, nhưng quá trình sinh tổnghợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định Các con đường này cũng chỉ là sựcải biến các con đường sinh tổng hợp của tế bào dưới sự tham gia của các enzymehoặc hệ thống enzyme đặc biệt Vì vậy, chỉ cần tác động làm thay đổi đường hướngtrao đổi chất là có thể cho hàng loạt các sản phẩm khác nhau Các vật liệu ban đầucủa quá trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp cũng chính là những sản phẩm traođổi sơ cấp Demain đã mô tả con đường sinh tổng hợp CKS từ VSV có thể thựchiện theo 3 con đường [28]:

- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như:chloramphenicol, các CKS nhóm nucleoside

- CKS được tổng hợp từ 2 hoặc 3 chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau như:lincomixin, novobioxin

- CKS được tổng hợp bằng cách polime hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau

đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác Thuộc con đường này có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nhiều loại kháng sinh đã được tổng hợp

1.3.1.2 .2 Di truyền học của sự hình thành chất kháng sinh

Các gene mã hóa cho các enzyme đặc biệt trong sinh tổng hợp CKS thườngnằm trên nhiễm sắc thể, hoặc một số trường hợp trên plasmid như: gene mã hóa cho

sinh tổng hợp chloramphenicol ở Streptomyces venezuelae nằm trên plasmid, trong

khi đó gene mã hóa cho sinh tổng hợp tetracycline lại nằm trên nhiễm sắc thể

Sinh tổng hợp CKS còn phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene Không chỉgồm những gene chịu trách nhiệm trực tiếp tổng hợp CKS từ những đơn vị cơ bản,

mà cả những gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, coenzyme, cofactorcũng như các gene phụ trách sản sinh năng lượng cho quá trình tổng hợp Ước tính

số lượng gene có liên quan đế sinh tổng hợp chlotetracyclin lên tới hàng trăm gene.Điều đó cũng giải thích vì sao so với các chất trao đổi bậc một, tổng hợp CKS phụthuộc nhiều hơn vào các điều kiện sinh lý như: thành phần môi trường, pH, nhiệt

độ, nồng độ ion, nồng độ phosphate vô cơ, độ thông khí, thế oxy hóa khử [51].Trong nghiên cứu sản xuất CKS, ngoài việc tìm kiếm ra các CKS mới phảiđồng thời với việc nghiên cứu nâng cao HTKS của các chủng Các chủng hoangdại thường có hoạt tính thấp, để đưa vào sản xuất cần phải tiến hành chọn lọcchủng, sử dụng các biện pháp gây đột biến, các kỹ thuật di truyền hiện đại để chủđộng tạo ra được các chủng giống tốt Điều quan trọng là các chủng mới đượctuyển chọn phải đảm bảo cho hiệu suất kháng sinh cao, an toàn và có hiệu quả vềmặt kinh tế

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

1.3.2.1 Thành phần môi trường lên men

Thực tế cho thấy, thành phần môi trường lên men có vai trò rất quan trọng,không chỉ ảnh hưởng đến số lượng mà còn ảnh hưởng đến cả chất lượng của CKS tạothành Vì vậy thành phần môi trường lên men thích hợp cho việc sinh tổng hợp cácCKS khác nhau cũng sẽ khác nhau

* Nguồn cacbon: Các chủng XK có khả năng đồng hóa được nhiềunguồn cacbon khác nhau Nhìn chung, nguồn thức ăn cacbon thường được sử

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

dụng làm môi trường lên men rất đa dạng bao gồm: các loại bột và hạt ngũ cốc,cám mỳ, cám gạo, các loại đường đơn, đường đôi, dịch thủy phân gỗ… Thôngthường glucose là nguồn thức ăn cacbon tốt cho sự sinh trưởng của nhiều chủng

XK nhưng các oligosaccharide và polysaccharide lại thích hợp hơn cho sinhtổng hợp CKS Trong lên men CKS, nhiều trường hợp dư thừa glucose trongmôi trường sẽ ức chế quá trình này

Một số nghiên cứu đã chứng minh chủng Streptomyces parvulus ATCC

12434 có khả năng sinh enzyme kynureninase (l-kynurenine hydrolase, EC 3.7.1.3)khi có sự cảm ứng của tryptophan trong môi trường Đây là enzyme đóng vai tròquan trọng trong hệ thống sinh tổng hợp CKS actinomycin Tuy nhiên, khi môitrường dư thừa lượng glucose cần thiết sẽ dẫn tới ức chế tổng hợp enzyme này [50]

* Nguồn nitơ: Nitơ là thành phần dinh dưỡng không thể thiếu được trongquá trình sinh trưởng và tổng hợp CKS của XK Nguồn thức ăn nitơ thường được

sử dụng làm môi trường lên men kháng sinh có thể là bột đậu tương, nước chiếtngô, cao nấm men, pepton, các muối nitrat, muối amôn… Trong một số trườnghợp, quá trình tổng hợp CKS lại đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trongmôi trường

* Nguồn photpho vô cơ: Photpho là yếu tố tham gia điều chỉnh sinh tổnghợp CKS Nồng độ photpho cao sẽ làm tăng tổng hợp axit nucleic trong tế bào, rútngắn pha tổng hợp và kéo dài pha dinh dưỡng hoặc ức chế tổng hợp enzyme

* Các nguyên tố vi lượng: Là một trong các thành phần không thể thiếuđược trong môi trường lên men, góp phần thay đổi đáng kể khả năng tổng hợpCKS của nhiều chủng XK [13]

1.3.2.2 Điều kiện nuôi cấy

Cùng với thành phần môi trường lên men, điều kiện nuôi cấy cũng có ảnhhưởng rất lớn đến quá trình tổng hợp CKS của XK Vì vậy, trong lên men CKS,người ta thường tập trung khai thác hiệu quả tác động của các yếu tố trong môitrường như: nhiệt độ, pH, nồng độ oxy, thế oxy hóa khử, cường độ sục khí… đểnhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp CKS [17]

Khi tiến hành tách chiết CKS từ dịch lọc, cần lưu ý là pH của dịch nuôi cấy

có ảnh hưởng lớn đến việc CKS đi ra môi trường nhiều hay tích tụ trong sinh khối

nhiều Ví dụ, nếu pH của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces rimosus thấp, kháng

sinh oxytetracyclin đi ra môi trường nhiều, ngược lại nếu pH kiềm thì kháng sinh lạitích tụ trong sinh khối nhiều hơn [14] Đối với các dịch lên men có độ nhớt caothường gây khó khăn cho quá trình lọc, vì vậy để khắc phục, người ta thường bổsung một số chất trợ lọc giúp cho quá trình lọc diễn ra tốt hơn

Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối

Trước khi tách chiết, cần phải rửa sinh khối bằng nước để loại bỏ các thànhphần của môi trường Chiết rút là phương pháp thích hợp nhất để tách chiết CKS rakhỏi sinh khối tế bào Hiệu quả tách chiết phụ thuộc vào khả năng hoà tan của CKStrong dung môi chiết Các dung môi hữu cơ dùng để tách chiết CKS có thể là:butanol, metanol, etyl axetat, axeton… [3], [10]

Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc

Trước khi tiến hành chiết rút kháng sinh ra khỏi môi trường nuôi cấy, cần phảiloại sinh khối tế bào ra khỏi dịch nuôi bằng phương pháp lọc hay ly tâm Phươngpháp ly tâm không những loại được sinh khối mà còn loại bỏ được các chất không

có lợi ra khỏi dịch nuôi cấy Tốc độ ly tâm được sử dụng với mục đích này thường

là 15.000 vòng/phút [10]

Các CKS có trọng lượng phân tử thấp thường hoà tan trong nước và trongdung môi hữu cơ Để tách chiết có hiệu quả cần phải lựa chọn các loại dung môi cókhả năng hoà tan CKS [1]

Chất kháng sinh thô nhận được từ dịch lọc hay sinh khối được làm sạch bằngcách cô đặc và loại bỏ tạp chất Điểm đáng chú ý là các CKS thường bị mất hoạt tính

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

trong điều kiện nhiệt độ cao, axit và kiềm cao Do vậy, khi tách chiết và tinh sạch,phải nghiên cứu các điều kiện thích hợp sao cho CKS vẫn giữ được hoạt tính [2]

1.4 XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT

1.4.1 nấm là nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh hại cây trồng

Vi nấm là VSV có nhân điển hình, phát triển nhanh chóng do quá trình pháttán bào tử nhờ gió hoặc nước, do đó dễ dàng xâm nhập vào cây trồng hoặc hạtgiống và lan truyền từ cây này sang cây khác, từ vùng này sang vùng khác Ngoài ra

vi nấm còn tồn tại ngay trong đất và xâm nhập vào cây trồng thông qua bộ rễ Cây

có thể bị nhiễm bởi một hoặc vài loại nấm, có thể bao gồm cả những loại nấm kýsinh không gây hại đến cây, nhưng phần lớn là các loại nấm gây hại cây trồng Theo

số liệu của Tổ chức Nông – Lương của Liên Hợp Quốc (FAO), tổn thất hàng năm

về các sản phẩm nông nghiệp do các tác nhân gây hại khác nhau gây ra là 20% tổngsản lượng toàn cầu, trong đó riêng tổn thất do nấm chiếm khoảng một nửa [29]

Việt Nam là nước nhiệt đới, có khí hậu nóng ẩm, vì vậy việc nhiễm nấm làkhông thể tránh khỏi Một lượng lớn cây lương thực, cây công nghiệp ngắn ngày bịnhiễm các loại vi nấm gây bệnh tạo ra hàng loạt các dịch bệnh khác nhau ảnh hưởnglớn đến năng suất cây trồng, đặc biệt những cây có giá trị như: lúa, ngô, đậu, chè…Tính từ năm 1957 đến nay, nước ta đã trải qua nhiều đợt dịch bệnh hại cây trồngnhư đạo ôn, khô vằn, héo rũ, thối cổ rễ… mà tác nhân gây bệnh chủ yếu nghiêm

trọng nhất là vi nấm, phổ biến là Fusarium oxysporum, Fusarium solani,

Rhizoctonia sp., Aspergillus sp., Penicillium sp.… Hầu hết chúng là những loài bán

ký sinh và hoại sinh điển hình, có phạm vi ký chủ rộng, gây nhiều tổn thất lớn vềsản lượng thu hoạch và làm mất tính ổn định về năng suất của nhiều giống cây trồng[24], [12]

Tình hình dịch hại do nấm qua các năm không hề giảm mà còn có chiềuhướng tăng với các bệnh ngày càng phức tạp cùng với sự phòng vệ ngày càng caocủa chính các loài nấm đó Vì vậy việc nghiên cứu những chế phẩm nhằm hạn chếnhững thiệt hại do nấm đang là mối quan tâm hàng đầu được các nhà khoa học đặt

ra hết sức cấp bách

1.4.2 Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật

Trong thiên nhiên, các loại VSV đối kháng ức chế hoạt động hoặc tiêu diệtVSV gây bệnh chủ yếu bằng các CKS là các sản phẩm trao đổi chất của chúng Đâychính là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây Sự có mặt của XK đốikháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây Khi điều tra XK đối khángtrong đất ở Nhật Bản cho thấy ở nơi có nhiều XK trong đất thì ở đó các dòng

Fusarium bị biến mất nhanh [53] Thông thường, một loại XK đối kháng có thể ức

chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt phổ rộng có thể ức chếnhiều tác nhân gây bệnh có trong đất Tuy nhiên, khi sử dụng các chủng có hoạt phổrộng phải chú ý để tránh XK ức chế luôn cả khu hệ VSV có lợi cho vùng rễ

Xạ khuẩn ngoài việc tiết ra các CKS, còn tác động lên khu hệ VSV thôngqua các enzyme phân giải Ngoài ra, nhiều XK còn tiết ra các chất kích thích sinhtrưởng thực vật cũng như kích thích các khu hệ VSV có lợi trong vùng rễ Nhiềunghiên cứu cho thấy CKS do XK sinh ra không những không ảnh hưởng đến thựcvật mà ở nồng độ thấp còn có khả năng kích thích sự sinh trưởng của thực vật [10]

Năm 1954, Trung Quốc đã phân lập được chủng Streptomyces sp 5406 có khả

năng sinh ra CKS phòng chống bệnh thối rễ và đã áp dụng trên 6 triệu ha trồng bôngthu được những kết quả khả quan Mới đây, Bryden và cộng sự (2005) cũng đã tách

chiết thành công CKS jingangmyxin được tách chiết từ một loài Streptomyces

hygromyxin, ứng dụng rất rộng rãi trong phòng chống bệnh thối rễ [26].

Cùng với sự phát triển của khoa học, ngày càng có nhiều CKS có nguồn gốc

XK được tinh chế và đưa vào sản xuất ở quy mô công nghiệp được sử dụng trongphòng trừ nấm gây bệnh thực vật

Chất kháng sinh Blasticidin S được Takeuchi tinh chế từ dịch nuôi chủng

Streptomyces griseochromogenes, dùng để phòng chống bệnh đạo ôn do Pyricularia oryzae gây ra Blasticidin S có phổ tác dụng rộng, ngoài khả năng ức chế sự sinh

trưởng của P.oryzae chúng còn có khả năng ức chế vi khuẩn, nấm và còn có thể

chống khối u [43]

Polyoxin là nhóm kháng sinh thuộc họ nucleotide peptidylpyrimidin, được

tổng hợp bởi chủng XK Streptomyces cacaoi var.asoensis Chất kháng sinh này

được coi là rất an toàn khi sử dụng trong phòng chống nấm bệnh, không độc cho vậtnuôi và cây trồng [43]

Validamycin A được tách chiết từ môi trường nuôi cấy của chủng

Streptomyces hygroscopicus var limoneus [31] Validamycin A đặc biệt có hiệu quả

để phòng chống các bệnh nấm thực vật do Rhizoctonia solani gây ra như khô vằn, thối thân, thối rễ, đốm đen trên nhiều loại hạt Ngoài hoạt tính chống lại R.solani,

Validamycin A còn có hoạt tính chống vi khuẩn và một số nấm khác nữa Theo CụcBảo vệ môi trường Mỹ (FPA), Validamycin A có độ độc thuộc nhóm IV, nghĩa làchúng được sử dụng trong thực tiễn và không độc Vì thế, Validamycin được coi làmột trong những sản phẩm kháng nấm lý tưởng có nguồn gốc VSV, có triển vọng

và an toàn cho môi trường [31]

Ở Việt Nam đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng CKS trongphòng chống các bệnh do vi nấm ở thực vật Bùi Thị Việt Hà và cộng sự đã ứngdụng chế phẩm kháng sinh T-41 và D-42 có nguồn gốc XK để chống nấm

Sclerotium rolfsii gây bệnh mốc trắng ở cà chua và nấm R solani gây bệnh lở cổ rễ,

thối bắp ở bắp cải và đã được thử nghiệm ngoài đồng ruộng cho kết quả khả quan[10], [11]

Thực tế đã cho thấy, việc sử dụng các CKS có nguồn gốc XK trong lĩnh vựcbảo vệ thực vật có nhiều triển vọng hơn so với hóa chất bảo vệ thực vật bởi các hợpchất tự nhiên này có nhiều ưu việt: có tác dụng chọn lọc cao, có thể tiêu diệt VSVgây bệnh ngay ở nồng độ thấp, có tác dụng nhanh, thường không độc hoặc độc thấpvới người, động vật và thực vật, có khả năng ức chế VSV đã kháng thuốc hóa học,thời gian bán hủy ngắn do đó không gây ô nhiễm môi trường… CKS và dịch lênmen các chủng sinh CKS được dùng để xử lý hạt giống trước khi gieo trồng nhằmtiêu diệt mầm bệnh bên trong và ngoài hạt, diệt bệnh ở các bộ phận trên mặt đất củacây và làm sạch mầm bệnh trong đất Tuy nhiên, để khắc phục tính kháng thuốc củaVSV, ngoài việc định kỳ thay thuốc, người ta còn dùng phối hợp nhiều CKS Bên

cạnh đó còn cần chú ý tới việc đảm bảo sự cân bằng của khu hệ VSV hữu ích trong đất.

Nhìn chung, so với trong y học, việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thựcvật vẫn còn ở mức độ thấp, tuy nhiên, những thành tựu thu được và xu hướng pháttriển hiện nay đã khẳng định tầm quan trọng của CKS trong nền nông nghiệp hiệnđại Cần phải có sự phối hợp một cách có kế hoạch trong việc tìm kiếm CKS mới,xây dựng biện pháp đấu tranh sinh học, đồng thời có thể phối hợp với các biện pháphóa học sẽ đem lại những hiệu quả to lớn trong phòng chống bệnh và nâng cao hiệusuất cây trồng

1.5 XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG

Hiện nay, tốc độ ô nhiễm môi trường đang ngày càng gia tăng, do đó cầnphải thực hiện nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với việc xử lý chất thải ra ngoài môitrường Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được enzyme có khả năng và triển vọngtrong giám định và xử lý ô nhiễm môi trường Trong lĩnh vực này, VSV môi trườngđang là phương pháp tiếp cận nghiên cứu tốt nhất của thế giới

1.5.1 ển chọn xạ khuẩn sinh enzyme

VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để duy trì

sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi VSV có hệ enzyme đa dạng vàphong phú Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năng sinh enzyme nhưnhau, ngay cả những chủng cùng một loài cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợpenzyme [21] Vì vậy, việc nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng VSV có hoạtlực cao trong việc tạo thành enzyme mong muốn là cần thiết Ví dụ, muốn lựa chọncác chủng VSV sinh enzyme chịu nhiệt nên lựa chọn từ suối nước nóng hay bể ủ rácthải; tuyển chọn các VSV sinh enzyme chịu kiềm, chịu axit thường phân lập từ nơi có

độ kiềm cao hay axit cao; lựa chọn chủng sinh cellulase thường tìm thấy ở các mẫuđất có nhiều xác thực vật bị phân hủy… Tuy nhiên, trong thực tế, để tuyển chọn đượccác chủng VSV có hoạt tính enzyme mạnh và có khả năng ứng dụng trong sản xuấtđòi hỏi các bước nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức Bên cạnh đó có nhiều

chủng VSV đã đưa vào sản xuất nhưng còn nhiều lĩnh vực đòi hỏi cần phải tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ cao nhất cho con người.

Một số nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã chỉ ra rằng các chủng

XK thuộc chi Streptomyces có khả năng sinh một số enzyme có ý nghĩa quan trọng

trong công nghệ xử lý môi trường Ziad Jaradat và cộng sự (2008) đã phân lập,

tuyển chọn được chủng Streptomyces sp J2 từ các bãi rác thải công nghiệp có khả

năng sinh enzyme cellulase mạnh sử dụng trong xử lý rác thải [57] De Azeredo và

cộng sự (2006) đã ứng dụng enzyme protease từ chủng XK Streptomyces sp 594 ưa

nhiệt để phân hủy các phế thải từ ngành công nghiệp gia cầm [38]

Theo nghiên cứu của tác giả Phạm Hồng Ngọc Thùy (2008) đã phân lập và

tuyển chọn được chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126 có khả năng sinh tổng

hợp chitosanase khi chúng được nuôi trong môi trường có chất cảm ứng là chitosan.Chitin, chitosan là polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên, đặc biệt trong vỏtôm, cua, ghẹ Trước đây để phân hủy chitin, người ta thường phải sử dụng axit HClđậm đặc gây ô nhiễm môi trường Vì vậy, việc thu nhận chế phẩm enzyme

chitosanase từ Streptomyces griseus có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy

chitin bằng phương pháp sinh học, giúp tạo sản phẩm có chất lượng tốt và ít gây ônhiễm môi trường… [20]

Viện Công nghệ Môi trường, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đãnghiên cứu cho ra một chế phẩm vi sinh xử lý môi trường hiệu quả và được ứngdụng rộng rãi tại Hà Nội, Phú Thọ, Thái Bình…, đó là chế phẩm Biomix 1 Đây làmột tập hợp gồm 10 chủng VSV ưa nhiệt (sinh trưởng tối ưu ở 45 - 550C) thuộc

nhóm XK chi Streptomyces và vi khuẩn thuộc chi Bacillus Các chủng này có ưu

điểm là sinh các enzyme xenlulase, amylase, protease ngoại bào có tác dụng phânhủy mạnh các chất hữu cơ trong chất thải và là những chủng VSV không gây bệnhcho người và động vật, thực vật

1.5.2 số enzyme chủ yếu ứng dụng trong bảo vệ môi trường

Cho tới nay, người ta đã biết được khoảng 3.000 enzyme Tất cả các enzymeđều được gọi tên và được xếp vào “Hệ thống phân loại” gồm 6 lớp Trong đó, chỉ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

các enzyme xúc tác phản ứng oxy hóa – khử thuộc lớp 1 (Oxidoreductase) và cácenzyme xúc tác phản ứng thủy phân thuộc lớp 3 (Hydrolase) có vai trò tích cựctrong xử lý môi trường Một số enzyme thủy phân (Hydrolase) được sử dụng phổbiến trong xử lý môi trường bao gồm: amylase, protease và cellulase

 Enzyme amylase

Amylase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như: động vật, thựcvật, VSV Ngày nay, do có ưu thế về nhiều mặt, VSV đã trở thành nguồn thuenzyme chủ đạo [21] Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sửdụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dânkhác Các amylase là các enzyme đường hóa, có khả năng phân hủy amylose,amylopectin và các polysaccharide tương tự để giải phóng glucose Vì vậy, cácenzyme này có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn tinhbột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản

Mặc dù amylase được sản xuất chủ yếu từ nguồn nấm mốc và vi khuẩn, tuynhiên việc sử dụng XK để sản xuất enzyme gần đây cũng được quan tâm nghiêncứu Nhìn chung, trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy

nhiên cũng có một số ít như loài xạ khuẩn ưa nhiệt Micromonospora vugaris 42 có

khả năng tạo một lượng nhỏ amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và cácenzyme khác [44]

Enzyme protease

Protease thuộc nhóm enzyme thủy phân protein được sử dụng rộng rãi trongcông nghiệp thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá và thịt Protease có thể thủyphân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắnkhô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi Protease thủy phân các proteinkhông tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắtcác chuỗi polypeptide tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt Sau đó, quá trình hoàtan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tánenzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ Chính vì tính chất này màprotease được sử dụng, một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những

phế thải này không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lýcác phế thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôikhông còn mùi hôi thối [21].

 Enzyme cellulase

Trong thập kỷ qua, enzyme thuỷ phân cellulose ngày càng được quan tâm Sựquan tâm này là do các enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose,chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nênnguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sảnphẩm giàu năng lượng khác

Trong cấu trúc của cellulose chủ yếu là liên kết β-(1-4) glucoside Tuy nhiên,việc thủy phân cellulose cần tới một hệ enzyme bao gồm các cellulase với nhữngtác động đặc trưng riêng biệt Chính vì vậy, đã có nhiều nghiên cứu đề cập đến việcsản xuất các chế phẩm bao gồm một số enzyme để xử lý phế thải là cácpolysaccharide thực vật [21]

VSV có khả năng sinh tổng hợp cellulase thuộc ba nhóm: nấm sợi, XK và vikhuẩn Trong công nghiệp sản xuất sản xuất cellulase hiện nay, người ta chủ yếunuôi cấy sợi nấm sợi và XK, còn vi khuẩn ít được ứng dụng trong sản xuất Thêmvào đó các loài XK thường chịu nhiệt tốt hơn các loài nấm sợi, enzyme cellulasecủa XK cũng hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzyme cellulase của nấm sợi nên XKngày càng được tập trung nghiên cứu theo hướng thu nhận chế phẩm cellulase [23]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Gồm 162 chủng XK phân lập từ 40 mẫu đất được lấy từ các địa điểm khácnhau thuộc khu vực núi Pháo, xã Hà Thượng, huyện Đại Từ và thị trấn Trại Cau,huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên

2.1.2 sinh vật kiểm định

11 chủng VSV kiểm định, bao gồm:

- 2 chủng vi khuẩn G (+): Staphylococcus aureus ATCC 25923 do Viện Kiểm nghiệm – Bộ Y tế và Bacillus subtilis VTCC-B-888 do Viện Bảo tàng giống

chuẩn VSV Việt Nam cung cấp

- 2 chủng vi khuẩn G (-): Escherichia coli VTCC-B-883 và Pseudomonas

aeruginosa VTCC-B-481 do Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam cung cấp.

- 3 chủng nấm mốc: Fusarium oxysporum VTCC-F-1301, Fusarium solani VTCC-F-1302 và Aspergillus niger VTCC-F-001 do Viện Bảo tàng giống chuẩn

VSV Việt Nam cung cấp

- 4 chủng nấm mốc gây bệnh trên cây chè, ký hiệu là: Đ1, PL3, TB4 và N2nhận được từ Phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học

2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ MÔI TRƯỜNG

2.2.1 Hóa chất

- Các loại đường chuẩn: glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, arabinose…

của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, NaH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3,NaCl, FeSO4.7H2O… nhập từ Anh, Trung Quốc

- Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone… của hãng Merck (Đức)

- Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột, casein, CMC… của Nhật, Trung Quốc,Việt Nam sản xuất.

- Mồi dùng cho phản ứng PCR, bộ kít dùng cho phản ứng PCR, bộ kít tinh sạch sảnphẩm PCR AccuPrep Gel Purification do hãng Bioneer – Hàn Quốc sản xuất

2.2.2 ng cụ và thiết bị

- KHVQH Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức)

- KHVĐT JSM 5410LV (Nhật) - Máy PCR (USA/Singapore)

- Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan)

- Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy cất nước Hamilton…

- Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy đo pH 151 Martini (Nhật)

2.2.3 trường nghiên cứu

* Môi trường Gause 1 (g/l):

Tinh bột: 20; K2HPO4: 0,5; MgSO4.7H2O: 0,5; NaCl: 0,5; KNO3: 0,5;FeSO4: 0,01; Thạch: 20; Nước máy: 1 lít, pH: 7,0 – 7,4

* Môi trường Gause 2 (g/l)

Cao thịt: 3; NaCl: 5; Pepton: 5; Glucose: 10; Thạch: 20;Nước máy vừa đủ 1 lít; pH = 7 - 7,4

* Môi trường ISP 1 (g/l)

Trypton: 5; Cao nấm men: 3; Thạch: 18; Nước cất: 1 lít

* Môi trường ISP 2 (g/l)

Cao nấm men: 4; Dextrose: 4; Cao malt: 10; Thạch: 20; Nước cất: 1lít; pH = 7

* Môi trường ISP 3 (g/l)

Đại mạch: 40g; Muối vệt A: 1ml; Thạch: 20g; Nước cất: 1 lít

* Môi trường ISP 4 (g/l)

Tinh bột: 20; MgSO4.7H2O: 1; K2HPO4: 1; (NH4)2SO4: 2; CaCO3: 2;NaCl: 1; Muối vệt A: 1ml; Thạch: 20; Nước cất: 1 lít; pH = 7 - 7,4

* Môi trường ISP 5 (g/l)

L-Asparagin: 1; Muối vệt A: 1ml; K2HPO4: 1; Glycerol: 10; Thạch: 20;Nước cất: 1 lít; pH = 7 - 7,4.

Muối A (%): FeSO4 7H2O: 0,1 g; ZnSO4.7H2O: 0,1g; MnCl2.4H2O: 0,1g; Nước cất: 100 ml

* Môi trường ISP 6 (g/l)

Peptone: 6; Thạch: 20; Cao nấm men: 1; Nước cất: 1 lít; Xitrat sắt: 0,5;

pH 7 - 7,2

* Môi trường ISP 9 (g/l)

(NH4)2SO4: 2,64; Nguồn cacbon: 10; K2HPO4: 5,65;Muối B: 1ml; KH2PO4: 2,38; Thạch: 20; MgSO4.7H2O: 1;Nước cất: 1 lít; pH = 6,8 – 7

 Muối B (%): CuSO4.5H2O: 0,64; FeSO4 7H2O: 0,11; MgCl2: 0,79; Nước cất : 100 ml

 Nguồn cacbon : D-glucose, arabinose, xylose, manitol, rhamnose, cellulose,inositol, fructose, raffinose, lactose, maltose, saccharose

* Môi trường 79 (g/l)

Glucose: 10; NaCl: 6; Peptone: 10; K2HPO4: 0,2; Casein: 2;Cao nấm men: 2; Thạch: 20; Nước cất: 1 lít; pH = 7 - 7,4

* Môi trường Hữu cơ – Agar (g/l)

Cao thịt: 30g; Pepton: 5g; NaCl: 5g; Glucose: 10g; Thạch: 20g;Nước cất: 1 lít; pH: 7,0 - 7,2

* Môi trường Glycerin – nitrat (g/l)

Glycerin: 30; NaNO3: 2, KH2PO4: 1; FeSO4: 0,01; MgSO4: 0,5;Thạch: 20; Nước cất: 1 lít; pH: 7,0 – 7,2

* Môi trường MPA (g/l):

Cao thịt: 5; Pepton: 10; NaCl: 5; Thạch: 18; Nước máy: 1 lít; pH: 7,0 – 7,2

* Môi trường PDA (g/l):

Khoai tây: 200; Đường: 20; Thạch: 20; Nước máy: 1 lít;

pH = 7 - 7,4

* Môi trường Czapek – Thom (g/l):

Saccarose: 30; NaNO3: 2; K2HPO4: 1; MgSO4 7H2O: 0,5; KCl: 0,5;FeSO4: 0,01; Thạch: 20; Nước máy: 1 lít.

* Môi trường cơ sở xác định hoạt tính enzyme (g/l)

NaHPO4: 0,615; axit xitric: 0,25; cơ chất: 1g; thạch: 2,0; nước cất: 100ml

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 ương pháp phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn

Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn theo phương pháp của Vinogradski [6] Cân1g đất cho vào bình nón chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút Dùngpipet vô trùng hút 0,5 ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước vô trùng vàtiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3… 10-6 Ở mỗi nồng độ pha loãng từ 10-3 đến 10-6,nhỏ 100 µl sang đĩa Petri chứa môi trường Gause 1 Dùng que gạt vô trùng changđều, sau đó nuôi ở nhiệt độ 30oC từ 4 - 7 ngày Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của XKđược cấy ria 3 pha sang đĩa Petri để làm sạch Sau 4 - 7 ngày, nhặt các khuẩn lạcriêng rẽ cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause 1, tiếptục nuôi ở điều kiện trên trong 7 - 14 ngày

2.3.2 Phương pháp đếm số lượng tế bào

Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, các đĩa nuôi cấy XK ở cácnồng độ pha loãng từ 10-3 đến 10-6 được lựa chọn để đếm số lượng khuẩn lạc mọctrong mỗi đĩa Petri

Theo lý thuyết: 1 khuẩn lạc được hình thành từ 1 tế bào Tuy nhiên trên thực tếkhó có thể xác định được chính xác là một khuẩn lạc có thể được hình thành từ 1 haynhiều tế bào Vì vậy để tính tổng số tế bào có trong 1 đơn vị thể tích, người ta thường

dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 đơn vị thể tích - CFU” [6].

Từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có thể suy ra số lượng tế bào (CFU) cótrong 1 g đất theo công thức sau:

CFU/g = A x 1/K x 1/V

Trong đó:

A: Số lượng khuẩn lạc trung bình mọc trên các đĩa thạch có cùng độ pha loãng V: Thể tích dịch đất pha loãng được cấy gạt trên đĩa thạch

K: Độ pha loãng của dịch đất được cấy trên thạch

2.3.3 ương pháp xác định hoạt tính kháng sinh

* Phương pháp thỏi thạch

Sử dụng để sơ tuyển các chủng XK có hoạt tính kháng sinh Tiến hành nuôicấy VSV kiểm định trên các môi trường thích hợp trong các đĩa Petri (vi khuẩn -môi trường MPA, nấm mốc - môi trường PDA hoặc Czapek - Thom) XK nuôi cấytrên môi trường Gause 1, sau 7 ngày dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặtlên bề mặt môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định Sau đó đặt các đĩa vào tủ lạnh

40C trong vòng 6 - 8 giờ để CKS khuếch tán rồi chuyển sang tủ ấm ở 300C Đọc kếtquả sau 24 giờ đối với vi khuẩn kiểm định, sau 48 - 72 giờ đối với nấm kiểm định

Hoạt tính kháng sinh được xác định theo kích thước vòng vô khuẩn: D - d(mm), trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính của thỏi thạch

* Phương pháp khoanh giấy lọc

Dùng để xác định HTKS của dịch chiết kháng sinh bằng dung môi Khoanhgiấy lọc có đường kính 10 mm được tẩm một lượng dịch CKS (khoảng 0,1ml/1khoanh giấy lọc), sau đó để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Đặt khoanh giấy lọc đã

tẩm CKS vào đĩa Petri đã cấy VSV kiểm định Các bước tiếp theo giống phương pháp thỏi thạch [6].

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme

* Phương pháp sơ tuyển các chủng XK sinh enzyme mạnh

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường cơ sở có bổ sung 1% nguồn cơchất tương ứng với enzyme cần xác định: tinh bột – xác định hoạt tính amylase,CMC – xác định hoạt tính cellulase, casein – xác định hoạt tính protease Sau 5ngày, tiến hành đục các thỏi thạch đặt lên các môi trường thạch cơ sở có cơ chấttương ứng Đặt các đĩa vào tủ lạnh 40C trong 6 – 8 giờ, sau đó chuyển sang tủ ấm

300C trong 12 - 24h Hiện vòng phân giải bằng các thuốc thử tương ứng

Hoạt tính enzyme được xác định bằng giá trị: D – d (mm), trong đó D làđường kính vòng phân giải cơ chất, d là đường kính lỗ thạch

* Phương pháp xác định hoạt tính enzyme trong dịch lên men

Nuôi cấy XK trên môi trường cơ sở chứa cơ chất dùng để xác định hoạt tínhenzyme tương ứng trên máy lắc 220 vòng/phút trong 5 ngày Thu dịch enzyme từmôi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm 15.000 vòng/phút trong 10 phút Nhỏ vào các

lỗ khoan trên môi trường cơ chất tương ứng dịch nuôi cấy XK Sau đó đặt các đĩavào tủ lạnh 40C trong vòng 6 - 8 giờ rồi chuyển sang tủ ấm 30oC Đọc kết quả sau

12 - 24 giờ

2.3.5 Phương pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme

Dịch nuôi cấy XK sau khi lọc được đun cách thủy ở các mức nhiệt độ: 400C,

500C, 600C, 700C, 800C trong các khoảng thời gian 20, 40 và 60 phút, sau đó đểnguội ở nhiệt độ phòng và xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp đục lỗthạch

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

2.3.6.1 Đặc điểm hình thái

* Quan sát cuống sinh bào tử

Cấy ria XK trên môi trường Gause 1, sau đó cắm lamen nghiêng 450 trên bềmặt môi trường Sau 5 - 7 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng, lấy lamen đem quan sát hìnhdạng CSBT dưới kính hiển vi quang học và chụp ảnh.

CSBT có thể có 3 dạng: RF (rectiflexibiles): dạng thẳng và lượn sóng; RA (retinaculiaperti): dạng xoắn, thô sơ và ngắn; S (spirales): CSBT dạng xoắn và ngắn

* Quan sát bề mặt bào tử

Dùng que cấy lấy một ít KTKS có bào tử, sau đó cố định mẫu bằngglutaraldehyde 3%, rửa mẫu bằng dung dịch đệm cacodylate và cố định lại bằngaxit osmic 1% (OsO4 1%) Tiếp tục rửa lại bằng đệm cacodylate 1% và khử nướcbằng cồn có nồng độ tăng dần từ 30 – 100 độ Cho mẫu lên đế để khô tự nhiên Sau

đó tiến hành mạ phủ vàng bằng máy JFC 1200 Soi và chụp ảnh bằng kính hiển viđiện tử quét JSM 5410LV tại Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng, Hà Nội

Bào tử có các hình dạng: tròn, elip, que, ovan… Bề mặt bào tử có thể gặp cácdạng: Sm (Smooth): dạng nhẵn, Wa (Warty): dạng mụn cóc; Sp (Spiny): dạng gai;

Ha (Hairy): dạng tóc; Ru: dạng nếp nhăn

2.3.6.2 Đặc điểm nuôi cấy

* Màu sắc KTKS, KTCC, sắc tố tan

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Gause 1, Gause 2, ISP 1, ISP 2,ISP 3, ISP 4, ISP 5, ISP 6, môi trường 79, môi trường hữu cơ – agar, môi trườngglycerin – nitrat ở nhiệt độ phòng Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát màu sắcKTKS, KTCC và sắc tố tiết ra môi trường theo phương pháp của Shirling và Gottlieb[47], [55]

* Khả năng sinh melanin

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP 6 ở 300C Bắt đầu quan sát màucủa môi trường sau 24 giờ cho đến ngày thứ 14 Nếu sinh melanin, màu của môitrường sẽ chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm cho đến màu đen

2.3.6.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa

* Khả năng đồng hóa nguồn đường

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP 9 có bổ sung 1% các nguồnđường khác nhau: D - glucose, fructose, manitol, rhamnose, lactose, raffinose,arabinose, saccharose, xylose, inositol, maltose…

Cách làm: Cân 1g đường, thanh trùng bằng đèn UV rồi bổ sung vào 100 mlmôi trường ISP 9 còn nóng, lắc đều rồi đổ vào ống nghiệm và nuôi cấy XK ở nhiệt

độ 300C Sau 7 - 14 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng và so sánh với đốichứng Trong đó môi trường không có đường được coi là đối chứng âm

* Khả năng chịu muối

Nuôi cấy XK trên môi trường ISP 1 có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ:0; 0,5; 3; 5; 7; 9; 11; 12 (%).Quan sát sự sinh trưởng của XK sau 7 - 14 ngày

* Nhiệt độ thích hợp

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause 1 trong khoảng nhiệt độ từ

200C - 450C Quan sát sự sinh trưởng của XK sau 7 - 14 ngày

mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 1,2% Triton) Ủ ít nhất 30 phút ở 370C

(3) Bổ sung 20 µl proteinase K và 200 µl Buffer AL, vortex nhẹ nhàng Ủ ở

560C trong 30 phút và sau đó tiếp tục ủ ở 950C trong 15 phút

(4) Ly tâm thu tủa Bổ sung 4 µl RNase (100 mg/ml), vortex khoảng 15 giây

và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút Ly tâm loại bỏ dịch, sau đó bổ sung 200 µlBuffer AL vào mẫu Vortex khoảng 15 giây, ủ ở 700C trong 10 phút

(5) Bổ sung 200 µl ethanol (96%), vortex 15 giây rồi chuyển sang cột QIAampMini spin Ly tâm 8.000 vòng/phút Đặt cột sang ống 2 ml sạch

(6) Bổ sung 500 µl Buffer AW1 vào cột, ly tâm 8.000 vòng/phút Đặt cột sangống 2 ml sạch và loại bỏ ống cũ chứa dịch lọc Bổ sung 500 µl Buffer AW2 Ly tâm14.000 vòng trong 3 phút

(7) Đặt cột sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ ống chứa dịch Bổ sung 200 µlBuffer AE, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó ly tâm ở 8.000 vòng/phút và thutủa

2.3.7.2 Nhân đoạn gene 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR

Trình tự 2 cặp mồi (27F, 1525R) và (341F, 907R) được sử dụng để nhân đoạngene 16S rRNA từ DNA tổng số của 2 chủng HT17.8 và HT19.1:

27F : 5’- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’

1525R : 5’- AAA GGA GGT GAT CCA GCC -3’

341F : 5’- CCT ACG GGA GGC AGC AG -3’

907R : 5’- CCG TCA ATT CCT TRA GTT T -3’

Thành phần phản ứng: Buffer Taq (10X): 2,5 µl; dNTPs (2,5 mM): 2,5 µl;

MgCl2 (25 mM): 3 µl; Mồi xuôi (20 µM): 1 µl; Mồi ngược (20 µM): 1 µl; DNAkhuôn: 1 µl; Taq DNA polymerase (5 U/µl): 0,2 µl; Nước khử ion: 13,8 µl; Tổngthể tích: 25 µl

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được sử dụng để nhân đoạn gene 16SrRNA của 2 chủng HT17.8 (và HT19.1) như sau:

Bảng 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Các bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tác dụng

1 940C 5 phút 1 Biến tính

940C

580C2

(550C)

720C

1 phút

1 phút(1 phút 30 giây)

Sau khi kết thúc phản ứng PCR thì sản phẩm được điện di kiểm tra trên gelagarose 1% trong đệm TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn 1kb để chắc chắngene nhân lên có kích thước mong muốn

Sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ kit AccuPrep Gel Purification theo quytrình của nhà sản xuất bioneer

2.3.7.3 Phương pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA

Sản phẩm PCR được sau khi đã được tinh sạch được gửi xác định trình tự trênmáy đọc tự động ABI PRISM® 3100 Avant Geneetic Analyzer sử dụng bộ kitBigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Trình tự nucleotide được xử lý bằngphần mềm ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v 1.0 và DNA SequencingAnalysis đó được so sánh với trình tự gene 16S rRNA của các prokaryote đã đượccông bố trên ngân hàng gene thế giới bằng chương trình BLAST

2.3.8 Nghiên cứu bước đầu quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh

2.3.8.1 ựa chọn môi trường lên men thích hợp

Xạ khuẩn được lên men trên các môi trường cơ bản là: Gause 1, Gause 2, A

-4, A - 4H, ISP 4 và môi trường 79 Sau 7 ngày nuôi cấy trên máy lắc 220 vòng/ phút

ở nhiệt độ 28 – 300C, xác định HTKS trong dịch lên men để chọn ra môi trường lênmen thích hợp cho sinh tổng hợp CKS của chủng nghiên cứu

2.3.8.2 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên sinh tổng hợp chất kháng sinh

Bổ sung các nguồn nitơ vào dung dịch muối A đã bổ sung 1,5% glucose đểlàm môi trường lên men XK Sau 7 ngày nuôi trên máy lắc 220 vòng/phút ở 28 –

300C Xác định HTKS của dịch lên men theo phương pháp đục lỗ thạch Các nguồnnitơ bổ sung vào dung dịch muối A (g/l): Cao nấm men: 1, bột đậu tương: 1,pepton: 1, KNO3: 0,1, (NH4)SO4: 0,2

2.3.9 Phương pháp tách chiết chất kháng sinh

2.3.9.1 Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối bằng dung môi hữu cơ

Sau khi lên men XK trên môi trường thích hợp, dịch nuôi cấy và sinh khốiđược ly tâm tách riêng Phần sinh khối được chiết bằng các loại dung môi hữu cơ:etyl-axetate, iso-butanol, n-propynol, ethanol, methanol, acetone, với tỷ lệ chiết là1:1 Hỗn hợp dung môi sinh khối này được vortex 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó

ly tâm loại sinh khối Cuối cùng hỗn hợp dung môi và chất chiết được đem thửHTKS với các VSV kiểm định bằng phương pháp khoanh giấy lọc

2.4.9.2 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ