Xây dựng tiêu chuẩn cơ sơ kiểm nghiệm nicotin trong viên nén nhai hỗ trợ cai thuốc lá

Do đó, việc xây dựng một quy trình định lượng nicotin trong các chế phẩm viên nén nhai là cần thiết.. Với những lý do nêu trên, đề tài “Xây dựng Tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm nicotin tron

Trang 1

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SƠ KIỂM NGHIỆM

NICOTIN TRONG VIÊN NÉN NHAI

HỖ TRỢ CAI THUỐC LÁ

Mã số: <Mã số đề tài>

Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Ngọc Tú

.

Trang 2

MỤC LỤC

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2

2.1 ĐỐI TƯỢNG 2

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

2.2.1 Phương pháp định tính nicotin bằng sắc ký lớp mỏng 2

2.2.2 Phương pháp định lượng nicotin bằng sắc ký hiệu năng cao 3

2.2.3 Áp dụng quy trình cho chế phẩm viên nén nhai chứa nicotin trên thị trường 5

2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm viên nén nhai nicotin chứa dược chất nicotin polacrilex 5

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 6

3.1 Xây dựng phương pháp định tính nicotin bằng SKLM 6

3.2 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng nicotin bằng HPLC 6

3.2.1 Sơ bộ khảo sát quy trình 6

3.2.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 7

3.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 8

3.2.4 Tóm tắt các điều kiện để khảo sát quy trình định lượng 11

3.2.5 Thẩm định quy trình định lượng nicotin bằng HPLC 13

3.3 Áp dụng quy trình cho một số chế phẩm viên nén nhai chứa nicotin trên thị trường 27

3.4 Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở để kiểm tra chất lượng “Viên nén nhai nicotin polacrilex” 28

3.4.1 Yêu cầu kỹ thuật 28

3.4.2 Phương pháp thử 29

KẾT LUẬN 32

KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

.

Trang 3

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

.

Trang 4

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi rã nền tá dược gum 7

Bảng 3.2 Kiểm tra hiệu suất chiết nicotin 8

Bảng 3.3 Giá trị thông số pic nicotin trong khảo sát pH 10

Bảng 3.4 Thông số sắc ký trong khảo sát tỉ lệ pha động 11

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống quy trình định lượng nicotin 13

Bảng 3.6 Cách pha dung dịch thẩm định tính tuyến tính 17

Bảng 3.7 Số liệu thẩm định tính tuyến tính quy trình định lượng nicotin 17

Bảng 3.8 Số liệu thống kê tính tuyến tính của quy trình 19

Bảng 3.9 Kết quả thẩm định độ đúng quy trình định lượng nicotin 20

Bảng 3.10 Kết thẩm định độ lặp lại – mẫu chuẩn nicotin ditartrat 23

Bảng 3.11 Kết quả thẩm định độ lặp lại quy trình định lượng nicotin 24

Bảng 3.12 Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian – mẫu chuẩn nicotin ditartrat 25

Bảng 3.13 Kết quả thẩm định độ lặp lại quy trình định lượng nicotin 26

Bảng 3.14 Thống kê kết quả của 2 kiểm nghiệm viên 26

Bảng 3.15 Kết quả 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn trong ứng dụng quy trình 27

Bảng 3.16 Kết quả áp dụng quy trình định lượng cho viên nén nhai Ohno 28

.

Trang 5

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1.SKĐ định tính nicotin trong chế phẩm 6

Hình 3.2 SKĐ của nicotin sơ bộ khảo sát quy trình 6

Hình 3.3 Phổ UV của dung dịch nicotin đối chiếu 8

Hình 3.4 SKĐ của nicotin ở đệm pH 5,0 9

Hình 3.7 SKĐ tỉ lệ pha động MeOH – đệm = 15:85, (a) pH 2,55; (b) pH 2,40 10

Hình 3.10 Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng nicotin – (a) mẫu trắng, (b) mẫu giả dược, (c) mẫu chuẩn, (d) mẫu thử, (e) so sánh SKĐ 14

Hình 3.11 Kết quả tinh khiết pic nicotin trên mẫu chuẩn 15

Hình 3.12 Kết quả tinh khiết pic nicotin trên mẫu thử 16

Hình 3.13 Biểu đồ thể hiện tính tuyến tính của quy trình phân tích 18

.

Trang 6

.

Trang 7

Thuốc lá là nguyên nhân gây ra gánh nặng tử vong và bệnh tật lớn thứ 2 tại Việt Nam.Bệnh tật và tử vong liên quan đến thuốc lá chỉ xảy ra nhiều năm sau khi hút thuốc lá.Việt Nam đã và đang chịu gánh nặng khổng lồ về sức khỏe và kinh tế do thuốc lá gây

ra Các biện pháp dùng thuốc được tổ chức y tế thế giới khuyến cáo sử dụng gồm có babiện pháp: nicotin thay thế (miếng dán, viên nhai, ống hít); bupropion hydrochloride(viên uống), varenicilline Trong đó, nicotin được sử dụng phổ biến nhất

Ở Việt Nam, số lượng chế phẩm chứa nicotin trong hỗ trợ cai thuốc lá còn chưa nhiều.Hơn nữa, DĐVN vẫn chưa có chuyên luận về nicotin, cả nguyên liệu lẫn thành phẩm

Do đó, việc xây dựng một quy trình định lượng nicotin trong các chế phẩm viên nén

nhai là cần thiết Với những lý do nêu trên, đề tài “Xây dựng Tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm nicotin trong viên nén nhai hỗ trợ cai thuốc lá” đã được thực hiện với những

mục tiêu cụ thể như sau :

* Xây dựng phương pháp định tính nicotin bằng sắc ký lớp mỏng

* Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng nicotin bằng sắc ký hiệu năng cao

* Áp dụng quy trình cho chế phẩm viên nén nhai chứa nicotin trên thị trường

* Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở để kiểm tra chất lượng “Viên nén nhai nicotin”

.

Trang 8

+ Mẫu placebo: Không có vết trùng với vết chính ở mẫu đối chiếu.

+ Vị trí vết nicotin của mẫu đối chiếu và mẫu thử phải tương đương nhau

- Tiến hành: Theo dược điển USP 36

+ Mẫu đối chiếu: Cân lượng chuẩn tương ứng 4 mg nicotin cho vào trong ống ly tâm.

Thêm 5 mL cloroform và siêu âm trong 30 phút Tiến hành ly tâm mẫu trong điều kiện

3000 vòng/phút trong 5 phút Lấy lớp dung dịch trên, làm nguội ở nhiệt độ thườngtrong 5 phút Thêm 3 mL dung dịch acid hydrocloric 0,5 N Lắc đều và tiến hành lytâm như điều kiện trên Lấy lớp trên chuyển vào bình lắng và điều chỉnh đến pH 10bằng dung dịch natri hydroxyd 1 N (dùng giấy chỉ thị vạn năng để kiểm tra) Thêm 3

mL cloroform, lắc nhẹ và để yên trong 5 phút Lấy lớp dưới để tiến hành chấm sắc ký

+ Mẫu thử: Cắt nhỏ lượng viên nhai (tương đương 4 mg nicotin) thành lát nhỏ rồi

chuyển vào ống ly tâm Cho thêm 5 mL cloroform và siêu âm trong 30 phút Tiếnhành ly tâm mẫu trong điều kiện 3000 vòng/phút trong 5 phút Lấy lớp dung dịch trên,làm nguội ở nhiệt độ thường trong 5 phút Thêm 3 mL dung dịch acid hydrocloric 0,5

N Lắc đều và tiến hành ly tâm như điều kiện trên Lấy lớp trên chuyển vào bình lắng

và điều chỉnh đến pH 10 bằng dung dịch natri hydroxyd 1 N (dùng giấy chỉ thị vạnnăng để kiểm tra) Thêm 3 mL cloroform, lắc nhẹ và để yên trong 5 phút Lấy lớp dưới

để tiến hành chấm sắc ký

+ Mẫu placebo: Chuyển 2177,3 mg placebo vào trong ống ly tâm Thêm 5 mL

cloroform và siêu âm trong 30 phút Tiến hành ly tâm mẫu trong điều kiện 3000vòng/phút trong 5 phút Lấy lớp dung dịch trên, làm nguội ở nhiệt độ thường trong 5 .

Trang 9

ic 0,5 N Lắc đều và tiến hành ly tâm nhưđiều kiện trên Chuyển lớp trên vào bình lắng và điều chỉnh đến pH 10 bằng dung dịchnatri hydroxyd 1 N (dùng giấy chỉ thị vạn năng để kiểm tra) Thêm 3 mL cloroform,lắc nhẹ và để yên trong 5 phút Lấy lớp dưới để tiến hành chấm sắc ký.

➢ Chấm 10 µL mỗi dung dịch đối chiếu và dung dịch thử Vết chấm mẫu cách mặtdưới bản sắc ký 1,5 cm

➢ Hệ dung môi: Cloroform – aceton – diethylamin (40: 5: 5)

➢ Tiến hành chạy sắc ký đến khi đường di chuyển của dung môi tối thiểu là khoảng

7 cm Để khô và soi dưới đèn UV, bước sóng 254 nm

2.2.2 Phương pháp định lượng nicotin bằng sắc ký hiệu năng cao

2.2.2.1 Sơ bộ khảo sát quy trình

- Điều kiện sắc ký: Cột nhồi pha tĩnh C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)

+ Pha động: A-B = 15:85

+ Dung môi A: Methanol

+ Dung môi B: Đệm citrat phosphat (Cách pha đệm: cân 5,02 g NaH2PO4 và 6,20 gvào 500 mL nước, khuấy đều)

+ Thể tích tiêm: 20 µL

+ Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút

+ Detector UV: λmax = 260 nm

- Quy trình xử lý mẫu:

+ Pha dung môi pha mẫu (DMPM): Đệm citrat phosphat

+ Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 24,5 mg nicotin ditartrat cho vào bình định mức

50 mL Hòa tan bằng DMPM rồi bổ sung vừa tới vạch Tiếp tục pha loãng 5 mL dungdịch này trong bình định mức 20 mL Lọc qua đầu lọc 0,45 µm

+ Mẫu thử: Cho 1 viên vào cốc 250 mL, thêm 50 mL hexan, khuấy từ (tốc độ 450vòng/phút) đến khi tan chất nền gum Tiếp tục thêm chính xác 50 mL DMPM và khuấythêm khoảng 25 phút Cho dung dịch này vào phễu chiết, ổn định trong khoảng 20 phút.Lấy lớp dưới lọc thô qua giấy lọc, sau đó lọc qua đầu lọc 0,45 µm

.

Trang 10

- Bước 1: Hòa tan chất nền gum để giải phóng nicotin vào dung dịch bằng dung môi

phân cực trung bình đến kém phân cực Tiến hành khảo sát với hexan và ethyl acetat.Ghi nhận khả năng và thời gian hòa tan gum của 2 dung dịch trên

- Bước 2: Giải phóng nicotin dưới tác nhân acid Ghi nhận hiệu suất chiết.

2.2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sắc ký

Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm

- Nicotin là một base hai bậc với các giá trị pKa1 = 3,12 (vòng pyridin) và pKa2 = 8,02(vòng pyrolidin) nên pH có ảnh hưởng lớn đến tỉ lệ ion hóa của nó Ở pH 7,0 – 7,5, có

ít hơn 25% nicotin ở dạng trung hòa Ở pH 2,5 – 3,0; nicotin tồn tại cả hai dạng protonhóa 1 bậc và 2 bậc; trong đó dạng proton hóa 1 bậc khoảng từ 19-43%.[6]

- Bên cạnh đó, có nghiên cứu cho thấy rằng ở khoảng pH 5,0 – 6,0, nicotin tồn tại chủyếu ở dạng proton hóa 1 bậc

- Do vậy, tiến hành sự ảnh hưởng ở hai vùng pH như sau:

+ Khảo sát sự ảnh hưởng ở pH 5,0; 5,5; 6,0: pha đệm citrat phosphat, điều chỉnh đến

pH cần thiết bằng dung dịch NaOH 2M

+ Khảo sát ở pH < 2,5: pha đệm citrat phosphat, điều chỉnh đến pH 2,4 bằng acidpercloric.[7]

- Ghi nhận số liệu Đánh giá dựa trên hình dạng pic, diện tích pic, hệ số kéo đuôi và sốđĩa lý thuyết

Ảnh hưởng bước sóng hấp thu

Trong phép phân tích đồng thời, việc lựa chọn bước sóng rất quan trọng vì nó quyết địnhtới độ nhạy của phép phân tích Do phương pháp phân tích là HPLC sử dụng đầu dò làdetector UV-Vis cố định bước sóng, cần khảo sát điều kiện nhằm chọn bước sóng tối ưu

để phân tích Tiến hành quét phổ chuẩn nicotin để tìm bước sóng hấp thu cực đại

Trang 11

2.2.3 Áp dụng quy trình cho chế phẩm viên nén nhai chứa nicotin trên thị trường

Áp dụng quy trình cho 1 số viên nén nhai trên thị trường

2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm viên nén nhai nicotin chứa dược chất nicotin polacrilex

Tiến hành xây dựng tiêu chuẩn cơ sở các chỉ tiêu sau cho viên nén nhai chứa nicotinpolacrilex:

Trang 12

ỨU

3.1 Xây dựng phương pháp định tính nicotin bằng SKLM

- Kết quả:

Hình 3.1.SKĐ định tính nicotin trong chế phẩm

+ Mẫu placebo không cho vết ở vị trí như mẫu thử, mẫu chuẩn

+ Mẫu thử và mẫu chuẩn có vị trí vết và giá trị Rf tương ứng với nhau

- Kết luận: Phương pháp có tính đặc hiệu

3.2 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng nicotin bằng HPLC

3.2.1 Sơ bộ khảo sát quy trình

Tiến hành trên chuẩn nicotin ditartrat và đánh giá hình dạng pic, cũng như các thông sốnhư thời gian lưu, diện tích pic, hệ số kéo đuôi

- Kết quả:

Hình 3.2.SKĐ của nicotin sơ bộ khảo sát quy trình

.

Trang 13

ích pic là 1686814, hệ số kéo đuôi F =1,246

- Nhận xét: Ở điều kiện khảo sát, pic nicotin có thời gian lưu tương đối ngắn, có thể bị

sự ảnh hưởng của dung môi Bên cạnh đó, hình dạng pic còn hơi rộng ở chân Tiến hànhkhảo sát thêm các yếu tố để cải thiện điều kiện sắc ký

3.2.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

* Khảo sát dung môi hòa tan nền gum

- Tiến hành: Chuẩn bị 6 cốc có mỏ 250 mL Cho 1 viên vào mỗi cốc Cho vào 3 cốc đầu,mỗi cốc 50 mL hexan và và 3 cốc sau, mỗi cốc 50 mL ethyl acetat Khuấy trên bếp từ.Ghi nhận lại thời gian rã viên hoàn toàn

- Kết quả:

Bảng 3.1.Kết quả khảo sát dung môi rã nền tá dược gum

Thời gian rã viên hoàn

- Nhận xét: dung môi hexan hòa tan tốt nền gum tá dược để giúp phóng thích nicotin

polacrilex ra môi trường nên chọn làm dung môi xử lý bước 1

* Kiểm tra hiệu suất chiết ở bước 2

- Tiến hành:

Sau khi chiết với 50 mL n-hexan Thêm chính xác 50 mL DMPM vào và khuấy trong

25 phút Chuyển hỗn hợp vào bình lắng, để yên khoảng 20 phút Lấy lớp dưới, lọc thôqua giấy lọc và lọc qua màng 0,45 µm Sau khi khi chiết lần 1 với 50 mL DMPM Thêmtiếp tục 50 mL DMPM vào lớp hexan Khuấy trong 25 phút Chuyển hỗn hợp vào bìnhlắng, để yên khỏang 20 phút Lấy lớp dưới, lọc thô và lọc qua màng lọc 0,45 µm.Tiến hành tiêm mẫu

So sánh diện tích pic lần sau và lần đầu

- Kết quả:

.

Trang 14

u suất chiết nicotin Mẫu

Chiết lần 1 Chiết lần 2 Hiệu suất chiết

- Nhận xét: Hiệu suất cả 3 mẫu đều trên 99% Dùng 50 mL DMPM để chiết 1 lần.

3.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

Khảo sát bước sóng hấp thu

- Tiến hành như quy trình xử lý mẫu nicotin chuẩn Mẫu trắng là DMPM Sau đó quétphổ với bước sóng từ 400 – 200 nm

- Kết quả:

Hình 3.3.Phổ UV của dung dịch nicotin đối chiếu

- Nhận xét: Bước sóng hấp thu cực đại là 259 nm nên, phù hợp bước sóng trong điều

kiện khảo sát ban đầu là λ = 260 nm

Sự ảnh hưởng của pH dung dịch đệm

- Tiến hành khảo sát pH của dung dịch đệm ở 3 mức pH 5,0; 5,5 và 6,0 với chuẩn nicotinditartrat Đệm được điều chỉnh pH dung dịch NaOH 2M

- Kết quả:

.

Trang 15

Hình 3.4 SKĐ của nicotin ở đệm pH 5,0

.

Trang 16

nicotin trong khảo sát pH

pH Thời gian lưu Diện tích pic Hệ số kéo đuôi Số đĩa lý thuyết

- Nhận xét: Ở cả 3 mức pH cho thấy giá trị thời gian lưu đều được cải thiện Tuy nhiên,

hình dạng pic chưa được gọn, đồng thời diện tích giảm Bên cạnh đó, các giá trị hệ sốbất đối tương đối cao

- Như vậy, pH trong khoảng 2 – 2,5 tương đối thích hợp hơn

Khảo sát tỉ lệ pha động

- Thành phần pha động là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng cũng như các thông

số của pic Tiến hành khảo sát các tỉ lệ pha động ở mức pH 2,55 và 2,40 (điều chỉnhbằng acid percloric)

- Kết quả: + Kết quả tỉ lệ MeOH – đệm = 15:85

Trang 17

Kết quả đưa ra cho thấy điều kiện pH 2,40 điều chỉnh bằng acid percloric và tỉ lệ phađộng MeOH – đệm = 10:90 là phù hợp cho quy trình phân tích.

3.2.4 Tóm tắt các điều kiện để khảo sát quy trình định lượng

- Điều kiện sắc ký:

+ Cột thép không gỉ Inertsurtain nhồi pha tĩnh C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)

.

Trang 18

mL với DMPM Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

+ Dung dịch thử: Định lượng riêng rẽ 10 viên Cho 1 viên nén vào cốc có mỏ 250 mL.Thêm 50 mL n- hexan, khuấy từ đến khi viên rã hoàn toàn (khoảng 60 phút) Thêm 50mLDMPM vào và tiếp tục khuấy trong 25 phút Chuyền toàn bộ dịch trong cốc sangbình lắng và để yên trong 20 phút Lấy lớp dưới lọc thô qua giấy lọc Tiếp tục lọc dungdịch qua màng lọc 0,45 µm

+ Tiêm lần lượt 20 µL dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống sắc ký và ghi lạisắc đồ

- Tính lượng nicotin tìm lại được trong mỗi mẫu theo công thức sau:

X (mg) =

c

t c t

S

D C

S  

với

+ St, Sc: diện tích pic nicotin của dung dịch thử, chuẩn tương ứng

+ Cc: nồng độ chất chuẩn nicotin tính bằng mg/mL

+ Dt: độ pha loãng mẫu thử

- Tính % phục hồi theo công thức sau: % độ đúng =

Trang 19

bằng HPLC

Tính tương thích của hệ thống

- Yêu cầu

+ %RSD diện tích pic và thời gian lưu của 6 lần tiêm lặp lại ≤ 2,0%

+ Hệ số đối xứng của pic nicotin ≤ 2,0

- Tiến hành: tiêm liên tục 6 lần mẫu chuẩn nicotin ditartrat trong 1 vial Đánh giá cácthông số sắc ký

(phút)

Diện tích pic

(uV)

Hệ số kéo đuôi

Số đĩa lý thuyết

+ %RSD 6 lần tiêm lặp lại của thời gian lưu 0,14% < 2,0%

+ %RSD 6 lần tiêm lặp lại của diện tích pic 0,05% < 2,0%

+ Hệ số đối xứng trung bình 1,332 nằm trong khoảng 0,8 – 1,5

.

Trang 20

Hình 3.10 Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng nicotin – (a) mẫu

trắng, (b) mẫu giả dược, (c) mẫu chuẩn, (d) mẫu thử, (e) so sánh SKĐ

.

Trang 21

Hitachi Chromaster 5430

Hình 3.11 Kết quả tinh khiết pic nicotin trên mẫu chuẩn

.

Trang 22

Hình 3.12 Kết quả tinh khiết pic nicotin trên mẫu thử

+ Pha 6 dung dịch chuẩn có nồng độ 0,016; 0,024; 0,032; 0,040; 0,048; 0,056 (mg/mL).Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Mỗi nồng độ thực hiện 2 lần

.

Trang 23

Bảng 3.7 Số liệu thẩm định tính tuyến tính quy trình định lượng nicotin

Lượng cân chuẩn nicotin ditartrat 24,6 mg Độ pha loãng chuẩn

Độ phaloãng

Nồng độ(mg/mL)

Trang 24

Hình 3.13 Biểu đồ thể hiện tính tuyến tính của quy trình phân tích

y = 5E+07x - 648,6R² = 0,9996

0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000

Trang 25

Coefficie nt

Standard Error t Stat P-value

Lower 95%

Upper 95%

Intercept

-648,600

19334,41089

0,033546406

0.974846092

54329,53048

53032,33048XVariable

1

47782009,89

498866,8154

95.78109509

08

7.12388E-46396933,56

49167086,21

Trắc nghiệm Fisher (F = 9174.02 > F0,05 = 6,61) phương trình hồi quy tương thích

Trắc nghiệm Student (ta = 95,7811 > t0,05 = 2,45; tb = 0,0335 < t0,05 = 2,45): hệ số a (độdốc) có ý nghĩa và hệ số b (tung độ gốc) không có ý nghĩa về mặt thống kê

.

Trang 26

độ và diện tích pic trong khoảng khảo sát.

Phương trình hồi quy y = 5E+07x - 648.6 Hệ số R2 = 0,9996

Độ đúng

- Yêu cầu

+ Độ thu hồi nicotin của các mẫu độ đúng trong khoảng [98,0% - 102,0%]

+ %RSD của các mẫu trong cùng nồng độ khảo sát ≤ 2,0%

- Tiến hành: Thực hiện phương pháp thêm chuẩn nguyên liệu nicotin polacrilex vào mẫu

tự tạo với 3 mức nồng độ 70%, 100% và 120% so với nồng độ định lượng Thực hiện 3mẫu ở mỗi mức nồng độ

- Kết quả:

.

Trang 27

ng quy trình định lượng nicotin

Nhóm Số mẫu

Lượng cânmẫu placebo(mg)

Lượng cândược chất

Hàm lượngnguyêntrạng

Lượngnicotin thêmvào a (mg)

% phục hồi

Trung bình và % RSD

1886643 1891805 1889224,0 2,0045 99,16%

1886232 1890540 1888386,0 2,0036 99,93%

.

Trang 28

Nhóm III

120%

,5 2,4131 101,13%

99,50% 1,44%

2224508 2224857 2224682,5 2,3605 98,93%

2228609 2229429 2229019,0 2,3651 98,44%

Trung bình (9 mẫu) 99,65%

Nhận xét: Các nồng độ khảo sát đều có tỷ lệ thu hồi nicotin trong khoảng 98% - 102%

và %RSD ở 3 mẫu cùng nồng độ đều < 2% Phương pháp phân tích đạt yêu cầu về độđúng

Khoảng xác định

- Kết quả khảo sát tuyến tính cho thấy nicotin tuyến tính trong khoảng 40% - 140% sovới nồng độ chuẩn đem thử (tương đương với khoảng nồng độ nicotin từ 0,016 mg/mLđến 0,056 mg/mL)

- Kết quả khảo sát độ đúng cho thấy nicotin thu hồi tốt ở các nồng độ khảo sát 70%,100%, 120% (tương đương với các nồng độ nicotin là 0,028 mg/mL, 0,04 mg/mL và0,048 mg/mL) và độ lặp lại của các mẫu trong cùng nồng độ đều có %RSD nhỏ hơn2,0%

- Như vậy chọn khoảng xác định của nicotin từ 70% đến 120% nồng độ định lượng

Độ lặp lại

- Yêu cầu: %RSD của 6 mẫu định lượng riêng biệt  2,0%

- Tiến hành: tiến hành thử nghiệm trên 6 mẫu, ghi nhận lại SKĐ, tính giá trị %RSD.+ Mẫu chuẩn: Như quy trình đã nêu

+ Mẫu thử: Cân 20 viên gum, ghi nhận khối lượng và tính khối lượng trung bình của 1viên Xay đều viên bằng máy xay Cân khối lượng tương ứng 1 viên và xử lý mẫu nhưquy trình đã nêu

- Hàm lượng % nicotin (C10H14N4) so với hàm lượng nhãn tính theo khối lượng trungbình viên, được tính theo công thức:

D

D C m

m S

S

c t t

c c

t   % 

Y(%/nhãn) = X 100

T .

Trang 29

- Trong đó:

+ St, Sc: Diện tích pic nicotin của mẫu thử, mẫu chuẩn

+ C%: Hàm lượng chuẩn nicotin tính trên nguyên trạng

+ mt, mc: Khối lượng cân thử, chuẩn (mg)

+ Dt, Dc: Độ pha loãng của dung dịch thử, dung dịch chuẩn

+ MW: Khối lượng trung bình viên (mg)

T: Hàm lượng lý thuyết của nicotin trong 1 viên nén nhai (T = 2 mg)

- Kết quả:

Bảng 3.10 Kết thẩm định độ lặp lại – mẫu chuẩn nicotin ditartrat

Mũi Thời gian lưu Diện tích pic Hệ số đối xứng

Khối lượng trung bình 1 viên: m = 1106,46 mg

Khối lượng cân chuẩn nicotin ditartrat: 24,4 mg

Hàm lượng nicotin/nhãn lý thuyết: 2 mg

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

Trang 30

Bảng 3.11 Kết quả thẩm định độ lặp lại quy trình định lượng nicotin

bình mg/viên

% sonhãn

Nhận xét: %RSD của 6 mẫu định lượng riêng biệt đối với nicotin nhỏ hơn 2,0% Vậy

phương pháp đạt yêu cầu về độ lặp lại

Độ chính xác trung gian

- Yêu cầu:

+ %RSD của 6 mẫu định lượng riêng biệt với mỗi kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%

+ %RSD của 12 mẫu định lượng riêng biệt với 2 kiểm nghiệm viên khác nhau ≤ 2,0%.+ Hai kiểm nghiệm viên đồng nhất thống kê

- Tiến hành tương tự độ lặp lại nhưng được thực hiện khác ngày và khác kiểm nghiệmviên

- Kết quả:

Trang 31

Bảng 3.12 Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian – mẫu chuẩn nicotin ditartrat

Khối lượng trung bình 1 viên: m = 1108,00 mg

Trang 32

Bảng 3.13 Kết quả thẩm định độ lặp lại quy trình định lượng nicotin

bình mg/viên

% sonhãn

Bảng 3.14 Thống kê kết quả của 2 kiểm nghiệm viên

- Kiểm nghiệm viên 1: Nguyễn Duy

- Ftn< Fc: 2 kiểm nghiệm viên đồng nhất về thống kê

Trang 33

- Nhận xét: Kết quả của 2 kiểm nghiệm viên đồng nhất về thống kê Qui trình phân tích

đạt yêu cầu về độ chính xác trung gian

3.3 Áp dụng quy trình cho một số chế phẩm viên nén nhai chứa nicotin trên thị trường

- Tiến hành: Áp dụng quy trình đã thẩm định cho viên nén nhai Ohno do công ty cổ phầndược phẩm Việt Phúc, số lô 030216 Định lượng 10 viên nén, sau đó lấy giá trị trungbình làm kết quả định lượng

Trang 34

Bảng 3.16 Kết quả áp dụng quy trình định lượng cho viên nén nhai Ohno

- Kết luận: Viên nén nhai Ohno có giới hạn định lượng từ 90-100% khối lượng nhãn.

Kết quả định lượng được là 97,98% nên đạt mức yêu cầu

3.4 Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở để kiểm tra chất lượng “Viên nén nhai nicotin polacrilex”

3.4.1 Yêu cầu kỹ thuật

▪ Cảm quan

Viên nén hình tròn, màu trắng đục, hai mặt lồi, cạnh và thành viên lành lặn

▪ Định tính

Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của nicotin

Trang 35

▪ Độ đồng đều khối lượng

± 5% so với khối lượng trung bình viên

Mẫu thử: Cắt nhỏ lượng viên nhai (tương đương 4 mg nicotin) thành lát nhỏ rồi chuyểnvào ống ly tâm Cho thêm 5 mL cloroform và siêu âm trong 30 phút Tiến hành lytâm mẫu trong điều kiện 3000 vòng/phút trong 5 phút Lấy lớp dung dịch trên, làmnguội ở nhiệt độ thường trong 5 phút.Thêm 3 mL dung dịch acid hydrocloric 0,5 N.Lăc đều và tiến hành ly tâm như điều kiện trên Lấy lớp trên chuyển vào bình lắng

và điều chỉnh đến pH 10 bằng dung dịch natri hydroxyd 1 N (dùng giấy chỉ thị vạnnăng để kiểm tra) Thêm 3 mL cloroform, lắc nhẹ và để yên trong 5 phút Lấy lớpdưới để tiến hành chấm sắc ký

Trang 36

+ Hệ dung môi: Cloroform – aceton – diethylamin (40: 5: 5).

+ Tiến hành chạy sắc ký đến khi đường di chuyển của dung môi là khoảng 7 cm

Để khô và soi dưới đèn UV, bước sóng 254 nm

Yêu cầu: Vị trí vết nicotin của mẫu đối chiếu và mẫu thử phải tương đương nhau

Phương pháp HPLC

Trong phần độ đồng đều hàm lượng nicotin, thời gian lưu của pic chính trên SKĐ củamẫu thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic chính trên SKĐ của mẫu chuẩnnicotin

▪ Độ đồng đều khối lượng

(Có thể thay đổi tốc độ dòng hoặc tỷ lệ pha động nếu cần)

+ Cách pha đệm pH 2,4: Cân 5,02 g natri dihydrophosphat và 6,20 g acid citric vào

500 mL nước tinh khiết Khuấy đều và chỉnh đến pH 2,4 bằng acid percloric

Trang 37

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác lượng chất chuẩn tương ứng khoảng 8 mg nicotinchovào bình định mức 50 mL, thêm 40 mLDMPM, khuấy từ trong 20 phút Định mứctới vạch bằng DMPM, lắc đều Lấy 5,0 mL dung dịch thu được thành 20 mL vớiDMPM Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Tiêm lần lượt 20 l dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống sắc ký và ghi lạiSKĐ

Yêu cầu tính tương thích hệ thống: SKĐ 6 lần tiêm lặp lại của dung dịch chuẩn, độlệch chuẩn tương đối (%RSD) của thời gian lưu, diện tích pic không quá 2,0%, hệ

số đối xứng không quá 2,0

c

t

D

D C m S

- Trong đó:

+ S t, S c: lần lượt là diện tích pic nicotin từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn.+ C%: Hàm lượng chuẩn nicotin tính trên nguyên trạng.

+ m c: Khối lượng cân chuẩn (mg)

+ D t , D c: Độ pha loãng mẫu thử, chuẩn

+ T: Hàm lượng lý thuyết nicotin trong một viên nén (T = 2 mg).

Trang 38

KẾT LUẬN

- Thăm dò được điều kiện sắc ký cho quy trình định lượng nicotin

- Xác định được quy trình xử lí mẫu cho dạng viên nén nhai (gum) chứa nicotinpolacrilex

- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng nicotin trong viên nén nhai Kết quả thẩmđịnh về tính đặc hiệu, tính tuyến tính (R2 = 0,9996) độ đúng (tỉ lệ phục hồi 100,82%),

độ lặp lại (%RSD = 1,04), độ chính xác trung gian (%RSD6 mẫu = 1,06, %) ,(RSD12 mẫu

= 1,88), đều đạt yêu cầu cho phép, cho thấy có thể áp dụng quy trình vào việc xác địnhhàm lượng nicotin trong chế phẩm viên nén nhai, góp phần kiểm soát nhanh chất lượngcủa các chế phẩm có chứa nicotintrên thị trường

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho viên nén nhai nicotin chứa dược chất nicotin polacrilex

KIẾN NGHỊ

Với các kết quả thu được hy vọng nghiên cứu sẽ có thể góp phần vào việc ứng dụng phươngpháp RP - HPLC nói riêng và phương pháp HPLC nói chung để xác định các dược chất trongcác mẫu thuốc mới Bên cạnh đó, hướng nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sẽ tiến hành xử lí mẫutrong điều kiện khắc nghiệt khảo sát sự phân hủy nhằm xác định độ ổn định của viên nhai chứanicotin

Trang 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 American Society of Health System Pharmacists (2011), AHFS Drug InformationEssentials, Bethesda, MD

2 Anthonisen NR và các cộng sự (2005), "The effects of smoking cessation intervention

on 14,5 year mortality: a randomized clinical trial", Ann Intern Med 142(4), tr 233–239

3 Boca Raton (1995), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 76th ed, CRC Press,tr.8–54

4 Bruneton J (1999), Pharmacognosy and Phytochemistry Medicinal Plants, 2nd edition,Lavoisier Publishing, USA, tr.869-870

5 Centers for Disease Control and Prevention (US), National Center for Chronic DiseasePrevention and Health Promotion (US) và Office on Smoking and Health (US) (2010), "HowTobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-AttributableDisease: A Report of the Surgeon General", Centers for Disease Control and Prevention (US),

8 ICH Harmonised tripartite guiline (2005), Validation of analytical procedures: text andmethodology, chủ biên, tr 1-13

9 HIBBERD và GORROD (1983), "Enzymology of the metabolic pathway from nicotine

to cotinine, in vitro", European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics 8(2), tr.151-162

10 J.W Gorrod và P Jacob III (1999), Analytical Determination of Nicotine and RelatedCompounds and their Metabolites, Elsevier Science B.V., tr.287-288

11 Jerald EE (2007), Text book of Pharmacognosy and Phytochemistry, 1 st edition, SatishKumar Jain for CBS Publisher and distributors, tr.131

12 Jignesh V Patel (2014), Development and validation of analytical methods forestimation of nicotine in nicotine gum tablet, Master of Pharmacy, Ganpat University

13 John D Current "Pharmacology for anesthetists 5: Cholinergics and Anticholinergics",tr.53-54

Trang 40

14 Jorenby DE và các cộng sự (1999), "A controlled trial of sustained-release bupropion,

a nicotine patch, or both for smoking cessation", N Engl J Med 340(9), tr 685-691

15 Kar A (2003), Pharmacognosy and Pharmacobiotechnology, K K Gupta for New AgeInternational (P)Ltd, New Delhi, tr.523

16 KARENA SHAW (2009), Applicant section for drug substance nicotine polacrilex /resinate - prepared by nicobrand limited, chủ biên, tr 1-6

17 Bales Levy D, S, Nguyen T Lam, Nikolayev L., (2006), "The role ofpublic policies inreducing smoking and deaths caused by smoking in Vietnam: Results from the Vietnam tobaccopolicy simulation model", Social Science & Medicine 62, tr 1819–1830

18 Mendham J và các cộng sự (2006), Vogel’s textbook of quantitative chemical analysis,6th edition, Pearson education, London, tr.217-235

19 Neal L Benowitz (2009), "Pharmacology of Nicotine: Addiction, Smoking-InducedDisease, and Therapeutics", Annu Rev Pharmacol Toxicol 49, tr 57-71

20 Parrott S và các cộng sự (1998), Guidance for commissioners on the cost effectiveness

of smoking cessation interventions, Health Educational Authority Thorax, tr.1-38

21 L.A PETERSON và các cộng sự (1987), "Stereochemical studies on the cytochrome

P-450 catalyzed oxidation of (S)-nicotine to the (S)-nicotine D1'(5')- iminium species", Journal

25 Skoog DA, Holler FJ và Nieman TA (1980), Principle of instrumental analysis, 2ndedition, Thomson books cole, Philadelphia, tr.690-698

26 C.D.S TomLin (1994), The Pesticide Manual - World Compendium, 10th ed, Surrey,UK: The British Crop Protection Council, tr.735

27 TURNER và các cộng sự (1975), "Metabolism of nicotine by the isolated perfused doglung", Xenobiotica 5(9), tr 539-551

28 U.S Pharmacopeial Convention (2013), USP Pharmacopeia 36th, CD ROM, tr.4045,8169-8170

29 Wilson DH và các cộng sự (1990), " “Sick of Smoking”: Evaluation of a tagertedminimal smoking cessation intervention in general practice", Med J 152(10), tr 518–521.Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

Định dạng
Số trang	99
Dung lượng	4,13 MB