Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở lúa việt nam

Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR, RFLP, AFLP được nghiên cứu và phát triển để trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặ

- -

NGUYỄN THỊ AN TRANG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở

LÚA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

- -

NGUYỄN THỊ AN TRANG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở

LÚA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học

TS Lã Tuấn Nghĩa

ỘI 2012

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này

M ọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên c ứu khác Các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được công

b ố

Tôi xin hoàn toàn ch ịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

H ọc viên

Nguyễn Thị An Trang

L ỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Lã Tuấn

Nghĩa, TS Lê Thanh Hà người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo và hỗ

tr ợ tôi trong suốt quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu

và hoàn thành lu ận văn này

Tôi xin bày t ỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ công tác tại Viện Công ngh ệ Sinh học thực phẩm, Viện Đào tạo Sau Đại học- Trường Đại học Bách khoa

Hà N ội đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

t ại trường

Tôi xin chân thành c ảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Đa dạng sinh h ọc nông nghiệp – Trung tâm tài nguyên thực vật đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình công tác và th ực hiện luận văn

Cu ối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình nghiên c ứu

Lu ận văn này được thực hiện với nguồn kinh phí từ chương trình Công nghệ sinh h ọc nông nghiệp

Hà n ội, ngày 19 tháng 2 năm 2013

H ọc viên

M ỤC LỤC

L ỜI CẢM ƠN

M Ở ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Gi ới thiệu chung về cây lúa 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây lúa 4

1.1.2 Nguồn tài nguyên lúa Việt Nam 6

1.2 H ạn hán và cơ chế chống chịu hạn ở thực vật 8

1.2.1 Khái niệm và phân loại hạn hán 8

1.2.2 Phân loại hạn hán đối với cây trồng 8

1.2.3 Cơ sở di truyền của tính chịu hạn 9

1.2.4 Ảnh hưởng của hạn hán đối với cây lúa 10

1.2.5 Phản ứng của cây lúa với hạn hán 11

1.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 12

1.3.1 Đa dạng di truyền 12

1.3.2 Chỉ thị hình thái 13

1.3.3 Chỉ thị hóa sinh 14

1.3.4 Chỉ thị phân tử ADN 15

1.4 Thành t ựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa 22

1.4.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hình thái 23

1.4.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hóa sinh 25

1.4.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị ADN 25

1.5 Nghiên c ứu lúa chịu hạn trên thế giới và Việt Nam 26

1.5.1 Nghiên cứu lúa chịu hạn trên thế giới 26

1.5.2 Nghiên cứu lúa chịu hạn ở Việt Nam 28

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 V ật liệu nghiên cứu 30

2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu 30

2.2 Hóa ch ất và thiế bị nghiên cứu 32

2.3.Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Đánh giá khả năng chịu hạn của dòng/giống lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm 34

2.3.2 Tách chiết ADN tổng số từ lá lúa 36

2.3.3 Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN 37

2.3.4 Nhận dạng di truyền các giống lúa bằng chỉ thị SSR 37

2.4 Phân tích x ử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 K ết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng/giống lúa trong phòng thí nghi ệm 41

3.1.1 Kết quả đánh giá tỷ lệ nảy mầm, tỷ lệ rễ mầm đen (héo) ở giai đoạn nảy mầm 41

3.1.2 Đánh giá mức độ chống chịu hạn của 50 dòng/giống lúa 44

3.2 K ết quả đánh giả khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ 46

3.2 K ết quả tách chiết ADN tổng số 48

3.3 K ết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide 49

3.4 Quan h ệ di truyền liên quan đến tính chịu hạn của các dòng/giống lúa 56

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

4.1 K ết luận 64

4.2 Ki ến nghị 64

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 65

PH Ụ LỤC

DANH M ỤC VIẾT TẮT

ABA : Abcisis acid

AFLP (Amplified Fragment Length

Polymorphism)

: Đa hình chiều dài đoạn khuếch đại

CSGE : Conformation Sensitive Gel

Electrophoresis

DAMD-PCR : Direct Amplification of Minisatellite

IRRI : Viện nghiên cứu lúa quốc tế

ISSR : Inter Simple Sequencen Repeat

Kb : Kilo base

LED : Late embryogenesis abundant

MAS : Marker Assisted Selection

PCR (Polymerase Chain Reaction) : Phản ứng chuỗi trùng hợp

PIC (Polymorphism Information : Chỉ số thông tin đa hình của mồi

Content)

QTL (quantity trait loci) Locus kiểm soát tính trạng số lượng

RAPD( RADNom Amplified

Polymorphic DNA)

: Đa hình ADN khuếch đại

RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism)

: Đa hình chiều dài đoạn phân cắt

SCARs : Sequence Characterized Amplified Regions

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

SNP (Single Nucleotide

Polymorphism )

:Hiện tượng đa hình nucleotit đơn

SSR (Simple sequence repeat) : Trình tự lặp đơn giản

STMS : Sequence – tagged microsatellite marker

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách 50 mẫu dòng/ giống lúa trong nghiên cứu 30

Bảng 2.2 Danh sách 32 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 32

Bảng 2.3 Thang điểm đánh giá mức chống chiu hạn của lúa sau khi xử lý Saccarin1% và KClO3(3%) 35

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR (thể tích phản ứng 20µl/tube) 37

Bảng 2.5 Các bước phản ứng trong máy PCR 38

Bảng 2.6 Thành phần gel polyacrylamide 8% 38

Bảng 3.1 Tỷ lệ nảy mầm, tỷ lệ rễ mầm đen khi xử lý bằng dung dịch đường Saccarin 1 % và KClO3 3 % 42

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của 50 dòng/giống lúa ở giai đoạn mạ khi xử lý bằng dung dịch KClO3 (3%) trong 7 ngày 47

Bảng 3.3 Số băng ADN, số alen thể hiện, hệ số PIC của các chỉ thị nghiên cứu 50

Bảng 3.4 Tỷ lệ khuyết số liệu và dị hợp tử của các dòng/giống lúa nghiên cứu 54

Bảng 3.5 Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền SSR trên cây lúa đã được công bố 56

Bảng 3.6 Bảng ma trận tương đồng giữa 50 mẫu giống lúa nghiên cứu 59

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hóa hai loài lúa trồng 5

Hình 1.2 Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT)n 20

Hình 3.1 Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm 41

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mức độ chống chịu hạn của 50 dòng/giống lúa ở giai đoạn nảy mầm 45

Hình 3.3 Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn giai đoạn mạ 46

Hình 3.4 Hình ảnh nhận dạng ADN tổng số của các mẫu dòng/giống lúa 48

Hình 3.5 Kết quả nhận dạng di truyền 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM231 49

Hình 3.6 Kết quả nhận dạng di truyền 50 dòng/ giống lúa bằng chỉ thị RM201 49

Hình 3.7 Kết quả nhận dạng di truyền của 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM240 49

Hình 3.8 Kết quả nhận dạng di truyền của 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM255 50

Hình 3.9 Kết quả nhận dạng di truyền 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM261 50

Hình 3.10 Sơ đồ hình cây quan hệ giữa các giống 61

M Ở ĐẦU

1 Tính c ấp thiết của đề tài

Lúa trồng (Oryza sativ L.) là cây lương thực lâu đời và phổ biến nhất trên thế

giới [50] Cây lúa được gieo trồng tại 114 quốc gia, tập trung chủ yếu ở Châu Á, Phi,

Mỹ Latinh Đây là những nước có tỷ lệ dân số tăng cao do vậy nhu cầu về lúa gạo ngày càng tăng Tuy nhiên ở các nước này, đặc biệt là các nước Châu Á, diện tích

trồng lúa đang giảm nhanh do sự mở rộng các vùng dân cư, các khu công nghiệp và giao thông Thêm vào đó, các điều kiện bất lợi của môi trường như lũ lụt, hạn hán, xâm nhập mặn… cũng là nguyên nhân chính làm cho sản lượng lúa suy giảm [2]

Theo đánh giá của các nhà chuyên môn, khô hạn sẽ là yếu tố chính gây ảnh hưởng đến an ninh lương thực thế giới, nó có thể làm giảm tới 70% năng suất cây trồng nói chung [30] Tại Châu Á, hàng năm có 46 nghìn ha diện tích đất canh tác nhờ vào nước trời ( mưa tự nhiên) Tuy nhiên do sự biến đổi khí hậu sẽ làm thay đổi tình hình phân phối lượng mưa và làm gia tăng tỷ lệ các diện tích khô hạn ở những vùng đất nông nghiệp chủ chốt[85] Bên cạnh đó, nhu cầu sản lượng gạo ngày một tăng, theo báo cáo của FAO cho những năm 1990 – 2025 thì lúa gạo sản xuất mỗi năm phải

tăng 21% để đáp ứng nhu cầu lương thực cho 1,7% dân số tăng mỗi năm

Việt Nam là một nước đang phát triển, sản xuất nông nghiệp đang chiếm tỷ

trọng lớn trong nền kinh tế quốc dân Đồi núi chiếm 3/ 4 diện tích lãnh thổ, ở những vùng đồi núi nông nghiệp chủ yếu là đất dốc, kém màu mỡ và chưa có hệ thống

tưới tiêu chủ động, canh tác lúa và lương thực chủ yếu nhờ vào nước trời (rainfed)

Do vậy cây trồng ở những vùng này năng suất thấp và bấp bênh Tuy nhiên để cân đối lương thực trong cả nước giữa miền xuôi và miền núi thì cây lúa vẫn là cây

trồng chủ đạo trong nền nông nghiệp giúp cho sự ổn định về kinh tế và canh tác định cư ở những vùng này

Trước tình hình đó, chọn tạo các giống lúa chịu hạn phù hợp với tập quán và điệu kiện canh tác ở các vùng địa phương đang được nhà nước đầu tư Nhiều công trình nghiên cứu về tính chống chịu hạn ở lúa được công bố và một số giống lúa

chịu hạn (CH133, CH1, CH2, LC93 -1 …) đã được chọn tạo đem lại lợi ích kinh tế -

xã hội cao Tuy vậy, phương pháp chọn giống chịu hạn chủ yếu vẫn là truyền thống,

tốn nhiều công sức, thời gian và chưa đảm bảo độ tin cậy lâu dài vì sự lựa chọn chỉ được đánh giá qua biểu hiện hình thái

Ngày nay, nhờ vào tiến bộ của công nghệ sinh học nên công tác chọn tạo giống

đã trở nên hiệu quả hơn Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR, RFLP, AFLP được nghiên cứu và phát triển để trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể

giống khời đầu, từ đó xác định được các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp

có thể cho ưu thế lai cao nhất Việc tiếp cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá các giống bố mẹ một cách chính xác, không bị tác động bởi điều kiện ngoại cảnh, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo Vì vậy, chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu

2 M ục đích của đề tài

Kết hợp phân tích đa dạng di truyền các dòng/giống lúa sử dụng chỉ thị phân

tử SSR và tính chịu hạn của các dòng/giống lúa nghiên cứu nhằm góp phần quan

trọng cho việc khai thác nguồn gen chịu hạn và định hướng cho chọn tạo giống lúa

chịu hạn ở Việt Nam

3 N ội dung nghiên cứu của đề tài

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các mẫu dòng/giống lúa nghiên cứu

- Nhận dạng di truyền các mẫu dòng/giống lúa nghiên cứu bằng chỉ thị phân

4 Đối tượng nghiên cứu

dòng/giống lúa làm vật liệu nghiên cứu được cung cấp bởi Ngân hàng gen cây trồng

Quốc gia – Trung tâm Tài nguyên thực vật

hiện tại Bộ môn Đa dạng sinh học Nông nghiệp – Trung tâm tài nguyên thực vật

CHƯƠNG 1

1.1.Gi ới thiệu chung về cây lúa

Cây lúa (Oryza sativa L) còn được gọi là lúa Châu Á vì nó được thuần hóa từ lúa dại ở ba trung tâm đầu tiên vùng Đông Nam Á: Assam (Ấn Độ), biên giới Thái Lan- Myanmarr, trung du Tây Bắc Việt Nam Theo tài liệu của Trung Quốc thì khoảng năm 2800- 2700 TCN, ở Trung Quốc đã có nghề trồng lúa[17] Markey và

De CADNolle, Roievich cho rằng nguồn gốc cây lúa trồng là Miền Nam Việt Nam

và Campuchia Gutschin cho rằng cái nôi của nghề trồng lúa là ở chân dãy Himalaya

đổ xuống các vùng đồng bằng Bengale, Assam, Thái Lan vì ở vùng này có nhiều

loại lúa hoang dại và các giống lúa trồng phong phú [3]

Tuy có nhiều các tài liệu khác nhau, các khảo cổ đã chứng minh nguồn gốc khác nhau của cây lúa nhưng đa số các tài liệu đều cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở vùng đầm lầy Đông Nam Á, có thể thuộc nhiều quốc gia khác nhau, sau đó do khí

hậu nhiệt đới nóng ẩm cây lúa đã nan rộng ra các vùng khác nhau [13]

Lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angios Permes), lớp một lá mầm (Mono

Cotyledones), b ộ hòa thảo có hoa (Graminales), họ hòa thảo (Graminae), lúa trồng

thuộc chi Oryza (có 24 hoặc 48 nhiễm sắc thể), có 23 loài phân bố khắp thế giới

trong đó có hai loài lúa trồng Loài Oryza sativa L trồng phổ biến trên thế giới và

phần lớn tập trung ở Châu Á bao gồm ba loài phụ: Japonica phân bố ở những nơi có

vĩ độ cao (Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên), chịu rét cao, ít chịu sâu bệnh

Indica (được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam, Thái Lan,

Ấn Độ, Mianma), có đặc điểm hạt dài, thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh, năng

suất thấp, mẫn cảm với ánh sáng Javanica có đặc điểm trung gian, hạt dài, dày và

rộng hơn hạ Indica, chỉ được trồng ở vài nơi thuộc Indonesia [13]

Theo điều kiện sinh thái, cây lúa chia làm hai loại, lúa cạn và lúa nước Lúa

cạn được trồng vào mùa mưa trên đất cao, đất thoát nước tự nhiên, trên những chân

ruộng không đắp bờ hoặc không có bờ và không có nước dự trữ trên bề mặt

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì lúa cạn do lúa nước biến đổi thành và

những giống lúa này có khả năng trồng được ở những vùng khô hạn, vẫn có khả năng sinh trưởng phát triển bình thường trên ruộng có nước Đây là một đặc tính nông học của lúa cạn, khác với cây lúa trồng khác

Hiện nay có thể chia lúa cạn thành hai nhóm:

- Nhóm lúa cạn cổ truyền: Bao gồm những giống lúa cạn địa phương, thích nghi cao và tồn tại lâu đời, tính chống chịu cao, tuy nhiên giống lúa này có hạn chế

là năng suất thấp

- Nhóm lúa không chủ động nước hoặc sống nhờ nước trời: Loại này được phân bố trên những nương bằng, chân đồi thấp có độ dốc dưới 50 Đây là những

giống lúa cạn mới lai tạo, có khả năng chịu hạn trong những giai đoạn sinh trưởng

nhất định, hiệu suất sử dụng nước và tiềm năng năng suất cao [27]

Năng suất của các giống lúa cạn thường thấp do hai nguyên nhân chủ yếu:

Giống xấu và đất nghèo dinh dưỡng, phát triển trên những vùng dân trí thấp và điều

kiện canh tác kém [27] Tuy năng suất lúa cạn không cao, trung bình đạt 15 tạ/ha,

những cây lúa cạn đã góp phần vào tổng sản lượng lúa một cách đáng kể (từ 20%- 40% ở những vùng sản suất lương thực khó khăn), góp phần giải quyết lương thực

tại chỗ cho nhân dân, giảm được công vận chuyển và chủ động lương thực trong

một khoảng thời gian nhất định, phù hợp với điều kiện nhiều địa phương

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hóa hai loài lúa trồng

1.1.2 Ngu ồn tài nguyên lúa Việt Nam

Lãnh thổ Việt Nam trải dài trên 15 vĩ độ từ 8-230 vĩ Bắc nên địa hình và khí

hậu đều phức tạp Địa hình của Việt Nam rất đa dạng, có núi cao ở phía Bắc, vùng đất cao rộng lớn ở nam Trung Bộ, hai đồng bằng lớn là đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long

Việt Nam có 54 dân tộc, mỗi dân tộc có tập quán canh tác và sở thích về phẩm

chất lúa gạo khác nhau Trong quá trình hình thành và phát triển nền văn minh nông nghiệp lâu đời, nhân dân ta đã thuần hóa các dạng lúa trồng từ dạng này sang dạng khác và có thể đã thuần hóa từ lúa hoang dại sang lúa trồng ngày nay Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã cho rằng Việt Nam là một trong những trung tâm khởi nguyên của cây lúa trong vùng Đông Nam Á, Ấn Độ [23]

Có thể nói rằng, sự phong phú về điều kiện tự nhiên, sự đa dạng về thành phần dân tộc, sự phân bố cư trú ở độ cao khác nhau với những tập quán canh tác khác nhau và thị hiếu sử dụng lúa gạo khác nhau của từng vùng, từng dân tộc là nguyên nhân tạo nên sự phong phú đa dạng nguồn gen cây lúa của nước ta [23],[24]

 Tài nguyên lúa hoang d ại

Lúa hoang dại hiện được các nhà khoa học chú ý đặc biệt vì chúng cung cấp

một số gen quý giúp cho việc tạo ra giống mới sử dụng trong công nghệ sinh học Lúa hoang dại tồn tại rải rác trên lãnh thổ Việt Nam, phổ biến ở đồng bằng Bắc Bộ

và duyên hải miền Trung, do quá trình thâm canh tăng vụ nên lúa dại bị mất dần Ở đồng bằng sông Cửu Long lúa dại là nguồn lương thực quan trọng của nhân dân địa phương Cho đến thập kỷ 70 của thế kỷ 20, nông dân Nam Bộ vẫn còn nghề lượm lúa dại để lấy gạo ăn Ở Việt Nam có 4 loài lúa hoang dại [23]

- Oryza rufipogon: có ở Điện Biên Phủ, Thừa Thiên Huế, đồng bằng sông

Cửu Long Theo viện nghiên cứu lúa IRRI thì loài này có nguồn gen chịu chua phèn cao nhất thế giới

- Oryza nivaza: Ở tỉnh Đăklăk và dọc biên giới Việt Nam –Campuchia, là nguồn gen kháng rầy nâu và rầy lưng trắng

- Oryza oficinalis: Có nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long

- Oryza granulata : Ở các tỉnh vùng Tây Bắc, đang được các nhà khoa học khai thác nguồn gen chịu hạn

Trải qua thời gian gieo trồng và thuần hóa cây lúa hàng nghìn năm cùng với

sự đa dạng và phong phú về địa lý sinh thái trên toàn lãnh thổ, nhân dân ta đã tạo nên nguồn tài nguyên lúa trồng đa dạng và phong phú Việt Nam tồn tại 3 nhóm lúa địa phương có đặc tính di truyền khác nhau:

- Nhóm lúa Việt –Thái ở vùng núi phía Bắc, chủ yếu là lúa nương Đây là cây lương thực chính nuôi sống các dân tộc ít người, và là một trong những nhóm lúa có

sự đa dạng di truyền cao nhất thế giới

- Nhóm giống lúa mang đặc tính thâm canh ở vùng đồng bằng sông Hồng:

+ Lúa Chiêm: có những nguồn gen quý hiếm nổi tiếng thế giới như kháng đạo

ôn, chịu chua phèn, chịu đất nghèo lân, chịu rét trong thời kỳ mạ và thời kỳ lúa trỗ Lúa Chiêm tồn tại rất ít trong sản xuất nhưng giá trị của nguồn gen lúa Chiêm là độc

Các giống lúa địa phương thường có khả năng thích nghi cao với điều kiện khí

hậu, có khả năng chống chịu tốt, năng suất không cao nhưng ổn định Thông thường

những giống lúa được gieo trồng trên các vùng đất cao như đất nương thường có

khả năng chịu hạn rất tốt Ngược lại, các giống lúa được gieo trồng ở vùng đất thấp, luôn có lớp nước trên bề mặt ruộng lúa, không có điều kiện rút nước khi mưa lớn,

hoặc rút nước chậm trong một thời gian dài thường có khả năng chịu úng ngập Bên

cạnh đó, có những giống lúa địa phương còn có khả năng chịu mặn, chịu phèn, kháng sâu bệnh Đó là những nguồn gen quý giá cần được đánh giá và khai thác

nhằm phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn gen và tạo nguồn vật liệu cho công tác

chọn tạo giống vừa có khả năng chống chịu với những điều kiện môi trường bất lợi

và có năng suất cao [15]

1.2 H ạn hán và cơ chế chống chịu hạn ở thực vật

Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nên trong cả quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hướng đến sinh trưởng và phát triển của cây

Mức độ khô hạn do môi trường gây nên ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển

của cây, nhẹ thì làm giảm năng suất, nặng thì có thể dẫn đến tình trạng hủy hoại cây

và mùa màng Theo Robert và cs., (1991)[65] hạn được xem là nhân tố gây thiệt hại

lớn nhất đối với năng suất lúa Trên thế giới, thiệt hại do khô hạn hằng năm gây ra đối với sản suất lúa khoảng 1,024 triêu đôla [65]

 H ạn không khí

Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (390 - 420C) và độ ấm thấp

nhỏ hơn 65% Hiện tượng này thường gặp ở những tỉnh Miền Trung nước ta vào

những đợt gió Lào và ở vùng Bắc Bộ vào cuối thu, đầu đông Hiện tượng này cũng

xuất hiện ở một số nước trên thế giới như gió Chamsin ở Israel, gió Mistral ở miền nam nước Pháp làm ảnh hưởng nghiệm trọng đến một số loại cây trồng như phong lan, cam, chanh,đậu tương…[11]

Hạn không khí ảnh hưởng trực tiếp lên các bộ phận của cây trên mặt đất như hoa, lá, chồi non… Đối với thực vật nói chung và cây lúa nói riêng thì hạn không khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời, vì nhiệt độ cao, ẩm thấp làm cho tốc độ thoát hơi nước nhanh vượt quá mức bình thường, lúc đó rễ hút nước không đủ để bù đắp lại lượng nước mất, cây lâm vào trạng thái mất cân bằng về nước Mức độ phản ứng của cây đới với sự mất nước sẽ tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của chúng Riêng đối với cây lúa hạn gây ảnh hưởng nghiêm trọng đặc biệt vào thời kỳ bắt đầu hình thành các cơ quan sinh sản cho đến lúc kết thúc quả trình thụ phấn Hạn không khí gây thiệt hại nhất ở giai đoạn lúa phơi màu và thậm chí gây nên mất mùa nếu

gặp phải đợt nhiệt độ cao và độ ẩm không khí thấp (mặc dù nước trong đất không

thiếu) làm cho hạt phấn không có khẳ năng nảy mầm, quá trình thụ tinh không xảy

ra và hạt bị nép [11]

 H ạn đất

Mức độ khô hạn của đất tùy thuộc vào sự bốc hơi nước trên bề mặt và khả năng giữ nước của đất Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến

mức cây không cạnh tranh được nước của đất làm cho cây không thể lấy nước vào

tế bào qua rễ, chính vì vậy hạn đất thường gây nên hiện tượng cây héo lâu dài Hạn đất có thể xảy ra ở bất kỳ vùng đất nào và thường xảy ra nhiều ở những vùng có điều kiện khí hậu, địa hình, địa chất, thổ nhưỡng đặc thù như sa mạc ở Châu Phi, đất đồi trọc của Châu Á, mùa ít mưa nhất và nhiệt độ thấp ở châu Âu Tóm lại hạn đất tác động trực tiếp lên bộ phận rễ của cây làm ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây nói chung [11]

 H ạn toàn diện

Hạn toàn diện là hiện tượng khi hạn có cả hạn đất và hạn không khí xảy ra cùng một lúc Trong trường hợp này cùng với sự mất nước do không khí làm cho hàm lượng nước trong lá giảm nhanh dần đến nồng độ dịch bào tăng lên, mặc dù sức hút nước từ rễ của cây cũng tăng nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt không đủ cung cấp cho cây Hạn toàn diện thường dẫn đến hiện tượng héo vĩnh viễn, cây không có khả năng phục hồi [11] Ở nước ta, hiện tượng hạn toàn diện thường xảy

ra ở các tỉnh miền Trung (Nghệ An, Quảng Trị…) gây nên thiệt hại đáng kể về nắng

suất lúa vào các tháng cuối hè

1.2.3 Cơ sở di truyền của tính chịu hạn

Sự thể hiện tính chống chịu khô hạn được quan sát thông qua những tính trạng

cụ thể như hình thái rễ cây, lá, chồi thân, phản ứng co nguyên sinh, bao phấn, quá trình trỗ bông, v.v Những tính trạng như vậy được gọi là tính trạng thành phần (Component traits) Trong đó người ta nhận thấy rằng cơ chế chống chịu khô hạn

cơ bản là giống nhau ở các loài cây trồng Đặc biệt sự giống nhau thể hiện ở mức

độ phân tử rõ ràng hơn so với sinh lý học và hình thái học Do vậy chúng ta có thể nghiên cứu từ một cây rồi suy diễn ra đối với nhiều cây khác [65]

Đáp ứng lại hiện tượng stress do khô hạn, cây trồng có một cơ chế rất tiến bộ

từ việc nhận tín hiệu đến truyền nó đi vào hệ thống tinh vi của tế bào, kích thích

hoạt động của gen mục (Thomashow, 1999; Xiong và cs., 2002) [76, 86] Chống

chịu khô hạn là tính trạng cực kỳ phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sự thể hiện đồng thời

cả một hệ thống gen mục tiêu [76] và bị hạn ảnh hưởng bởi các yếu tố về môi trường,vật lý, hóa học (Soltis và Soltis, 2003) Để chống chịu với điều kiện khô hạn cây trồng có rất nhiều cách như tăng hàm lượng các chất hòa tan ví dụ như: proline, trehalose, betaine và mannitol, đóng vai trò như những thể bảo vệ thẩm thấu (osmoprotestant), trong vài trường hợp, chúng ổn định được các phân tử chức năng dưới điều kiện bị stress [70], giảm nồng độ các hoocmon kích thích (Auxin, giberelin, xitokinin), tăng nồng độ các chất ức chế (Abscicis acid (ABA), etylen và các hợp chất phenol) Hàm lượng ABA tăng kéo theo sự đóng lỗ khí làm giảm cường độ thoát hơi nước, ABA xúc tiến quá trình tổng hợp protein và amino axit có tác dụng tăng khả năng giữ nước của tế bào trong điều kiện khô hạn Protein LEA (Late embryogenesis abundant) cũng được chú ý trong điều kiện bị stress do thiếu nước [87] Protein này có chức năng ổn định màng tế bào [87] Sự thể hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nó cho thấy vai trò bảo vệ cây

chống chịu sự mất nước [44] Nhiều nghiên cứu đã công bố rằng có sự thay đổi

biểu hiện của gen khi hạn hán xảy ra đáp ứng với cả stress sinh học và stress phi sinh học Bao gồm cả gen liên kết với những chức năng đa dạng như gen MAP kinase, DREB genes, calcium – dependent protein kinase, endo – 1,3 – glucanase, nhân tố kéo dài dịch mã [51], và glutathione reductase Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự thay đổi biểu hiện của một gen có thể gây ảnh hưởng tới phản ứng

của lúa trong tình trạng thiếu nước hoặc Trehalose – 6- phosphate synthase và phosphatase chức năng phát triển và tăng trưởng mô phân sinh, Aquaporin chức năng hoạt động kênh nước, Expansin chức năng điều khiển sự mở rộng của thành tế bào [52] Arginine decarboxylase chức năng tạo ra putrescine đóng vai trò bảo vệ

Nước vừa là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng là các quá trình chuyển hóa hóa sinh, vừa là môi trường để các phản ứng trao đổi được xảy ra Vì

vậy việc cung cấp nước cho cây là biện pháp canh tác và hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là mục tiêu tạo ra giống luôn được quan tâm

Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trình sinh trưởng

và phát triển của cây Thiếu nước nhẹ thì giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước nghiêm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng quá trình già hóa tế bào Khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào

và mô bị tổn thương và chết [78]

Đối với cây lúa, đặc biệt là lúa nước thì Paleg (1991)[61] cho rằng nếu lượng nước trong đất chỉ còn 50% lượng nước cần thiết thì mức độ ảnh hưởng năng suất

phụ thuộc vào giai đoạn phát triển:

- Giảm 1/5 năng suất khi hạn hán xuất hiện vào giai đoạn đẻ nhánh

- Giảm 1/3 năng suất khi cây lúa đang trong giai đoạn phân hóa làm đòng và

trỗ bông

- Giảm 2/3 năng suất hay thậm chí là mất mùa hoàn toàn vào giai đoạn cây lúa đang trỗ bông và thụ phấn

Trong những năm 1998, 1999 ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Quảng Trị năng suất đã

giảm 4/5 ở những diện tích bị hạn trong giai đoạn lúa làm đòng Thậm chí có những địa phương phải hủy bỏ lúa đang trong thời kỳ đẻ nhánh để cấy lúa lại

Kháng hạn được định nghĩa như khả năng ra hoa và tạo hạt dưới điều kiện thiếu nước của cây Dưới điều kiện bị hạn hán quá trình ra hoa và phát triển bị chậm

lại Hạn hán xảy ra trước 30 - 10 ngày ảnh hưởng tới bầu nhụy và sự giảm phân của

hạt phấn, hạn hán xảy ra trước 10 - 5 ngày làm chậm lại quá trình kéo dài nhụy và

mô chống đỡ Sự thay đổi về mặt di truyền ở giai đoạn ra hoa bị chậm lại dưới điều

kiện hạn hán [62]

Khi gặp hạn bộ lá ngừng phát triển hoặc phát triển chậm để hạn chế sự thoát hơi nước Đồng thời phiến lá mỏng hơn, nhiều lông hơn để hạn chế sự tích tụ nhiệt [92]

Phản ứng thiết thực nhất của lúa chịu hạn là đóng khí khổng khi gặp điều kiện

hạn Điều này có tác dụng hạn chế sự thoát hơi nước nhưng đồng thời nó cũng làm

giảm khả năng quang hợp Vì vậy, đối với lúa chịu hạn có một đặc điểm thích nghi

đó là nâng cao hiệu suất quang hợp trước khi xảy ra hiện tượng đóng khí khổng khi

gặp điều kiện hạn[92]

Lá có xu hướng cuộn lại và giảm góc độ lá Điều này có tác dụng làm giảm cường độ bức xạ trên bề mặt lá tăng cường ánh sáng đi xuống dưới và duy trì trạng thái thoát hơi nước bề mặt lá ở mức độ tối thiểu [92]

Khi gặp điều kiện hạn axit abcisic (ABA) được tăng cường tổng hợp ở rễ, sau

đó vận chuyển lên lá, đẩy nhanh tốc độ già hóa của lá, đóng khí khổng làm giảm sự thoát hơi nước Bên cạnh đó ABA được tăng cường trên lá làm mức độ héo tăng lên giúp cây tránh bớt được mức độ bức xạ mặt trời trên, làm giảm sử dụng nước và

hiện tượng tăng bề mặt lá [92]

Rễ mọc dài hơn phân bố rộng và sâu hơn vào lớp đất giúp cây lúa tận dụng nước tầng sâu Khi bắt đầu gặp điều kiện hạn ở giai đoạn cây con, khối lượng rễ và

tỉ lệ rễ/thân lá tăng lên, sinh nhiều rễ đốt vì rễ đốt có thể đâm sâu vào các lớp đất, do

đó tăng cường khả năng hấp thụ nước đồng thời khi gặp hạn tốc độ dài của rễ lớn hơn tốc độ dài của lá Ở các giống lúa chịu hạn (CH5; 103S - R20 và Toitsu) Chiều dài rễ, số lượng rễ/cây lúa, trọng lượng khô của rễ/cây và tốc độ hút nước của rễ ở các giống chịu hạn cao hơn nhiều so với giống đối chứng khi có nước trở lại [17] Bên cạnh đó lúa chịu hạn, thì tế bào rễ có áp suất thẩm thấu cao hơn làm cho sức hút nước lớn

Khi gặp hạn, cây có phản ứng giảm chiều cao cây để hạn chế nhu cầu sử

dụng nước, đồng thời hạn chế sự tác động của bức xạ mặt trời, phản ứng thấp cây cũng làm tăng khả năng chống đổ [92]

1 3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học là vấn đề rất được quan tâm hiện nay Giữ gìn và bảo tồn đa

dạng sinh học là mục tiêu sống còn trong việc duy trì cân bằng sinh thái, đảm bảo môi sinh của các sinh vật trên trái đất, trong đó có con người Khái niệm đa dạng sinh học được hiểu theo nhiều cấp, đó có thể là sự đa dạng của các quần xã sinh vật trong hệ sinh thái, là sự đa dạng giữa các loài trong quần xã hay sự đa dạng ở các

cấp độ di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài Mặc dù là cấp độ thấp nhất, nhưng đa dạng di truyền lại có vai trò vô cùng quan trọng trong tiến hóa và thích nghi của các sinh vật, mọi biến động ở cấp độ đa dạng di truyền đều có tác động

đến những cấp độ cao hơn và cuối cùng là ảnh hưởng đến đa dạng sinh học [72]

Đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở nguồn gen và kiểu gen trong

mỗi loài Mỗi loài có một bản đồ nhiễm sắc thể và số lượng nhiễm sắc thể khác nhau, cho nên hiếm có các cá thể của cũng một loài hoặc cùng một giống có trật tự các gen trong hệ gen giống hệt nhau Trong quá trình tiến hóa, các nhiễm sắc thể luôn biến đổi từ nhiễm sắc thể tâm cân đến nhiễm sắc thể tâm lệch và hơn nữa là sự

có mặt của nhiễm sắc thể kèm Mỗi một sự biến đổi bên trong của cơ thể đều được

thể hiện ra bên ngoài để tạo ra các dạng khác biệt nhau [12]

Những nghiên cứu trước về mức độ đa dạng di truyền chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình thái Với các phương pháp phân tích mới, người ta đã thấy rằng biến dị di truyền bên trong các loài được cấu trúc có thứ bậc giữa các nhóm có đặc hiệu bên trong như dưới loài, thứ và quần thể Xét về thực chất, mức độ đa dạng di truyền

phụ thuộc vào số lượng và sự khác biệt của các gen bên trong loài Nếu biến dị xảy

ra giữa các alen bên trong locut và tế bào thì được gọi là dị hợp tử và biến đổi như

vậy ở các tế bào đa bội có thể lơn hơn các tế bào lưỡng bội Mức độ khác biệt giữa các locus trong tế bào lớn hay nhỏ phụ thuộc vào việc các gen có được lặp lại trong

hệ gen hay không

Nghiên cứu đa dạng di truyền có vai trò và ý nghĩa rất quan trọng trong chọn

giống Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể chọn

lọc và bào tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ cho quá trình lai tạo giống thông qua chọn lựa các cặp bố mẹ trong các phép lai nhằm thu được ưu thế lai cao nhất Đó là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì được nòi giống, kháng với loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi trong điều kiện ngoại

cảnh [15]

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị hình thái là phương pháp đánh

giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận)

Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, không đòi hỏi các thiết bị đặc đắt tiền cũng như quy trình phức tạp Hiện nay phương pháp này vẫn được sử dụng phổ biến trên cây

trồng để giúp các nhà nghiên cứu phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những

hạn chế: (i): Số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, chỉ thị hình thái chịu tác động

của môi trường và phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá trình phát triển, (ii):

Việc đánh giá mang tính chất thống kê nên cần thực hiện với số lượng lớn để đảm

bảo tính chính xác, (iii): Có nhiều tính trạng đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình mà có thể đánh giá được Vì thế cho đến nay, các nhà

chọn giống thường kết hợp sử dụng các chỉ tiêu hình thái với xác định bằng chỉ thị sinh hóa và chỉ thị ADN để đạt được kết quả chính xác nhất [4]

học) Isozyme được trích ly, tinh sạch và điện di trên gel Các thành phần trong gel

biến tính (thường là SDS) phá vỡ các cấu trúc bậc cao của chuỗi amino acid và dưới tác động của điện trường, các isozyme biến tính sẽ phân tích trên gel dựa trên khối lượng và độ tích điện Từ sự đa hình các băng điện di thu được sec giúp nhận diện

từng cá thể và đánh giá được sự đa dạng trong quần thể nghiên cứu

So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị hóa sinh đáng tin cậy hơn bởi mỗi protein

là sản phẩm của một gen, do đó sự đa hình các protein cũng phán ánh gián tiếp sự đa hình trong kiểu gen của sinh vật Tuy nhiên, đối với các cá thể có quan hệ di truyền

gần gũi (đặc biệt là giữa các giống cây trồng) thì các sản phẩm biểu hiện gen

(protein, enzyme…) không cho sự đa hình rõ ràng Cho nên loại chỉ thị này cũng chưa phản ánh thật chính xác bản chất di truyền của mỗi tính trạng Do đó khả năng ứng dụng của chỉ thị hóa sinh còn hạn chế rất nhiều Bởi vậy trong hầu hết những nghiên cứu đa dạng di truyền ngày nay, chỉ thị ADN được sử dụng phổ biến hơn cả

Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu Chỉ

thị di truyền phân tử có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô

với độ chính xác cao mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường Chỉ thị phân tử được chia làm hai nhóm chính:

- Chỉ thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP

- Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR…

đoạn phân cắt giới hạn)

Năm 1980, Botstein và cs đã phát minh ra phương pháp RFLP (đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn)

RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic Nguyên lý

của phương pháp: ADN của bộ gen sau khi cắt bằng enzyme giới hạn sẽ thành

những đoạn có kích thước khác nhau Khi điện di những đoạn này sẽ phân bố ở

những vị trí khác nhau trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành sợi đơn và được chuyển lên màng cellulose băng nylon Trong quá trình lai ADN tiếp theo, nếu chúng bổ sung với mẫu dò (là một đoạn ADN đã được đáng dấu phóng xạ hoặc hóa

học) thì sẽ cho phản ứng lai Kết quả của phản ứng lai là chúng ta có thể xác định được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau [10]

Kỹ thuật RFLP đã được các nhà di truyền lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên

cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người (Botstein và cs 1980) Chỉ thị

RFLP là chỉ thị đồng trội được sử dụng phổ biến trong tạo giống cây trồng với nhiều

mục đích khác nhau: lập bản đồ di truyền, chọn lọc sớm tính trạng đơn gen, phân tích đa hình di truyền Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian, công sức, kỹ thuật phức tạp, độc hại do sử dụng chất phóng xạ và đòi hỏi ADN chất lượng cao[59],[8]

Loại chỉ thị AFLP được phát hiện bởi Zabeau Vos(1993) và được mô tả chi

tiết bởi Vos và cs (1995) [81] Các chỉ thị này được dùng như một công cụ đặc trưng để xác định mức độ quan hệ giữa các giống, loài và là nguồn chỉ thị di truyền cho lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các đặc điểm hình thái, năng suất, chất lượng hoặc các locus gen khác [81]

Kỹ thuật AFLP dựa trên sự nhân bản chọn lọc ADN từ hệ gen đã xử lý bằng enzyme giới hạn Kỹ thuật này gồm bốn bước:

• Cắt ADN hệ gene bằng enzyme giới hạn và gắn các oligonucleotide tiếp

hợp (adapter)

• Khuếch đại tiền chọn lọc bằng cặp mồi tiền chọn lọc

• Khuếch đại chọn lọc sử dụng các tổ hợp mồi EcoRI và MseI chọn lọc khác nhau

• Phân tích trên gel các đoạn ADN được nhân lên

Kỹ thuật này cho phép nhân cùng một lúc một cách đặc trưng với một số lượng lớn các đoạn cắt giới hạn (50 - 100 đoạn) Mỗi đoạn bao gồm một phần cố định dài hơn 15bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn và một phần thay đổi

ngắn 2 - 4bp Phần cố định dài tạo ra sự ổn định của sản phẩm và phần thay đổi

ngắn tạo ra nhiều locus, có thể trên 100 locus với một tổ hợp mồi AFLP Sự đa hình được xác định bằng sự có mặt hoặc không có mặt của một phân đoạn ADN Sản

phẩm PCR sau đó được phân tách trên gel có độ phân giải trình tự cao và có thể nhìn thấy bằng phóng xạ tự chụp Nếu không sử dụng nucleotit được đánh dấu phóng xạ, có thể sử dụng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang hoặc nhuộm bạc để quan sát

sản phẩm

Ưu điểm: là một kỹ thuật có độ nhạy cao dễ phát hiện đa hình trong toàn bộ hệ gen AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen (Thomas và cs 1995) và chọn giống (Vos và cs 1995) [81]

AFLP cho đa hình cao, vì vậy kỹ thuật AFLP hứa hẹn cho phép xem xét kỹ sự

đa hình ở một số lượng lớn locus trong một thời gian rất ngắn và đòi hỏi một lượng rất

nhỏ ADN (Thomas và cs 1995) Điều này tạo cho AFLP trở thành một hệ thống chỉ thị

lý tưởng cho hàng loạt nghiên cứu di truyền (Maughan và cs 1996) [81]

Nhược điểm: AFLP là chỉ thị di truyền trội do đó không có khả năng phân

biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử Phương pháp phức tạp, đòi hỏi

phải có các phương pháp xử lý số liệu tự động trong quá trình phân tích, giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao [81], [47]

được nhân bội ngẫu nhiên)

Năm 1990, William và Welsh trong nghiên cứu độc lập đã phát triển chỉ thị

ngẫu nhiên RAPD dựa trên kỹ thuật PCR Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên bằng sử dụng một mồi đơn chứa

trật tự ngẫu nhiên William và cs (1990) những người đầu tiên thông báo về sử

dụng các đoạn mồi đơn dài 10 nucleotide và có trình tự tùy ý để phân tích đa hình của bộ genome thực vật (khoai tây, lúa mì) Wesh và MccelADN (1991) thông báo kết quả tương tự nhưng với đoạn mồi dài hơn Ngày nay kỹ thuật RAPD đã được thống nhất theo phương pháp của William và cs (1990) là sử

dụng các đoạn mồi đơn dài từ 9- 12 nucleotide, tối thiểu là 4 nucleotide, có trình

tự ngẫu nhiên [8]

Điểm khác của RAPD so với các chỉ thị khác là nó chỉ sử dụng một mồi ngẫu nhiên Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào trong hệ gen khi tìm được vị trí bổ sung Với đặc điểm đoạn được nhân bản là ngắn (khoảng từ 200 – 2000 nucleotide) nên khả năng đoạn mồi tìm ra được điểm gắn trên ADN khuôn là không

quá khó khăn Theo lý thuyết, số lượng các đoạn ADN được nhân bản phụ thuộc

vào độ dài và vị trí các đoạn mồi, kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc ADN

hệ gen Kết quả là sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được tính đa hình

dựa trên các phân đoạn ADN được nhân bản

Nhiệt độ gắn mồi của RAPD không cao (300 – 360C) cho nên sẽ có nhiều đoạn ADN khác nhau được nhân bản

Các chỉ thị RAPD thường được sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các quần thể, loài vi sinh vật, giống cây trồng hay các cá thể để phục

vụ cho công tác lai tạo giống hoặc phân loại Đồng thời, chúng cũng được sủ dụng như chỉ thị phân tử để xác định kiểu gen kiểm soát hoặc liên quan đến một tính trạng nào đó ở sinh vật

Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD nếu hai cá thể có cùng hệ gen hoàn toàn giống nhau thì khi làm phản ứng PCR – RAPD với bất kỳ

mồi nào cũng cho băng ADN giống nhau Nếu chúng có ít nhiều khác biệt về genome thì với một số mồi sẽ có những băng khác nhau giữa chúng, sự khác nhau này sẽ thể hiện sự đa hình di truyền của các cá thể nghiên cứu [81]

Ưu điểm: Nhanh, giá thành cho mỗi mẫu phân tích là thấp, không cần biết

những thông tin về trình tự , dễ dàng phân tích cho số lượng mẫu lớn

Nhược điểm: Đây là một kỹ thuật nhạy cảm, phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm, các thiết bị nghiên cứu, giai đoạn nghiên cứu Mặt khác, RAPD là chỉ thị đồng trội nên không thể nhân biết được cá thể dị hợp tử Khó nhận biết những đoạn cùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau thực sự có được tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen [31]

Để khắc phục những hạn chế này người ta nhân những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế mồi những đoạn dài khoảng 20bp từ cả hai đầu gọi là chỉ thị SCARs (Sequence Characterized Amplified Regions)

Chỉ thị SSR cho phép ta phát hiện được tính đa hình về chiều dài các trình tự nucleotide đơn giản Hiện nay, hơn 15000 chỉ thị SSR đã được thiết lập (www.gramene.org, 2006), phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của lúa [37] Nhiều

công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền đã được công bố [49],[46],[55],[58] Ngoài ra, chỉ thị SSR còn được dùng để chọn lọc tính kháng

bệnh do khảm virut ở cây đậu tương,chọn lọc giống phân tử ở lúa, xác lập mối quan

hệ thân thuộc giữa các giống cây trồng như ngô (Ngô Thị Minh Tâm, 2007), đậu tương (Lương Thị Thu Hương, 2006), xây dựng bản đồ liên kết (Zhao, 1993)… [7],[5],[41] Chỉ thị SSR có hai ưu điểm lớn so với các chỉ thị ADN khác

Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn

có tính bảo thủ cao của các đoạn cặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị ADN ngâu nhiên Bên cạnh đó, nhờ tính bảo thủ của vùng trình tự sườn mà các mồi SSR có thể được sử dụng chéo giữa các loài có mối quan hệ di truyền gần gũi [7],[66]

Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến đổi

di truyền, số lần lặp lại các motif SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn SSR

có chiều dài khác nhau Bởi vậy phản ứng SSR-PCR có thể phát hiện các alen khác nhau trong cùng một locut SSR, qua đó phát hiện được các cá thể đồng hợp tử/di

hợp tử ở locut đó (chỉ thị đồng trội)

Không chỉ có những ưu điểm trên, với tần suất xuất hiện cao của các trình tự

lặp thì số lượng chỉ thị SSR là rất phong phú với mức đa hình cao Dựa trên kỹ thuật PCR và kết hợp với các phương thức phát hiện khác nhau, các phân tử sử dụng chỉ

thị SSR rất đơn giản, nhanh chóng, tin cậy và đặc biệt có khả năng tự động hóa cao [7], [41], [48], [77], điều này rât phù hợp với các nghiên cứu di truyền quẩn thể như đánh giá đa dạng di truyền, lập bản đồ gen, chọn giống phân tử… Một số nghiên

cứu so sánh đánh giá ưu nhược điểm của chỉ thị SSR với các loại chỉ thị RFLP, AFLP, RAPD… đã khẳng định những ưu điểm của SSR so với các chỉ thị trên (Garcia và cs, 2004) [[36], [74]

Hình 1.2 Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT) n

Khác với chỉ thị ngẫu nhiên (RAPD) hay chỉ thị dựa trên các giới hạn (RFLP, AFLP), chỉ thị SSR được phát triển dựa trên trình tự ADN đã biết trước của đối tượng nghiên cứu Quy trình phát triển chỉ thị SSR gồm hai giai đoạn chính là xác định các trình tự lặp trên hệ gen và thiết kế mồi đặc hiệu cho đoạn trình tự đó, đây là quy trình phức tạp, đòi hỏi áp dụng nhiều kỹ thuật, phương pháp khác nhau và đặc

biệt có chí phí rất tốn kém [6],[54],[48],[77] Vì vậy, chỉ thị SSR chỉ thực sự phát huy hiệu quả khi trình tự ADN hệ gen của đối tượng cần nghiên cứu đã được khám phá đầy đủ Theo Brown và cs (1996)[28][31], có ba hướng chính trong phát triển

và thiế kế mồi SSR, bao gồm (i) tìm kiếm trình tự lặp và thiết kế mồi SSR trên cơ sở

dữ liệu trình tự (ngân hàng cDNA, EST, GeneBank); (ii) áp dụng tính chất bảo thủ

của vùng trình tự sườn để áp dụng chéo mồi SSR giữa các đối tượng có quạn hệ di truyền gần gũi và (iii) sàng lọc thư viện hệ gen (thư viện BAC, YAC) để phát hiện

và thiết kết mồi SSR [54]

Mỗi hướng nghiên cứu phát triển chỉ thị SSR đã được cải tiến thành nhiều phương pháp khác nhau và được ứng dụng ở một số đối tượng như khoai tây (Milbourne và cd, 1998), lúa (Panaud và cs, 1995)… Hiện nay, với sự ra đời và phát triển nhanh chóng của các cơ sở dữ liệu di truyền (NCIB, EM…) đặc biệt là ngân

hàng EST thì việc phân lập và phát triển chỉ thị SSR dựa trên cơ sở trình tự sẵn có

đã trở thành hướng đi nhanh chóng, đơn giản, ít tốn kém và ngày càng phổ biến [34], [75]

ISSR là kỹ thuật dựa trên PCR, nhân bản các đoạn ADN nằm giữa hai vùng lặp hướng ngược chiều nhau sử dụng một loại mồi duy nhất (dài 15-25 nucleotit) có trình tự loại giống SSR Các mồi ISSR có thể được bổ sung them từ một đến bốn nucleotit “neo” ở đầu 3’(Yang và cs, 1996) hoặc đầu 5’(Zietkiewicz và cs, 1994)

nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng nhân gen Hẩu hết chỉ thị ISSR là chỉ thị trội và

có tính ổn định cao hơn chỉ thị QAPD Dựa trên motif lặp và số nucleotit làm “neo”

để thiết kế mồi ISSR thì số lượng IRRS gần như là không giới hạn [43],[47]

Chỉ thị ISSR có tính đa hình cao và rất hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Bên cạnh SSR và ISSR còn có nhiều chỉ thị khác được phát triên dựa trên trình

tự lặp không được sử dụng rộng rãi như STMS (Sequence – tagged microsatellite marker) và DAMD-PCR (Direct Amplification of Minisatellite ADN marker [47]

Trong số nhiều dạng đột biến xảy ra tự nhiên trong hệ gen, sự thay đổi một nucleotit (các đột biến điểm hay hiện tượng đa hình nucleotit đơn- SNP)( Single Nucleotide Polymorphism) là hiện tượng phổ biến, có số lượng rất lớn và phân bố

khắp hệ gen Về bản chất, khài niệm SNP mô tả những vị trí cặp base trong hệ gen

của hai (hay nhiều hơn) cá thể mà tại đó có sự thay đổi trong trình tự, ví dụ SNP có

thể thay đổi trình tự ADN từ AAGGCTAA sang ATGGCTAA SNP có thể xảy ra ở vùng không mang mã hoặc vùng mang mã trên hệ gen, trong đó nhiều SNP không gây ảnh hưởng tới tế bào những cũng có những SNP gây ra những biến đổi không

có lợi cho cơ thể [43] SNP là chỉ thị rất phù hợp cho nghiên cứu đa dạng di tryền và

đa dạng quần thể bởi số lượng lớn (mỗi 1000bp hệ gen có một SNP) và có thể áp

dụng các phương pháp tự động trong phát hiện và phân tích [63] SNP được áp dụng

phổ biến trong nghiên cứu di truyền học ở người (trong chuẩn đoán bệnh và nghiên

cứu đáp ứng thuốc) Đến nay, SNP đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền thực vật [63]

Bên cạnh SNP, có nhiều chỉ thị khác dựa trên trình tự ADN cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền và phân loại như chỉ thị

đặc hiệu các vùng bảo thủ rADN, STS… [72]

Phân tử ADN không chỉ khác nhau về trình tự mà còn khác nhau về hình dạng không gian khi ADN ở trạng thái sợi xoắn kép Hai trình tự ADN chỉ cần có một vị trí nucleotit khác nhau cũng có thể mang hình dạng khác nhau Bằng phương pháp điện di có thể phát hiện được sự đa hình (về hình dạng) giữa các đoạn ADN này (chỉ

thị Single Nucleotide Polymorphism) CSGE – Conformation Sensitive Gel Electrophoresis) [47], [84]

Cùng với những thành tựu của công nghệ sinh học, nhiều loại chỉ thị mới đã được phát triển và ứng dụng, làm phong phú hơn những công cụ sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền Với mục tiêu làm sáng tỏ hơn bản chất phân tử trong các nghiên cứu, các chỉ thị mới đi sâu vào phân tích trình tự ADN của các gen cụ

thể (chỉ thị STS, EST và ADN microarray…) giúp nghiên cứu đa dạng di truyền chính xác và chi tiết hơn Tuy nhiên, các chỉ thị này yêu cầu kĩ thuật và chi phí cao hơn các loại chỉ thị ADN trước (RAPD, SSR…) Đây chính là điểm cơ bản hạn chế

sự phổ biến sự phổ biến của các chỉ thị này trong nghiên cứu đa dạng di truyền

1.4 Thành t ựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa

Lúa là cây lương thực chủ đạo trong nền nông nghiệp của nhiều nước trong khu vực Châu Á – Thái Bình Dương Việc nâng cao năng suất lúa bằng cách phối

hợp giữa phương pháp truyền thống và công nghệ sinh học là chiến lược hàng đầu được nhiều quốc gia quan tậm Vì vậy, đến nay các nhà chọn giống đã sử dụng

những biến đổi di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng năng suất cao, chất lượng gạo tốt, kháng với sâu bệnh chính và chống chịu những điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng, mặn [1], [39]

Tuy nhiên vì mục tiêu hướng tới năng suất, chất lượng nên số lượng các tính

trạng được nhắm đến trong quá trình lại tạo bị thu hẹp, bởi vậy giữa các giống lúa lai có sự tương đồng di truyền cao hơn hẳn so với giống hoang dại Các hoạt động canh tác như thay thế giống truyền thống bằng giống lúa lai làm mất dần đi nguồn gen hoang dại (có thể mang những tính trạng quý chưa biết đến) là nguồn vật liệu quý cho công tác chọn tạo giống; cao hơn nữa làm mất đi sự đa dạng di truyền của cây lúa và có thể ảnh hưởng đến đa dạng sinh học Chính vì vậy, nghiên cứu đa

dạng di truyền lúa nhằm bảo tồn các giống lúa đặc sản và hỗ trợ công tác chọn tạo

giống là yêu cầu rất cấp thiết

Chỉ thị hình thái được sử dụng khá phổ biến trong phân loại, đánh giá đa dạng

di truyền lúa và nhất là đánh giá chọn lựa các tổ hợp lai trong công tác chọn tạo

giống lúa Chỉ thị hình thái là công cụ đầu tiên được Kato sử dụng để phân loại dưới loài lúa trồng Châu Á Các tính trạng hình thái nông học như chiều dài lá, chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, màu phiến lá, dạng bông của 90 giống có nguồn gốc từ Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản và tỷ lệ hạt khi lai các giống mới với nhau đã được

sử dụng để phân loại các giống lúa Kết quả cho thấy lúa trồng Châu Á được chia

thành hai nhóm là Indica và Japonica [24]

Chang và cs., [32] xác định tính trạng chiều dài hạt thóc và tỷ lệ dài hạt/rộng

hạt do đơn gen, hai gen hoặc trung gen điều khiển và có hệ số di truyền cao và được xem là tính trạng quan trọn để đánh giá đa dạng di truyền lúa Tác giả đã đề nghị chia lúa trồng Châu Á thành ba loài phụ : Indica và Japonica và Javanica Các chỉ tiêu như độ dài của trụ gian lá mầm, độ phân hủy kiềm, chiều dài/rộng hạt, phản ứng

của hạt thóc với dụng dịch phenol cũng sử dụng để phân loại lúa Indica và Japonica

(Oka, 1958) [40] Oka đã tiến hành chọn ngẫu nhiên 147 giống từ tập đoàn lúa địa phương trên 1000 giống thu thập từ các nước Ấn Độ, Đông Dương, Trung Quốc và

Nhật Bản sau đó tiến hành quan sát 41 chỉ tiêu và tính trạng, trong đó có 11 tính

trạng thể hiện sự biến dị lớn giữa các giống được sử dụng và phân loại Chỉ tiêu

phản ứng của hạt thóc với dụng dịch Phenol là chỉ tiểu quan trọng nhất Qua việc phân tích tương quan 11 tính trạng cho thấy các giống lúa nghiên cứu được chia

thành hai nhóm (i) nhóm bắt màu dung dịch phenol (dạng hình Indica) và (ii) Là

nhóm không bắt màu với dung dịch phenol (dạng hình Japonica) [15]

Ở Việt Nam, đặc điểm hình thái được sử dụng phổ biến trong đánh giá các

giống lúa và đóng vai trò quan trọng trong công tác chọn lọc và lai tạo giống lúa Năm 2006, Lưu Ngọc Trình đã đánh giá đầy đủ 60 tính trạng hình thái nông học của 1,819 giống, đánh giá 40-50 tính trạng của 1.385 giống và 20-30 tính trạng của 2.066 giống trong tổng số 6.083 giống lúa đang bảo quản tại Ngân hàng gen cây

trồng Quốc Gia, Trung tâm Tài nguyên thực vật [9]

Đánh giá đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hóa sinh được sử dụng rộng rãi từ

thập kỷ 70 của thế kỷ XX Second (1982) [69] dựa vào kết quả phân tích 40 locut

đẳng men (isozym) của hai loại lúa trồng Châu Á (Oryza sativa) và lúa trồng Châu Phi (Oryza glaberima) đã cho thấy lúa trồng Châu Á được chia thành hai nhóm

Indica và Japonica

Chỉ thị hóa sinh được Glaszmann (1987) [38], sử dụng để nghiên cứu cấu trúc di truyền của lúa trồng Châu Á đã chia loài Oryza sativa thành sáu nhóm, trong

đó nhóm Indica và Japonica là hai nhóm đối cực theo phân loại của Chang (1976)

tuy khác nhau về mặt hình thái những bản chất di truyền không khác xa nhau nhiều

lắm, Glaszmann ghép chung vào nhóm lúa Japonica và gọi lúa Japonica theo phân

loại của Chang (1976) là Japonica truyền thống hoặc Japonica ôn đới và lúa

Javanica là lúa Japonica nhiệt đới

Cho đến nay, các nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua chỉ thị hóa sinh của lúa ở Việt Nam cũng khá nhiều và quy mô lớn Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của 101 giống lúa địa phương bằng 9 locut thuộc 5 enzym thu từ huyện Nho Quan, Ninh Bình và huyện Đà Bắc, Hòa Bình cho thấy 44 giống (43,6%) thuộc lúa Indica và 57 giống (56,4%) thuộc lúa Japonica (Trần Danh Sửu, 2004) [20]

Năm 1999, Nguyễn Văn Tạo đã phân tích đa dạng di truyền 53 lúa miền Nam

dựa trên 19 locut của 10 enzym cho thấy có 21 trường hợp có sự biến đổi di truyền trong giống [60]

1.4.3 Nghiên c ứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị ADN

Với những thành tựu của sinh học phân tử, chỉ thị ADN đã được ứng dụng

rất hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật mà phân tích đa dạng và chọn

giống phân tử (MAS – Marker Assisted Selection) là hai lĩnh vực thành công

nhất Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa sử dụng chỉ thị ADN cũng được tiến hành mạnh mẽ trong những năm gần đây, với các chỉ thị như RFLP, RAPD, AFLP, SSR…

Với ưu điểm đơn giản, nhanh chóng chi phí thấp và nhất là không yêu cầu biết trước trình tự ADN, RAPD là chỉ thị được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu

đa dạng di truyền lúa Virk và cs., (1995) [80] đã nghiên cứu đa dạng di truyền lúa

và xác định các giống trùng lặp với 47 mẫu của 44 giống trong tập đoàn nguồn gen lúa đang bảo quản tại IRRI Bùi Chí Bửu và cs., 1999 [2], đã sử dụng 20 chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng di truyền 72 giống lúa địa phương Việt Nam

Do có nhược điểm kém ổn định nên một số nghiên cứu đã kết hợp chỉ thị RAPD với một số chỉ thị khác như SSR, AFLP… nhằm nâng cao độ tin cậy của kết

quả Mahmoud nghiên cứu biến động và quan hệ di truyền của 7 giống lúa bằng việc

kết hợp của 8 chỉ thị RAPD, 6 chỉ thị SSR và 8 chi thị AFLP cho thấy mức độ đa hình của mồi tương ứng là 72,2% ; 90% và 67,9% và khẳng định các kỹ thuật nêu trên đều có thể áp dụng tốt cho nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa [56]

Song Z.P và cs., (2003) [73], đã sử dụng 23 chỉ thị SSR phân tích đa hình của

232 cá thể thuộc 6 quần thể lúa (3 quần thể từ Jiangxi và 3 quần thể từ Hunan-Trung

Quốc) Kết quả thu được tổng số 115 alen và các nhà nghiên cứu cho rằng quần thể lúa ở Jiangxi ở mức độ đa hình cao hơn Hunan

Võ Thị Minh Tuyền và cs., (2007) [25], đã sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu

10 giống/dòng lúa có nguồn gốc khác nhau và đã xác định được tương đồng di truyền dao động từ 0,49 – 0,96 Qua kết quả nghiên cứu đã phân loại các giống lúa thành các nhóm có khoảng cách di truyền khác nhau, đó là cơ sở để chọn bố mẹ cho

chọn giống lúa lai

Chỉ thị RFLP và SSR đã được Olufowote và cs., 1997 [58] nghiên cứu biến

động di truyền trong giống của 71 giống lúa Kết quả cho thấy các giống lúa địa phương có mức đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến Cả hai phương pháp này đều cho thấy số lượng alen ở các giống lúa địa phương cao hơn

hẳn các giống lúa cải tiến Chỉ thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ

di truyền gần gũi, đồng thời số lượng các alen cao hơn chỉ thị RFLP, 113 chỉ thị RFLP và 60 chỉ thị SSR được Xu và cs., (2004) [87] sử dụng để định lượng đa dạng alen của 125 giống lúa thu từ các Bang miền Tây và miền Nam nước Mỹ và 111

giống từ tập đoàn lúa Quốc tế đang bảo quản tại IRRI

Dựa trên trình từ lặp, Masood (2004) [53] đã giải trình tự bộ gen lục lạp của lúa dại (Oryza nivara) Fukuoka (2003) [67] đã nghiên cứu về đa dạng di truyền

của 129 giống lúa bản địa miền Bắc Việt Nam bằng chi thị phân tử RFLP và ADN

lục lạp Phân tích nhóm dựa trên các chi thị RFLP cho thấy giống lúa ở miền Bắc

Việt Nam đã chia thành 3 nhóm Trong đó, 86% các giống trong nhóm 1 gồm 23

giống thuộc phân loài phụ Indica, các giống này đều có ADN lục lạp khuyết thiếu

tại đoạn Pst1của ORF100 Tất cả các giống trong nhóm 2 và 2 thuộc phân loài phụ

giống Japonica, nhóm 2 gồm các giống lúa ruộng và nhóm 3 gồm các giống lúa

nương Nghiên cứu cho thấy sự khác biệt di truyền giữa nhóm 2 và nhóm 3 liên

quan đến biến dị di truyền trong phân loài phụ lúa Japonica

1.5 Nghiên c ứu lúa chịu hạn trên thế giới và Việt Nam

Sinh học phân tử tiếp cận với kháng hạn đã được ứng dụng rộng rãi ở lúa được bắt đầu với phân tích QTL bản đồ di truyền lúa bao phủ toàn bộ hệ gen lúa

bằng chỉ thị microsatellite McCouch và cs, (2002)[57] và những người nghiên cứu

về lúa trên khắp thế giới đã lập bản đồ đa dạng di truyền quần thể và các cơ sở dữ

liệu có liên quan Ware và cs, (2002) [83]

Nghiên cứu lập bản đồ gen cây lúa đã thành công trong việc xác định vùng

di truyền liên kết với các tính trạng di truyền như chiều cao cây, ngày ra hoa và

một số trường hợp nó có thể xác định gen đặc biệt nằm dưới 1 QTL (Ishimanu và

cs (2004) [45]

Trên thế giới nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu

hạn đã được tiến hành và đạt được nhiều thành tựu trong những năm qua Wang và

cs 2007 [82] đã so sánh sự thể hiện gen giữa giống lúa nước và giống lúa cạn trong điều kiện bị stress do khô hạn, bằng phương pháp cDNA microarray Các giống đã được sử dụng IRAT109, Haogelao, Han 297 (lúa cạn) Zhongzuo 93, Yuefu, Nipponbare (lúa nước) Kết quả sau khi đọc chuỗi trình tự ADN, có 64 unique ESTs

thể hiện ở mức độ cao ở giống lúa cạn và 79 unique ESTs ở giống lúa nước Tác giả

dự đoán sự thể hiện của các gen mục tiêu ở mức độ cao trong lúa cạn có thể cải tiến được khả năng chống chịu stress do khô hạn trong lúa nước và những loài cây trồng

có liên quan gần về huyết thống [79]

Bản đồ của các QTL/gen kháng hạn đã được định vị trên nhiễm sắc thể lúa

Đã phát hiện được 32 locus tính trạng số lượng QLT của lúa liên kết gen kháng hạn

đã được xác định nằm trên các NST số 1, 2, 4, 8 và 9 [64],[90], [88] Các gen kháng

hạn đã được xác định liên quan đến: tính trạng điều khiển áp suất thẩm thấu (osmotic adjustment); Tính bền vững màng tế bào (cell-membrane stability); Hàm lượng Abscicis acid; điều hòa khí khổng (stomatal regulation); Trạng thái nước của

lá (leaf water status) và hình thái rễ (root morphology) [91]

Shen và cs (1999) [71] đã sử dụng quần thể đơn bội kép (DH) của cặp lai IR64 x Azucena tại Viện Lúa Quốc Tế (IRRI) Các tác giả đã ghi nhận bốn đoạn trên nhiễm sắc thể số 1, 2, 7, và 9 là nơi định vị các QTL tính trạng trọng lượng rễ lúa dài, trọng lượng rễ dài / thân chồi, trọng lượng rễ dài / số chồi, chiều dài rễ tối

đa, độ dầy của rễ, trọng lượng rễ tổng số liên quan tới khả năng chịu hạn của lúa

Zhang và cs 1999 [91] lập bản đồ di truyền QTL đối với khả năng điều tiết áp

suất thẩm thấu (OA), trên quần thể RIL của tổ hợp lai IR58821-23-B-2-1 UBN-1-12, với 166 dòng con lai được chọn Đã sử dụng 383 AFLP và 106 RFLP để thiết lập bản đồ QTL

/IR52561-Các tính trạng số lượng (QTL) ở cây lúa ở giai đoạn mạ: tổng số rễ, thể tích rễ,

số chồi, tỉ lệ rễ /chồi, chiều dài rễ tối đa, điểm chống chịu khô hạn, độ dày của rễ, chiều cao của cây mạ trọng lượng của rễ khô, độ cuốn lại của lá lúa, đã được thiết

lập bản đồ QLT Shashidhar và cs., (1999) Huang N và cs (2002) [42] đã lập bản đồ QTL tính trạng chiều cao của cây lúa bằng phương pháp RFLP sử dụng 5 quần thể

C039/Moroberekan, IR64/Azucena, Palawan/1R42, Tesanai2/CB và Waiyin/CB,

kích thước của quần thể biến đổi từ 135 - 250 Kết quả đã phát hiện được 23 QTL

trải trên toàn bộ 12 NTS Đặc biệt đã phát hiện ra 13 gen lùn ở lúa có quan hệ gần

với các QTL

Những năm gần đây trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều nghiên

cứu về khả năng chịu hạn và tuyển chọn các giống lúa cạn lúa chịu hạn cho các

vùng canh tác khó khăn Các nhà sinh lý cho rằng, áp suất thẩm thấu đóng vai trò

quan trọng, tạo nên khả năng chống chịu hạn ở cây trồng Những nghiên cứu gần

đây khẳng định: áp suất thẩm thấu cũng liên quan đến tỷ lệ nảy mầm và đề nghị sử

dụng để xác định những kiểu gen có áp suất thẩm thấu cao

Trần Nguyên Tháp (2001) [18] đã tiến hành nghiên cứu những đặc trưng cơ

bản của các giống lúa chịu hạn nhằm xây dựng chỉ tiêu chọn giống Qua kết quả thu

được, tác giả đề xuất một mô hình chọn giống lúa chịu hạn Với thí nghiệm đánh giá

khả năng chống chịu hạn nhân tạo của cây lúa ở trong phòng, tác giả khuyến cáo nên

chọn nồng độ muối KClO3 3% hoặc nồng độ đường Saccarin 0,8-1,0% để xử lý hạt

Vũ Văn Liết và cs (2004)[28] đã sử dụng dung dịch KClO3 3% ngâm hạt

thóc trong 48h trước khi cho nảy mầm và KClO3 1% xử lý rễ mạ để tiến hành thanh

lọc các giống lúa chịu hạn

Trong giai đoạn 1995-1997, Vũ Tuyên Hoàng, Trương Văn Kính và cộng sự [26] đã công bố thêm 3 giống lúa mang những đặc tính tốt: cho năng suất cao,

chống chịu hạn khá, dễ thích ứng với vùng đất nghèo dinh dưỡng bị hạn và thiếu nước tưới Đó là các giống CH5, CH7 và giống CH132 Năm 2002, giống CH5 được công nhận là giống quốc gia với những ưu điểm về khả năng chống chịu hạn, sâu bệnh và cho năng suất cao đã được gieo trồng rộng rãi ở nhiều vùng khó khăn

về nước

Trần Nguyên Tháp, Nguyễn Trọng Khanh, Vũ Tuyên Hoàng, Nguyễn Tấn Hinh, Trương Văn Kính (2002) [22] công bố vai trò của gen chống hạn trong sự

điều chỉnh hàm lượng proline trong lá lúa trong điều kiện môi trường thay đổi Trong điều kiện khủng hoảng nước, hàm lượng proline có sự khác nhau giữa các

giống lúa cạn và lúa nước Các giống chịu hạn tốt được biểu thị bởi hàm lượng proline trong lá cao, đặc điểm chịu hạn và mức suy giảm năng suất thấp Sự khác nhau về hàm lượng proline của các giống lúa cạn và lúa nước làm sáng tỏ vai trò của gen đối với cơ chế chống lại sự mất nước ở điều kiện gieo trồng cạn

Ở Việt Nam, nghiên cứu nguồn gen chịu hạn ở mức độ phân tử đã được tiến hành trong nhiều năm trở lại đây Lập bản đồ QTL tính kháng hạn ở giống lúa nương sử dụng chỉ thị phân tử do tổ chức Rockefeller tài trợ đã được tiến hành tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Nguyễn Đức Thành

và cs., (2004) [10] Viện Di truyền Nông nghiệp cũng đã tiến hành các nghiên cứu phân tích di truyền và lập bản đồ gen chịu hạn ở một số giống lúa địa phương [20][16]

Năm 2010, Nguyễn Thị Lang và cs [14] đã xác định được 42 giống/dòng lúa có

khả năng chịu hạn cao phục vụ cho sản xuất ở đồng bằng sông Cửu Long Tác giả cũng thiết lập bản đồ QLT điều khiển chống chịu khô hạn trên quần thể BC2F2 tổ

hợp lai OM1490/WAB880 - 1 - 38 - 20 - P1 HB Bản đồ đã sử dụng 234 SSR đa hình phủ trên 12 NST khoảng cách trung bình giữa 2 marker là 10,97 cM Đánh giá

kiểu hình tập trung vào 3 tính trạng chống chịu hạn vào thời kì trỗ hoa, chiều dài rễ,

khối lượng rễ Bản đồ QTL giả định liên kết gen chống chịu khô hạn thể hiện NST

số 2, 3, 4, 8, 9, 10 và 12

Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nếp địa phương ở các tỉnh đồng bằng Bắc bộ

bằng chỉ thị chỉ thị SSR được xây dựng từ 12 nhiễm sắc thể của lúa Kết quả đã cho ra

234 đa hình và tìm được 46 locus Trong số 50 chỉ thị SSR sử dụng, 45 chỉ thị cho đa hình tại 46 locus giữa các giống lúa nếp nghiên cứu, 44 trong tổng số 45 chỉ thị cho đa hình tại 1 locus riêng chỉ thị RM20 cho đa hình tại 2 locus Số alen đa hình tại mỗi locus biến động từ 2 đến 10, đạt trung bình 5 alen Chỉ thị cho số lượng alen nhiều nhất (10 alen) là các chỉ thị RM22, RM144, RM335 Nhằm bảo tồn giống lúa đặc sản mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn giống lúa chất lượng cao [21]

CHƯƠNG 2

2.1 V ật liệu nghiên cứu

Qua đánh giá sơ bộ chúng tôi đã lựa chọn 50 mẫu giống lúa được cung cấp

bởi Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia, Trung tâm Tài nguyên thực vật

B ảng 2.1 Danh sách 50 mẫu dòng/ giống lúa trong nghiên cứu