LUẬN văn THẠC sĩ CÔNG NGHỆ SINH học (FULL) đánh giá sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương (glycine max merril) địa phương

Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phương phápmới trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống cây trồng nói chung và của cây đậu tương nói riêng như RAPD, RFLP, AFLP, SS

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) còn gọi là đậu nành là một cây

trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Sản phẩm của nó làm thực phẩmcho con người, thức ăn cho gia súc nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất

khẩu và là cây cải tạo đất tốt [5] Vì thế cây đậu tương được gọi là "Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu" Hiện nay, cả nước đã hình thành 6 vùng

sản xuất đậu tương: vùng Đông Nam bộ có diện tích lớn nhất (26,2% diện tíchđậu tương cả nước), miền núi Bắc bộ: 24,7%, đồng bằng sông Hồng: 17,5%,đồng bằng sông Cửu Long: 12,4%[2] Tổng diện tích 4 vùng này chiếm 80%diện tích trồng đậu tương cả nước, còn lại là đồng bằng ven biển miền Trung

và Tây Nguyên [5]

Các giống đậu tương ở nước ta hiện nay rất phong phú bao gồm cácgiống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến và tập đoàncác giống đậu tương địa phương Các giống đậu tương địa phương Việt Namcũng rất đa dạng, phong phú cả về kiểu hình và kiểu gen Đây là nguồn vậtliệu quý cho công tác chọn tạo giống đậu tương phù hợp với điều kiện sảnxuất của từng vùng, miền khác nhau [10]

Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương địa phương tạo

cơ sở cho công tác chọn tạo giống đã và đang được nhiều nhà khoa học quantâm nghiên cứu Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phương phápmới trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống cây trồng nói chung

và của cây đậu tương nói riêng như RAPD, RFLP, AFLP, SSR, STS, Cácphương pháp này không những phát huy hiệu quả mà còn khắc phục nhượcđiểm của các phương pháp chọn giống truyền thống bởi hiệu quả sàng lọccao, tiết kiệm thời gian và tin cậy

Trên thế giới, kỹ thuật RAPD đã được nhiều tác giả sử dụng để nghiêncứu quan hệ di truyền của một số giống đậu tương như: [26], [32], [34],[43], [49], [50] Ở Việt Nam, Vũ Anh Đào (2009), đánh giá sự đa dạng ditruyền ở mức phân tử của 16 giống đậu tương với 10 mồi ngẫu nhiên bằng kỹthuật RAPD tổng số phân đoạn DNA thu được là 766 Trong phạm vi vùngphân tích có 56 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đó có 21 băng vạchcho tính đa hình (tương ứng 37,5%) [4], Chu Hoàng Mậu và đtg (2002) đã

sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích sự sai khác về hệ gen giữa các dòngđậu tương đột biến với nhau và với giống gốc, tạo cơ sở cho chọn dòng độtbiến có triển vọng [12] Nhằm tạo cơ sở cho việc lựa chọn giống đậutương có chất lượng tốt phục vụ công tác lai tạo giống, chúng tôi lựa chọn

và tiến hành nghiên cứu đề tài luận văn thạc sĩ là: “Đánh giá sự đa dạng di

truyền của một số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) địa

phương”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được sự khác biệt trong hệ gen và mối quan hệ di truyền của 30giống đậu tương địa phương bằng kỹ thuật RAPD

3 Nộ i dung nghiên cứu

3.1 Phân tích sự đa dạng của một số đặc điểm hình thái, khối lượng của hạtnhư: màu vỏ hạt, rốn hạt, hình dạng hạt, khối lượng 1000 hạt của các giốngđậu tương nghiên cứu

3.2 Sử dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) đểkhuếch đại các phân đoạn DNA với sự sàng lọc với 16 mồi ngẫu nhiên cókích thước 10 nucleotide

3.3 Xác định hệ số đa dạng trong hệ gen của các giống đậu tương nghiên cứu.3.4 Thiết lập sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ và khoảng cách di truyềncủa các giống đậu tương nghiên cứu

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Theo từ điển thực phẩm, cây đậu tương được biết có nguồn gốc xa xưa

từ Trung Quốc và được coi là cây thực phẩm cho đời sống con người từ hơn

4000 năm trước, sau đó được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứVIII, vào nhiều thế kỷ sau có mặt ở các nước Á Châu như Thái lan, Malaisia,Korea và Việt Nam Cây đậu tương có mặt ở Âu Châu vào đầu thế kỷ XVII

và ở Hoa Kỳ vào thế kỷ XVIII Ngày nay Hoa Kỳ là quốc gia đứng đầu sảnxuất đậu tương chiếm 50% sản lượng trên toàn thế giới, rồi đến Braxin,Achentina, Trung Quốc [19]

Đậu tương thuộc chi Glycine, họ đậu Leguminosae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae và bộ Phaseoleae Đậu tương có tên khoa học là Glycine Max (L) Merrill, có bộ NST 2n = 40 [5], [2].

Do xuất phát từ những yêu cầu, căn cứ và tiêu chí phân loại khác nhaunên cũng có nhiều cách phân loại khác nhau Nhưng đến nay, hệ thống phânloại căn cứ vào đặc điểm về hình thái, phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắcthể được nhiều người sử dụng [5]

Hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm về hình thái, sự phân bố địa lý

và số lượng (NST) nhiễm sắc thể do Hymowit và Newell (1984) xây dựng

Theo hệ thống này ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja Chi Glycine được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia ra làm

2 loài: loài đậu tương trồng Glycine (L.) Merr và loài hoang dại hàng năm G Soja Sieb và Zucc.

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học của cây đậu tương

Cây đậu tương là cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ,thân, lá, hoa, quả và hạt

Rễ đậu tương

Rễ cây đậu tương có rễ chính và rễ phụ Rễ chính có thể ăn sâu 30-50cm

và có thể trên 1m Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tậptrung nhiều ở tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2 Trên rễ chính và rễ phụ cónhiều nốt sần Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần ít haynhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu và kỹ thuật trồng

Quá trình phát triển của bộ rễ có thể phân ra làm 2 thời kỳ: (i) Ở thời kỳthứ nhất, lớp rễ đầu tiên được phát triển, rễ cái và rễ phụ đầu tiên phát triểnmạnh kéo dài ra và sinh nhiều rễ con Thời kỳ này thường kéo dài từ 30-40ngày sau mọc (ii) Ở thời kỳ thứ hai, lớp rễ đầu tiên phát triển chậm dần, rễ conkhông nhú ra nữa thậm chí có một số rễ con khô đi Lúc này gốc thân gần cổ

rễ các rễ phụ nhỏ kéo dài ra và phát triển cho tới khi gần thu hoạch Số lượng

có thể 30-40 rễ phụ ăn ở phía gần mặt đất Lớp rễ này có nhiệm vụ cung cấpđấy đủ chất dinh dưỡng cho sự phát triển của thân, lá và làm quả Trong kỹthuật trồng nên chú ý thời kỳ này, cần vun đất sao cho lớp rễ này phát triểnmạnh Một đặc điểm hết sức quan trọng cần lưu ý là trên bộ rễ của cây đậutương có rất nhiều nốt sần Đó là các u bướu nhỏ bám vào các rễ Nốt sần là

kết quả cộng sinh của một số loại vi sinh vật có tên khoa học là Rhizobium Japonicum với rễ cây đậu tương Vi sinh vật thường có dạng hình cầu hoặc

hình que [5] Trong một nốt sần có khoảng 3-4 tỷ vi sinh vật, mà ta chỉ có

thể nhìn thấy chúng qua kính hiển vi phóng đại 600 - 1000 lần [5], [19]

Nốt sần ở rễ đậu tương thường tập trung ở tầng đất 0-20cm, từ 30cm nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít hoặc không có Nốt sần đóng vai

20-trò chính trong quá trình cố định đạm khí trời cung cấp cho cây Lượng đạmcung cấp cho cây khá lớn khoảng 30-60 kg/ha Nốt sần có thể dài l cm, đườngkính 5 - 6 mm, mới hình thành có màu trắng sữa, khi tốt nhất có màu hồng(màu globulin có cấu tạo gần giống hemoglobin trong máu có Fe) [5].

Thân đậu tương

Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiềulông nhỏ Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyểnsang màu nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ vớimàu sắc của hoa sau này Nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu trắng

và nếu khi còn non thân có màu tím thì hoa có màu tím đỏ Thân có trungbình 14-15 lóng, các lóng ở phía dưới thường ngắn, các lóng ở phía trênthường dài (vì những lóng phía trên phát triển từ ngày 35-40 trở đi vào lúccây đang sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài) Tuỳ theo giống và thời vụgieo mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ 3 - 10 cm Câyđậu tương trong vụ hè thường có lóng dài hơn vụ xuân và vụ đông Chiều dàicủa lóng góp phần quyết định chiều cao của thân Thân cây đậu tương thườngcao từ 0,3 m - 1,0 m Giống đậu tương dại cao 2-3 m Những giống thân nhỏlóng dài dễ bị đổ hay mọc bò thường làm thức ăn cho gia súc Những giốngthân to thường là thân đứng và có nhiều hạt và chống được gió bão Toàn thân

có một lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống

lá Thực tế cũng có giống không có lông tơ Những giống có mật độ lông tơdày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn và chịu rét khoẻ Ngược lại nhữnggiống không có lông tơ thường sinh trưởng không bình thường, sức chốngchịu kém Thân có lông tơ nhiều ít dài ngắn, dày thưa là một đặc điểm phânbiệt giữa các giống với nhau[19]

Căn cứ vào tập tính sinh trưởng và đặc điểm của thân người ta chia ralàm 4 loại: (i) Loại mọc thẳng: thân cứng, đường kính thân lớn, thân khôngcao lắm, đốt ngắn, quả nhiều tập trung thường là giống ra hoa hữu hạn; (2)Loại bò: thân chính phân cành rất nhỏ, mềm, phủ trên mặt đất thành đám dây,thân rất dài, đốt dài, quả nhỏ phân tán; (3) Loại nửa bò: là loại trung gian giữa

2 loại mọc thẳng và mọc bò trên; (4) Loại mọc leo: thân nhỏ rất dài, mọc bòdưới đất hoặc leo lên giá thể khác

Thân đậu tương có khả năng phân cành ngay từ nách lá đơn hoặc kép.Những cành trên thân chính phân ra gọi là cành cấp 1, trên cành cấp 1 có thểphân ra cành cấp 2 Số lượng cành trên một cây nhiều hay ít thay đổi theogiống, thời vụ, mật độ gieo trồng và đ iều kiện canh tác Trung bình trên 1 câythường có 2-5 cành, có một số giống trong điều kiện sinh trưởng tốt có thể cótrên 10 cành Thường sau mọc khoảng 20-25 ngày thì cây đậu tương bắt đầuphân cành Vị trí phân cành phù hợp là cao trên 15cm, nếu thấp quá không cólợi cho việc cơ giới hoá Giống đậu tương có góc độ phân cành càng hẹp thìcàng tốt cho việc tăng mật độ[5]

Lá đậu tương

Lá đậu tương có 3 loại: Lá mầm, lá nguyên, lá kép

Lá mầm (lá tử diệp) mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc vớiánh sáng thì chuyển sang màu xanh Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinhdưỡng nuôi cây mầm, khi hết chất dinh dưỡng lá mầm khô héo đi, cho nêntrong kỹ thuật trồng đậu tương nên làm đất tơi nhỏ và chọn hạt to cây sẽ mọckhoẻ, sinh trưởng tốt

Lá nguyên (lá đơn) xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3 ngày và mọc phíatrên lá mầm Lá đơn mọc đối xứng nhau Lá đơn to màu xanh bóng là biểuhiện cây sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của một giống có khảnăng chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng không bìnhthường

Lá kép gồm có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét Lá kép mọc so le, lá képthường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu Cũng có giống khiquả chín lá vẫn giữ được màu xanh, những giống này thích hợp trồng làmthức ăn gia súc Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ Lá có nhiều hình dạng khácnhau tuỳ theo giống, những giống lá nhỏ và dài chịu hạn khoẻ nhưng thườngcho năng suất thấp Những giống lá to chống chịu hạn kém nhưng thường chonăng suất cao hơn Nếu 2 lá kép đầu to và dày thường biểu hiện giống có khảnăng chống chịu rét Số lượng lá kép nhiều hay ít, diện tích lá to hay nhỏ chiphối rất lớn đến năng suất và phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các lá nằmcạnh chùm hoa nào giữ vai trò chủ chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùmhoa ấy Nếu vì điều kiện nào đó làm cho lá bị úa vàng thì quả ở vị trí đóthường bị rụng hoặc lép Các nhà chọn giống đậu tương đưa ra cơ sở để nângcao năng suất đậu tương tăng cường quá trình quang hợp và muốn quang hợpvới hiệu quả cao thì phải chọn những cây có bộ lá nhỏ, dày, thế lá đứng và lá

có dạng hình trứng Số lá nhiều to khoẻ nhất vào thời kỳ đang ra hoa rộ Khiphiến lá phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi là biểu hiện câysinh trưởng khoẻ có khả năng cho năng suất cao [5]

Hoa đậu tương

Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm Màu sắc củahoa thay đổi tuỳ theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng Đaphần các giống có hoa màu tím và tím nhạt Các giống đậu tương có hoa màutrắng thường có tỷ lệ dầu cao hơn các giống màu tím Hoa phát sinh ở nách lá,đầu cành và đầu thân Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1-10 hoa vàthường có 3-5 hoa Hoa đậu tương ra nhiều nhưng tỷ lệ rụng rất cao khoảng30% có khi lên tới 80%

Hoa đậu tương thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị vànhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy.

- Đài hoa có màu xanh, nhiều bông

- Cánh hoa: Một cánh to gọi là cánh cờ, 2 cánh bướm và 2 cánh thìa

- Nhị đực: 9 nhị đực cuốn thành ống ôm lấy vòi nhuỵ cái và 1 nhị riêng lẻ

- Nhụy cái: Bầu thượng, tử phòng một ngăn có 1-4 tâm bì (noãn) nên thường

quả đậu tương có 2-3 hạt [5]

Các cánh hoa vươn ra khỏi lá đài từ ngày hôm trước và việc thụ phấnxẩy ra vào sáng ngày hôm sau lúc 8-9 giờ sáng trước khi nụ hoặc hoa chưa nởhoàn toàn Mùa hè hoa thường nở sớm hơn mùa đông và thời gian nở hoa rấtngắn sáng nở chiều tàn Hoa đậu tương thường thụ phấn trước khi hoa nở và

là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chiếm trung bình 0,5 - 1% [2].Thời gian bắt đầu ra hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống

và thời tiết khác nhau Giống chín sớm sau mọc trên dưới 30 ngày đã ra hoa vàgiống chín muộn 45-50 ngày mới ra hoa Thời gian ra hoa dài hay ngắn theogiống và theo thời vụ Có những giống thời gian ra hoa chỉ kéo dài 10-15 ngày.Kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ hoa rộ thường từ ngày thứ 5 đến ngày thứ

10 sau khi hoa bắt đầu nở Hoa trong đợt rộ mới tạo quả nhiều, còn trước vàsau đợt hoa rộ thì tỷ lệ đậu quả thấp Điều kiện thích hợp cho sự nở hoa là ởnhiệt độ 25-280C, ẩm độ không khí 75-80%, ẩm độ đất 70-80% Căn cứ vàophương thức ra hoa người ta chia các giống đậu tương làm 2 nhóm:

Nhóm ra hoa hữu hạn: Thuộc những giống sinh trưởng hữu hạn,

hướng ra hoa theo trình tự từ trên xuống dưới và từ ngoài vào trong Nhữnggiống này thường cây thấp ra hoa tập trung, quả và hạt đồng đều

Nhóm ra hoa vô hạn: Thuộc những giống sinh trưởng vô hạn, có

hướng ra hoa theo trình tự từ dưới lên trên và từ trong ra ngoài Những giốngnày thường ra hoa rất phân tán, quả chín không tập trung và phẩm chất hạtkhông đồng đều [5] Trong thực tế, những giống hoa tập trung nếu gặp điềukiện bất thuận, hoa sẽ rụng nhiều nên thất thu nặng Còn những giống thờigian ra hoa dài tuy quả chín không tập trung nhưng nếu bị rụng vào một đợtthì hoa sẽ ra tiếp đợt sau nên không thất thu nặng Một hoa có từ 1800-6800hạt phấn tuỳ theo giống khác nhau, giống hạt to thì có bao phấn to và nhiềuhạt phấn Hạt phấn thường hình tròn, số lượng và kích thước hạt phấn tuỳgiống khác nhau, giống hạt to thường có hạt phấn to và nhiều hơn so vớigiống có hạt nhỏ Hạt phấn nảy mầm tốt trong điều kiện nhiệt độ 18-230C.

Quả và hạt

Số quả biến động từ 2 đến 20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới 400quả trên một cây một quả chứa từ 1 tới 5 hạt, nhưng hầu hết các giống quảthường từ 2 đến 3 hạt Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài từ 2tới 7 cm hoặc hơn Quả có màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâuhoặc đen Màu sắc quả phụ thuộc vào sắc tố caroten, xanthophyll, màu sắc củalông, sự có mặt của các sắc tố antocyanin Lúc quả non có màu xanh nhiềulông (có khả năng quang hợp do có diệp lục) khi chín có màu nâu Hoa đậutương ra nhiều nhưng tỷ lệ đậu quả thấp 20-30% Ví dụ trong vụ xuân 1 cây cóthể có 120 hoa nhưng chỉ đậu 30-40 quả là cao, trên một chùm 5-8 hoa chỉ đậu2- 3 quả Những đốt ở phía gốc thường quả ít hoặc không có quả, từ đốt thứ 5-6trở lên tỷ lệ đậu quả cao và quả chắc nhiều Trên cành thường từ đốt 2-3 trở lênmới có quả chắc, những quả trên đầu cành thường lép nhiều Sau khi hoa nởđược 2 ngày thì cánh hoa héo và rụng, ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 sau hoa nở đãhình thành quả và 7 -8 ngày sau là thấy nhân quả xuất hiện Trong 18 ngày đầuquả lớn rất nhanh sau đó chậm dần, vỏ dày lên và chuyển từ màu xanh sangmàu vàng Hạt lớn nhanh trong vòng 30- 35 ngày sau khi hình thành quả

Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: Hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹtvv Giống có màu vàng giá trị thương phẩm cao Trong hạt, phôi thườngchiếm 2%, 2 lá tử điệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt Hạt tonhỏ khác nhau tuỳ theo giống, khối lượng một nghìn hạt (M1000 hạt) thay đổi

từ 20-400g trung bình từ l00g-200g Rốn hạt của các giống khác nhau thì cómàu sắc và hình dạng khác nhau, đây là một biểu hiện đặc trưng của của cácgiống[5]

1.1.3 Thành phần hoá sinh của hạt đậu tương

Hàm lượng các axit amin quan trọng có chứa lưu huỳnh như methionine

và cysteine của đậu tượng cao gần bằng hàm lượng các chất này có trong trứng

gà Hàm lượng casein, đặc biệt lysine cao gần gấp rưỡi lần chất này có trongtrứng Vì thế mà khi nói về giá trị của protein trong hạt đậu tương là nói đến hàmlượng protein cao và sự cân đối của các loại axít amin cần thiết Protein của đậutương dễ tiêu hoá hơn thịt và không có các thành phần tạo colesteron Ngày nayngười ta mới biết thêm hạt đậu tương có chứa lecithin, có tác dụng làm cho cơthể trẻ lâu, tăng thêm trí nhớ, tái tạo các mô, làm cứng xương và tăng sức đềkháng của cơ thể

Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗkhác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng Lipit của đậutương chứa một tỉ lệ cao các axít béo chưa no (khoảng 60-70%) có hệ số đồnghoá cao, mùi vị thơm như axit linoleic chiếm 52-65%, oleic từ 25-36%,linolenolic khoảng 2- 3% Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránhđược xơ mỡ động mạch [2]

1.1.4 Vị trí, tầm quan trọng của cây đậu tương

Giá trị về mặt thực phẩm

Trong hạt đậu tương có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượngvitamin B1 và B2 ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C,v.v Đặc biệt trong hạt đậu tương đang nảy mầm hàm lượng vitamin tăng lênnhiều, đặc biệt là vitamin C Phân tích thành phần sinh hoá cho thấy trong hạtđậu tương đang nảy mầm, ngoài hàm lượng vitamin C cao, còn có các thànhphần khác như: vitamin PP, và nhiều chất khoáng khác như Ca, P, Fev.v Chính vì thành phần dinh dưỡng cao như vậy nên đậu tương có khả năngcung cấp năng lượng khá cao khoảng 4700 cal/kg [7] Hiện nay, từ hạt đậutương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó cóhơn 300 loại làm thực phẩm được chế biến bằng cả phương pháp cổ truyền,thủ công và hiện đại dưới dạng tươi, khô và lên men vv như làm giá, đậuphụ, tương, xì dầu vv đến các sản phẩm cao cấp khác như cà phê đậu tương,bánh kẹo và thịt nhân tạo vv Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặcbiệt là đậu tương hạt đen, có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột.Đậu tương là thức ăn tốt cho những người bị bệnh đái đường, thấp khớp, thầnkinh suy nhược

Giá trị về mặt công nghiệp

Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như:chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chấtđốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tươngđược dùng để ép dầu Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu vềcung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầuthực vật Đặc điểm của dầu đậu tương: khô chậm, chỉ số iốt cao : 120- 127 ;ngưng tụ ở nhiệt độ: - 15 đến -18oC Từ dầu này người ta chế ra hàng trăm sảnphẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà phòng, ni lông v.v

Giá trị về mặt nông nghiệp

Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1 kg hạt đậu tương đương với1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Toàn cây đậu tương (thân, lá, quả, hạt) có hàmlượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức

ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc Sảnphẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N:6,2%,P2O5: 0,7%, K2O: 2,4%, vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [2]

Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1 ha trồng đậu tương nếusinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N [19] Trong hệ thốngluân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tácdụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng

mà giảm chi phí cho việc bón N Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phânhữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong thân chiếm 0,05%, trong lá: 0,19% [6]

Tóm lại, hạt đậu tương có giá trị rất cao về dinh dưỡng, giá trị của nóđược đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protein và lipit, trong đó hàm lượngprotein dự trữ và chất lượng của chúng là yếu tố quan trọng đã quyết định vaitrò và vị thế của cây đậu tương so với các cây ngũ cốc khác, đậu tương đã trởthành loài thực vật cung cấp nguồn thực phẩm quan trọng cho người và gia súc,hạt đậu tương có

thể chế biến tới 600 sản phẩm khác nhau, ngoài ra đậu tương còn dùng làmthuốc chữa bệnh rất tốt và lành tính trong đó đậu tương có màu đen có nhiềuứng dụng trong lĩnh vực này.

1.2 NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG VÀ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN

đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dụng mồi đơnchứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên [17] Đến nay, kỹ thuật này đã và đangđược ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử Người ta

đã sử dụng kỹ thuật này để thiết lập bản đồ di truyền, đánh giá hệ gen củagiống và sự đa dạng di truyền của tập đoàn giống [27]

Về nguyên lý, kỹ thuật RAPD có cơ sở là kỹ thuật PCR, nhưng sử dụng mồi ngẫu nhiên để nhân bản những đoạn DNA hoàn toàn ngẫu nhiên trong hệ gen

Các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm:

- DNA khuôn (DNA template) với nồng độ 5 - 50 ng trong 20 - 25 µl.DNA khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng RAPD, được tách từ các mẫu:virus, vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật… DNA có độ tinh sạch, có thể là sợiđơn, sợi đôi, mạch vòng hoặc mạch thẳng DNA khuôn được khuếch đại dướidạng thẳng có hiệu quả hơn dạng vòng Kích thước DNA khuôn nhỏ hơn 3 kbcho kết quả tốt nhất [8]

- Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleotide cótrật tự nucleotide ngẫu nhiên và có chiều dài 8 - 10 nucleotide (thường sửdụng mồi dài 10 nucleotide) Nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng RAPDthấp (320 - 400C) Nồng độ mồi phải thích hợp để đảm bảo kết quả phản ứng(phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp) tạo nên lượng sản phẩm cần thiết.Nếu nồng độ mồi quá cao có thể làm cho hiệu quả phản ứng kém chính xác,

do mồi bám vào các vị trí không đặc hiệu Nếu nồng độ mồi quá thấp sẽkhông đảm bảo đủ lượng sản phẩm RAPD

- Taq-polymerase: là một enzyme quan trọng, có vai trò quyết định đến

phản ứng PCR Đây là loại enzyme chịu được nhiệt độ cao trong các loạienzyme Đặc điểm của chúng là có khả năng kéo dài mồi để tạo một sản phẩm

có chiều dài 8 - 13 kb Taq-polymerase được tách chiết từ chủng vi khuẩn ở suối nước nóng Thermus aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến

tính DNA (92o - 950C) Taq - polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, tồn

tại ở nhiệt độ ủ 950C kéo dài Enzyme này có hoạt tính cao ở 720 - 800C làmcho phản ứng xảy ra nhanh, hiệu quả và chính xác [1]

- dNTP: là các nucleotide tự do được sử dụng làm nguyên liệu cho phảnứng RAPD, gồm bốn loại: dATP, dTTP, dGTP, dCTP Nồng độ dNTP mỗiloại thường dùng trong các phản ứng RAPD khoảng 50 - 200 µM Nếu nồng

độ các loại dNTP quá ít thì tạo sản phẩm ít không đủ để phát hiện, ngược lại,nồng độ dNTP quá cao thì phản ứng khó thực hiện [17]

- Dung dịch đệm: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đếnchất lượng và hiệu quả của phản ứng Dung dịch đệm của phản ứng phảiđảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt động của enzyme như:MgCl2, KCl, Tris HCl Thành phần của dung dịch đệm của phản ứng baogồm: Tris HCl 10mM (pH = 8.3 ở nhiệt độ phòng), KCl 50mM, MgCl2

1,5mM khi ủ ở nhiệt độ phòng Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0,5 5mM Thành phần này đóng vai trò quan trọng đến khả năng bắt cặp vàgắn các mồi với mạch khuôn [1], [8].

-Chu kỳ phản ứng

Phản ứng RAPD được tiến hành qua các giai đoạn sau:

- Giai đoạn biến tính DNA: Ở nhiệt độ 950C trong 30 - 60 giây làm cho cácliên kết hydro giữa 2 mạch bị đứt Khi đó DNA sợi đôi tách thành 2 sợi đơntạo điều kiện cho sự bắt cặp mồi

- Giai đoạn tiếp hợp mồi: Nhiệt độ hạ xuống 320 - 400C, mồi bám vào đầu

3’OH của mạch khuôn DNA và bắt đầu quá trình tổng hợp sợi mới

- Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 720C thì các đoạn mồi đã bắt

cặp với các mạch đơn sẽ được kéo dài với sự tham gia của Taq - polymerase.

Một chu kỳ trên xảy ra, một đoạn DNA được nhân lên thành hai, cácđoạn DNA được nhân tiếp tục được coi là mạch khuôn để tổng hợp cho chu kìsau Như vậy, sau n chu kỳ thì sẽ tạo ra 2n các đoạn DNA giống hệt đoạnDNA khuôn ban đầu Phản ứng RAPD có thể thực hiện 40 - 45 chu kỳ

1.2.1.2 Kỹ thuật AFLP

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hình độ dài cácđoạn được nhân bản chọn lọc) là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR Kỹthuật này cho phép phát hiện một cách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen đãđược cắt bởi enzyme giới hạn và gắn với đoạn tiếp hợp

Về nguyên tắc, kỹ thuật AFLP tương tự như kỹ thuật RAPD, chỉ có điểmkhác biệt là mồi trong phản ứng AFLP gồm hai phần: phần cố định dàikhoảng 15 bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay đổi dàikhoảng 2 - 4 bp Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide có độ

phân giải cao Sự đa hình được xác định bởi sự có mặt hay vắng mặt của một phân đoạn DNA.

Kỹ thuật AFLP có ưu điểm là phân tích đa hình di truyền trong khoảngthời gian ngắn, lượng DNA đòi hỏi ít, cho sự đa hình cao Kỹ thuật này đượcđánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng ditruyền ở cây trồng, như lúa, lạc, đậu xanh, đậu tương [35]

1.2.1.3 Kỹ thuật RFLP

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - đa hình độ dài cácđoạn cắt giới hạn) là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA hệgen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn DNA có độ dài xácđịnh, số lượng các đoạn phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen Sửdụng kỹ thuật RFLP có thể xác định một tính trạng ở trạng thái đồng hợphoặc dị hợp trong một cá thể Vì vậy, RFLP là một chỉ thị tin cậy trong phântích liên kết và chọn giống [51] Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là tốnkém và mất thời gian Kỹ thuật này đòi hỏi phải có một lượng DNA lớn (50 -

200 ng từ mỗi cá thể)

1.2.1.4 Kỹ thuật SSR

SSR (Simple Sequence Repeats - trình tự lặp lại đơn giản) hay còn gọi

là vi vệ tinh (microsatellites) Kỹ thuật này được Litt và Luty phát triển năm

1989 dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR Trong cấu trúc hệ gen của sinhvật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự nucleotide lặp lại, chúng đặc trưngcho loài SSR gồm 2 - 5 nucleotide lặp lại nhiều lần Thông thường, các SSR

có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của NST, như vùng tâm động hoặccác đầu mút Chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa hoạt động củacác gen, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của NST trong các quá trìnhphân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác

định giới tính ở cả động vật và thực vật Do sự khác nhau về số lượngnucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR đượcnhân bản sẽ được phát hiện sau quá trình điện di trên gel agarose haypolyacrylamide.

SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống câytrồng, do khả năng phát hiện tính đa hình rất cao Song chỉ thị này có nhượcđiểm là sự phức tạp trong thiết kế mồi và giá thành thiết kế mồi cao Trongthực tế, chỉ thị này đã được sử dụng để nghiên cứu một số tính trạng liên quanđến năng suất, bệnh hại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lậpbản đồ gen… [20], [39]

1.2.2 Sử dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng và mối quan

hệ di truyền ở thực vật

Hiện nay, kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi trongnghiên cứu và xác định quan hệ di truyền ở thực vật Kỹ thuật RAPD cũngđược ứng dụng trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền giữa các loài và trongphạm vi một loài phân tích và đánh giá hệ gen của thực vật nhằm xác địnhnhững thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức phân tử

Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá hệ gen củagiống và mối quan hệ di truyền giữa các loài, nhóm các cá thể cùng một loài[9]

Đinh Thị Phòng và đtg (2001), đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để đánh giá

sự thay đổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, kết quả

đã chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử giữa các dòng lúa chọn lọc [14]

Nguyễn Thị Tâm (2003), sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để phân tích đahình DNA trong bộ gen của dòng lúa được chọn lọc, kết quả các dòng có sựsai khác ở mức độ phân tử, trong đó dòng HR128 có hệ số sai khác với giốnggốc là lớn nhất [21]

Trương Quang Vinh và đtg (2008), đánh giá sự đa hình DNA của một

số giống khoai tây nhập nội và của Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD, kết quả đãthu được 78 phân đoạn DNA có kích thước từ 0,25 – 3 kb, được tạo ra từ 14mồi ngẫu nhiên, đã xác định có 11 mồi cho tính đa hình Hệ số sai khác ditruyền của 8 giống khoai tây nghiên cứu từ 4,5% đến 31,1% [23]

Trần Thị Ngọc Diệp (2009), nghiên cứu sự đa dạng di truyền phân tửcủa 14 giống ngô với 10 mồi ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD, kết quả thuđược 674 băng rõ nét và đã phát hiện được sự sai khác về mặt di truyền giữacác giống ngô nghiên cứu [3]

Nguyễn Minh Quế (2009), sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để đánh giá mốiquan hệ di truyền của 5 giống dẻ bằng kỹ thuật RAPD tổng số phân đoạnđược nhân bản ngẫu nhiên là 46 phân đoạn Trong đó có 14 phân đoạn chotính đa hình (chiếm 30,4%) và không cho đa hình là 32 phân đoạn (chiếm69,9%) [16]

Hoàng Thị Thao (2010), bằng kỹ thuật RAPD với việc sử dụng 10 mồingẫu nhiên đã nhận được 1208 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên từ

hệ gen của 30 giống đậu xanh Trong 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng thì cả 10mồi biểu hiện tính đa hình Kết quả phân tích cho thấy, 30 giống đậu xanhnghiên cứu chia thành 2 nhóm chính, hệ số tương đồng di truyền giữa 2 nhóm

Raghunathachari và đtg (2000), đã xác định được sự đa dạng di truyền của

18 giống lúa nhờ kỹ thuật RAPD Nhóm tác giả đã sử dụng 10 mồi và thu được

144 băng DNA, trong đó các băng thể hiện tính đa hình chiếm 95,1% [40]

Ranade và đtg (2001), sử dụng 40 mồi ngẫu nhiên để nghiên cứu đặcđiểm của 12 giống đậu đen Kết quả phân tích sản phẩm RAPD chỉ ra đượcmột số băng đặc hiệu tương ứng với các mồi ngẫu nhiên để phân biệt một sốgiống trong nhóm nghiên cứu [42]

Raina và đtg (2001) đã sử dụng chỉ thị RAPD - SSR để phân tích sự đadạng hệ gen và xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc dại[41]

Jorge và đtg (2003), đã đánh giá sự tương đồng di truyền giữa cácgiống chè ở Hy Lạp nhờ kỹ thuật RAPD Họ sử dụng 25 mồi ngẫu nhiên đểkhuếch đại các đoạn DNA của 7 giống chè Kết quả cho 282 băng, trong đó

có 195 băng thể hiện tính đa hình Nghiên cứu cho thấy những giống chè ở

Hy Lạp có thể hiện tính đa dạng di truyền [33]

Paulo (2004) xác định mối quan hệ di truyền của 81 giống ngô (Zea mays) ở phía Nam Brazil nhờ chỉ thị RAPD Trong nghiên cứu này, tác giả sử

dụng 32 mồi ngẫu nhiên và kết quả thu được 225 băng, trong đó có 184 băngthể hiện tính đa hình (chiếm 72,2%) [37]

Dey và đtg (2005) nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 38 dòng lúathơm và 2 dòng đối chứng Nhóm tác giả đã tiến hành phản ứng RAPD với 5mồi ngẫu nhiên Kết quả khuếch đại được 44 băng DNA, với kích thước từ

500 - 3500 bp Trong 44 băng có 41 băng thể hiện tính đa hình [28]

Subramanian V và đtg (2006) đã nghiên cứu tính đa hình DNA ở câylạc nhờ kỹ thuật RAPD Nhóm tác giả đã sử dụng 48 mồi ngẫu nhiên và xác

định được 7 mồi (14,6%) đa hình Tổng số băng DNA được tạo ra từ 7 mồi đó

là 408 băng, trong đó có 27 băng thể hiện tính đa hình [45]

Yiwu Chen và đtg (2006), sử dụng 11 mồi ngẫu nhiên để đánh giá đadạng của một số giống lạc trong tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt, tácgiả đã nhận được 109 phân đoạn DNA, trong đó có 66 phân đoạn đa hìnhchiếm 60,6% Điều này cho thấy, trong phạm vi của mỗi phản ứng RAPDgiữa 33 giống lạc nghiên cứu khác nhau về cấu trúc DNA, mức sai khác từ4% đến 18% Kết quả phân tích DNA cho thấy các giống lạc ở cùng một vùngđịa lý, sinh thái được tập trung thành từng nhóm, giữa các giống chống chịubệnh gỉ sắt của tập đoàn giống ICRISAT và các giống có năng suất cao khôngphân bố ở cùng một nhánh Vì thế có thể lựa chọn các cặp bố mẹ mong muốn

để phục vụ cho công tác lai giống [48]

Awan (2007) sử dụng kỹ thuật RAPD để xác định mối quan hệ ditruyền của 7 giống lúa mì ở Pakistan (6 giống nhập nội và 1 giống khác) Kếtquả có 112 băng DNA được tạo ra từ 15 mồi ngẫu nhiên, trong đó có 50 băngthể hiện tính đa hình, mối tương đồng di truyền là 86,2 - 93% Điều này chobiết mối quan hệ gần gũi của các giống lúa mì này [24]

Venkata và đtg (2007) đã xác định tính đa hình DNA ở 21 giống chuối

ở Nam Ấn Độ nhờ chỉ thị RAPD và ISSR Phản ứng RAPD được thực hiệnvới 50 mồi và ISSR với 12 mồi Kết quả thu được 641 băng DNA, có kíchthước 200 - 3100 bp, trong đó có 382 băng thể hiện tính đa hình, tương ứngvới 60% tính đa dạng sinh học [47]

Gyu-Taek Cho và đtg (2008) cũng công bố kết quả nghiên cứu về sự đadạng di truyền và cấu trúc quần thể đậu tương ở Hàn Quốc [32]

Ở Việt Nam, quan hệ di truyền ở cây đậu tương cũng đã được nghiêncứu, tuy nhiên số lượng các nghiên cứu chưa nhiều

Chu Hoàng Mậu và đtg (2002) đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh

hệ gen của các đậu tương đột biến bằng kỹ thuật RAPD cho thấy ba đoạn mồi

có biểu hiện đa hình và 6 dòng đậu tương đột biến có mức độ sai khác vềDNA trong hệ gen [13]

Pham Thi Be Tu và cs (2003), Sử dụng 20 chỉ thị RAPD đánh giá 50mẫu giống đậu tương đã ghi nhận sự đa hình ở 17 chỉ thị [38].

Đinh Thị Phòng và Ngô Lam Giang (2008), Sử dụng 25 chỉ thị RAPDđánh giá sự đa hình của 19 giống đậu tương phát hiện 17 mồi chỉ ra tính đahình trong đó 3 mồi có tính đa hình cao[15]

Vũ Anh Đào (2009), đánh giá sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của 16giống đậu tương với 10 mồi ngẫu nhiên bằng kỹ thuật RAPD tổng số phânđoạn DNA thu được là 766 Trong phạm vi vùng phân tích có 56 phân đoạnDNA được nhân bản, trong đó có 21 băng vạch cho tính đa hình (tương ứng37,5%) [4]

Trên thế giới, Doldi và đtg (1997) sử dụng 33 mồi ngẫu nhiên để phânnhóm 18 giống đậu tương có đặc tính chín sớm Kết quả đã phân nhóm đượcmột số giống có hàm lượng protein cao, sử dụng cho chương trình nghiên cứunhằm mục đích nâng cao hàm lượng đạm các giống đậu tương thích nghi vớiđiều kiện Châu Âu [29]

Li và đtg (2002) đã phân tích 10 giống đậu tương trồng và đậu tương dại

ở bốn tỉnh của Trung Quốc đã bổ sung dữ liệu về sự đa dạng chỉ thị phân tửRAPD của các giống đậu tương này [34]

Sự đa dạng di truyền của các cây đậu tương dại (Glycine soja Siebold et

Zucc.) ở vùng Viễn Đông của nước Nga cũng đã được đánh giá ở mức phân

tử bởi Seitova và đtg (2004) [43]

Wie An, Hongkun Zhao và cs (2009), Đánh giá sự đa dạng di truyền của

50 giống đậu tương dại và đậu tương gieo trồng ở các vùng khác nhau củaTrung Quốc với 10 cặp mồi ngẫu nhiên[51]

Trong những năm gần đây kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi đểphân tích di truyền của hệ thống sinh học Đây là phương pháp hiệu quả trongviệc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu ditruyền và lập bản đồ di truyền

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu thực vật

Vật liệu nghiên cứu của đề tài là hạt của 30 giống đậu tương khác nhau,trong đó 20 giống do Viện nghiên cứu Ngô cung cấp và 10 giống do Trung tâmgiống cây trồng của các tỉnh cung cấp Nguồn gốc của các giống đậu tươngnghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

Hoá chất: Sử dụng các hóa chất tinh khiết của các nước và các

hãng nổi tiếng như Taq - polymerase, buffer PCR của hãng Invitrogen

EDTA, Tris, Agarose,… của Đức

Các loại thiết bị máy móc: Các thiết bị máy móc phục vụ sinh học phân

tử như máy PCR, máy quang phổ UV - Visible Spectrometer (cintra 40) củaAustralia, máy li tâm lạnh eppendorf của Đức, nồi hấp khử trùng, máy soi gel,

bộ điện di, box cấy, máy lắc, lò vi sóng, cân điện tử, tủ sấy, tủ lạnh, bể ổnnhiệt, pipetman, máy làm khô DNA (Speed Vac) và một số thiết bị, máymóc cần thiết khác

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Sinh học phân tử và Côngnghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên Phòng thí nghiệmsinh học - Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học khoa học - Đại học TháiNguyên

Bảng 2.1 Nguồn gốc các giống đậu tương nghiên cứu

Hình 2.1 Hình ảnh hạt của các giống đậu tương nghiên cứu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số theo Gawel và Jarret (1991) [31] như sau:

(1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn

(2) Bổ sung 800 μll đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M,NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịchnổi (làm 2 lần )

(3)Thêm 700 μll đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M,CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra

để ở nhiệt độ phòng 5 phút

(4) Thêm 600 μll chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút

(5) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

(6) Hút 500 μll dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa

(7) Thêm 500 μll isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng

(8) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô.(9) Bổ sung 300 μll cồn 70% búng nhẹ

(10) Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn (Làm 2 lần)

(11) Làm khô DNA bằng máy speed vac

(12) Hoà tan DNA trong H2O khử ion

2.2.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số

Chúng tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA táchchiết được bằng 2 phương pháp

Phương pháp quang phổ hấp thụ

Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm củacác base purin và pyrimidin Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm(A260) của các mẫu cho phép xác định hàm lượng acid nucleic trongmẫu dựa vào mối tương quan: một đơn vị A260 tương ứng với nồng độ 50ng/µl cho dung dịch chứa DNA sợi đôi

Hàm lượng DNA (ng/µl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng

Để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu DNA tách chiết được, chúng tôitiến hành đo thêm giá trị mật độ quang ở bước sóng 280 nm (A280) Độtinh sạch được thể hiện ở tỷ số A260/A280 Một dung dịch DNA được coi làsạch khi tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0

Phương pháp điện di DNA tổng số trên gel agarose

Điện di kiểm tra DNA tổng số của mẫu thí nghiệm trên gel agarose0,8% (0,8 g agarose trong 100 ml dung dịch TAE 1X) Sản phẩm điện diđược nhuộm bằng dung dịch ethydium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánhsáng cực tím

Dựa vào hình ảnh điện di có thể đánh giá nồng độ và độ tinh sạch củaDNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết

2.2.1.3 Phương pháp RAPD

Phản ứng RAPD được tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phươngpháp của Foolad và đtg (1995) [30] Sử dụng 16 mồi ngẫu nhiên được tổnghợp bởi hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự củacác mồi được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Trình tự nucleotide của 16 mồi sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD Bước Phản ứng Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Chu kỳ

45

1

2.2.1.4 Phân tích số liệu RAPD

Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, sự xuất hiện các băngđiện di được ước lượng kích thước và thống kê các băng điện di với từngmồi ở từng mẫu nghiên cứu Sự xuất hiện hay không xuất hiện các băng điện

di được tập hợp để phân tích số liệu theo nguyên tắc: Số 1- xuất hiện phânđoạn DNA và số 0 - không xuất hiện phân đoạn DNA Các số liệu này được

xử lý trên máy tính theo phần mềm NTSYS pc version 2.0 (USA, 1998) đểxác định quan hệ di truyền của các giống đậu tương

Xác định hệ số đa dạng di truyền (Genetic Diversity Index) trong cấu trúc DNA dựa trên các phân đoạn DNA được nhân bản (HRAPD) theo công

H RAPD 1f i

i 1

HRAPD là hệ số đa dạng di truyền

fi là tần suất của alen thứ i

2

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ KHỐI LƯỢNG 1000 HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG NGHIÊN CỨU

Hình thái và khối lượng hạt là một trong những đặc tính quan trọngđược quan tâm trong công tác chọn tạo giống đậu tương

Khối lượng 1000 hạt là một trong các yếu tố quan trọng cấu thành năngsuất của cây đậu tương, tính trạng này do kiểu gen chi phối và có thể thay đổi

do chế độ chăm sóc, mùa vụ và điều kiện môi trường Kết quả nghiên cứu một

số đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương nghiêncứu được trình bày ở bảng 3.1

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khối lượng 1000 hạt của các giống đậutương biểu hiện khác nhau và phụ thuộc vào kích thước và độ đồng đều của hạt.Khối lượng hạt của 30 giống đậu tương dao động từ 74,6 g đến 194,61g Trongcác giống đậu tương nghiên cứu thì giống VNlc8 khối lượng hạt cao nhất194,61g, thấp nhất là giống VNlc28 có khối lượng 74,6g Có thể xếp theo thứ tự

từ cao đến thấp về khối lượng 1000 hạt của các giống đậu tương như sau:VNlc8 > VNlc3 > VNlc2 > VNlc25 > VNlc7 > VNlc4 > VNlc23 >VNl24 >VNlc1 > VNlc10 > VNlc13>

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của 30 giống đậu tương

hạt

Màu rốn hạt

Màu sắc chủ yếu của rốn hạt ở các giống đậu tương nghiên cứu là màuđen, màu nâu, màu nâu đậm, màu nâu đen Đây là đặc điểm hình thái quantrong sử dụng trong chọn giống để nhận dạng giống đậu tương trồng.

Về hình dạng hạt, các giống đậu tương nghiên cứu có nhiều hình dạngkhác nhau, bao gồm hình trụ, ô van và hình trứng

Kết quả phân tích màu sắc vỏ hạt, màu rốn hạt, hình dạng hạt và khốilượng 1000 hạt đã cho thấy sự đa dạng về hình thái, kích thước hạt của cácgiống đậu tượng địa phương Đây chính là cơ sở để đánh giá hiện trạng nguồngen cây đậu tượng địa phương Việt Nam và cũng là nguồn vật liệu chọn giốngphong phú cần đươc khai thác có hiệu quả

3.2 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG TRONG HỆ GEN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Công nghệ sinh học đang có nhiều đóng góp có giá trị sản xuất nôngnghiệp, đặc biệt trong lĩnh vực chọn giống cây trồng Kỹ thuật sinh học phân

tử được ứng dụng nhằm đánh giá sự đa dạng trong hệ gen và xác định mốiquan hệ di truyền của thực vật, trong đó RAPD là một kỹ thuật khá thuận lợi

và có hiệu quả Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả ứng dụngRAPD vào việc phân tích tính đa hình DNA của 30 giống đậu tương

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá đậu tương

Lá non đậu tương 14 ngày tuổi được sử dụng để tách chiết DNA tổng số.Kiểm tra chất lượng tách chiết DNA bằng phương pháp điện di trên gelagarose 0,8% (Hình 3.1) và xác định hàm lượng DNA trên máy quang phổ ởbước sóng 260 nm và 280 nm Hình 3.1 cho thấy DNA tổng số có một băngduy nhất, rõ nét ở gần giếng truyền mẫu Kết quả kiểm tra DNA trên máyquang phổ cho thấy dung dịch DNA tách chiết được có hàm lượng và độ tinh

sạch (tỷ số A260/A280 là 1,8 - 2,0) đảm bảo và có thể sử dụng cho các phântích DNA tiếp theo





Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số của 30 giống đậu tương nghiên cứu

1.VNlc1, 2.VNlc2, 3.VNlc3, 4.VNlc4, 5.VNlc5, 6.VNlc6, 7.VNlc7, 8.VNlc8, 9.VNlc9, 10.VNlc10, 11.VNlc11, 12.VNlc12, 13.VNlc13, 14.Vlnc14, 15.VNlc15, 16.VNlc16, 17.VNlc17, 18.VNlc18, 19.VNlc19, 20.VNlc20, 21.VNlc21, 22.VNlc22, 23.VNlc23, 24.VNlc24, 25.VNlc25, 26.VNlc26, 27.Vnl27, 28.VNlc28,29.VNlc29, 30.VNlc30

3.2.2 Kết quả nhân bản các phân đoạn DNA bằng kĩ thuật RAPD

Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi pha loãng DNA về nồng độ50ng/μll và tiến hành các phản ứng RAPD với sự sàng lọc 16 mồi ngẫu nhiên.Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (giá trị PIC càng lớn thì tính đahình của mồi đó càng cao), khoảng cách di truyền được xác định thông qua hệ

số tương đồng và biểu đồ hình cây Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhauđược điện di trên gel agarose 1,8%

Phân tích RAPD với 16 mồi kết quả thu được số lượng các phân đoạnDNA được nhân bản với mỗi mồi dao động từ 60 đến 138 phân đoạn Kíchthước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,25 kb đến 2,5

kb Tổng số phân đoạn DNA nhân bản được của 16 đoạn mồi RAPD khi phântích 30 giống đậu tương là 1388 phân đoạn Trong số 16 mồi phân tích, số

phân đoạn DNA được nhân bản của 30 giống đậu tương ở mồi M8 là nhiềunhất (138 phân đoạn DNA) và số phân đoạn được nhân bản ít nhất là ở mồiM11 và MTr2 (60 phân đoạn DNA).

Đối với mỗi giống đậu tương thì số phân đoạn được nhân bản có sựkhác nhau, dao động từ 40 phân đoạn đến 52 phân đoạn Giống có tổng sốphân đoạn DNA được nhân bản với 16 mồi nhiều nhất là giống VNlc22 (52phân đoạn), và giống có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 16 mồi ítnhất là giống VNlc16 (40 phân đoạn) Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiệnhay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các giống đậu tươngvới nhau trong cùng một mồi Điều này được tổng kết và thể hiện qua tỷ lệphân đoạn đa hình ở mỗi mồi nghiên cứu, kết quả tổng hợp trên bảng 3.2

Bảng 3.2 Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 16 mồi RAPD

Số phân đoạn

đa hình

Số phân đoạn đơn hình

Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%)

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, tổng số phân đoạn DNA của 30 giống đậutương khi phân tích 16 mồi ngẫu nhiên là 93 phân đoạn, trong đó có 76 phânđoạn cho tính đa hình (chiếm 81,7%) và không đa hình là 17 phân đoạn(chiếm 18,3%) Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng

từ 0,25 kb đến 2,5 kb Số lượng các phân đoạn tương ứng với mỗi mồi nằmtrong khoảng 2 đến 8 phân đoạn, trong đó mồi nhân bản được ít phân đoạnDNA nhất là mồi M11 và MTr2 (2 phân đoạn), và mồi nhân được nhiều phânđoạn DNA nhất là mồi M7, MTr4 (8 phân đoạn)

Bảng 3.2 cũng cho thấy, có 14 mồi đều biểu hiện tính đa hình, 2 mồi thểhiện tính đơn hình đó là mồi M11 và MTr2 Tuy nhiên, mức độ đa hình giữacác mồi là khác nhau Mồi biểu hiện tính đa hình thấp nhất đó là mồi M10 vàM16 (50%), mồi biểu hiện tính đa hình cao nhất là các mồi M1, M5, M7, M8,M15, M17, MTr4 (100%) Giá trị PIC (Polymophism Information Content)được sử dụng khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình Giá trị PIC khôngchỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn liên quan trực tiếp với

số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ Tính đa hìnhcủa các mồi RAPD còn được đánh giá thông qua giá trị PIC, giá trị PIC cànglớn thì sự đa hình càng cao và ngược lại

n PIC 1

2