LUẬN văn THẠC sĩ CÔNG NGHỆ SINH học (FULL) xác định trình tự gen e6 và l1 của HPV và gen EBNA 1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng

DANH MỤC CÁC HÌNHHình 1.1 năng nhiễm ung thư cổ tử cung của các châu lụcBản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả 4 Hình 1.2 thư cổ tử cungCơ chế nhiễm HPV Human papilloma vir

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HPV Human papilloma virus

HP6 Hải Phòng 6 (ký hiệu mẫu)

LCL Lymphoblastoid

LCR Long control region

LMP Latent membrane protein

MHC Major Histocompatibility Complex

MT7 Miền trung 7 (ký hiệu mẫu)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình ung thư CTC trên thế giới (không tính Châu

Bảng 2.1 Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt độ trong phản ứng multiplex-PCRHPV16/HPV18 39

Bảng 2.3 Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR của gen EBNA-1 40Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách

Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằ ng enzym EcoRI 47

Bảng 2.8 Chu trì nh nhiệ t củ a phả n ứ ng giả i trì nh tự 49Bảng 3.1 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen

Bảng 3.2 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen L1

Bảng 3.3 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗinucleotide gen EBNA-1 của EB17, EB18, EB19 và EB20 64

Bảng 3.4 Kết quả xác định phân týp của các chủng EBV qua

phân tích acid amin tại vị trí 487 của EBNA-1 66

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 năng nhiễm ung thư cổ tử cung của các châu lụcBản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả 4

Hình 1.2 thư cổ tử cungCơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) trong ung 9

Hình 1.3 Mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc của 101 Papillomavirusdựa trên so sánh chuỗi nucleotid của gene capsid L1 11

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV trong cơ thể bị nhiễm 27

Hình 1.8 Cấu trúc hệ gene EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a)và dạng mạch thẳng (b) 29

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu phân tích gene EBNA-1 củavirus EBV và E6 của virus HPV16 và L1 của HPV18 34

Hình 3.2

Kiểm tra sản phẩm multiplex-PCR sử dụng cùng lúc 2 cặp

mồi (E6F-E6R và HP18F-HP18R) với khuôn DNA tổng

Hình 3.3 Kiểm tra sản phẩm tách dòng đoạn gen E6 của mẫu PK12(bản A) và đoạn gen L1 của mẫu PS16 (bản B). 53

Hình 3.4 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen

Hình 3.5 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự genL1 của mẫu PS16 (HPV18). 54

Hình 3.8 Kết quả bước đầu phát hiện HPV16/HPV18 bằng phươngpháp đa mồi multiplex-PCR. 59

Hình 3.10 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gen EBNA-1 61Hình 3.11 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự genEBNA-1 63

Hình 3.13 So sánh một phần trình tự acid amin EBNA-1 của 13 chủng nghiên cứu 65

MỤC LỤC Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 4

1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung 4

1.1.1.1 Trên thế giới 4

1.1.1.2 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 6

1.1.1.3 .3 Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thư CTC 6

1.1.1.4 Human papilloma virus và bệnh ung thư cổ tử cung 6

1.1.2 Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus 9

1.1.2.1 Phân loại Papilloma virus9 1.1.2.2 Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus 12

1.1.2.3 Quá trình nhân lên của HPV 14

1.1.2.4 Cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV 16

1.1.3 Chẩn đoán ung thư CTC 17

1.1.3.1 Chẩn đoán tế bào học 17 1.1.3.2 Chẩn đoán dựa trên phân tích mRNA 19

1.1.3.3 Định týp HPV bằng sinh học phân tử 19

1.1.4 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp

PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 21

1.2 UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) 22

1.2.1 tễ học ung thư vòm mũi họng 22

1.2.1.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới 22

1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 23

1.2.2 Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus (EBV) 24

1.2.2.1 Phát hiện virus Epstein - Barr và ung thư VMH 24

1.2.2.2.ểm phân loại và cấu trúc EBV 25

1.2.2.3 nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của EBV… 26

1.2.2.4 học phân tử và sắp xếp hệ gene của EBV 28

1.2.2.5 ản phẩm của gene EBNA-1 29

1.2.3 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng ở Việt Nam 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tư ợng nghiên cứu 33

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu 33

2.2.1.Dụng cụ, trang thiết bị 33

2.2.2.Hoá chất 33

2.3 Ph ươ ng pháp nghiên cứu 34

2.4 Quy trình nghiên cứu 35

2.4.1.ấy mẫu và bảo quản 35

2.4.2 thuậtKỹ tách chiết DNA tổng số 35

2.4.3.Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR 37

2.4.3.1 Thiết kế mồi……… 37

2.4.3.2.Quy trình phản ứng PCR 38

2.4.3.3.Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR 40

2.4.3.4.Tinh sạch sản phẩm PCR 41

2.4.4 Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR 42

2.4.4.1 Tạo vectơ tái tổ hợp 42

2.4.4.2 Chuyển nạp……… ………… 43

2.4.4.3.Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp 44

2.4.4.4.Tách DNA plasmid tái tổ hợp 45

2.4.4.5.Kiểm tra DNA tái tổ hợp 47

2.4.5 Giải trình trình tự và xử lý số liệu 48

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 51

3.1.1 Kế t quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51

3.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex-PCR phát hiện 16 và HPV-18 52

3.1.3 Kết quả tách dòng và giải trình tự các sản phẩm HPV-16 và HPV-18 từ các mẫu kiểm tra 53

3.1.4 Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và chuỗi gen L1 của HPV-18 54

3.1.5 Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 của HPV16 và L1 của HPV18 56

3.1.6 Kết quả bước đầu phát hiện HPV-16 và HPV-18 bằng phương

pháp đa mồi multiplex-PCR 59

3.2 Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen EBNA – 1 của EBV 60 3.2.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 60

3.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR 61

3.2.3 Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của EBV 62

3.2.4 Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen EBNA-1 của EBV 63

3.2.5 Kết quả xác định phân týp EBV qua phân tích vị trí acid amin số 487 của EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng của các chủng Việt Nam và thế giới 64

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

4.1 KẾT LUẬN 69

4.2 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, ung thư (cancer) là mộttrong những nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao nhất ở người, chiếm khoảng12% trong tổng số trường hợp tử vong hàng năm trên thế giới, đứng thứ 2 sau tỷ

lệ tử vong của các bệnh lí về tim - mạch và ngày càng có xu hướng gia tăng

Bệnh ung thư nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ dẫnđến nguyên nhân gây tử vong, do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Bệnh

có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới (nam và nữ) và ở tất cả các mô, các cơquan trong cơ thể Đặc biệt, ung thư cổ tử cung (CTC) và ung thư vòm mũihọng (VMH) là hai trong số 5 loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất ở Việt Nam

và các quốc gia đang phát triển trong khu vực Trong đó, ung thư CTC đứng thứ

2 trong số các ung thư và là nguyên nhân gây tử vong cao nhất cho phụ nữ ởViệt Nam [1], [9] Bên cạnh đó, ung thư VMH cũng là một trong 5 loại ung thưphổ biến nhất ở người và là loại hay gặp nhất trong ung thư vùng tai mũi họng

ở các nước vùng Đông nam Á và phía nam Trung Quốc [23], [56]

Nguyên nhân gây ra ung thư rất phức tạp, liên quan đến thể địa, tập quán,thói quen và môi trường sống Trong đó, một số yếu tố đã được coi là liên quanchặt chẽ với việc gây ra ung thư như: yếu tố vật lí (phóng xạ), hóa chất độc, cácgốc tự do và đặc biệt ngày nay đã phát hiện ra vai trò của các virus trong tiếntriển ung thư Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh virus là nguyênnhân gây ra hai loại ung thư này ở người Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện

diện của HPV (Human papilloma virus) trong hơn 95% các trường hợp ung thư

cổ tử cung [62], do đó HPV được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [9]

Các nghiên cứu về mối liên quan giữa Epstein-Barr Virus (EBV) và ung thư

VMH cũng đã cho thấy sự biểu hiện của kháng nguyên virus trong các giai đoạncủa bệnh, vai trò quan trọng của EBV trong bệnh học cũng như trong quá trìnhsàng lọc chẩn đoán điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24]

9

Papilloma virus (PV) thuộc họ Papillomaviridae, lưu hành phổ biến

trong tự nhiên, gây bệnh chủ yếu cho các loài động vật có xương sống bậc caonhư: người, ngựa, bò, chó, thỏ và một số loài chim Đặc biệt, PV có đặc tính gâybệnh đặc hiệu loài, HPV chỉ gây bệnh ở người mà không gây bệnh ở loài khác[36] Đối với người, HPV thích ứng gây khối u ở da, miệng, thực quản, hầu,họng và đường hậu môn - sinh dục Cấu trúc hệ gen HPV là phân tử DNA sợi

đôi (double strand DNA - dsDNA) hình vòng tròn khép kín, có độ dài khoảng

7900 cặp nucleotid, được bao bọc bởi phân tử protein histon, các vùng gen HPVđược định vị trên một sợi DNA Trong đó, L1 là gen mã hoá cho protein vỏngoài và cũng chính là thành phần kháng nguyên bề mặt của virus Gen E6thuộc phân vùng gen thứ 2 (vùng sao chép sớm) của hệ gen HPV, tổng hợpprotein E6 và các protein tương ứng, có vai trò quan trọng giúp cho sự nhân lênDNA của virus, tham gia cơ chế hình thành ung thư CTC Protein E6 của HPVxâm nhập hệ gen của tế bào, phong toả và kìm hãm p53 bằng cách bám vào p53,kích thích phân giải p53 nhờ enzym ubiquitin ligase [57] Hậu quả, tế bào vẫntiếp tục phân chia, không có sự kiểm soát và phát triển thành khối u

EBV là loại virus nhiễm phổ biến trong cộng đồng còn gọi là

Herpes virus type 4, thuộc họ Herpesviridae [26] EBV gây bệnh trên

người và lây truyền qua đường tiêu hoá, có đặc tính thích ứng tế bào Lympho

B và là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (IM),liên quan đến cơ chế tiến triển của một số loại ung thư như: tăng sinhlympho B, ung thư biểu mô như ung thư VMH và ung thư dạ dày Tuynhiên, EBV có khả năng gây sơ nhiễm và tồn tại lâu dài trong cơ thể màkhông gây bệnh Cấu trúc hệ gen của EBV là DNA sợi đôi xoắn kép, mạch

hở, kích thước khoảng 172 kb, nếu tính cả phần cấu trúc lặp ở hai đầu là 184

kb, mã hoá cho 9 protein virus Trong đó, gen EBNA-1 là một đoạn DNA nằmtrong tổ hợp gen EBNA protein kháng nguyên, có vai trò thiết yếu trong quátrình xâm nhập và nhân lên cũng như duy trì sự tái tạo hệ gen của virus, bêncạnh đó protein EBNA-1 còn ngăn cản quá

trình phân giải và trình diện kháng nguyên của virus ở tế bào nhiễm Gen

EBNA-1 và sản phẩm protein EBNA-EBNA-1 có mặt trong tất cả các khối u có liên quanđến EBV Như vậy, với sự hiểu biết về các đặc tính sinh học phân tử củaHPV và EBV, cùng với sự phát triển của các kĩ thuật ứng dụng sinh học phân

tử, hoàn toàn có thể giúp cho việc phát hiện sớm và chính xác HPV và EBVtrên bệnh nhân, phục vụ chẩn đoán và áp dụng các biện pháp điều trị sớm nhằmngăn chặn sự tiến triển của bệnh, giảm tỷ lệ tử vong do các ung thư mà chúnggây ra Hiện nay, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu đặc tính, địnhloại và xác định týp một cách chính xác, có hệ thống về HPV và EBV Việcnghiên cứu ứng dụng PCR trong chẩn đoán phát hiện HPV và EBV cũng đãđược thực hiện gần đây, nhưng còn nhiều hạn chế như: quy trình thực hiện phứctạp, thời gian trả lời kết quả kéo dài và giá thành xét nghiệm

Xuất phát trên cơ sở phân tích những công trình nghiên cứu có liên quan,

những kết quả mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu về Human papilloma virus (HPV) và Epstein-Barr Virus (EBV), chúng tôi tiến hành nghiên cứu

đề tài: “ Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV

để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng” với

mục tiêu nghiên cứu:

1 Thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và chuỗi gen L1 của HPV-18, ở một

số chủng Human papilloma virus (HPV) bằng cặp mồi thử nghiệm để

nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử và so sánh với các chủng của ViệtNam và thế giới

2 Thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của một số chủng Epstein-Barr Virus

(EBV) bằng cặp mồi thử nghiệm để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử

và so sánh với các chủng của Việt Nam và thế giới

Hình 1.1 Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả năng nhiễm ung thư của các châu lục [64].

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV)

1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung

Ung thư cổ tử cung là bệnh ác tính thường gặp thứ hai ở phụ nữ trên toànthế giới và là một trong số các nguyên nhân tử vong hàng đầu liên quan đến

bệnh ung thư cho phụ nữ ở các nước đang phát triển với khoảng 500.000 ca mới

và 250.000 ca chết mỗi năm Khoảng 80% số ca ung thư cổ tử cung xảy ra ở các

nước có mức sống thấp [27]

1.1.1.1 Trên thế giới

Trên toàn thế giới tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung trên 100.000 phụ nữ (tất

cả các lứa tuổi) Theo Hiệp hội chống ung thư thế giới (UICC), tỷ lệ ung thư

CTC chiếm 12% trong số các bệnh ung thư ở phụ nữ (Hình 1.1)

Ở Pháp, cứ 100.000 phụ nữ ở tuổi 45 có 13 trường hợp mắc ung thư CTC

và con số này tăng lên khi ở tuổi 60 cứ 100.000 người có 46 người mắc Tần

suất mới mắc hàng năm từ 20 đến 85 trường hợp trong tổng số 100.000 phụ nữ

Tỷ lệ tử vong do ung thư CTC ở các nước cũng rất khác nhau, ở Mexico là cao

nhất

Hình 1.1 Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả năng nhiễm ung thư của các châu lục [64].

Các nghiên cứu điều tra gần đây cho thấy, tỷ lệ mới mắc và tỷ lệ tử vong

do ung thư CTC ở các nước phát triển đang có xu hướng giảm dần, do áp dụng

rộng rãi phương pháp chẩn đoán sàng lọc Pap smear, nên đã phát hiện sớm ung

thư CTC Ở Anh tỷ lệ chết giảm từ 88/100.000 dân năm 1972 xuống còn63/100.000 dân trong năm 1992 Ở Mỹ tỷ lệ mới mắc là 44/100.000 dân năm

1947, đến năm 1996 tỷ lệ mới mắc hàng năm đã giảm xuống 7,5/100.000 dân[49]

Các nước có tỷ lệ ước tính mắc ung thư cổ tử cung cao nhất xảy ra ở châuPhi, Trung Mỹ, Nam Mỹ và Châu Á

Bảng 1.1 Tình hình ung thư CTC trên thế giới (không tính châu Phi) [11].

điều kiện sử dụng thử nghiệm Pap smear không phải là có sẵn [9].

Ở châu Á bao gồm Malaysia khoảng 266.000 trường hợp mới pháthiện và 143.000 ca tử vong mỗi năm [63]

Ở khu vực Đông Nam châu Á, tỷ lệ ung thư CTC ở Thái lan, Myanma,Lào, Campuchia chiếm cao nhất [8].

Tóm lại, tỷ lệ mắc bệnh ung thư CTC khác nhau tùy thuộc các quốc gia,dân tộc, chủng tộc trong cùng một nước, phụ nữ da đen mắc bệnh gấp 2 lần phụ

nữ da trắng, phụ nữ ở thành thị mắc bệnh cao hơn phụ nữ ở nông thôn [8], [50]

1.1.1.2 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam

Hiện nay, ở Việt Nam chưa có thống kê cụ thể hàng năm về tỷ lệ mớimắc và tử vong do bệnh ung thư CTC Tuy nhiên, năm 1994, theo điều tra củabệnh viện K - Hà Nội, tỷ lệ ung thư CTC là 7,7/100.000 phụ nữ, chiếm 6% trongcác loại ung thư Ở thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ này là 35/100.000 phụ nữ vàchiếm hơn 20% trong các loại ung thư nói chung Ung thư CTC đứng thứ 2 trong

số các ung thư ở phụ nữ Việt Nam, nhưng gây tử vong cao nhất cho phụ nữ [9]

1.1.1.3 Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thư CTC

Nhiều nghiên cứu và giả thuyết cho thấy ung thư CTC hay gặp ở nhữngphụ nữ có hoạt động tình dục sớm (dưới 20 tuổi), có nhiều bạn tình, nhữngngười có thai sớm, đẻ nhiều, mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục, có thóiquen hút thuốc lá, tình trạng kinh tế thấp, có tiền sử viêm nhiễm CTC, nhất làloạn sản CTC không được điều trị triệt để, nhiễm nhiều loại virus cơ hội như

Herpes simplex virus týp 2 [3], [6] và [11].

Hiện nay, nguyên nhân gây ung thư CTC đã được biết một cách cụ thể,

đó là do loại virus sinh u nhú ở người Human papillomavirus (HPV), thuộc họ Papillomaviridae gây ra HPV được phát hiện có mặt trong, trên 95% các

trường hợp ung thư CTC, do vậy được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thưCTC [62], [71]

1.1.1.4 Human papilloma virus và bệnh ung thư cổ tử cung

Các nghiên cứu dịch tễ học tại Hoa Kỳ cho thấy rằng 75% dân số tuổi 15

- 50 bị nhiễm HPV sinh dục và kéo dài trong suốt cuộc đời của họ Trong số đó,

60% bị nhiễm trùng thoáng qua, 10% bị nhiễm trùng dai dẳng (có sự hiện diệncủa HPV DNA trong các mẫu mô bộ phận sinh dục), 4% có dấu hiệu nhẹ tế bàohọc và 1% với tổn thương lâm sàng.

Ở Việt Nam, tần suất lưu hành của HPV là rất cao ở nhóm tuổi có sinhhoạt tình dục ở cả nam và nữ Nhóm tuổi 20 - 29 bị nhiễm HPV cao nhất Một

nghiên cứu theo dõi bằng Pap smear ở phụ nữ trẻ tuổi trong 2 năm, đã nhận thấy

tỷ lệ nhiễm HPV trong năm đầu là 3%, trong năm sau là 7% [11] Tỷ lệ mới mắcHPV hàng năm là 7%

Có rất nhiều týp HPV là nguyên nhân gây ung thư CTC, nhưng tần suấtxuất hiện có khác nhau [25] HPV týp 16 (HPV-16) là týp nổi trội chiếm 46 -63% các trường hợp ung thư CTC, tiếp theo là HPV-18 (10-14%), HPV-31 (2-7%), HPV-33 (3-5%) và HPV-45 (2-8%) ở nhiều nơi trên thế giới trừ châu Á.Bên cạnh các týp trên, ở châu Á còn phát hiện các týp khác là HPV-58 (6%) vàHPV-52 (4%) Ngoài HPV-16 và HPV-18, các týp HPV có khả năng gây ungthư CTC bao gồm: HPV-31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -68, -73

và -82, và có thể cả các týp HPV-26, -53 và -66 [47], [54]

Ở người, nhiễm virus papilloma thường biểu hiện những trạng thái tăng

sinh nội mô biểu bì thuộc nhiều dạng khác nhau như: sùi niêm mạc, viêm, xơcứng biểu mô, khối u papilloma vùng sinh dục, vùng hầu họng, dạng tăng sinh

tế bào keratin [71] Hầu như, mọi týp HPV đều có biểu hiện đặc trưng liên quanđến khối u papilloma vùng sinh dục, như condyloma, u xơ và u mềm CTC,chúng có tính chất lây truyền qua đường tình dục [42] Biểu hiện khối u điểnhình do HPV gây ra chủ yếu là u biểu mô vùng hậu môn - sinh dục như: âm hộ,

âm đạo, trực tràng, vùng hậu môn, dương vật và khối u ở vòm họng, hầu- họng[17]

Những nghiên cứu về Human papillomavirus (HPV) cho thấy HPV tác

động chủ yếu vào các tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa của cổ tử cung, tạinơi tiếp giáp giữa cổ trong và cổ ngoài (nơi tiếp giáp 2 loại mô khác nhau: biểu

mô tế bào trụ tuyến và biểu mô lát tầng không sừng hóa) Biểu mô lát tầng

không sừng hóa vốn được tổ chức với chức năng che chở, bảo vệ và được quyđịnh sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó sẽ được bong ra ngoài HPVtấn công vào lớp tế bào đáy của biểu mô vốn có khả năng sinh sản cao và gây rahiện tượng phát triển mạnh hơn bình thường của 1 rồi nhiều lớp tế bào sau đó.Khi tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp của tế bào biểu mô lát (dị sản nặngtại chỗ), sẽ có khả năng phát triển lan rộng khỏi màng đáy vào các lớp sâu hơnbiểu mô lát và hình thành ung thư cổ tử cung giai đoạn xâm lấn Tuy nhiên,những tổn thương ban đầu chỉ xảy ra tại biểu mô lát vốn không có tiếp xúc mạchmáu, HPV hầu như chỉ hiện diện tại chỗ và không đi vào máu, do đó không gây

ra tình trạng viêm, không hoạt hóa hệ miễn dịch và hầu như không gây miễnnhiễm sau khi đã nhiễm tự nhiên HPV (Hình 1.2)

Những nghiên cứu ở giai đoạn xâm lấn và giai đoạn trước xâm lấn là cầnthiết để dự đoán tác động tương lai của loại vắc-xin HPV-16/HPV-18 và xétnghiệm HPV Phân tích xác định các chủng HPV trong ung thư cổ tử cung giaiđoạn xâm lấn (ICC) cho thấy HPV-16 là phổ biến nhất và HPV-18 loại thứ haiphổ biến, trong tất cả các châu lục Kết hợp giữa các trường hợp nhiễm HPV-16/HPV-18, ICC ở Châu Âu, Bắc Mỹ và Australia (74 - 77%) cao hơn so với ởChâu Phi, Châu Á và Nam/Trung Mỹ (65 - 70%) Các loại HPV phổ biến nhất làHPV 31, 33, 35, 45, 52 và 58, mặc dù sự phân bố tương đối của chúng khácnhau tùy theo vùng địa lý Tổn thương mô biểu bì mức độ cao (tổn thương có

vảy cao cấp intraepithelial HSIL (high-grade squamous intra-epithelial lesion),

trong nhiễm HPV thường biểu hiện rõ ràng trong vòng vài tháng, khoảng90% biểu hiện rõ ràng trong vòng hai tháng Trong số các trường hợp HSIL,HPV16/18 có tỷ lệ nhiễm là 52% [52]

Hình 1.2 Cơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) trong ung thư cổ tử cung [6].

Ngày nay, nhiều bằng chứng cho thấy dường như cũng có các đáp ứngmiễn dịch trong bệnh nhân nhiễm HPV mặc dù yếu ớt: những người có suygiảm miễn dịch dễ bị nhiễm HPV và khi đã nhiễm thì tiến triển sẽ nhanh vànặng nề Bên cạnh đó, có sự gia tăng nồng độ kháng thể kháng HPV sau khi bịnhiễm tự nhiên, tuy nhiên nồng độ kháng thể này không đủ để gây đáp ứng miễndịch bảo hộ cơ thể nhiễm Tổn thương dị sản hay ung thư cổ tử cung có một thờigian dài phát triển tại biểu mô và tại cổ tử cung Trung bình, khoảng 10- 20 nămcho sự tiến triển từ dị sản đến ung thư cổ tử cung Đây chính là điều kiện thuậnlợi cho việc kiểm soát ung thư cổ tử cung, giúp phát hiện sớm và điều trị nhữngtổn thương dị sản cũng như ung thư giai đoạn sớm

1.1.2 Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus

1.1.2.1 Phân loại Papilloma virus

Những nghiên cứu về sinh học chức năng và sinh học phân tử đã cho

phép phân loại Papilloma virus (PV) một cách hoàn chỉnh và tách hẳn nhóm papilloma virus ra khỏi nhóm Polyoma virus Như vậy, tất cả PV chỉ là một

nhóm duy nhất, thuộc họ Papillomaviridae PV phân bố tương đối rộng rãi trong

thiên nhiên, gây bệnh cho các loài động vật có xương sống bậc cao chủ yếu là

người, ngựa, bò, chó, thỏ và một số loài chim Virus Papilloma gây bệnh cho

người (HPV) chỉ là một loại duy nhất [36] Tính đặc hiệu loài gây bệnh của PVrất cao, khó có thể tìm thấy loại PV của loài này lại gây bệnh loài khác, PV chỉthích ứng biểu mô sừng và niêm mạc, gây tăng sinh tế bào biểu mô ở đườngsinh dục và hậu môn, vùng vòm họng, hầu - họng [32] Đối với người, HPV gâykhối u ở da, miệng, thực quản, hầu, họng và đường hậu môn - sinh dục

Về phân loại, PV được chia làm 5 siêu nhóm chính (super- groups) đánh

dấu từ A - E (Hình 1.3) Trong mỗi siêu nhóm, PV được chia thành các nhómkhác nhau, mỗi một nhóm lại bao gồm các virus thuộc các týp khác nhau [22]

Ví dụ: siêu nhóm A, chủ yếu là HPV bao gồm 12 nhóm phụ là A1 - 12, trong đócác týp HPV thuộc nhóm A9 là các loại virus có khả năng gây ung thư CTC rấtcao

Hầu hết, PV gây bệnh và biểu hiện lâm sàng đều thuộc siêu nhóm A (PVthích ứng đường sinh dục và niêm mạc), hoặc siêu nhóm B (PV gây u xơ cứngbiểu mô sùi) Siêu nhóm C và D gồm các PV gây khối u xơ papilloma và khối u

đích thực do Papillomavirus gây ra Siêu nhóm E chưa được phân loại chính xác

đó là hỗn hợp của PV thích ứng và gây khối u ở da

PV được phân chia tiếp tục thành các týp Đối với HPV được coi là cùngtýp, nếu chuỗi gen L1 trong hệ gen không khác nhau trên 10% Tuy nhiên cũng

có nhiều trường hợp, phân týp HPV không hoàn toàn dựa vào chênh lệch %nucleotid trong chuỗi gen L1, mà còn phải xem xét đặc tính gây bệnh của cáctýp đó [21], [22]

Hình 1.3 Mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc của 101 Papillomavirus dựa trên so

sánh chuỗi nucleotid của gen capsid L1 Các chuỗi gen được thu nhận từ Ngânhàng Gen, xử lý bằng chương trình BioEdit, ClustalX 1.8.1 và phân tích phả hệbằng chương trình MEGA2.1 Nhóm A5, A7 và A9 gồm các týp HPV có nguy

cơ gây ung thư cao ở người [35]

1.1.2.2 Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus

Năm 1974 - 1976, bắt đầu có sự nghiên cứu về HPV và chứng minh HPV

là nguyên nhân gây ung thư CTC Nhưng đến những năm 1980, sự phát triểnứng dụng các kỹ thuật đã xác định DNA - HPV trong mô bệnh phẩm ung thưCTC [18], [19], [72] Những týp đầu tiên được phân lập là HPV-16 và HPV-18,

và hệ gen của chúng chính là nguồn gen quan trọng trong nghiên cứu về HPV

Virus Papilloma của người có kích thước nhỏ, khoảng 55nanomet (nm), không

có vỏ bọc ngoài cùng Dưới kính hiển vi điện tử, HPV trông giống như quả bónggôn, nằm cạnh nhau theo một tập hợp (Hình 1.4) [51], [70]

Hạt virus có cấu trúc hình khối, gồm 72 capsomer, tạo nên protein cấutrúc capsid có 2 lớp: Lớp 1 (L1) và lớp 2 (L2) L1 (layer 1) là lớp protein bề

mặt, còn gọi là lớp vỏ lớn, có cấu trúc khối từ các đơn vị 5 góc cạnh Kề cận L1

là protein cấu trúc của L2 (layer 2), còn gọi là lớp vỏ bé, gồm nhiều đơn vị xếp

lớp theo nhau (12 đơn vị /virus)

Hình 1.4 Human Papillomavirus mô hình và ảnh chụp dưới kính hiển vi

điện tử [51]

Hệ gen của HPV là phân tử DNA sợi đôi (double strands DNA dsDNA) khép kín thành vòng tròn, kích thước khoảng 7900bp, được bao bọc bởinhiều phân tử histon Các gen thành phần hệ gen của HPV được định vị trongmột sợi DNA Về chức năng, hệ gen HPV chia làm 3 phân vùng quan trọng:

Phân vùng thứ nhất: Là vùng không mã hóa L, có độ dài 400 1000 bp,

có chức năng điều hoà sao chép, gọi là vùng điều hoà lớn (LCR = long controlregion), gồm chuỗi p97 (TATA Singnal 1,2) là tiểu phần khởi động (p97 corepromoter), các tiểu phần kích hoạt và một số chuỗi gen câm [16] Vùng này có hệ

số biến đổi nucleotid cao hơn rất nhiều so với các vùng khác của hệ gen HPV

- Phân vùng thứ hai: Là vùng sao chép sớm, ký hiệu là E (early region),

gồm các gen: E1, E2, E4, E5, E6 và E7, giúp cho sự nhân lên DNA của virus,tham gia cơ chế hình thành khối u CTC

- Phân vùng thứ ba: gồm các gen tổng hợp protein L1 và L2, là những

protein cấu trúc capsid của virus, được sản xuất muộn hơn Do vậy, được gọi làvùng sao chép muộn, ký hiệu là L (late region) (Hình 1.5)

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của hệ gen HPV -16.

Ghi chú: E1,2,4,5,6,7: các gen sớm; L1,2: các gen muộn; TATA Singnal 1,2: promotor khởi động sao chép của hệ gen; Long Control Region: vùng điều khiển của hệ gen [16].

Hiện nay, HPV có khoảng 100 týp khác nhau đã được xác định, mỗi týp

có hàng chục phân týp (subtype); mỗi một phân týp lại có hàng chục biến thể(variant) khác nhau, còn gọi là chủng virus, các chủng virus được đặt tên theo

địa danh, hoặc nhân danh, do đó nếu phân tích về mặt di truyền, nhiều chủng tuytên khác nhau nhưng rất có thể cùng thuộc về một biến thể Do sự biến động và

đa dạng này, việc định týp và định chủng của HPV là rất phức tạp, đòi hỏi kỹthuật cao và chính xác Việc định týp và chủng (biến thể) của HPV dựa vào kếtquả phân tích và xác định mức độ đồng nhất về thành phần nucleotid, cũng nhưmức độ tương đồng về thành phần acid amin của các chuỗi gen E6, E7 và L1.Một mẫu virus HPV mới phân lập, được gọi là cùng týp với một týp HPV

đã xác định trước đó, nếu thành phần nucleotid của các chuỗi E6, E7 và L1 cómức độ đồng nhất trên 90% [59] Những mẫu virus khác nhau trong cùng mộttýp lại được phân chia thành các phân týp (hay biến thể hoặc chủng) trên cơ sởphân tích sự biến đổi nucleotid và acid amin của các gen sớm (E) và gen muộn(L) Về nguyên tắc, một virus HPV mới phân lập được coi là đồng phân týp(đồng chủng) nằm trong một týp HPV nào đó, nếu như hệ gen của chúng cómức độ đồng nhất về nucleotid và về acid amin tương đồng 90 - 98% Một biếnthể độc lập của virus HPV phải có sai khác ít nhất là 2% so với biến thể khác khi

so sánh; nếu dưới 2%, chúng được coi là cùng biến thể Tuy sai khác ít về hệgen, nhưng có một số biến thể HPV trong tự nhiên lại có các đặc tính sinh học

và hóa sinh học khác nhau, đặc biệt là khả năng gây ung thư và cơ chế hìnhthành khối u CTC

1.1.2.3 Quá trình nhân lên của HPV

HPV thường bắt đầu nhân lên ngay sau khi xâm nhập vào tế bào biểu mô,qua những chấn thương rất nhỏ của biểu mô như sinh hoạt tình dục Do chỉnhững tế bào màng đáy của biểu mô vẩy mới mẫn cảm với virus [11]

Một số hoạt chất (Integrin- 6) rất cần thiết cho thụ thể của tế bào hoạtđộng đối với HPV-6, nhưng không bắt buộc đối với HPV-11, -33 Giống nhưnhiều loại virus khác, HPV-16, -33 khi tiếp xúc với tế bào chủ, thông qua thụ

Hình 1.6 Quá trình nhân lên của HPV [11].

- Virus xâm nhập vào tế bào biểu mô hạ tầng thì sự nhân lên của virus thuộcloại hình không tăng về số lượng và tồn tại với một số lượng thấp, DNA của

tế bào thực hiện quá trình tổng hợp nên DNA của chính virus, với tỷ lệ: 1phân tử hệ gen /1 tế bào

- Đối với tế bào keratin đã được biệt hoá thích ứng với virus thì virus thực hiệnquá trình nhân lên và tự nó điều khiển quá trình nhân lên DNA của mình vớimột số lượng rất lớn, đồng thời tổng hợp nên protein cấu trúc capsid, để thựchiện quá trình lắp ghép, tạo virus hoàn chỉnh

1.1.2.4 Cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV

Khái niệm về cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV

Cơ chế HPV gây ung thư CTC đã được Massimi và Banks (1997) giảithích như sau: ở người và động vật, có hai protein điều chỉnh sự phân chia và

mức độ phát triển tế bào là RB (retinoblast) và p53 (protein điều hoà khối u).

Khi hai gen E6 và E7 của HPV tổng hợp protein, làm cho tự nó tiếp xúc với RB

và p53 sẽ gây cản trở quá trình điều chỉnh sự phân chia tế bào, kết quả tế bào bịnhiễm HPV sinh sản tự phát, không có sự kiểm soát, thay đổi cấu trúc và genkhông thể sửa chữa được và phát triển thành ung thư Trong giai đoạn sớm,những tế bào CTC bị nhiễm có thể chỉ thay đổi nhỏ về hình dáng và kích thước,dần dần bị biến dạng, rối loạn trật tự cấu trúc, phá huỷ biểu mô bề mặt CTC.Những thay đổi này sẽ gây nghịch sản hoặc tạo thành khối tân tạo hoặc là ungthư trong biểu mô ở CTC [2], [11]

Do hệ gen của HPV chỉ mã hoá được 8 đến 10 loại protein, cho nên trongquá trình nhân lên, HPV sử dụng các yếu tố trợ giúp của tế bào chủ trong việctương tác vùng điều hoà lớn (LCR) của hệ gen, để sao chép gen E6, E7 ProteinE6, E7 kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào nhiễm bằng cách bám vào và vô hoạt

protein điều hoà khối u của tế bào, hoạt chất cyclin (chất kích thích chu kỳ nhân

lên của tế bào) và các enzym kinase [55]

Trong quá trình gây nhiễm của HPV, gen E6 và E7 đã tạo nên môi trườngkhông thích hợp, làm biến đổi hoạt động sống của tế bào, buộc tế bào phục vụriêng cho virus Dẫn đến tế bào bị biến đổi nghiêm trọng về hình thái, cấu trúccũng như chức năng, nhưng tế bào không chết mà chỉ biệt hoá và sinh trưởngtheo hướng khác

Cơ chế gây ung thư cổ tử cung do tương tác của protein E6 và p53

Không giống như các loại ung thư khác, p53 trong ung thư CTC vẫn tồntại dưới dạng nguyên thuỷ và không bị đột biến Protein E6 của HPV phong toả

và kìm hãm p53 bằng cách bám vào p53, hướng p53 phân giải nhờ enzymubiquitin ligase [57] Do ảnh hưởng của sự phân giải này, gen p53 không thựchiện sự đột biến điểm ở trong gen Hậu quả dẫn đến kìm hãm quá trình phân

chia tế bào, sự “chết theo chương trình (apoptosis) ” và điều hoà sự sửa sai

DNA Như vậy, tế bào vẫn tiếp tục phân chia, không có sự kiểm soát và trởthành khối u Gen E6 của HPV-16 là loại protein bao gồm 158 axit amin có cấutrúc gấp khúc phức tạp chứa 2 cấu trúc Zinc -finger motif kế tiếp nhau Zinc-finger motif là cấu trúc bao gồm 4 axit amin Cystein (C) hay Histidin (H) làmkhung tương tác kết hợp với nguyên tố Kẽm (Z++) Có 4 loại Zinc-finger motif,trong đó ở HPV-16 là cấu trúc bao gồm 4 axit amin Cystein (C) hay Histidin (H)làm khung tương tác kết hợp với nguyên tố Kẽm (Z++) Có 4 loại Zinc-fingermotif, trong đó ở HPV-16, gen E6 có Zinc-finger motif thuộc loại thứ nhất.Protein E6 của các týp HPV thuộc nhóm "nguy cơ thấp" không có khả năng bámvào p53 với số lượng ít và chúng không tác động lên p53 trong điều kiện in vitro[9] Tuy nhiên, protein E6 của HPV có thể hình thành phức hợp đa thành phầnvới ít nhất 6 loại protein nội bào khác và vô hiệu hóa hoạt động chức năng củachúng Nhưng cho đến nay, người ta vẫn chưa xác định được các protein này

1.1.3 Chẩn đoán ung thư CTC

1.1.3.1 Chẩn đoán tế bào học

Ung thư CTC thường gặp ở phụ nữ độ tuổi sinh đẻ, từ 30 - 50 tuổi [3],[8], [11] Vùng phát hiện ung thư CTC chủ yếu ở ranh giới giữa biểu mô lát và

biểu mô trụ (Squamous Columnar Junction - SCJ) tiến triển lâu dài từ các tổn

thương nghi ngờ Triệu chứng hay gặp là ra máu bất thường, ra máu tự nhiênhoặc sau giao hợp hoặc sau mãn kinh Khí hư thường lẫn máu, mủ, có mùi hôi

và đau thường xuất hiện ở giai đoạn muộn [12], [49], [50] Cả về tế bào C, môbệnh học và sinh học phân tử đều phát hiện mối liên quan chặt chẽ giữa HPVvới ung thư CTC Năm 1949, George Papanicolaou đã đưa ra một phương pháp

tế bào học phát hiện những bất thường của tế bào biểu mô ở CTC để phát hiện

sớm ung thư CTC, được gọi là Pap smear Nguyên lý của phương pháp này là

dựa vào tính chất các tế bào của niêm mạc âm đạo CTC bong ra một cách liêntục, đặc biệt là các tế bào ác tính bong càng sớm và dễ bong Đây là phươngpháp có độ đặc hiệu cao (trên 90%), độ nhạy khoảng 60 - 85% lại đơn giản, tiếtkiệm, cho nên được sử dụng trong chẩn đoán sàng lọc trong nhiều năm qua đểphát hiện sớm ung thư CTC Dựa trên cơ sở phân tích hình thái học chitiết Papanicolaou và Traut đưa ra bảng phân loại gồm 5 nhóm phiến đồ: [3], [11],[65]

+ P I: Phiến đồ bình thường

+ P II: Phiến đồ viêm: như P I nhưng có tăng sinh tế bào Đôi khi thấy tếbào đáy nhưng vẫn bình thường hoặc tế bào dự trữ hoặc tế bào viêm.+ P III: Nghi ngờ có tế bào ung thư, cần theo dõi

+ P IV: Có ít tế bào ung thư

+ P V: Hầu như toàn bộ tiêu bản là những tế bào bong có đầy đủ tính chấtcủa ung thư

Hiện nay, thường áp dụng hệ thống phân loại Bethesda - 2001 để chẩn

đoán và phân loại các tổn thương biểu mô ở CTC (Squamous Intraepithelial Lesion - SIL): [5], [8].

những ưu điểm trên phương pháp Pap smear đã đóng góp rất nhiều trong chẩn

đoán sớm ung thư CTC, tuy nhiên phương pháp này cũng có tỷ lệ âm tính giả,theo nghiên cứu của các tác giả tỷ lệ dao động từ 1,1 đến 29,7% [3], [4], [15],[65] Ngày nay, nhờ sự phát triển của sinh học phân tử, đặc biệt kỹ thuật PCRcho phép phát hiện chính xác nhiễm HPV

1.1.3.2 Chẩn đoán dựa trên phân tích mRNA

Phát hiện các serotype bằng phương pháp phát hiện sự có mặt của mRNA của gen E6, E7 sau khi đã hoà nhập vào hệ gen của tế bào chủ Thực chất củaphương pháp này dựa trên cơ sở gen E6, E7 có khả năng đột nhập vào hệ gen tếbào chủ và trở thành một thành phần của hệ gen tế bào chủ Gen E6, E7 củaHPV cũng được sao chép thành các RNA tương ứng Khi phát hiện sự có mặtcủa các gen này, nghĩa là tế bào chủ đã bị nhiễm và tiếp nhận DNA của HPV.Khi tế bào cơ thể đã có sự xâm nhập của DNA E6 và E7 vào hệ gen, tế bào đãbiến đổi thành tế bào ung thư ác tính và tần suất xuất hiện của mRNA của E6 vàE7 là rất cao, chúng có hoạt tính cao để tổng hợp các protein E6, E7 gây ungthư Phương pháp này sử dụng chất huỳnh quang và thực hiện trên máy đo hàmlượng tế bào, gọi là phương pháp tế bào động Ngoài ra, có thể thực hiện trực

tiếp trên các phiến kính đã được sử dụng trong chẩn đoán “Pap smear” và xem

kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang (có thể nhận biết được các tế bào nổi và

tế bào đã nhập gen) Theo các báo cáo nghiên cứu thì độ nhạy của phương pháp

là 100%, độ đặc hiệu là 70%, sở dĩ phương pháp này có dương tính giả là dotính đặc hiệu có bị giảm, tuy nhiên dương tính giả không có nghĩa là âm tính, dohàm

lượng gen E6 và E7 thấp (virus chưa sao chép hoàn toàn) [9]

1.1.3.3 Định týp HPV bằng sinh học phân tử

Phương pháp sinh học phân tử quan trọng nhất trong chẩn đoán và định týpHPV là PCR, sử dụng các cặp mồi chung cho mọi týp HPV và đặc hiệu riêngcho từng týp riêng biệt Do vậy, có 2 loại PCR được sử dụng: PCR chung chomọi týp HPV và PCR riêng cho từng týp HPV

PCR chung cho mọi týp HPV

PCR chung cho mọi týp phát hiện HPV, còn được gọi là PCR đặc hiệu theo nhóm, gs-PCR (group-specific PCR), phát hiện virus thuộc cùng một nhóm Một

trong những cố gắng của các nhà khoa học thực nghiệm là làm sao chỉ cần một

phản ứng PCR mà phát hiện được tất cả các týp HPV và phân biệt HPV với cácloại virus gây ung thư khác Do vậy, PCR trong trường hợp này phải sử dụng

các cặp mồi (primer) chung cho nhiều týp HPV, nhưng chỉ riêng cho HPV, mà

không chung với các virus khác Cặp mồi cổ điển nhất được thiết kế là MY09 MY11, có khả năng nhân lên được đoạn DNA có độ dài 450 cặp nucleotid, nằmtrong gen L1 là gen cấu trúc vỏ capsid của HPV [17] Cặp mồi thứ hai là GP5 -GP6 cũng được sử dụng để thu nhận một đoạn DNA nằm bên trong giới hạn củavùng DNA do MY09 -MY11 nhân lên Sử dụng cả hai cặp mồi MY09 - MY11

-và GP5 - GP6 -và phương pháp PCR lồng (Nested PCR) phản ứng được thựchiện có độ nhạy cao với lượng khuôn ban đầu chỉ cần là 0,005 - 0,010 nanogram(ng), tương đương với DNA hệ gen của 10 - 200 virus HPV

Có khoảng 7% số lượng phản ứng PCR với cặp mồi MY09 - MY11 khôngcho kết quả phát hiện DNA - HPV, có thể do không có DNA của virus HPVtrong tế bào ung thư của mẫu nghiên cứu hoặc DNA - HPV đã nhập gen vào tếbào CTC và do vậy virus không còn tồn tại trong bệnh phẩm [61]

Nhiều phương pháp nghiên cứu được sử dụng để định týp HPV sau khinhân một đoạn gen bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi chung Cặp mồi chungcủa PCR hoạt động trên hệ gen HPV của nhiều týp, nhưng không cho biết sảnphẩm PCR là của týp nào Do vậy, việc xác định týp chỉ có thể thành công saukhi phân tích sản phẩm Trong nhiều cách phân tích, người ta thường sử dụngphương pháp giải trình tự (Sequencing) và so sánh đối chiếu các chuỗi nucleotid

và acid amin của sản phẩm; hoặc sử dụng phương pháp phân tích đa hình RFLP

(Restriction fragment length polymorphism) và hợp lai phóng xạ với các mẫu dò

DNA đã biết

Gần đây, cặp mồi ký hiệu SPF10 được thiết kế chỉ nhân được đoạn gen 65

bp (Base pair) của gen L1, nhưng rất nhạy và hầu như thực hiện được với tất cả

các mẫu bệnh phẩm, kể cả bệnh phẩm cố định bằng formalin PCR khó cho sản

phẩm dài với khuôn DNA kém chất lượng, đặc biệt là DNA tách từ mẫu cố địnhtrong formalin Do đó, SPF10 tỏ ra có lợi thế khi rà soát nhiều loại bệnh phẩm

có chất lượng khác nhau

PCR riêng định týp HPV

Định týp riêng biệt HPV dựa vào tìm kiếm sự khác nhau về thành phần gentrong gen E6 và E7, đây là các gen "độc", tổng hợp protein gây ung thư, do vậychúng quyết định độc lực (tính gây bệnh) của HPV và chúng có mức độ biến đổikhác nhau Hiện nay, đã có 14 cặp mồi đặc hiệu cho PCR, sử dụng một cách đặchiệu và nhạy nhân đoạn gen có độ dài 100bp trong gen E7, phát hiện HPV thuộccác týp HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -66 và -68[62] Phản ứng có độ nhạy rất cao, chỉ cần 10 - 200 virus HPV là đủ cung cấpDNA hệ gen làm khuôn để thực hiện PCR thành công Do có khả năng phát hiện

riêng từng týp, nên phản ứng PCR kiểu này được gọi là phản ứng PCR đặc hiệu theo týp, ký hiệu là ts-PCR (type- specific PCR) PCR đặc hiệu theo týp

hiện nay được sử dụng nhiều trong nghiên cứu, nhưng rất giới hạn trong sànglọc bệnh phẩm đại trà, do chi phí còn rất cao

1.1.4 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam Bệnh

ung thư CTC là một bệnh phổ biến, có tỷ lệ tử vong cao trong các

bệnh ung thư nói chung và ung thư đường sinh dục nữ nói riêng, có thể coi đây

là một bệnh nguy hiểm đối với phụ nữ trên thế giới và đặc biệt ở Việt Nam hiệnnay Mặc dù, với sự hiểu biết ngày càng sâu sắc về nguyên nhân gây bệnh vàứng dụng các biện pháp nhằm phát hiện sớm, ngăn ngừa tiến triển của bệnh như:

vệ sinh, phát hiện sớm và điều trị những tổn thương nghi ngờ, chẩn đoán sànglọc…, nhưng cho đến nay bệnh vẫn ngày càng có xu hướng gia tăng

Bệnh được gây ra bởi nhiều nguyên nhân đa dạng và phức tạp dẫn đến việcphát hiện, chẩn đoán và áp dụng các biện pháp điều trị, ngăn ngừa cho bệnh

nhân ở giai đoạn tiềm ẩn của bệnh gặp nhiều khó khăn HPV đã được xác định

là nguyên nhân chính gây ung thư CTC ở người và lây nhiễm chủ yếu quađường tình dục cũng là một trong những nguyên nhân góp phần gia tăng tỷ lệmắc mới hàng năm trong cộng đồng Tuy nhiên, những hiểu biết về HPV và ungthư CTC đã cho thấy bệnh hoàn toàn có thể được ngăn chặn và điều trị khỏi, nếuđược phát hiện và điều trị sớm Các phương pháp chẩn đoán bệnh sử dụng phổbiến hiện nay dựa trên triệu chứng lâm sàng, chẩn đoán tế bào học, soi CTC,chẩn đoán mô bệnh học, thường chỉ phát hiện được ở giai đoạn muộn khi bệnh

đã chuyển sang giai đoạn ung thư, không hoặc khó chẩn đoán được người bệnh

có bị nhiễm HPV ở giai đoạn sớm, tiềm ẩn và nếu nhiễm thì thuộc týp HPV nào.Các dữ liệu về gen và hệ gen của HPV được lưu trữ trong Ngân hàng Gen[GenBank (http://www ncbi.nlm.nih.gov)] là một nguồn dữ liệu giá trị cho việcphân tích, so sánh đối chiếu các týp HPV ở Việt Nam, qua đó lựa chọn ra cácchỉ thị di truyền của HPV nhằm phục vụ cho xây dựng phương pháp phát hiệnHPV lưu hành gây bệnh tại Việt Nam, giúp cho việc chẩn đoán phát hiện sớmHPV, bước đầu định hướng ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trongviệc chẩn đoán ung thư CTC và xác định týp HPV hay gặp ở nước ta

1.2 UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV)

1.2.1 Dịch tễ học ung thư vòm mũi họng

Ung thư vòm mũi họng NPC (Nasopharyngeal carcinoma) là một khối u

ác tính xuất phát từ lớp biểu mô phủ của vùng vòm mũi họng [53] Loại ung thưnày được xếp vào các khối u biểu mô của đường tiêu hoá và hô hấp trên Đây làmột trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người Việt Nam và là loại hay gặp nhấttrong các ung thư vùng tai mũi họng [23], [56]

1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, vùng có nguy cơ ung thư vòm mũi họng cao nhất là miềnNam Trung Quốc và phần lớn các nước Đông Nam Á với tỷ lệ 20 – 30/100.000

dân, do đó ung thư vòm mũi họng còn gọi là U Quảng Đông [33] Trong nhữngvùng này, NPC là ung thư vòm mũi họng đứng hàng đầu của nam giới và chiếmtới 3/4 các loại ung thư vùng đầu cổ Vùng có nguy cơ trung bình ở quanh bờbiển Địa Trung Hải và phía Đông Châu Phi với tỷ lệ 5 - 9/100.000 dân Vùng cónguy cơ rất thấp 0,1- 0,5/100.000 dân như Châu Âu, Châu Mỹ và ở các nướccông nghiệp phát triển (Bắc Mỹ, Nhật, Úc) là những nơi mà NPC chỉ chiếm 1-3% vùng đầu mặt cổ.

Ngoài tính phức tạp chủng/type và đặc tính gây bệnh của EBV, còn phải

kể đến sự đa nhiễm các loại virus ung thư khác như: HSV, HPV, CMV, HIV và

có thể EBV tồn tại trợ giúp tương tác lẫn nhau để ung thư biểu mô phát triểnmạnh hơn [48] EBV có thể là phức hợp chính gây ra ung thư VMH và các ungthư biểu mô khác rải rác trong cơ thể, mà nguyên nhân gây bệnh cũng hết sức đadạng, phức tạp dẫn đến việc chẩn đoán và điều trị bệnh gặp nhiều khó khăn Córất nhiều giả thiết, về nguyên nhân gây bệnh ung thư vòm họng nhưng tập trung

thành ba nhóm chủ yếu đó là do virus Epstein-Barr, do di truyền và do các yếu

tố môi trường, tập quán ăn uống, hoá chất [45], [69] Trong thời gian gần đây,nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả đã chứng minh được mối liên quan

mật thiết giữa virus Epstein-Barr và ung thư vòm mũi họng Các nghiên cứu này

đã cho thấy sự biểu lộ của các kháng nguyên virus trong các giai đoạn của bệnh

và vai trò quan trọng của virus Epstein-Barr trong bệnh học cũng như trong quá

trình sàng lọc chẩn đoán, điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24], [30], [37],[40]

1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Ở Việt Nam, ung thư vòm mũi họng đứng hàng đầu trong các ung thư TaiMũi Họng và Đầu Mặt Cổ, đứng hàng thứ 7 trong các ung thư toàn thân (7,1%).Theo UICC, ung thư vòm mũi họng chiếm 1% dân số thế giới EBV là mối quantâm sâu sắc của các nhà lâm sàng và sinh học phân tử, do quần thể EBV ở nước

ta cũng có nhiều biến động lớn và có nét riêng biệt về đặc tính phân tử và gâybệnh [13] Ở Việt Nam, cho đến nay đã xác định được chủng EBV giống chủng

của châu Âu B95-8 [14] Một số chủng/type mới phát hiện được coi là nguyênnhân gây ung thư cao, thuộc nhóm lưu hành vùng Nam Trung Quốc, có nhữngđột biến đặc biệt so với EBV của thế giới [7], [13], [67].

Một trong những phương pháp tiên tiến trong định type virus gây bệnh, làthu nhận đoạn gen (gen kháng nguyên hoặc/và độc lực) hoặc toàn bộ đoạn gen,

hệ gen cần nghiên cứu bằng phản ứng PCR, sau đó so sánh trình tự củachuỗi nucleotide/amino acid của chúng, đối chiếu với các chủng/type khác trênthế giới Hiện nay, trong Ngân hàng gen [GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)] đã có hàng trăm chuỗi nucleotid và một số hệgen hoàn chỉnh của EBV thuộc các type khác nhau trên thế giới, đặc biệt toàn

bộ hệ gen của chủng GD1 (số đăng ký: AY961628) thuộc loại độc lực caophân lập ở Quảng Đông trong vùng dịch tễ ung thư VMH Nam Trung Quốc[67], là một nguồn dữ liệu quý giá cho việc so sánh đối chiếu các chủng/typeEBV của Việt Nam Qua nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước, đãphát hiện được hàng trăm chuỗi nucleotid và một số hệ gen hoàn chỉnh củaEBV trong các mô sinh thiết ung thư vòm mũi họng thuộc các type EB (WT),

EB (B95-8), EB (RAJI), EB (GD1), EB (CN) Các chủng virus này có phân bốkhác nhau theo các vùng trên thế giới Chúng có độc tính và đặc tính gây bệnhkhác nhau [24]

1.2.2 Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus

1.2.2.1 Phát hiện virus Epstein - Barr và ung thư vòm mũi họng (VMH)

Năm 1958, Burkitt phát hiện ra khối u lympho xương hàm trên ở trẻ emChâu Phi, từ đó bệnh này được mang tên ông: Burkitt’s Lymphoma (BL) Năm

1964, Epstein-Bar phân lập được loại virus ở dòng Lymphoblast trong khối u

BL bằng kính hiển vi điện tử [28] Từ đó virus này được mang tên: Virus Epstein - Barr (EBV) Năm 1966, Kelein báo cáo về phản ứng miễn dịch của

kháng thể dịch chống lại tế bào Lympho B nuôi cấy [34] Cũng vào năm ấy Oldbáo cáo phản ứng ngưng kết của kháng thể chống kháng nguyên EBV trong ungthư VMH Năm 1968, Henle khuấy động nền y học thế giới bởi phát hiện thấy

sự chuyển đổi từ (-) sang (+) của phản ứng miễn dịch của kháng thể chống lạiEBV ở một kỹ thuật viên trong khoa của ông mà trước đó đã mắc bệnh tăngbạch cầu đơn nhân nhiễm trùng Sau đó, Henle nghiên cứu thấy phản ứng miễndịch huỳnh quang (+) tới 92 % ở bệnh nhân ung thư VMH Năm 1969, phát hiệnđược EBV trong tế bào line của tổ chức ung thư vòm bằng kính hiển vi điện tử.Năm 1975, Nadol phân lập được các tiểu thể EBV trong tế bào biểu mô ung thưvòm bằng kính hiển vi điện tử Đây là lần đầu thấy các tiểu thể virus

Herpes trong tế bào ung thư của người và gợi ý rằng EBV có thể là tác nhân

gây ung thư [20], [60] Đặc biệt, EBV làm chuyển dạng tế bào lympho thànhnguyên bào lympho và thay đổi cả thể nhiễm sắc, đồng thời lại trung hòakháng thể Năm 1980, một số nghiên cứu đã tìm ra được các nhóm gen cơbản và năm 1984 đã biết được toàn bộ chuỗi gen của EBV và ngày nay hệgen EBV của hàng chục chủng trên thế giới đã được giải mã và nghiên cứu[31], [41], [67])

1.2.2.2 Đặc điểm phân loại và cấu trúc EBV

EBV là một thành viên thuộc nhóm Herpes type 4 gây nhiễm bệnh trênngười [46], được phân loại theo sơ đồ phân loại như sau: Viruses ; dsDNA viruses, no RNA stage ; Herpesviridae ; Gamma herpesvirinae ; Lympho cryptovirus ; Human herpesvirus 4 (liệt kê danh pháp phân loại tại Ngân hàngGen:(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/ Taxonomy/taxonomyhome.html/)

EBV tồn tại dưới dạng hình khối cầu, bao gồm vỏ capsid, vỏ ngoài

(envelope) và trong cùng là hệ gen virus Cấu trúc hệ gen của EBV là chuỗi

DNA xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172kb, nếu tính cả phần cấu trúclặp ở hai đầu là 184kb Hệ gen được chứa đựng trong vỏ capsid, có hình tháiđối xứng hình khối, đó là cấu trúc protein đóng kín để bảo vệ nhân DNA củavirus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV Capsid là vỏ được xácđịnh bởi 20 mặt bên, với 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng theo kiểu 5-3-

2 Vỏ capsid bao gồm 162 capsome, là những đơn vị cấu trúc trên 5 đỉnh hay 6đỉnh Các đơn vị protein đó được mã hoá bởi các gen virus Capsid lại được

bao quanh bởi một vỏ bao ngoài khác, gọi là vỏ ngoài (envelope), cấu trúc

chủ yếu từ thành phần glycoprotein Vỏ bao này cũng được mã hoá và cũngmang dấu ấn miễn dịch Giữa capsid và vỏ ngoài là khoảng chứa đựng cácprotein đệm cấu trúc và các enzyme của virus Vỏ ngoài của EBV có sự nhạycảm với tác động của acid, ether, các dung dịch hoà tan, sát khuẩn và đôngkhô [26] Hiện nay, có hai loại EBV được biết gây nhiễm ở người đó là:EBV-1 và EBV-2, mặc dù biểu hiện lâm sàng và gây bệnh như nhau, nhưngtrong hệ gen có sự sai khác về cấu trúc gen EBNA-1

1.2.2.3 nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của EBV

EBV là loại virus truyền nhiễm gây bệnh trên người và lan truyền quađường tiêu hoá, thường được phát hiện trong chất thải tế bào, chất tiết ở phầntrên của hệ tiêu hoá và hô hấp như nước bọt, niêm dịch vùng họng EBV có đặctính hướng bạch huyết hấp phụ lên tế bào Lympho B thông qua tương tác củaglycoprotein gp350/220 có trên bề mặt virus với thụ thể CR2/CD21 của bổ thểC3d Sự xâm nhập của EBV vào Lympho B còn có sự trợ giúp của phức hợpgp25 (gL), gp42/38 và gp85 (gH) Phức hợp này làm trung gian tương tác giữaEBV với MHC lớp 2 và chúng có vai trò như một tổ hợp thụ thể đồng trợ giúpcho EBV xâm nhập sâu vào tế bào Lympho B [48] EBV gây sơ nhiễm và tồntại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh EBV là nguyên nhân gây bệnhtăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn và có liên quan đến cơ chế tiến triểncủa một số loại ung thư như tăng sinh lymphoB hay Burkitt lymphoma, bệnhHodgkin, một số dạng T-lymphoma, ung thư biểu mô như ung thư VMH vàung thư dạ dày Đặc trưng của các khối u này là các tế bào khối u chứa mộtlượng lớn các bản sao hệ gen của EBV và xuất hiện sự biểu hiện các genprotein màng tàng nhiễm (LMP) cho một lượng lớn các sản phẩm protein mà

nó có thể đóng vai trò chuyển hoá khối u lành thành ác tính [46]

Trong cơ thể, EBV có 3 hướng tiếp tục tiến triển được minh hoạ ở Hình 1.7:

- Xâm nhập vào tế bào biểu mô và nhân lên (Hình 1.7-(2 ))

- Gây sơ nhiễm và xâm nhập vào tế bào lympho B thực hiện sự nhân lên(Hình 1.7-(1)/(3)/(6)/(7)/(8)/(9)).

- Tàng nhiễm và tiến triển ung thư khi có đủ điều kiện (Hình 1.7-(3)/(4)).Ngoài ra, quá trình nhiễm EBV cũng có khả năng kích thích đáp ứngmiễn dịch, chủ yếu là loại hình miễn dịch trung gian tế bào có vai trò củalympho T (Hình 1.7-(5))

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV

trong cơ thể bị nhiễm [48]

Đối với trường hợp thứ nhất, EBV tìm thấy điều kiện thích ứng trong tếbào biểu mô và sự nhân lên của EBV thuộc loại hình gây nhiễm có sinh sản

(productive infection) (Hình 1.7-(2)) EBV giải phóng ra tiếp tục các hướng tiến

triển như đã nêu ở trên EBV có thể nhân lên trong tế bào biểu mô hoặc chuyển

từ sơ nhiễm sang gây nhiễm thứ cấp bằng cách nhân lên mãnh liệt trong lympho

B giải phóng virus vào nước bọt hoặc có thể chuyển từ sơ nhiễm sang tàngnhiễm và tiến triển ung thư vòm họng [48]

Đối với trường hợp thứ hai, EBV sơ nhiễm sẽ tìm đến lympho B có trongvùng họng, thực hiện sự xâm nhập và nhân lên trong các tế bào này Virus giải

phóng ra hàng loạt bằng cách dung giải tế bào, xâm nhiễm vào quần thể lympho

B, gây nhiễm thứ cấp mà kết quả là có một lượng lớn EBV được tung ra, chúng

có rất nhiều trong nước bọt Lúc này, EBV lại có thể gây nhiễm các tế bào biểu

mô (Hình 1.7-(7-9))

Đối với trường hợp thứ ba, EBV thực hiện sự gây nhiễm bán sinh sản

(semi-productive infection) và tàng nhiễm trong tế bào lympho B (Hình 1.7 –

(4)) Nhờ trợ giúp của một số sản phẩm protein sớm (EBNA-1) và muộn 1), EBV thực hiện quá trình chuyển đổi lympho B, non hoá và biệt hoá chúngtăng sinh và tiến triển ung thư Tuy nhiên, quá trình ung thư do EBV khởiphát còn chịu nhiều tác động hỗ trợ của rất nhiều yếu tố mà về thực chất ngày nay còn chưa biết rõ

(LMP-1.2.2.4 Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gen của EBV

Hệ gen của EBV là cấu trúc DNA vòng, sợi đôi (dsDNA), chứa các gen

mã hóa cho các protein của virus được định vị trên một sợi DNA của hệ gen.Trong Hình 1.8 là sơ đồ cấu trúc vòng DNA của hệ gen EBV, trong đó có vùngmầm và điểm khởi phát oriP; các exon mã hoá cho 6 protein kháng nguyên nhân(EBNA-1, -2, -3A, -3B -3C và EBNA-LP) và 3 protein màng (LMP-1, -2A, -2B) Các promoter cho từng vùng sao chép được ký hiệu Cp/Wp, Qp (b) Sơ đồmạch thẳng của hệ gen EBV, trong đó có 6 gen EBNA và gen LMP-1 giới hạn

hai đầu bởi các chuỗi kết thúc TR (terminal repeat).

Hình 1.8 Cấu trúc hệ gen EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a) và dạng mạch

thẳng (b) (Murray PG và cs, 2001 [48])

Hệ gen của EBV có 6 tổ hợp gen mã hoá cho các loại protein kháng nguyên:Kháng nguyên nhân, ký hiệu là EBNA: (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C và EBNA-LP) và 3 gen mã hoá cho protein màng (LMP-1, LMP-2A và LMP-2B) [26], [48] Sáu protein EBNA có liên quan đến vai trò xâmnhập và nhân lên của virus trong tế bào Lympho B giai đoạn đầu, còn 3 loạiprotein LMP liên quan đến chu kỳ EBV trong dòng tế bào Lympho B đã chuyểnđổi từ dạng nghỉ sang dạng thường trực - những dòng tế bào mầm gây nhiễmtrùng muộn (LCL) Trong dòng tế bào LCL, EBNA được sao chép trong mộtRNA thông tin đơn nhất và tổng hợp thành một protein chung, sau đó đượcphân cắt thành các EBNA thành phần độc lập [46], [66]

1.2.2.5 Gen và sản phẩm của gen EBNA-1

Gen EBNA-1 là một đoạn DNA nằm trong tổ hợp gen EBNA mã hoá cho protein EBNA-1 EBNA-1 là chuỗi polypeptide bao gồm 641 acid amin, trong đóthành phần 3 acid amin glycine-glycine-alanine (Gly-Gly-Ala) được lặp lại nhiều

lần, mà số lượng lặp thay đổi khác nhau trong các mẫu/chủng EBV khác nhau[60] Vùng lặp 3 acid amin Gly-Gly-Ala này có tác dụng điều hoà nghịchMHC-I và ngăn cản quá trình phân giải kháng nguyên Nếu không có trình diệnkháng nguyên phân giải thì Lympho T loại CD8 không có chức năng hoạt động

để kìm hãm hoạt hoá EBNA-1 Protein EBNA-1 có vai trò thiết yếu trong quátrình xâm nhập và nhân lên cũng như duy trì sự tái tạo hệ gen của virus GenEBNA-1 và sản phẩm protein EBNA-1 có mặt trong tất cả mọi dạng khối u cóliên quan đến EBV và gen EBNA-1 có khả năng biểu hiện protein bằng cách

sử dụng một trong 4 loại promoter khởi động EBNA-1 thực hiện chức năng

bằng cách bám vào vùng mầm oriP là điểm khởi phát sự nhân lên của DNA

hệ gen EBV EBNA-1 còn tương tác điều hoà tiếp tục sự sao chép của tổ hợp

EBNA bằng cách bám vào vị trí Qp và promoter này được sử dụng trong tế bào

nhiễm EBV theo chương trình tàng nhiễm type 1 và tàng nhiễm type 2 [26].Ngoài ra, có vai trò kích hoạt sao chép và điều hoà chức năng của promoter

Cp và LMP-1 Vai trò trong sự hình thành khối u lymphoma tế bào B của

EBNA-1 cũng được chứng minh khi gây bệnh thực nghiệm trên chuột Trongtất cả các EBNA thì gen EBNA-1 có vai trò quan trọng trong chu kỳ tái tạo,nhân lên và gây bệnh của EBV

1.2.3 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng ở Việt Nam

Khi người bị nhiễm EBV có những điều kiện cần thiết cho sự tiến triển ungthư VMH và nhiễm tiềm tàng EBV vào tế bào lympho-B đủ điều kiện phát triểnthành dạng ung thư Burkitt (BL), người ta luôn thấy gen EBNA-1 ở trạng tháisao chép sớm và protein luôn luôn được tổng hợp, do vậy kháng nguyên EBNA-1xuất hiện kèm theo cho phép xác nhận tế bào đã chuẩn bị cho sự chuyển dạngsớm trở thành ung thư Việc phát hiện gen EBNA-1 trong những tháng đầu tiên,đặc biệt là phát hiện từ tế bào lympho-B chuyển dạng có tầm quan trọng đặcbiệt cho sự xác nhận chính xác bệnh nhân đã có dấu hiệu ung thư sớm [58]

VCA (Viral capsid antigen) là kháng nguyên vỏ virus, luôn luôn xuất hiện trong

người nhiễm EBV, vì

EBV nhân lên trong tế bào biểu mô cần protein này Đối với EBV gây nhiễmtiềm tàng lympho-B và có dấu hiệu chuyển dạng gây ung thư hay biểu môvùng họng chuyển thành NPC, sự biểu hiện gen EBNA nói chung và EBNA-1nói riêng cũng như thành phẩm của gen này là protein EBNA-1 trong cơ thể làchỉ thị chẩn đoán hết sức quan trọng và cần thiết xác định người bệnh xuất hiệnung thư ở giai đoạn sớm EBNA-1 cần thiết cho virus nhân lên và khép vòngtạo episome chuẩn bị cho sự gây nhiễm tiềm tàng và chuyển dạng ung thư,

do vậy, gen EBNA-1 có giá trị chẩn đoạn sớm rất cao trong ứng dụng sinh họcphân tử

Chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật PCR thông thường và PCR địnhlượng (real-time PCR) đã được áp dụng rộng rãi đối với phát hiện EBV ở mọidạng gây nhiễm và gây bệnh, ở ung thư NPC hay Burkitt hoặc trong các ung thưkhác có liên quan đến vai trò của EBV [29] Một số nghiên cứu sử dụng PCR vàreal-time PCR đã thành công trong phát hiện EBV ở ung thư vú, trong liên kếttiến triển NPC [39], trong tế bào di căn lan toả trong cơ thể hoặc sử dụng pháthiện gen trước khi kiểm nghiệm bằng huyết thanh học và PCR còn phát hiệnđược EBV trong bệnh phẩm cố định paraffin hoặc mẫu máu lâm sang [38].Như vậy, có thể phân làm 2 giai đoạn chẩn đoán: chẩn đoán sớm (trong vòng 6tháng) sử dụng kỹ thuật phân tử phát hiện gen EBNA-1 hoặc kỹ thuật miễn dịchphát hiện sản phẩm của gen và chẩn đoán muộn kỹ thuật miễn dịch phát hiệnkháng thể kháng EBNA-1

Tuy nhiên, cho đến nay những nghiên cứu sinh học phân tử EBV và NPC

ở nước ta mới chỉ dừng ở góc độ khám phá chỉ thị di truyền phân tử giúp giámsát lâm sàng chứ chưa có những nghiên cứu gen/hệ gen một cách có hệ thống

để có những giám sát dịch tễ học phân tử loại virus nguy hiểm này Vì thế,việc chẩn

đoán sớm và phòng bệnh còn rất hạn chế Hiện nay, phương pháp PCR sử dụngchỉ thị phân tử của EBV, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hơn nữa có thể xácđịnh được các týp EBV đã và đang được ứng dụng vào trong chẩn đoán Các dữ