LUẬN văn THẠC sĩ CÔNG NGHỆ SINH học (FULL) nghiên cứu môi trường tái sinh của một số giống ngô (zea mays l ) phục vụ chuyển gen

Xác định được các điều kiện thích hợp để tái sinh cây từ phôi non và từ mô sẹo của 5 giống ngô... được ứng dụng nhiều thành tựu khoa học về các lĩnh vực di truyền học, chọngiống, công ng

LỜI CAM ĐOAN

học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Các số liệu, kết quảtrong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trìnhnào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này

Thái Nguyên, ngày 13 tháng 09 năm

Tác giả luận văn

i

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1

2

2

4 Ý ngh ĩa khoa học 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ l ư ợc về cây ngô 3

3

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây ngô 6

1.1.3 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 7

10

1.2.1.Nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới 10

1.2.2.Nghiên cứu tái sinh ngô ở Việt Nam 14

1.3.Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và thành phần môi trường đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngô 14

1.3.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng 14

của thành phần môi trường 17

1.3.3 in vitro 19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

21

3

2.2.Hóa chất và thiết bị 21

2.3.Phạm vi nghiên cứu 22

2.4.Địa điểm, thời gian tiến hành nghiên cứu 22

2.5.Ph ư ơng pháp nghiên cứu 22

2.5.1.Tái sinh cây trực tiếp từ phôi non 23

2.5.2.Tạo mô sẹo từ phôi và thân non 24

2.5.3.Nghiên cứu khả năng tái sinh cây từ mô sẹo 26

2.5.4 Nghiên cứu điều kiện đưa cây in vitro ra ngoài môi trường 26

2.6 Xử lý số liệu 27

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Tái sinh cây trực tiếp từ phôi non 28

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi phôi đến khả năng tái sinh cây trực tiếp từ phôi non 28

4

3.4 Nghiên cứu

30

non 35

non 36

2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non 38

-proline đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non 41

3 đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non 44

2,4-D 48

phôi non 51

kiện đưa cây in vitro ra ngoài môi trường 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

I Kết luận 55

II Đề nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 63

5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới giai đoạn

2009 - 2011 7

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 - 2012 9

21

28

Bảng 3.2 cây từ phôi 32

34

LVN 25, LVL 61, LVN 66, LVN 99, 36

hưởng của 2,4-D 39

Bảng 3.6 43

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của AgNO3

45

DANH MỤC CÁC HÌNH

5

885 29

từ phôi nonLVN 885 32

35

885 37của 2,4-D

3.8 Ảnh hưởng của AgNO3

46

11

2

MỞ ĐẦU 1.

Cây ngô (Zea mays L.) là cây lương thực giàu dinh dưỡng có vai trò

hàng nông sản xuất khẩu có giá trị Cây ngô được gieo

Theo thống kê của FAO, năm 2012 cây ngô

.Những năm gần đây, nhờ việc sử dụng phương pháp chuyển gen đã tạo

ra nhiều giống ngô mới có giá trị dinh dưỡng cao [38], [53]; có khả năng

, …

nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy in vitro

gô

Thực tế13

Mặt khác, nguồn vật

thực hiện thông qua sự tái sinh phôi hoặc mô sẹo [41] Trong đó, mô sẹo đượchình thành từ phôi non hay từ lát cắt của thân cây non

14

Xác định được các điều kiện thích hợp để tái sinh cây từ phôi non và từ

mô sẹo của 5 giống ngô

-Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về cây ngô

Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Hòa thảo (Poaceae), bộ Hòa thảo (Poales

(theo “Vân Đài loại ngữ” của Lê Quý Đôn)

năm 1920, Sturtevantel đi

(c ) sau đây [6]:

1- Ssp amilaceae - ngô bột

cây đặc và khá chắc, chia nhiều lóng (dóng) to dần từ dưới lên, nằm giữacác đốt và kết thúc bằng bông cờ.

Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và đối xứng xen kẽ nhau, hình dải 50 - 100

cm, rộng 5 - 10 cm Căn cứ vào vị trí và hình thái lá trên cây, lá ngô được chiathành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá ngọn, lá bi

Hoa ngô

; hoa cái mọc sát nhau, được bao bằng lá bắc to, vòi nhụy dài,quả dĩnh, hạt xếp thành hàng, các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông đượcbao bọc trong một số lớp lá và được bao chặt vào thân [2], [10]

Hạt ngô gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ và chânhạt Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt Lớp alơron nằm dưới vỏhạt và bao lấy nội nhũ

Phôi ngô

chiếm 1/3 thể tích của hạt, gồm có các phần: ngù (phần ngăn cách giữa nộinhũ và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm [12].

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây ngô

Ngô là một trong những cây ngũ cốc quan trọng trong nền kinh tế toàncầu, ngô đứng thứ 3 sau lúa mì và lúa gạo Nhưng ngô lại giàu dinh dưỡnghơn lúa mì và lúa gạo, góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới,đặc biệt các nước thuộc châu Mỹ La Tinh

được ứng dụng nhiều thành tựu khoa học về các lĩnh vực di truyền học, chọngiống, công nghệ sinh học, cơ giới hóa, điện khí hóa và tin học vào công tácnghiên cứu và sản xuất [12]

nguyên liệu cho công nghiệp. gười ta đã sản xuấtkhoảng 670 mặt hàng khác nhau của các ngành công nghiệp lương thực - thựcphẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ

Hầu như 70% chất dinh dưỡng trong thức

ăn tổng hợp là từ ngô Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tưởng cho gia

tỷ

tỷ lệ này rất cao như Mỹ 76%, Bồ Đào Nha 91%,Malaysia 91% (CIMMYT, 2001)

, cần khoảng 4 triệu

[57]

sản xuất axit acetic.

ilin, Streptomicin,

như aceton, nhựa hóa học Phôi ngô chứa 17,2 - 56,8% lipid nên có thể dùng để ép dầu [2]

1.1.3 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam

1.1.3.1 .1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới

Ngô là cây trồng có địa bàn phân bố rộng, được gieo trồng khắp trênthế giới với sản lượng hàng năm cao hơn bất kỳ cây lương thực nào Năm

1961, năng suất ngô trung bình trên thế giới chỉ đạt 20 tạ/ha thì đến năm

2011 đã l 51,84 tạ/ha, tăng gấp 1,5 lần Ngô được trồng ở hầu hết các nơitrên thế giới như Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi và Châu Á Do điềukiện khí hậu, thổ nhưỡng, tập quán canh tác dẫn đến diện tích, sản lượng vànăng suất ngô ở các khu vực có sự chênh lệch nhau, điều đó được thể hiện ởbảng 1.1 [54]

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới

giai đoạn 2009 - 2011

ợng (triệu tấn) Khu vực Diện tích (triệu ha)

(Nguồn FAOSTAT, 2012)

Qua bảng 1.1 cho thấy, châu Mỹ

Châu Mỹ chiếm 37,85% diện tích và 49,65%

tích trồng ngô thế giới nhưng năng suất thấp chỉ đạt 49,41 tạ/ha (năm 2011)

và xếp ở vị trí thứ ba Châu Âu có năng suất khá cao nhưng diện tích trồngngô rất thấp, chiếm chưa đến 10% diện tích trồng ngô thế giới, do đó sảnlượng chỉ đạt 12,28% tổng sản lượng thế giới Trong những năm gần đây,

cho sản lượng ngô của châu Âu tăng vọt thêm 26,8% chỉ trong 1 năm (2010 2011) Ngược lại, ở Châu Mỹ diện tích trồng ngô tăng nhưng năng suất và sảnlượng giảm

-Những năm gần đây áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiêntiến, đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngô lai nên năng suất và sảnlượng ngô thế giới có sự nhảy vọt, nhất là ở các nước có nền kinh tế phát

Bên cạnh đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các giống ngô chuyểngen năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh cũng góp phần

sản lượng ngô thế giới

1.1.3.2 .2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam

Ngô được đưa vào nước ta cách đây khoảng 300 năm và trở thành câylương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, là cây

thêm tiến bộ kỹ thuật, đặc biệt là về giống, cây ngô đã có những bước tăngtrưởng đáng kể về diện tích, sản lượng và năng suất

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 - 2012

(triệu ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Năng suất (tạ/ha)

diện tích ngô chưa đến 300 nghìn ha, năng suất 10,51 tạ/ha

Nếu như năm 1990, năng

Năm 1975,

(3,85 triệu tấn)

trồng ngô lai, kết hợp áp dụ

lai và đang ở giai đoạn đầu đi vào công nghệ cao (công nghệ gen, nuôi cấybao phấn và noãn) [2], [12].

Bên cạnh những thuận lợi và thành tựu đã đạt được, ngành

Sản lượng ngôtrong nước không đủ phục vụ cho con người và phát triển ngành chăn nuôi.Hàng năm, Việt Nam vẫn phải nhập khẩu lượng lớn ngô để chế biến thức ăngia súc Vì vậy, việc nghiên cứu tạo giống ngô có năng suất cao, khả năngchống chịu tốt, đồng thời đáp ứng yêu cầu chất lượng là nhiệm vụ rất quantrọng và cấp thiết đối với các cơ quan nghiên cứu, chọn tạo giống

1.2.1 Nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới

Nuôi cấy in vitro cây ngô được bắt đầu từ rất sớm vào những năm

1930, khi Lampe và Mills nuôi cấy nội nhũ và phôi non trong môi trường có

bổ sung dịch chiết khoai tây nhưng mô chỉ sinh trưởng có giới hạn [48] Larue

gian dài phôi non và phôi ngô trưởng thành để xác định nhu cầu dinh dưỡngcho sinh trưởng và phát triển

Tái sinh cây từ phôi non hoặc bộ phận khác của những loài ngũ cốc lầnđầu tiên được miêu tả trong những năm 1960 đến 1980 [49] Phôi non được

sử dụng phôi có kích thước 1 - 1,5 mm thu được sau 2 tuần thụ phấn cấy

Năm 1975, Green và Phillips

ngô [32]

ai loại mô sẹo của phôi : mô sẹo loại I có đặcđiểm cứng, đặc, nhỏ, màu trắng - vàng và có thể sản sinh ra các loại mô khácgiống như phôi soma mô sẹo thường tăng trưởng chậm hoặc khónuôi cấy trong thời gian dài Mô sẹo loại II được quan sát trong 1 số loại ngô

Chúng có tỷ lệ phôi hóa cao,

, nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tái sinh cây trực tiếp từ phôi caohơn tỷ lệ tái sinh thông qua mô sẹo [20]

Giai đoạn đầu của quá trình tái sinh phôi ngô là giai đoạn phôi somatrưởng thành nảy mầm được cảm ứng bởi nồng độ sucrose cao (60 g/l) trongđiều kiện không có ánh sáng và không có chất điều hòa sinh trưởng Giai

đoạn thứ hai của quá trình tái sinh in vitro cây ngô là giai đoạn phát triển chồi

và rễ, được cảm ứng tốt khi giảm nồng độ đường sucrose [28]

Năm 1989, Vain đánh giá ảnh hưởng của ethylene trong nuôi cấy in

vitro, sử dụng AgNO3 như chất ức chế hoạt động của ethylene tỷ lệ

khi phôi non được nuôi cấy trong môi trường MS chứa AgNO3 từ 5 đến 20

trường có AgNO3 tăng cao hơn [47]

Năm 2004, Zhang nghiên cứu 15 dòng ngô Tangsipingtou thuần bằng

nuôi cấy in vitro để đánh giá ảnh hưởng của kiểu gen, môi trường, chất kích

thích sinh trưởng và phương pháp tạo mô sẹo có nguồn gốc từ phôi non và tái

khả năng tái sinh cây giảm đến một mức độ nhất định [52]

Shohael (2003) nghiên cứu 3 dòng ngô CML-161; CML-323;

- 72,0% Kết quả cho thấy môi trường đạt tỷ lệ cao nhất (72,0%) làmôi trường N6 có bổ sung L-proline 2,3 g/l, hydrolysate casein 200 mg/l và2,4-D 1,0 mg/l [42].

Năm 2004, Huang và Wei

7 dòng ngô

tương đối cao

Binott (2005) nuôi cấy phôi non từ 12 dòng ngô bố mẹ thuần chủng và

sinh cây Hạt non thu ở các giai đoạn 10, 15, 18, 21 và 24 ngày tuổi sau khithụ phấn và được khử trùng bề mặt Phôi non đem cấy trên môi trường tạo

casein 0,1 g/l, glycine 2 g/l, sucrose 30 g/l và gelrite 3 g/l nồng độ 2 mg/l

hình thành từ 80 đến 90% đối với phôi non của con lai và từ 50 đến80% đối với phôi non của dòng bố mẹ Khả năng phôi hóa được tiến hành ở 6

Năm 2011, Gorji nghiên cứu dòng ngô thuần khả năng tạo mô

khi bổ sung dicamba 2 mg/l, trong môi trường MS có bổ sung 2,4-D ở nồng

hơn so với môi trường N6 bổ sung 2,4-D Tỷ lệ hình thành rễ cao nhất khi đưachồi vào môi trường MS có bổ sung 2 mg/l NAA Trên môi trường MS có bổsung BAP 1 mg/l và IAA 0,5 mg/l thúc đẩy tần số hình thành chồi cao, tỷ lệtái sinh cây đạt từ 53 - 67% [31].

Nguyên liệu được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy tái sinh ngôphục vụ mục đích chuyển gen là phôi chưa trưởng thành [27], [28], [35], [50].Tuy nhiên, việc tạo phôi chưa trưởng thành là một quá trình khắt khe, cần thờigian để trồng cây, thụ phấn, tách các phôi chưa trưởng thành Cây mẹ trồngtheo mùa và mẫu cấy được thu vào một khoảng thời gian nhất định mới chokết quả tái sinh tốt [29], [31] Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra các nguyên liệukhác dễ dàng thu nhận hơn là một trong những thách thức lớn để có thể tiếnhành chuyển gen nhanh và hiệu quả hơn [24]

Trong tái sinh ngô, các thân non chưa trưởng thành lần đầu tiên được

sử dụng bởi Songstad [46] Trên môi trường N6 trung bình bổ sung 2,4-D,

dòng mô hình như A188 và B73 Ưu điểm của việc sử dụng các thân nonchưa trưởng thành là có thể nuôi cấy trong vòng 6 - 7 tuần, không cần đợi đếngiai đoạn sinh sản, thụ phấn, thụ tinh, phôi phát triển Đây là nguyên liệu lítưởng nhất vì mẫu cấy không cần thông qua quá trình giảm phâm và thụ tinh,giảm được sự biến đổi di truyền

3 mg/l

-0 - 3% [44].

1.2.2 Nghiên cứu tái sinh ngô ở Việt Nam

ngô, đó là: “nghiên cứu môitrường nuôi cấy in vitro phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen ở ngô

[11]

Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường N6 bổ sung 2,4-D 7 mg/l; casein 100

phôi 18 - 20 ngày đối với vụ hè

dòng

2dòng ngô HR8 và HR9 đạt lần lượt là 75,2% và 74,1%, tỷ lệ tái sinh cây đạt24,9% và 21,4% [14]

Nguyễn Văn Đồng (2009), tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh từphôi non của 45 dòng ngô Việt Nam thuộc 3 nhóm ngô tẻ, ngô nếp và ngôngọt, sử dụng dòng đối chứng là dòng ngô mô hình HR8 có khả năn

[4].

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.3 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và thành phần môi trường đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngô

1.3.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

sinh trưởng, phân chia tế bào và kiểm soát sự biệt hóa cũng như phát sinh

hình thái của thực vật Trong nuôi cấy tế bào in vitro, các chất điều hòa sinh

trưởng là thành phần quan tr

điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất

, loại mô, hàm lượng chất

cytokinin [15]

Auxin

Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indolaxetic (IAA) nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng n

Auxin gồm có auxin tự nhiên

và auxin tổng hợp (2,4-D, IBA, NAA …) [8] Trong nuôi cấy in vitro, auxin

có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, thúc đẩy sự sinh trưởng của

dụng từ 0,1 - 10 mg/l Còn 2,4-D được bổ sung vào môi trường cho hiệu quảtạo mô sẹo ở nhiều loại thực vật [1], [18].

Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô cây ngũcốc đã được Bhaskaran và Smith (1990) tổng kết Nhìn chung, chất điều hòasinh trưởng nhóm auxin điển hình là 2,4-D với nồng độ 1 - 3 mg/l cần thiếtcho sự hình thành mô sẹo phôi hóa từ phôi hợp tử 2,4-D là yếu tố quan trọngtrong sự khởi đầu phát triển của mô sẹo và mô sẹo có khả năng tạo phôi từphôi non ngô [20].

2,4-D là chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất để cảmứng tạo mô sẹo từ phôi Việc bổ sung các citokynin kết hợp với 2,4-D có thểlàm tăng phản ứng của phôi trong một số loài cỏ Kiểu gen là một yếu tố cóvai trò cơ bản trong quá trình phôi cảm ứng ngô [27], [35], [36], [51]

Khi nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non dòng ngô lai F1(M947 x M948) và (M950 x M951) của Das (2001) cho thấy môi trường MS

có bổ sung 2,4-D 2 mg/l là hiệu quả nhất [26] Sairam (2003) cũng đã tạođược mô sẹo từ các mẫu mô phân sinh chồi đỉnh với tần số tương đối cao(80%) khi bổ sung 2,4-D 5 mg/l vào môi trường nuôi cấy

Shohael (2003) nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến sự tạo

2,4-D 1,5 - 2,5 mg/l và thấy các dòng ngô có nồng độ 2,4-D tối ưu khácnhau [39]

Cytokinin

Loại cytokinin đầu tiên pháthiện được là zeatin tách từ mầm ngô Ngoài ra còn có hàng loạt cytokininkhác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea…, trong đókinetin không có mặt trong tự nhiên, thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA [8].Cytokinin liên quan tới sự phân bào, duy trì sự trẻ hóa các cơ quan, làm giảmhiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy Hàm

lượng cytokinin cao sẽ hoạt hóa thành chồi bất định, chồi nhiều nhưng kích thước nhỏ [17] Các cytokinin thường dùng là: BAP, kinetin…

Những năm 1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BAP có thể kích thíchnhiều quá trình, BAP được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phátsinh phôi với các nồng độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật và mục đíchnuôi cấy [8]

Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển H

Việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin kết hợp vớiauxin trong quá trình hình thành phôi soma từ các mẫu mô sẹo của các câyngũ cốc cũng đã được nghiên cứu Theo Cho (1998), bổ sung BAP 0,1 mg/lkết hợp với 2,4-D 2 mg/l vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với sựhình thành và duy trì mô sẹo phôi hóa [25]

1 m

21 [22]

[33].

nuôi cấy bổ sung 2,4-D 2 mg/l kết hợp với BAP 0,2 mg/l làm tăng hiệu quảtạo mô sẹo phôi hóa từ phôi non của 2 dòng ngô nội phối C8605 và 9046 [34]

của thành phần môi trường của nitrat bạc