Xây dựng quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng phương pháp điện di mao quản

- Quy trình phân tách đồng phân tramadol bằng phương pháp điện di mao quản đãđược xây dựng, sử dụng hệ điện ly nền phosphat – tris 50 mM pH 3; tác nhân đối... MỞ ĐẦUBeta-cyclodextrin -C

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC TRAMADOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐIỆN DI MAO QUẢN /2017/HĐ-NCKH

Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Minh Phương

ThS Trần Quốc Thanh

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC TRAMADOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐIỆN DI MAO QUẢN /2017/HĐ-NCKH

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên)

Tp Hồ Chí Minh, 9-2018

Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài

MỤC LỤC

1 MỞ ĐẦU 1

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 TRAMADOL HYDROCLORID 3

2.2 Các công trình tách đồng phân tramadol bằng điện di mao quản 4

3 ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 5

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6

4 KẾT QUẢ 11

4.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA TRAMADOL 11

4.1.1 Khảo sát pH 11

4.1.2 Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền 11

4.1.3 Khảo sát tác nhân đối quang 12

4.2 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA TRAMADOL 13

4.2.1 Tính phù hợp hệ thống 13

4.2.2 Tính đặc hiệu 14

4.2.3 Tính tuyến tính 16

4.2.4 Độ lặp lại 20

4.2.5 Độ đúng 21

5 KẾT LUẬN 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Diện tích pic đƣợc chuẩn hóaĐiện di mao quản vùng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Chất đối chiếu dùng trong nghiên cứu 5

Bảng 3.2 Dung môi hóa chất sử dụng 5

Bảng 4.1 Kết quả tính phù hợp hệ thống 13

Bảng 4.2 Kết quả tính đặc hiệu 15

Bảng 4.3 Kết quả khảo sát sự tương quan giữa tỉ số nồng độ mỗi đồng phân/ epedrin và tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa 17

Bảng 4.4 Kết quả xử lý thống kê 18

Bảng 4.5 Kết quả độ lặp lại 20

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát độ đúng của đồng phân (-) tramadol 21

Bảng 4.7 Kết quả khảo sát độ đúng của đồng phân (+) tramadol 22

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của tramadol hydroclorid 3

Hình 4.1 Đồ thị biểu biễn sự phụ thuộc độ phân giải theo pH dung dịch điện ly nền 11

Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ phân giải theo nồng độ dung dịch điện ly nền 12

Hình 4.3 Điện di đồ của tramadol với các tác nhân đối quang khác nhau 12

Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn độ phân giải theo nồng độ CM-β-CD 13

Hình 4.5 Điện di đồ các mẫu trắng, chuẩn, thử và thử thêm chuẩn 15

Hình 4.6 Điện di đồ các mẫu đối chiếu 16

Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa tỉ số nồng độ đồng phân (-) tramadol/ ephedrin và tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa 17

Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quang giữa tỉ số nồng độ đồng phân(+) Tramadol/ ephedrin và tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa 18

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Xây dựng quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng

phương pháp điện di mao quản

- Mã số:

- Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Minh Phương Điện thoại: 0909810668Email: minhphuongvn80@yahoo.com

- Đơn vị quản lý về chuyên môn (Khoa, Tổ bộ môn): Bộ môn PT-KN, khoa Dược

- Đồng chủ nhiệm đề tài: Trần Quốc Thanh Điện thoại: 0903389214Email: tranquocthanhdhyd@yahoo.com

- Đơn vị quản lý về chuyên môn (Khoa, Tổ bộ môn): Bộ môn Bào chế, khoa Dược

- Thời gian thực hiện: 10/2017 – 10/2018

2 Mục tiêu: Xây dựng quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng

phương pháp điện di mao quản

- Đánh giá quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol

4 Kết quả chính đạt được (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, )

- Quy trình phân tách đồng phân tramadol bằng phương pháp điện di mao quản đãđược xây dựng, sử dụng hệ điện ly nền phosphat – tris 50 mM pH 3; tác nhân đối

quang carboxymethyl-β-CD 5 mg/ ml; điện thế 25 kV; nhiệt độ cột 25 oC; áp suấtbơm mẫu 50 mbar; thời gian bơm mẫu 5s; nội chuẩn ephedrin 50 µg/ ml Kết quảthẩm định cho thấy quy trình phân tách có tính đặc hiệu; khoảng tuyến tính 2,5 –

125 µg/ml cho mỗi đồng phân với hệ số tương quan cao (R > 0,995); độ lặp lại đạt(RSD < 2 %) và độ đúng với tỷ lệ phục hồi 98 - 106%

- Bài báo cáo poster tại hội nghị ASEAN PharmNET 2 2017 Malaysia

1 MỞ ĐẦU

Beta-cyclodextrin (-CD) và các dẫn chất của chúng được sử dụng phổ biến trongcác phương pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di maoquản (CE), làm tác nhân đối quang tách đồng phân quang học (1, 3, 4, 5, 6, 7), đặc biệtđược ứng dụng trong kiểm nghiệm các thuốc chứa hoạt chất có tính quang hoạt Đểphân tách các dược chất quang hoạt cần tác nhân đối quang phù hợp với tính chất củadược chất, đôi khi để phân tách được các dạng đồng phân của một chất còn cần phảiphối hợp nhiều tác nhân quang hoạt với nhau Các thuốc có hoạt chất là dạng đồngphân riêng lẻ xuất hiện ngày càng nhiều trên thị trường dược phẩm trong và ngoàinước do có hoạt tính mạnh và ít tác dụng phụ hơn dạng racemic của chúng như: S-amlodipin, levofloxacin, levocetirizin, esomeprazol, So với một số lượng lớn cácdược chất quang hoạt rất đa dạng về cấu trúc và tính chất đang có mặt trên thị trườnghiện nay thì số lượng các tác nhân quang hoạt được thương mại hóa còn ít, giá thànhcao Chính vì vậy, xu hướng của các nhà nghiên cứu ở các nước hiện nay là tổnghợp nhiều tác nhân tách đồng phân chuyên biệt có tính chọn lọc cao và có giá trịkinh tế (4,6) Gần đây nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tổng hợp được các dẫn chất

methyl--CD (M--CD), methoxycarbonyl--CD (MC--CD) và carboxymethyl-

-CD (CM--CD) Với mong muốn chứng minh hiệu quả của các sản phẩm này trongvai trò làm tác nhân đối quang để phân tách các đồng phân quang học bằng CE, đềtài: “Xây dựng quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng phươngpháp điện di mao quản” đã được thực hiện với mục tiêu xây dựng và thẩm định quytrình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng phương pháp điện di mao quảndùng tác nhân đối quang tự tổng hợp

với các mục tiêu sau:

- Ứng dụng tác nhân đối quang đã tổng hợp được để phân tách đồng phân quanghọc tramadol bằng phương pháp điện di mao quản

- Khảo sát các điều kiện điện di như dung dịch điện ly nền, pH, tác nhân đối quang,dung môi hữu cơ thêm vào dung dịch điện ly nền

- Xây dựng và thẩm định quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằngphương pháp điện di mao quản.

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tramadol được chỉ định trong các chứng đau từ trung bình đến nặng như đau cơ,khớp, đau hậu phẫu, đau do nguyên nhân thần kinh, đau do ung thư.

Tramadol có thể gây ra tác dụng không mong muốn: rối loạn thần kinh – tâm thần(tùy thuộc vào đáp ứng cá thể, thường gặp ở người cao tuổi), có thể gây lẫn lộn, ảogiác, co giật khi sử dụng liều cao hoặc đồng thời với các thuốc làm giảm ngưỡngkích thích gây động kinh Các tác dụng phụ thường gặp nhất là buồn nôn, nôn, buồnngủ, đau đầu, chóng mặt, vã mồ hôi, mệt mỏi, khô miệng, táo bón khi sử dụng kéodài Các phản ứng hiếm gặp hơn bao gồm đau thượng vị, phát ban, suy nhược, giảmthị lực và rối loạn tim mạch Các phản ứng rất hiếm gặp: phản ứng phản vệ (mề đay,phù mạch, co thắt phế quản) đôi khi dẫn đến sốc có thể gây tử vong; rối loạn tiếtniệu (tiểu khó, bí tiểu); rối loạn hô hấp hoặc suy hô hấp nếu sử dụng liều vượt quáliều khuyến cáo, hoặc dùng đồng thời với các thuốc giảm đau khác; lệ thuộc thuốc;hội chứng cai thuốc sau khi sử dụng một thời gian dài, với các triệu chứng kíchđộng, lo âu, căng thẳng, mất ngủ, tăng động, rung rẩy và triệu chứng trên tiêu hóa.Tăng enzym gan được ghi nhận trong một số ca sử dụng tramadol

2.2 Các công trình tách đồng phân tramadol bằng điện di mao quản

- Phương pháp CE: sử dụng cột mao quản silica không bao, đường kính trong

75 µm, chiều dài cột 40 cm (chiều dài hiệu quả 32 cm), dung dịch điện ly nền

phosphat 25 mM, pH 7,0 chứa 2% (kl/ tt) HS-γ-CD, điện thế 10 kV, nhiệt độ cột 20

3 ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng: Thuốc viên nang cứng Tramadol MYLAN (tramadol clohydrat) 50 mg,

số lô30461

Chất đối chiếu:

Bảng 3.1 Chất đối chiếu dùng trong nghiên cứu

Tramadol hydroclorid Ephedrin hydroclorid

Dung môi hóa chất

Bảng 3.2 Dung môi hóa chất sử dụng Tên dung môi/ hóa chất Nguồn gốc

Tris (hydroxymethyl

Acid phosphoric đậm đặc Merck

Kali dihydrophosphat Merck

- Cân phân tích Satorius

- Máy đo pH Neomet 240 L

- Bể siêu âm Brason

- Máy quang phổ UV- Vis Shimadzu MPC – 2200

- Máy điện di mao quản đầu dò DAD Agilent CE 7100 (Đức)

- Cột mao quản silica nung chảy chiều dài 56 cm, chiều dài hiệu lực 50 cm, đườngkính trong 50 µm

- Màng lọc PTFE 0,22 µm

- Các dụng cụ thường quy trong phòng thí nghiệm: pipet khắc vạch, pipet chínhxác, phễu lọc, bình định mức, becher…

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu

Dung dịch đối chiếu gốc tramadol hydroclorid 1000 µg/ ml

Cân chính xác 100 mg ephedrin hydroclorid chuẩn cho vào bình định mức 100 ml.Thêm 60 ml methanol Siêu âm cho tan hoàn toàn Bổ sung methanol đến vạch, lắcđều.

Dung dịch đối chiếu tramadol hydroclorid 50 µg/ ml (có nội chuẩn)

Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc tramadol hydroclorid và 1 ml dung dịchchuẩn gốc ephedrin hydroclorid 1000 µg/ ml cho vào bình định mức 20 ml Thêmnước khử khoáng vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc milipore 0,2 µm

Dung dịch thử tramadol hydroclorid 1000 µg/ ml

Cân 100 mg tramadol hydroclorid nguyên liệu cho vào bình định mức 100 ml.Thêm 60 ml methanol Siêu âm cho tan hoàn toàn Bổ sung methanol đến vạch, lắcđều

Dung dịch thử tramadol hydroclorid 50 µg/ ml (có nội chuẩn)

Hút chính xác 1 ml dung dịch thử tramadol hydroclorid 1000 µg/ ml và 1 ml dungdịch chuẩn gốc ephedrin hydroclorid 1000 µg/ ml cho vào bình định mức 20 ml.Thêm nước khử khoáng vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc milipore 0,2µm

Dung dịch acid phosphoric 0,5 M

Hút chính xác 5 ml dung dịch acid phosphoric đậm đặc cho vào bình định mức 100

ml Thêm nước khử khoáng vừa đủ đến vạch, lắc đều

Dung dịch tris 0,5 M

Cân chính xác 3,0285 g tris cho vào bình định mức 50 ml Thêm nước khử khoáng,lắc cho tan hoàn toàn Bổ sung nước khử khoáng đến vạch, lắc đều

Dung dịch điện ly nền phosphat – tris 50 mM pH 3

Hút chính xác 5 ml dung dịch acid phosphoric 0,5 M cho vào bình định mức 50 ml.Thêm nước khử khoáng đến vạch, lắc đều Chỉnh pH đến 3 bằng dung dịch tris 0,5

M Lọc qua giấy lọc thường Dùng dung dịch điện ly nền để pha dung dịch có chứatác nhân đối quang với nồng độ khảo sát, lọc qua màng lọc milipore 0,2 µm.

Giữa các lần tiêm mẫu, rửa cột bằng nước trong 5 phút, dung dịch đệm 15 phút

3.2.3 Khảo sát điều kiện phân tách đồng phân quang học tramadol

3.2.3.1 Điều kiện cố định

Quá trình điện di được tiến hành trên cột mao quản silica nung chảy, đường kínhtrong 50 µm, chiều dài tổng cộng 56 cm, chiều dài hiệu quả 50 cm

Cài đặt nhiệt độ mao quản 25 oC, điện thế 25 kV

Tiêm mẫu bằng chương trình áp suất 50 mbar × 5 giây

Bước sóng phát hiện: bước sóng hấp thu cực đại của tramadol

3.2.3.2 Điều kiện khảo sát

Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tách đồngphân như: dung dịch điện ly nền: phosphat – tris, kali dihydrophosphat; pH 2 – 6;

tác nhân đối quang: M-β-CD, HP-β-CD, CM-β-CD, MC-β-CD; nồng độ tác nhân

đối quang: 3 – 10 mg/ml.Điều kiện điện di được chọn phải có đáp ứng đầu dò cao,

3.2.4.1 Khảo sát tính phù hợp hệ thống

Bơm lần lượt 6 lần dung dịch đối chiếu vào máy điện di mao quản, tiến hành điện divới điều kiện được lựa chọn Tính phù hợp hệ thống được xác định dựa trên giá trị

và độ lặp lại các thông số

 Tỉ số thời gian lưu tM của chuẩn so với chuẩn nội

 Tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa CorrArea của chuẩn so với chuẩn nội

Quy trình đạt tính phù hợp hệ thống khi:

 Tỉ số thời gian lưu tM của chuẩn so với chuẩn nội có RSD ≤ 2,0 %

 Tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa CorrArea của chuẩn so với chuẩn nội có RSD ≤2,0 %

3.2.4.2 Xác định tính đặc hiệu

Bơm dung dịch đối chiếu, dung dịch thử, dung dịch thử thêm chất đối chiếu và mẫutrắng vào máy điện di mao quản Tiến hành điện di

Quy trình đạt tính đặc hiệu khi:

Tỉ số thời gian lưu của mẫu thử so với chuẩn nội và tỉ số thời gian lưu so với chuẩnnội của mẫu thử thêm chất đối chiếu phải tương đương so với tỉ số thời gian lưu sovới chuẩn nội của mẫu đối chiếu

Điện di đồ mẫu trắng không được có đỉnh trùng với đỉnh của mẫu đối chiếu

Diện tích đỉnh chuẩn hóa, chiều cao của đỉnh của dung dịch thử thêm chất đối chiếuphải tăng lên so với mẫu thử

3.2.4.4 Xác định khoảng tuyến tính

Bơm 6 dung dịch chuẩn có nồng độ tramadol tương ứng là 5 µg/ ml, 10 µg/ ml, 20µg/ ml, 50 µg/ ml, 100 µg/ ml, 250 µg/ ml và nồng độ ephedrin trong mỗi dung dịchtrên là 50 µg/ ml Mỗi dung dịch bơm 1 lần Ghi nhận giá trị diện tích đỉnh chuẩnhóa và tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa của từng đồng phân so với ephedrin trong mỗimẫu Dùng phần mềm Excel để vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỉ

số nồng độ mỗi đồng phân so với chuẩn nội ephedrin và tỉ số diện tích đỉnh chuẩnhóa của mỗi đồng phân so với ephedrin Thiết lập phương trình hồi quy thể hiệnmối tương quan tuyến tính cho 2 đồng phân Dùng trắc nghiệm F (Fisher) và trắcnghiệm t (Student) kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy và ý nghĩacác các hệ số trong phương trình, tính giá trị R2 Từ đó đánh giá tính tuyến tính vớiyêu cầu R2 ≥ 0,995

3.2.4.5 Khảo sát độ đúng

Khảo sát độ đúng được tiến hành theo phương pháp mẫu thử thêm chuẩn

Thêm chất đối chiếu tương ứng với 3 mức nồng độ 80%, 100%, 120 % so với nồng

độ đo được của mẫu thử Tiến hành đo 3 nồng độ mẫu thử thêm chuẩn, mỗi nồng độ

đo 3 lần Xác định tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa, tính hàm lượng tổng cộng tìmthấy, suy ra hàm lượng chất đối chiếu tìm thấy, từ đó tính tỷ lệ phục hồi Tỷ lệ phụchồi ở mỗi mức nồng độ phải đáp ứng ở mức giới hạn cho phép

để tách đồng phân tramadol.

Hình 4.1 Đồ thị biểu biễn sự phụ thuộc độ phân giải theo pH dung dịch điện ly nền

4.1.2 Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền

Kết quả khảo sát cho thấy, độ phân giải tăng lên trong khoảng nồng độ dung dịchđiện ly nền từ 20 – 50 mM và giảm nhẹ trong khoảng 50 – 60 mM Độ phân giải ởnồng độ dung dịch điện ly nền 50 mM là cao nhất.Chọn dung dịch điện ly nềnphosphat- tris 50 mM pH 3 làm điều kiện phân tách đồng phân tramadol

Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ phân giải theo nồng độ dung dịch

điện ly nền

4.1.3 Khảo sát tác nhân đối quang

Dung dịch đối chiếu và dung dịch điện ly nền đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 3.2.1

Các điều kiện điện di khác nhƣ pH, dung dịch đệm, điện thế, nhiệt độ cột mao quảnđƣợc cố định Khảo sát khả năng tách đồng phân tramadol của các loại tác nhân đốiquang M-β-CD, HP-β-CD, MC-β-CD, CM-β-CD ở nồng độ khảo sát 5 mg/ ml Kếtquả khảo sát đƣợc thể hiện ở hình 4.3

Nồng độ BGE

HP-β-M-β- MC-β-CD CM-β-CD

4.1.3.1 Khảo sát nồng độ tác nhân đối quang

Khảo sát độ phân giải của đồng phân tramadol trong các dung dịch điện ly nềnphosphat – tris 50 mM pH 3 chứa các nồng độ CM-β-CD 3 mg/ ml, 5 mg/ ml, 7 mg/

ml, 10 mg/ ml

Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn độ phân giải theo nồng độ CM-β-CD.

Nhận xét: Với nồng đồ 3 mg/ ml, độ phân giải nhỏ hơn 1,5 Ở các nồng độ 5, 7, 10mg/ ml, độ phân giải đều đạt trên 1,5 Tuy nhiên ở nồng độ 5 mg/ ml có độ phân

giải cao nhất (2,69) Khi nồng độ CM-β-CD tăng lên, hiện tƣợng kéo đuôi của pic

càng nhiều

Kết luận: Chọn nồng độ CM-β-CD 5 mg/ ml làm điều kiện tách đồng phân.

4.2 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA TRAMADOL