Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa sarda orientalis để thu dịch protein thủy phân bằng xúc tác hcl

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa sarda orientalis để thu dịch protein thủy phân bằng xúc tác hcl Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa sarda orientalis để thu dịch protein thủy phân bằng xúc tác hcl luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGỪ SỌC DƯA (SARDA ORIENTALIS) ĐỂ THU

DỊCH PROTEIN THỦY PHÂN

BẰNG XÚC TÁC HCl

Người hướng dẫn: ThS BÙI VIẾT CƯỜNG

ThS NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ THẢO MY

Số thẻ sinh viên: 107130108

Lớp: 13H2B

Đà Nẵng, 05/2018

Cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (Sarda Orientalis) là một phụ phẩm của ngành công

nghiệp đánh bắt, chế biến và thương mại cá ngừ với trữ lượng khoảng 2.000 tấn/năm ở Việt Nam Cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa có giá trị dinh dưỡng cao với hàm lượng protein chiếm 22,4% và có đủ các loại acid amin không thay thế nên được coi là nguồn nguyên liệu hoàn hảo để sản xuất dịch protein thủy phân Các nghiên cứu trước sử dụng enzyme như là xúc tác để thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ đã được tiến hành nhưng hiệu suất thu hồi protein thấp, thời gian phản ứng kéo dài và enzyme khá đắt tiền nên khó có khả năng áp dụng vào quy mô sản xuất lớn Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là khai thác ưu điểm của xúc tác HCl để thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa nhằm thu hồi dịch protein thủy phân với mục đích khắc phục những nhược điểm của phương pháp enzyme, nâng cao giá trị kinh tế của cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa và giải quyết các vấn đề liên quan đến môi trường

Các yếu tố ảnh hưởng chính đến phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa được lựa chọn để khảo sát trong nghiên cứu này gồm: nồng độ xúc tác HCl (M), tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl (g:mL), thời gian phản ứng (phút) và nhiệt độ phản ứng (°C) Thành phần hóa học tương đối của cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa được phân tích bằng phương pháp đo chuẩn của Cộng đồng phân tích quốc tế AOAC Các phương pháp phân tích được sử dụng gồm: phương pháp Bradford, phương pháp đồng, phương pháp

đo quang nhằm xác định protein, acid amin và độ hấp thụ của sản phẩm thô Phương sai ANOVA – One Way được sử dụng để phân tích sự khác biệt có ý nghĩa của hiệu suất thu hồi protein nhằm xác định điều kiện tối ưu cho từng yếu tố ảnh hưởng với phần mềm Minitab 17

Điều kiện tối ưu tương ứng với từng yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân và hiệu suất thu hồi protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ được xác định ở giá trị: nồng độ xúc tác HCl – 0,1 M, tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl – 1:34 (w:v), thời gian phản ứng – 10 phút và nhiệt độ phản ứng là 30°C Với điều kiện phản ứng tối ưu, hiệu suất thủy phân

và hiệu suất thu hồi protein đạt giá trị cực đại lần lượt là 83,45% và 66,40%

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

3 Các số liệu và dữ liệu ban đầu

4 Nội dung các phần thuyết minh và tính toán:

MỞ ĐẦU

Chương 1: TỔNG QUAN

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

5 Các bản vẽ, đồ thị (ghi rõ các loại và kích thước bản vẽ):

6 Họ tên người hướng dẫn: ThS Bùi Viết Cường

7 Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 12/01/2017

8 Ngày hoàn thành đồ án: 28/05/2017

Đà Nẵng, ngày 28 tháng 05 năm 2018

Trưởng Bộ môn Người hướng dẫn

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn 3 tháng nghiên cứu, được sự hướng dẫn tận tình của thầy Bùi Viết Cường, cùng với sự giúp đỡ của các thầy cô và các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm, tôi

đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình

Đầu tiên, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy Bùi Viết Cường đã hết lòng chỉ bảo và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi từ việc chọn đề tài cho đến khi hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình Thầy đã cũng cấp cho tôi nhiều kiến thức bổ ích, luôn định hướng, góp ý và sửa chửa, để từ đó giúp tôi năm bắt kĩ lưỡng, chi tiết hơn về nội dung, cũng như các vấn đề liên quan đến đồ án và hoàn thành đồ án một cách tốt nhất

Tôi chân thành cảm ơn thầy, cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm, các thầy,

cô ở phòng thí nghiệm và tất cả bạn bè đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp của mình

Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã quan tâm, chia sẻ và động viên để tôi hoàn thành công việc

Cuối cùng cho tôi được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốt nghiệp đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và nhận xét cho đồ án của tôi

Trân trọng cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày 14 tháng 05 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thảo My

CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đồ án “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân

cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (Sarda Orientalis) để thu dịch protein thủy phân bằng sự kết hợp giữa nhiệt và xúc tác HCl” dưới sự hướng dẫn của thầy Bùi Viết Cường là công

trình nghiên cứu độc lập được thực hiện bởi bản thân tôi Việc hoàn thành đồ án tốt nghiệp được soạn thảo và hoàn thành một cách độc lập, sáng tạo, không sao chép từ đề tài khác Các kết quả số liệu thu được trong bài đều trung thực, khách quan, không có chỉnh sửa, sao chép Tài liệu tham khảo sử dụng trong đồ án chính xác, có độ tin cậy cao, được trích dẫn đầy đủ và đúng quy định

Đà Nẵng, ngày 14 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Trần Thị Thảo My

MỤC LỤC

Tóm tắt

Nhiệm vụ đồ án

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Danh sách bảng biểu và hình vẽ v

Danh sách các cụm từ viết tắt và kí hiệu vii

Trang MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về protein từ thủy sản 2

1.2 Giới thiệu về cơ thịt đỏ cá ngừ 4

1.2.1 Nguyên liệu cơ thịt đỏ cá ngừ 4

1.2.2 Thành phần hóa học của cơ thịt đỏ cá ngừ 5

1.2.3 Sản lượng cơ thịt đỏ cá ngừ 6

1.3 Phản ứng thủy phân 9

1.3.1 Định nghĩa và cơ chế 9

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 10

1.4 Các nguyên liệu và phương pháp dùng để sản suất protein từ thủy sản 11

1.5 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và thế giới 12

1.5.1 Việt Nam 12

1.5.2 Thế giới 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Hóa chất 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa 15

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ xúc tác HCl đến quá tình thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa 15

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl đến quá tình thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa 16

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá tình thủy phân cơ thịt đỏ cá

ngừ sọc dưa 16

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến quá tình thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa 16

2.3 Các phương pháp phân tích 16

2.3.1 Xác định thành phần hóa học tương đối của cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa 16

2.3.2 Xác định hiệu suất thủy phân 17

2.3.3 Xác đinh hàm lượng protein 17

2.3.4 Xác định hàm lượng acid amin 18

2.3.5 Độ hấp thụ của sản phẩm thô sau phản ứng 19

2.3.6 Phương pháp tính toán và phân tích số liệu 20

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Kết quả xác định thành phần của cơ thịt đỏ của cá ngừ sọc dưa 21

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ xúc tác HCl đến quá trình thủy phân cơ thịt đỏ các ngừ sọc dưa 22

3.4 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình thuỷ phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa 26

3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến quá trình thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa 29

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

4.1 Kết luận 33

4.2 Kiến nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ

Bảng 1.1 Hàm lượng protein và các thành phần hóa học khác trong một số loài thủy

sản 2

Bảng 1.2 Tỉ lệ protein (%) trong tổng số protein của cá, mực ống và thịt 3

Bảng 1.3 Hàm lượng các chất trong 100g thịt đỏ cá ngừ (g/100g) 5

Bảng 1.4 Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ 6

Bảng 1.5 Sản lượng khai thác cá ngừ sọc dưa trong những năm gần đây của 3 tỉnh Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa (tấn/ năm) 7

Bảng 1.6 Tình hình xuất khẩu cá ngừ năm 2017 9

Bảng 3.1 Kết quả phân tích sự khác biệt có ý nghĩa của nồng độ xúc tác HCl ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi protein 24

Bảng 3.2 Kết quả phân tích sự khác biệt có ý nghĩa của tỷ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi protein 26

Bảng 3.3 Kết quả phân tích sự khác biệt có ý nghĩa của thời gian phản ứng ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi protein 28

Bảng 3.4 Kết quả phân tích sự khác biệt có ý nghĩa của nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi protein 31

Hình 1.1 Sự tạo thành histamine từ histidine 5

Hình 1.2 Sự biến đổi của myoglobin 5

Hình 1.3 Xu hướng đánh bắt các loại cá ngừ trên thế giới từ năm 1976 – 2000 7

Hình 1.4 Tình hình xuất khẩu cá ngừ của Việt Nam năm 2014 – 2016 8

Hình 2.1 Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250 18

Hình 2.2 Phản ứng tạo phức màu giữa protein và Coomasie G-250 18

Hình 3.1 Thành phần hóa học của thịt đỏ cá ngừ sọc dưa 21

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất xúc tác đến hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu hồi protein 22

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hàm lượng acid amin và độ hấp phụ tại bước sóng 284 nm 23

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất: thể tích xúc tác HCl đến hiệu suất thủy phân và thu hồi protein 24

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl đến hàm lượng acid amin và độ hấp thụ ở bước sóng 284 nm 25

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thủy phân và thu hồi protein 27 Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng acid amin và độ hấp thụ

ở bước sóng 284 nm 28 Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thủy phân và thu hồi protein 30 Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng acid amin và độ hấp thụ ở bước sóng 284 nm 31

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

− Da: đơn vị khối lượng phân tử

− AOAC: Association of Analytical Chemists – Cộng đồng phân tích quốc tế

− UV-Vis: Ultraviolet-visible spectroscopy – quang phổ tử ngoại khả kiến

− w:v: weigh:volume – khối lượng:thể tích

MỞ ĐẦU

Cá ngừ là một trong những loại thủy sản có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao Việt Nam là một quốc gia có trữ lượng cá ngừ tương đối lớn Theo ước tính của Hiệp hội chế biến cá ngừ (Vinatuna), sản lượng chế biến và tiêu thụ hàng năm đạt khoảng 200.000 tấn Với kim ngạch xuất khẩu đạt trên 400 triệu USD/năm, là một trong những mặt hàng thủy sản xuất khẩu chính của Việt Nam Các sản phẩm chế biến và xuất khẩu bao gồm: tươi sống, đồ hộp, đông lạnh, xông khói… Trong công nghiệp chế biến cá ngừ, chỉ sử dụng chủ yếu phần thịt trắng Phần thịt đỏ không được sử dụng do

có chứa các hợp chất mang màu, chủ yếu là myoglobin (Mb) và haemoglobin (Hb), khi tiếp xúc với oxy sẽ biến đổi hình thành dạng metMb (Mb-Fe3+) có màu nâu không mong muốn Vì vậy, có một lượng lớn cơ thịt đỏ cá ngừ được tạo ra mỗi năm khoảng

2000 tấn

Cơ thịt đỏ cá ngừ là nguồn nguyên liệu giàu protein và chứa hầu hết các acid amin thiết yếu Ngoài ra, protein thủy phân từ thủy sản có công dụng như một thành phần tạo chức năng cho sản phẩm thực phẩm như tạo gel, tạo bọt, tạo nhũ tương, … Tuy nhiên ở các nhà máy sản xuất và chế biến cá ngừ vẫn chưa có biện pháp tối ưu để xử lý phần cơ thịt đỏ này tương xứng với giá trị dinh dưỡng, mà chỉ được bán như phụ phẩm với giá 4.000 – 5.000 VNĐ/kg để làm thức ăn chăn nuôi Trong khi ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tận dụng cơ thịt đỏ cá ngừ để thu được lượng protein có giá trị và sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng Hiện nay, có một vài nghiên cứu sử dụng enzyme để thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ thu dịch protein nhưng còn nhiều hạn chế như thời gian thủy phân dài, hiệu suất thu hồi protein không cao Do đó,

để khắc phục các nhược điểm trên tôi được giao nhiệm vụ: “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (Sarda Orientalis) để thu dịch protein thủy phân bằng xúc tác HCl”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về protein từ thủy sản

Thủy sản là nguồn nguyên liệu quan trọng trong nhiều ngành như thực phẩm, nông nghiệp, công nghiệp và dược phẩm (ví dụ: thực phẩm cho con người, cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, công nghiệp đồ hộp…) Động vật và thực vật thủy sản bao gồm: tôm, cá, nhuyễn thể (mực, vẹn, sò, điệp, ốc,…) và rong, tảo,… là nguồn cung cấp một lượng chất dinh dưỡng đáng kể gồm protein, lipid, gluxit, vitamin, các khoáng chất Theo thống kê thì nguồn thủy sản đang cung cấp cho con người trên 20% tổng số protein của thực phẩm, ở nhiều nước đã lên trên 50% [1] Ngoài giá trị sinh học và dinh dưỡng, protein thủy sản cũng có vai trọng khác như: là chất có khả năng tạo cấu trúc, trạng thái cho sản phẩm thực phẩm Ví dụ, nhờ có protein của tơ cơ ở thịt,

cá mới tại ra cấu trúc gel cho sản phẩm chả, giò lụa Protein còn gián tiếp tạo ra chất lượng cho sản phẩm như tạo bọt, cố định mùi…

Hàm lượng protein của một số loại hải sản được thể hiện ở Bảng 1.1[1, 2, 3]

Bảng 1.1 Hàm lượng protein và các thành phần hóa học khác trong một số loài thủy

Nhìn chung, hàm lượng protein trong thủy sản khá cao chiếm khoảng 70 – 80% hàm lượng chất khô, nhất là ở cá [1] Trong cá có nguồn protein cao, dễ tiêu hóa, dễ hấp thụ và có giá trị sinh học cao, giá trị dinh dưỡng cao khi so sánh với protein của thực vật và động vật trên cạn Ngoài ra, protein có nguồn gốc từ thủy sản có đầy đủ các loại acid amin đặc biệt là đủ các loại acid amin không thay thế Ví dụ, protein của ngũ cốc có hàm lượng lysine và các acid amin chứa lưu huỳnh (methionine, cysteine) thấp, trong khi protein của cá là nguồn giàu các acid amin này [2] Do đó, protein cá

có giá trị dinh dưỡng cao hơn các loại ngữ cốc khác So với thịt bò, thịt lơn, protein trong cá có chất lượng hơn và là loại protein hoàn hảo [1]

Hệ thống protein của cá

So với động vật có vú, protein có nguồn gốc từ cá cũng tương tự, chỉ khác nhau về hàm lượng protein, tỉ lệ giữa các loại protein và một số tính chất vật lý, cách sắp xếp các protein Do đó cũng chia protein của mô cơ cá ra thành 3 nhóm: protein cấu trúc, protein cơ, protein khung mạng

Bảng 1.2 Tỉ lệ protein (%) trong tổng số protein của cá, mực ống và thịt

Protein cấu trúc 65 – 75% 77 – 85% 60,5%

Protein chất cơ 25 – 30% 20% 29%

Protein khung mạng 3 – 10% 10,5%

Protein cấu trúc (proein tơ cơ)

Có dạng sợi, mỗi sợi cơ được tạo bởi nhiều sợi cơ xếp song song với nhau Mỗi sợi

cơ gồm các thớ sợi thô và sợi mảnh Trong đó, các sợi cơ của cá và một số loại thủy sản thường ngắn hơn ở thịt động vật trên cạn và được sắp xếp thành những lớp mỏng,

do đó protein của thủy sản thường dễ chín và dễ bị thủy phân hơn thịt [4]

Protein cấu trúc gồm protein co rút như myosin, actin và protein điều hòa co rút như actomyosin và tropomyosin [4], chiếm khoảng 65 – 75% tổng hàm lượng protein trong

cá và khoảng 77 – 85% tổng hàm lượng protein trong mực [2] Các protein cấu trúc này có chức năng co rút đảm nhận các hoạt động của cơ Myosin và actin là các protein tham gia trực tiếp vào quá trình co duỗi cơ Protein cấu trúc có khả năng hòa tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion khá cao (>0,5 M) [2]

Myosin trong cá chiếm 40 – 45% protein tổng số [1] Protein này nhạy với biến tính nhiệt và dễ bị thủy phân bởi proteaza hơn myosin của động vật có vú [4] Ngoài ra, cấu trúc của cá và tôm cũng có một số điểm khác biệt so với động vật có vú

Actin của cá, tôm, cua rất khó tách ra khỏi myosin do đó khi chiết myosin thì một lượng lớn actin cũng bị tách ra khỏi

Protein chất cơ (protein tương cơ)

Gồm myoglobin, myoalbumin, globulin và các enzyme mà phần lớn là enzyme và mioglobin, chiếm khoảng 25 – 30% hàm lượng protein trong cá và 12 – 20% trong mực [3] Các protein này hòa tan trong nước, trong dung dịch muối trung tính có nồng

độ ion thấp (<0,15 M) Do đó có thể thu được khi tiến hành ép thịt cá, thịt của các loài thủy sản (tôm, cua, ghẹ…) hoặc chiết trong dung dịch muối có nồng độ thấp Khả năng hòa tan cao của protein là nguyên nhân làm mất gía trị dinh dưỡng do một lượng protein đáng kể thoát ra khi rửa cá, tan giá trong nước và ướp lạnh

Hầu hết protein chất cơ bị đông tụ khi đun nóng trong nước ở nhiệt độ trên 50°C Protein chất cơ của cá bị đông tụ ở nhiệt độ 90°C trong 10 phút Trong quá trình chế biến và bảo quản, myoglobin dễ bị oxy hóa thành metmyoglobin, ảnh hưởng đến màu sắc của sản phẩm [4]

Protein khung mạng (protein mô liên kết)

Là những protein của mạng, của màng sợi, của màng ty thể trong vảy, xương và của

mô liên kết, chiếm khoảng 15% trong thịt cá

Bao gồm các sợi collagen, elastin Hàm lượng collagen ở cơ thịt cá thấp hơn ở động vật trên cạn, chiếm khoảng 2 – 4% ở cá xương và 8 – 10% trong cá sụn Collagen ở cá kém bền nhiệt hơn nhiều và ít có các liên kết chéo hơn nhưng nhạy cảm hơn collagen

ở động vật máu nóng có xương sống [3] Trong các loài cá hàm lượng protein khung mạng cũng khác nhau, ví dụ: trong thịt cá ngừ có 11%, cá nục 5% [1] Cơ thịt cá có độ bền cơ học cao chứa nhiều collagen hơn so với loại có cấu trúc mềm mại như sò, ốc, hến… Collagen có trong mạng lưới ngoại bào, không tan trong nước, dung dịch kiềm hoặc dung dịch muối có nồng độ ion cao

1.2 Giới thiệu về cơ thịt đỏ cá ngừ

1.2.1 Nguyên liệu cơ thịt đỏ cá ngừ

Trong cá ngừ có hai loại thịt là thịt trắng và thịt đỏ Phần thịt đỏ của cá ngừ có vị trí nằm sát và dọc theo xương sống, màu sậm, mùi tanh và hương vị ít thơm ngon như thịt trắng Thịt đỏ chiếm khoảng 11% trọng lượng của cá ngừ và có nhiều ở phần giữ thân

cá (12,8%) hơn so với phần đầu (10,5%) hoặc đuôi (9,5%) [17] Đây là phần có giá trị dinh dưỡng và chứa hàm lượng protein cao Tuy nhiên, do đặc tính của cơ thịt đỏ cá ngừ chứa hàm lượng histidine cao và trong thời gian bảo quản, histidine bị sinh vật khử nhóm carboxyl hình thành độc tố histamine [3]

Hình 1.1 Sự tạo thành histamine từ histidine Ngoài ra, màu sắc của cơ thịt đỏ cá ngừ được tạo bởi các hợp chất mang màu, trong

đó chủ yếu là myoglobin (Mb) và hemoglobin (Hb), hàm lượng trong cơ thịt đỏ cao gấp 5 lần so với cơ thịt trắng [17] Tình trạng màu sắc của cơ thịt đỏ phụ thuộc vào sự oxy hóa nguyên tử sắt (Fe) trong nhóm hem của protein, dưới tác dụng của không khí

cơ thịt đỏ này dễ bị oxy hóa theo thời gian hình thành dạng metMb (Mb-Fe3+) có màu nâu không mong muốn [18] Do đó, lượng cơ thịt đỏ này được loại bỏ trong quá trình sản xuất ở các nhà máy và bán dưới dạng phụ phẩm để làm thức ăn chăn nuôi với giá thành rẻ, hoặc thải trực tiếp ra môi trường [19]

Hình 1.2 Sự biến đổi của myoglobin [4]

1.2.2 Thành phần hóa học của cơ thịt đỏ cá ngừ

Trong cơ thịt đỏ cá ngừ có chứa một lượng lớn protein, nước và chất béo Ngoài ra còn có các acid amin tự do, carbohydrate và một số chất khoáng Hàm lượng các chất

có trong cơ thịt đỏ cá ngừ được thể hiện ở bảng 1.3 [19]

Hàm lượng một số acid amin có trong cơ thịt đỏ cá ngừ được trình bày theo bảng 1.4 [19]

Bảng 1.4 Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ

1.2.3.1 Tình hình khai thác cá ngừ trên thế giới và Việt Nam

Theo thống kê của FAO sản lượng cá ngừ trên thế giới đầu những năm 1950 chỉ đạt

5 trăm nghìn tấn và tăng lên gần 1 triệu tấn trong những năm 1960 Đến năm 1984 tăng lên 2 triệu tấn và hơn 4 triệu tấn vào năm 2003 Hằng năm, thế giới khai thác gần

4 triệu tấn các loại cá ngừ chủ yếu (cá ngừ sọc dưa, cá ngừ vây vàng, cá ngừ mắt to và

cá ngừ vây xanh), ngư trường đánh bắt chủ yếu được lấy từ Thái Bình Dương chiếm 65%, tại Ấn Độ Dương sản lượng khai thác khoảng 21% cao hơn do với Đại Tây Dương (14%) [20] Trong đó, cá ngừ sọc dưa được phân bố rộng rãi chiếm khoảng 50% tổng sản lượng cá ngừ trên thế giới (hình 1.3) Kể từ khi bắt đầu khai thác thương mại vào đầu những năm 1970, sản lượng đánh bắt tăng từ 400 nghìn tấn lên 1,9 triệu tấn vào năm 1998 và vẫn giữ ở mức đó trong những năm 1999 và 2000 [20] Tuy nhiên vào tháng 1/2018, sản lượng khai thác của đội tàu Ecuador gồm 23.282 tấn cá ngừ sọc và 5.211 tấn cá ngừ mắt to, giảm lần lượt 52% và 58% so với cùng kỳ năm

2017 (theo số liệu của Ủy ban Cá ngừ nhiệt đới Liên Mỹ) Về vấn đề này, Tiến sĩ Franklin Ormaza, một cố vấn khoa học cho CNP, chỉ ra rằng việc sử dụng khoa học hải dương học nhiêu hơn trong hoạt động khai thác có thể cải thiện tình sản lượng khai thác [39]

Hình 1.3 Xu hướng đánh bắt các loại cá ngừ trên thế giới từ năm 1976 – 2000 [20]Hiện nay, tình hình khai thác cá ngừ trên thế giới đang khó khăn do những ngư trường đánh bắt chính đang chịu sức ép lớn và giá nhiên liệu tăng dẫn đến cá nguyên liệu sẽ có giá cao hơn [40] Để đáp ứng nhu cấu của thị trường thế giới, nghề nuôi cá ngừ đang được nghiên cứu và đưa vào ứng dụng ở một số nước trong hai thập kỷ trở lại đây

Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của TS Đào Mạnh Sơn: ở vùng biển xa bờ miền Trung và Đông Nam Bộ trữ lượng cá ngừ sọc dưa khoảng 618 nghìn tấn, cá ngừ vây vàng và cá ngừ mắt to vào khoảng 44,8 – 52,6 nghìn tấn và khả năng khai thác bền vững của cá ngừ vằn là 216 nghìn tấn, cá ngừ vây vàng và cá ngừ mắt to khoảng 17 nghìn tấn [5]

Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, 5 tháng đầu năm 2016 sản lượng khai thác cá ngừ đại dương tăng 7,1% so với cùng kỳ, đạt 9.605 tấn [41] Trong khi đó, theo Bộ

NN và PTNN, 11 tháng đầu năm 2017, tổng sản lượng khai thác cá ngừ tại 3 tỉnh trọng điểm miền Trung là Bình Định, Khánh Hòa và Phú Yên đạt 17,400 tấn, tăng 8,8% so với cùng kỳ năm trước [42] Ở Việt Nam, cá ngừ được khai thác bằng lưới vây, lưới rê trôi, câu cấn, câu vàng và nghề đăng Đối tượng khai thác chính của nghề lưới rê là cá ngừ sọc được khai thác ở vùng biển xa bờ miền Trung ( tập trung ở 3 tỉnh Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa), với sản lượng hàng năm trong những năm 2010 – 2014 gia tăng liên tục, đạt cỡ 25 đến trên 30 nghìn tấn (bảng 1.5) [6]

Bảng 1.5 Sản lượng khai thác cá ngừ sọc trong những năm gần đây của 3 tỉnh Bình

Định, Phú Yên, Khánh Hòa (tấn/ năm)

Sản lượng khai thác 25382 26593 28328 29462 31513

Năm

Thực tế, trữ lượng của quần thể cá ngừ sọc ở vùng biển Việt Nam đạt 200 nghìn tấn (2014) Sản lượng khai thác như trên mới đạt khoảng 16 – 17% trữ lượng là còn thấp Nên cần tăng cường lực khai thác để đạt được sản lượng cá ngừ tối ưu [6] Hầu hết lượng cá ngừ vằn đánh bắt được sử dụng để sản xuất đồ hộp [20]

1.2.3.2 Tình hình xuất khẩu cá ngừ ở Việt Nam

Theo thống kê của Vasep: trong 5 tháng đầu năm 2017, xuất khẩu cá ngừ của Việt Nam đạt 216 triệu USD, tăng 20% so với cùng kỳ năm 2016 Trong đó, cá ngừ chế biến đóng hộp tăng mạnh 35%, cá ngừ đông lạnh tăng 11% [43]

Năm 2016, xuất khẩu cá ngừ đạt gần 510 triệu USD Trong đó, Việt Nam thu về hơn 200 triệu USD khi xuất khẩu vào thị trưỡng Mỹ, với thị trường EU đạt 115 triệu USD Tuy nhiên, xuất nhập khẩu cá ngừ vào Nhật Bản giảm 5% còn 19 triệu USD Đặc biệt Trung Quốc bất ngờ trở thành nước nhập khẩu cá ngừ lớn thứ 5 của Việt Nam tăng hơn 67% so với năm 2015 [44]

Hình 1.4 Tình hình xuất khẩu cá ngừ của Việt Nam năm 2014 – 2016 [44]

Trong năm 2017 xuất khẩu cá ngừ sang các thị trường chính như Mỹ, EU, Nhật Bản, Mexico và Canada hầu hết đều tăng Mỹ tiếp tục là thị trường xuất khẩu hớn nhất của Việt Nam với giá trị đạt 209,9 triệu USD, tăng 13,5% so với cùng kỳ năm 2016 Giá trị xuất khẩu cá ngừ sang EU đạt 128,7 triệu USD, tăng 29,8%, trong đó Đức và

Hà Lan là hai nước tiêu thụ nhiều nhất và có thị trường cạnh tranh tốt đối với cá ngừ Việt Nam Ngoài ra, giá trị xuất khẩu cá ngừ sang một số nước khác cũng tăng mạnh được mô tả ở Bảng 1.6 [42]

Bảng 1.6 Tình hình xuất khẩu cá ngừ năm 2017

Nước xuất khẩu % tăng so với năm 2016

Cơ thịt đỏ có giá trị dinh dưỡng và chứa hàm lượng protein cao hơn so với các phần phụ phẩm khác Tuy nhiên, do đặc tính của cơ thịt đỏ không đáp ứng nhu cầu sản xuất nên được loại bỏ trong quá trình chế biến Hiện nay, cơ thịt đỏ cá ngừ được bán với giá 4.000 đến 5000 VNĐ/kg [22] để làm thức ăn chăn nuôi hay thậm chí thải bỏ trực tiếp

ra môi trường [19] Giải pháp xử lý như trên vừa gây lãng phí nguồn phụ phẩm giàu dinh dường vừa gây ô nhiễm môi trường, chính vì vậy cần có biện pháp để tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu cơ thịt đỏ cá ngừ

1.3 Phản ứng thủy phân

1.3.1 Định nghĩa và cơ chế

Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt hợp chất cao phân tử thành các phân tử đơn giản hơn dưới tác dụng của chất xúc tác và có sự tham gia của nước [7]

Cơ chế của quá trình thủy phân:

Bản chất của quá trình thủy phân protein là quá trình cắt mạch các phân tử peptid ở các liên kết peptid tạo ra các phân tử có kích thước nhỏ hơn như: peptone, polypeptide,

peptide và các acid amin [8] Trong quá trình thủy phân protein, các liên kết peptid bị cắt đứt theo trình tự như sau:

Protein → polypeptide → pepton → peptide → acid amin Vậy, sản phẩm của quá trình thủy phân protein là các polypeptide, pepton, peptide

và các acid amin Hầu hết các acid amin tạo thành chủ yếu là các L-α amino acid [8]

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

1.3.2.1 Ảnh hưởng của hoạt tính xúc tác và nồng độ H +

Khi sử dụng acid vô cơ làm chất xúc tác, acid phân ly càng mạnh thì phản ứng thủy phân xảy ra càng mạnh Trong các loại acid làm chất xúc tác vô cơ thì HCl có hoạt tính lớn nhất nên được sử dụng phổ biến nhất, H2SO4 có hoạt tính bằng 50% HCl, khả năng phân ly kém [7]

Tuy nhiên khi sử dụng acid vô cơ để thủy phân có nhược điểm là tạo ra nhiều sản phẩm phụ và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm

1.3.2.2 Ảnh hưởng của chất xúc tác và nồng độ chất xúc tác

Lượng chất xúc tác và nồng độ chất xúc tác tăng thì tốc độ thủy phân tăng nhưng chỉ tăng ở mức độ đủ để thủy phân tương đối triệt để Để định lượng chất xúc tác dựa vào cơ chế phản ứng thủy phân và kiểm tra sản phẩm tạo thành [7]

1.3.2.3 Ảnh hưởng của cơ chất thủy phân và thể tích xúc tác

Nồng độ cơ chất của nguyên liệu cho vào quá trình thủy phân tăng thì năng suất của quá trình sẽ tăng lên Tuy nhiên ở giới hạn nồng độ cơ chất của nguyên liệu nhỏ thì phản ứng thủy phân sẽ triệt để hơn Do đó tùy thuộc vào yêu cầu về chất lượng sản phẩm mà khống chế lượng cơ chất [7] Đồng thời nồng độ cơ chất còn ảnh hưởng tới

sự chênh lệch về nồng độ chất tan và khả năng tiếp xúc giữa nguyên liệu và chất xúc tác [7] Khi thể tích xúc tác tăng lên thì tốc độ phản ứng tăng lên tuy nhiên đến một tỷ

lệ nhất định thì phản ứng đạt trạng thái cân bằng

1.3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Khi thủy phân bằng acid thì yêu cầu nhiệt độ lớn hơn 100°C Khi nhiệt độ tăng làm

sự chuyển động hỗn loạn của các phân tử tăng có nghĩa là sự khuếch tán phân tử diễn

ra nhanh và mạnh mẽ hơn, dẫn đến tốc độ thủy phân cũng tăng theo nhưng sự tăng nhiệt độ có giới hạn vì nếu tăng quá cao có thể có các hợp chất hữu cơ khác bị thủy phân gây tổn thất sản phẩm [7] Tuy nhiên protein bị biến tính khá nhạy dưới tác dụng của nhiệt độ Ở nhiệt độ 40°C – 50°C hầu hết các liên kết của protein với các phân tử khác bị phá vỡ, quá trình thủy phân sẽ giải phóng protein ra môi trường Khi tăng nhiệt

độ lên 70 – 75°C thì protein bị đông tụ lại Biến tính của protein bởi nhiệt độ cao là

biến tính không thuận nghịch, chính vì vậy cần nâng nhiệt độ thích hợp để đảm bảo đặc tính của protein đồng thời thu hồi được lượng protein lớn nhất [9]

1.3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Thời gian thủy phân dài hay ngắn là để cho quá trình phân giải, cắt đứt các liên kết của các chất trong cơ chất dưới tác dụng của chất xúc tác Thời gian thích hợp sẽ có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân [7]

1.4 Các nguyên liệu và phương pháp dùng để sản suất protein từ thủy sản

Trong thực tế, thường sử dụng các phụ phẩm trong sản suất thủy sản để làm cơ chất trong các nghiên cứu để sản xuất protein từ thủy sản như cơ thịt đỏ của cá, đầu cá, vây, xương, vỏ và đầu tôm… Tuy nhiên, việc thu nhận dịch thủy phân protein từ thủy sản ở Việt Nam đã có từ lâu đời trong nghề sản xuất nước mắm Vì bản chất của quá trình sản xuất nước mắm chính là quá trình thủy phân protein trong cá nhờ hệ enzyme proteaza [3] Có nhiều phương pháp làm nước mắm cổ truyền như phương pháp đánh khuấy, phương pháp gài nén và kết hợp cả hai phương pháp trên tuy nhiên thời gian từ nguyên liệu ra thành phẩm rất lâu [10] Để giải quyết vấn đề thời gian người ta đã dùng phương pháp hóa học để sản xuất bằng cách dùng acid HCl công nghiệp để thủy phân vì có ưu điểm hơn các hóa chất khác như cho màu sắc nước mắm đẹp, đạm ít thối

và sự tổn thất của acid amin ít [10] Ngoài ra còn có thể sản xuất nước mắm bằng phương pháp vi sinh học là dùng vi khuẩn hay nắm mốc để tthủy phân thịt cá và loại

mốc được chọn là Aspergillus orizae [Nguyễn Trọng Cẩn (1990)]

Trong quá trình sản xuất chitin/chitosan từ phế liệu tôm, cũng có thể tách chiết và thu nhận chế phẩm carotene-protein bằng phương pháp hóa học (sử dụng dung môi hữu cơ, acid), phương pháp sinh học với enzyme proteaza hoặc kết hợp nhiều phương pháp để thu nhận chế phẩm có giá trị sử dụng cao nhất [11]

Đặc biệt, dịch chiết protein từ thủy sản được ứng dụng vào công nghệ sản suất bột

cá chăn nuôi ngày càng phát triển, thường tận dụng các loại cá kém giá trị và nguồn phế phẩm dồi dào từ công nghiệp chế biến thủy sản Có thể sản xuất bột cá chăn nuôi bằng phương pháp ủ chua, phương pháp cô đặc và phương pháp thủy phân [3] Hiện nay bột cá thực phẩm cũng được phát triển rất mạnh ở hầu hết các nước tiên tiến Ở

Mỹ, bột cá thực phẩm được sản xuất bằng phương pháp chiết, sản phẩm thu được chứa

70 – 80% protein, chất béo không quá 1%, không có mùi tanh, tỉ lệ tiêu hóa không dưới 90% Nhật Bản thường dùng phương pháp chiết để sản xuất bột cá ngoài ra còn dùng phương pháp thủy ngân để sản xuất và thu được sản phẩm bột cá giống sữa Còn

ở Ấn Độ cũng đã sử dụng các loại cá có giá trị sử dụng kém chế biến thành sản phẩm bột cá thủy phân giàu đạm cần thiết cho con người [45]

Hiện nay, vẫn chưa có phương pháp thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng xúc tác phi enzyme là HCl để thu nhận dịch protein nào được ứng dụng trong công nghệ sản xuất nên việc thực hiện nghiên cứu đề tài này là cần thiết

1.5 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và thế giới

1.5.1 Việt Nam

Tại Việt Nam trước tình hình chế biến và xuất khẩu cá và thủy sản phát triển mạnh

mẽ nên nguồn phế phẩm cao thải ra môi trường gây ô nhiễm Do đó, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện để tận dụng nguồn phế phẩm này như:

Theo Nguyễn Trọng Cẩn (1990) có thể sản xuất dịch đạm thủy phân từ nguyên liệu

cá bằng cách sử dụng nấm mốc Aspergillus Orizae hoặc vi khuẩn Trong nấm mốc Aspergillus Orizae có chứa hệ enzyme protease như innulase, imetase, asparaginase,

glutaminase, proteolytic Những enzyme này có tác dụng thủy phân trong điều kiện thích hợp là nhiệt độ 37 – 41°C, pH = 6 – 8, tỉ lệ nấm mốc thường sử dụng là 3 – 4%

so với nguyên liệu Thời gian thủy phân tùy thuộc vào mức độ hoạt động của nấm mốc

và yêu cầu hàm lượng đạm của sản phẩm Sản xuất dịch đạm thủy phân từ nấm mốc có thể có những nhược điểm như: Dịch đạm không có hương thơm, dễ bị đắng, có thể là

do xác vi sinh vật còn tồn tại, hoặc do các loại muối canxi, ma-giê có trong muối ăn; dịch đạm dễ bị chua, có nhiều nguyên nhân: có thể do lượng tinh bột mà mốc sử dụng không hết trong quá trình chế biến lên men lactic, có thể do các acid bay hơi hình thành khi cá bị ươn [10]

Công trình nghiên cứu “Sản xuất sản phẩm thủy phân từ đầu cá ngừ vây vàng bằng protease thương mại” của Nguyễn Thị Mỹ Hương được tiến hành năm 2012 cho thấy

sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex 0,5% ở nhiệt độ 45°C và pH tự nhiên của môi trường phản ứng trong thời gian 6 giờ, tỉ lệ nước:nguyên liệu là 1:1 (v:w) thì hiệu suất thủy phân và tỉ lệ thu hồi nitơ đạt giá trị cực đại lần lượt là 30,1% và 85,1% Phân tích thành phần hóa học tương đối của sản phẩm thô thu được sau phản ứng thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng cho thấy hàm lượng protein 88,2%, lipit 1,4% và tro 8,3% Sản phẩm thủy phân protein này có hàm lượng acid amin không thay thế cao [12]

Phạm Thị Hiền (2014), Nghiên cứu tách chiết protein từ thịt đỏ cá ngừ bằng phương pháp điều chỉnh pH đã đưa ra được ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian

chiết, tỷ lệ dung môi và nguyên liệu lên hiệu quả tách chiết protein từ thịt đỏ cá ngừ Hiệu suất thu hồi protein cao nhất tại pH = 13, thời gian chiết 1h, nhiệt độ dung môi chiết 30°C, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết = 1:10 [13]

Năm 2016 Trần Thị Bích Thủy với Nghiên cứu ứng dụng enzyme protamex để thủy phan cá trích thu dịch đạm đưa ra được điều kiện thủy phân thích hợp để thu dịch đạm

giàu acid amin từ protein của cá trính bằng enzyme Protamex ở pH tự nhiên với tỉ lệ nước:nguyên liệu là 1:1 Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện thủy phân thích hợp là: nhiệt độ 50°C, tỷ lệ enzyme - cơ chất 0,5% (w:v), thời gian 6 giờ Độ thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ, hàm lượng nitơ ammonia và hàm lượng nitơ acid amine trong dịch thủy phân thu được lần lượt đạt là 70,73%, 63,04%, 1,57 g/l và 12,88 g/l [14]

Năm 2017, công trình “Thu nhận dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ bằng phương pháp enzyme” của Ngô Thị Bích Ngọc đã xác định được các thông số tối ưu cho phản ứng

thủy phân của thịt đỏ cá ngừ bởi enzyme Protamex để thu được dung dịch thủy phân protein: thời gian phản ứng là 4 giờ, tỷ lệ enzyme:cơ chất = 0,4:100 (v:w), nhiệt độ phản ứng là 55°C Khi đó mức độ thủy phân đạt cực đại [23]

Hiện nay, các công trình nghiên cứu về thịt đỏ cá ngừ vẫn còn ít, chưa toàn diện Nghiên cứu quá trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng xúc tác HCl vẫn chưa được thực hiện

1.5.2 Thế giới

Trên thế giới thì có rất nhiều công trình nghiên cứu chiết tách protein từ cá và phế phẩm trong sản xuất cá như đầu, vây, thịt đỏ… bằng nhiều phương pháp khác nhau Trong đó có:

Ở Mỹ, Ling Lin Liu và cộng sự (1981) đã sản xuất dịch đạm thủy phân từ cá bằng enzyme pepsin và dịch thô enzyme từ dạ dày lợn để giảm chi phí sản xuất Tuy nhiên, chất lượng sản phẩm chưa cao vì enzyme có chứa nhiều tạp chất [24]

Batista (1999) đã nghiên cứu khai thác protein từ nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến cá tuyết và ứng dụng protein tách chiết được để làm surimi [25]

Ở Anh, J.Y.Imm và C.M.Lee (1999) đã nghiên cứu sản xuất bột gia vị thủy sản từ

cá tuyết Urophycis chuss bằng thủy phân Sử dụng ezyme Flavourzyme và Savorase ở

điều kiện pH tự nhiên (6,8) và tỷ lệ nước:cá là 2:5, ngoài ra còn bổ sung thêm 1,5% NaCl và 0,4% Sodium Tripolyphosphate (STPP) để cải thiện chất lượng của gia vị Kết quả cho thấy với thời gian thủy phân 6 giờ cho hiệu suất thủy phân cao nhất, dịch thủy phân cho hàm lượng cao các acid amin tạo vị umami và vị ngọt cao hơn so với nước dùng khi nấu nguyên liệu [26]

Ở Malaysia, S.Y.Yu, L.K.Tan (1990) đã sử dụng enzyme alkalase 0,61 để sản xuất

dịch đạm thủy phân từ cá rô phi Oreochromis mossambicus Điều kiện thủy phân cho

hiệu suất cao là ở nhiệt độ 50°C, pH là 8,0, với tỷ lệ một phần nước và một phần thịt cá; tỷ lệ enzyme và cơ chất là 1:50 Sau khi đã trung hòa, dịch thuỷ phân được thu hồi

và làm nguyên liệu sản xuất bánh quy “Keropok” [27] Cũng ở Malaysia, Herpandi và cộng sự (2011) đã nghiên cứu tận dụng các phế phẩm này để sản xuất thực phẩm chức năng cũng sử dụng chính các enzyme nội tại trong ruột cá để thủy phân [28]

Le Blanc và cộng sự (2005) đã thủy phân cá ngừ (Katsuobushi oligopeptide – KO) làm tăng hương vị của bột gia vị và có thể được sử dụng để thay thế muối trong thực phẩm và đồ uống [29]

Ở Cananda, Anushu G.P và cộng sự (2007) cũng tiến hành nghiên cứu thu nhận dịch đạm thủy phân từ cá Mecluc Thái Bình Dương Các điều kiện thủy phân khác nhau đã được thực hiện bao gồm tự thủy phân (1 giờ ở 52°C và pH 5,5), hoặc bằng bổ sung các enzyme thương mại như Validase ® BNP hay Flavourzyme 500® L Dịch thủy phân thu được từ loài cá này được chứng minh là có hoạt tính chống oxy hóa [30]

Năm 2010, Mahmoudreza Ovissipour và cộng sự, đã tạo dịch thủy phân từ nội tạng

cá ngừ vây vàng (Thunnus albacares) Điều kiện thủy phân (hoạt độ của enzyme, nhiệt

độ, và thời gian) được tối ưu hóa bằng cách sử dụng phương pháp phản ứng bề mặt Điều kiện tối ưu để đạt mức độ thủy phân cao nhất ở nhiệt độ 60,4°C, thời gian 90,25 phút và hoạt độ của protease (Alcalase 2,2 L) là 70,22 AU/kg protein Dịch thủy phân được sấy khô và xác định được tỷ lệ protein tương đối cao (72,34%) và lipid thấp (1,43%) với tỷ lệ hiệu quả trong phân giải protein từ nội tạng cá ngừ là 2,85 – 5,35 [31]

Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy, công nghệ enzyme có thể xúc tác cho quá trình chuyển hóa các nguyên liệu có giá trị thấp (cá tạp, phế phụ phẩm tôm, cá, …) thành một loại thực phẩm chức năng có giá trị cao hơn Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme thủy phân có nhược điểm là thời gian dài nhưng hiệu suất thu hồi protein không cao nên không hiệu quả kinh tế Vì vậy, đề tài nghiên cứu thủy phân cơ thịt đỏ

cá ngừ bằng xúc tác HCl để thu hồi dịch protein thủy phân được thực hiện để khắc phục nhược điểm trên để có thể kết hợp tận dụng ưu điểm của các phương pháp

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Thịt đỏ cá ngừ sọc dưa được cung cấp bởi nhà máy đồ hộp Hạ Long, Đà Nẵng Nguyên liệu được xay nhỏ (bằng máy xay gia dụng Panasonic, MX-SM 103, Malaysia) rồi loại bỏ xương và vảy bằng rây với lỗ rây có đường kính 2 mm Sau đó nguyên liệu được chia nhỏ thành từng khối (30 gram/khối) đựng trong bình kín và lưu trữ ở -20°C – 2°C cho các phân tích tiếp theo

2.1.2 Hóa chất

Acid clohydric (36 – 38%), acid phosphoric (85%), đồng clorua 99% (CuCl2), natri phosphate 99% (Na3PO4.12H2O), natri tetraborat 99,5% (Na2B4O7.10H2O), acid acetic đậm đặc 99,5%, kali iodid tinh thể 99% (KI), tinh bột, ống chuẩn natri thiosulfate (Na2S2O3), thimolphtalein (0,25%), natri hydroxit tinh thể (độ tinh khiết 96%), Coomassie Brilliant Blue G-250, ethanol (95%) Hầu hết các hóa chất được sử dụng có xuất xứ từ Trung Quốc

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa

Cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa được hòa trộn đều với xúc tác HCl ở nồng độ và thể tích xác định trong cốc sứ có nắp (50 mL) Quá trình thủy phân được thực hiện trong tủ ấm (Daihan IS – 30, Hàn Quốc) và tủ sấy (Ketong 101 – 2, Trung Quốc), nhiệt độ của phản ứng thủy phân đươc kiểm soát liên tục bằng nhiệt kế ngoài Sau khi kết thúc thời gian thủy phân, sản phẩm thô thu được sau phản ứng thủy phân được làm nguội đến nhiệt độ phòng và lọc qua giấy lọc (Whatman No.1) Lượng chất rắn còn sót lại được sấy khô đến khối lượng không đổi ở 100°C dùng để xác định hiệu suất thủy phân Dịch lỏng qua giấy lọc được bảo quản ở 4°C dùng cho các phân tích tiếp theo Phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa bằng xúc tác HCl với điều kiện xác định được thực hiện 3 lần

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ xúc tác HCl đến quá tình thủy phân cơ thịt

đỏ cá ngừ sọc dưa

Phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa được tiến hành với nồng độ xúc tác HCl khác nhau gồm 0,01 M; 0,05 M; 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M; 0,4 M; 0,5 M, tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl 1:10 (w:v), thời gian phản ứng 10 phút và nhiệt độ phản ứng

là 30°C

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl đến quá tình thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa

Nồng độ tối ưu của xúc tác HCl được sử dụng cho quá trình thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa với tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl trong khoảng 1:10 đến 1:46 (w:v) (khoảng cách giữa hai lần thí nghiệm là 4 mL HCl), thời gian phản ứng 10 phút và nhiệt độ phản ứng 30°C

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá tình thủy phân cơ thịt

đỏ cá ngừ sọc dưa

Nồng độ xúc tác HCl tối ưu và tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl tối ưu được sử dụng

để khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa với nhiệt độ phản ứng 30°C và thời gian phản ứng 5 phút và trong khoảng

10 – 80 phút (khoảng cách giứa hai thí nghiệm là 10 phút)

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến quá tình thủy phân cơ thịt

đỏ cá ngừ sọc dưa

Phản ứng thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa được thực hiện ở nồng độ xúc tác HCl, tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl, thời gian phản ứng tối ưu để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng Nhiệt độ phản ứng được khảo sát tăng từ 30 đến 80°C (khoảng cách giữa hai lần khảo sát là 10°C)

2.3 Các phương pháp phân tích

2.3.1 Xác định thành phần hóa học tương đối của cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa

Thành phần hóa học tương đối của cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (ẩm, protein, lipid, tro) được phân tích bằng phương pháp chuẩn của Cộng đồng phân tích quốc tế AOAC [32]

2.3.1.1 Xác định hàm lượng ni-tơ tổng số và protein thô của cơ thịt đỏ cá ngừ

Hàm lượng protein thô trong mẫu được xác định bằng phương pháp xác định hàm lượng ni-tơ tổng số - phương pháp Kjeldahl Vô cơ hóa mẫu bằng acid sulfuric đậm đặc, ni-tơ có trong mẫu sẽ chuyển thành amon sulfat Dùng kiềm đặc đẩy amoniac ra khỏi amon sulfat trong máy cất đạm tạo thành amon hydroxyt, sau đó định lượng bằng acid Hàm lượng ni-tơ trung bình trong phân tử protein của sản phẩm thủy sản là 16%

vì vậy hàm lượng protein thô trong mẫu thử bằng hàm lượng ni-tơ tổng số nhân với hệ

số 6,25 Quy trình được tiến hành theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.1 phụ lục 2

2.3.1.2 Xác định hàm lượng chất béo thịt đỏ cá ngừ

Hàm lượng chất béo được xác định dựa theo phương pháp chiết Soxhlet theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.2 phụ lục 2 Mẫu được xử lý bằng natri sulfat hoặc canxi sulfat,

chất béo giải phóng được trích ly bằng ete etylic Dung môi được làm bay hơi và lượng chất béo được xác định bằng cách cân

2.3.1.3 Xác định hàm lượng tro tổng số thịt đỏ cá ngừ

Tro hóa hoàn toàn mẫu trong lò nung ở nhiệt độ từ 500 đến 550oC, thời gian 4 – 6h trong lò nung để chuyển hóa hoàn toàn chất hữu cơ thành tro có màu xám trắng Hàm lượng tro được xác định từ khối lượng tro còn lại sau khi tro hóa Quy trình được tiến hành theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.3 phụ lục 2

2.3.1.4 Xác định hàm lượng ẩm thịt đỏ cá ngừ

Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử Hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô là lượng nước có trong mẫu thử Quy trình được tiến hành theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.4 phụ lục 2

2.3.2 Xác định hiệu suất thủy phân

Mẫu sau phản ứng được lọc bằng phễu lọc Bucher để thu hồi dịch lọc Lượng cá sau lọc được đem đi sấy ở 100oC đến khi khối lượng không đổi Sau đó đem cân rồi trừ cho khối lượng giấy lọc để thu được khối lượng còn lại sau phản ứng thủy phân

Hiệu suất thủy phân được tính theo công thức:

H%= M1 − M2

M2 ×100 Trong đó:

M1: Khối lượng chất khô của cá trước khi phản ứng

M2: Khối lượng chất khô của cá sau khi phản ứng

2.3.3 Xác đinh hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác đinh bằng phương pháp Bradford [33] Cách chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (G-250): cân 0,2 g G-250 và hòa tan trong 100 mL dung dịch ethanol (95%), sau đó thêm vào thuốc thử Bradford 200 mL acid phosphoric 85% Hỗn hợp được trộn đều và pha loãng đến 2 L trong bình định mức Trước khi sử dụng, thuốc thử Bradford được lọc qua giấy lọc Whatman No.1 [33] Trong phương pháp này, các protein có thể được phát hiện phải có trọng lượng phân tử lơn hơn 3000 Da, các protein nhỏ hơn, peptide và amino acid không thể phát hiện được [34]

Sản phẩm thô thu được sau phản ứng (0,1 mL) được pha loãng đến 10 mL bằng nước cất Dung dịch sau pha loãng (1 mL) được thêm 5 mL dung dịch thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (G-250) trong ống nghiệm và lắc đều, sau đó giữ yên trong 5 phút để ổn định màu Đo độ hấp phụ của hỗn hợp tại bước song 595 nm bằng quán phổ UV-VIS (Jenway spectrophotometer 6305, Vương quốc Anh) Hỗn hợp gồm nước cất

và thuốc nhuộm G-250 theo tỉ lệ (1:5, v:v) được dùng làm mẫu trắng Dung dịch albumin với các nồng độ khác nhau được dùng để xây dựng đường chuẩn Hàm lượng protein được tính toán bằng % (g protein trong 100 g trọng lượng khô của thịt đỏ cá ngừ)

Hình 2.1 Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250

Hình 2.2 Phản ứng tạo phức màu giữa protein và Coomasie Brilliant Blue G-250 Hiệu suất thu hồi protein được tính theo công thức:

H%= M1

M2 ×100 Trong đó:

M1: Khối lượng protein có trong dịch protein thủy phân thô (g)

M2: Khối lượng protein tổng có trong mẫu cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (g)

2.3.4 Xác định hàm lượng acid amin

Hàm lượng acid amin được xác định bằng phương pháp đồng [35] Cách chuẩn bị dung dịch đồng phosphate: dung dịch đồng cloric (A) cân 27,3 g CuCl2 (hoặc 35,4 g CuCl2.2H2O) hòa tan tròn 1 L nước Dung dịch natri phosphate (B): 64,5 g

Na3PO4.12H2O hòa tan trong 1 L dung dịch (hoặc 64,5 g Na2HPO4 hòa tan trong 500

mL nước cất đun sôi để nguội, thêm 7,2 g NaOH và định mức đến 1 L bằng nước cất đun sôi để nguội) Dung dịch đệm borat pH 8,8 (C): 28 g natri tetraborat

Pro-Dye Complex

A = 595 nm

(Na2B4O7.10H2O) hòa tan trong 750 mL nước cất Thêm 50 mL dung dịch HCl 0,1N

và thêm nước cất đến 1 L Trộn lẫn các dung dịch trên theo tỉ lệ: A:B:C = 1:2:2, thu được hỗn hợp đồng phosphate Cho dung dịch (a) trộn với dung dịch (b), lắc đều rồi cho thêm dung dịch (C) [15]

Sản phẩm thô thu được sau phản ứng (2,5 mL) được pha loãng đến 200 mL bằng nước cất Dung dịch sau pha loãng (5 mL) cho vào bình định mức (25 mL) rồi thêm 2 giọt thimolphtalein (0,25%) và thêm từng giọt natri hydroxit (0,1 N) vào cho đến khi dung dịch có màu xanh da trời nhạt Sau đó thêm 10 – 15 mL hỗn hợp đồng phosphate, rồi thêm nước cất đến vạch Lắc đều, lọc qua giấy lọc để thu dịch trong Dịch lọc (10 mL) cho vào bình tam giác, thêm 5 giọt acid acetic đậm đặt và 0,2 – 0,5 g kali iodid tinh thể rồi lắc đều, dung dịch có màu vàng Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfate (0,01 M) đến khi dung dịch có màu vàng nhạt Thêm 2 – 4 giọt dung dịch tinh bột 1%, dung dịch có màu xanh tím Chuẩn độ tiếp đến khi dung dịch mất màu Ghi lượng dung dịch natri thiosulfate 0,01 M đã dùng để chuẩn độ Lấy 5 mL nước cất thay cho 5

mL dung dịch mẫu pha loãng và tiến hành như trên làm mẫu trắng

Hàm lượng acid amin trong mẫu được tính bằng g/mL theo công thức:

XAA'= (V1− V2)×0,00028 ×10 ×25

2,5 ×10Trong đó:

V1: Thể tích natri thiosulfate 0,01 M tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thử (mL)

V2: Thể tích natri thiosulfate 0,01 M tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng (mL)

10: Độ pha loãng mẫu

5: Thể tích dung dịch pha loãng

25: Thể tích toàn bộ hỗn hợp dịch trước khi lọc (mL)

10: Thể tích dung dịch lọc lấy để chuẩn độ (mL)

0,00028: Số g nitơ acid amin tương ứng với 1 mL dung dịch natri thiofulfat 0,01 M

H%= Maa

Mp ×100 Trong đó:

Maa: Khối lượng của acid amin có trong dịch protein thủy phân thô (g)

Mp: Khối lượng protein tổng có trong mẫu cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (g)

2.3.5 Độ hấp thụ của sản phẩm thô sau phản ứng

Độ hấp thụ UV của sản phẩm thô tại bước sóng 284 nm phản ánh cường độ của phản ứng Maillard và sự hình thành các sản phẩm trung gian Sản phẩm thô thu được sau phản ứng (pha loãng 100 lần) được xác định bằng cách đo độ hấp phụ quang tại

bước sống 284 nm bằng máy quang phổ UV-VIS (Jenway spectrophotometer 6305, Vương quốc Anh) Nước cất được sử dụng làm mẫu trắng [33, 36, 37]

2.3.6 Phương pháp tính toán và phân tích số liệu

Phần mềm Minitab 17 được sử dụng để phân tích phương sai ANOVA – One Way cho sự khác biệt có ý nghĩa nhằm lựa chọn điều kiện tối ưu cho từng yếu tố ảnh hưởng