BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠ
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT CỦA THỔ PHỤC LINH
(SMILAX GLABRA ROXB LILIACEAE)
Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương
Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT CỦA THỔ PHỤC LINH
(SMILAX GLABRA ROXB LILIACEAE)
Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương
Ký tên
Thành phố Hồ Chí Minh – 2019
Trang 3MỤC LỤC
I ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1
II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 1
2.1 Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất và dụng cụ nghiên cứu…… 1
2.2 Phương pháp nghiên cứu……….2
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……….4
3.1 Chiết xuất và phân tách các phân đoạn………4
3.2 Phân lập tủa EA………7
3.3 Phân lập cao EA trên SKC nhanh và HPLC………7
3.4 Xác định độ tinh khiết các chất phân lập được………8
3.5 Xác định cấu trúc……… 10
III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 19
IV TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 20
Trang 4I ĐẶT VẤN ĐỀ:
Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác
nhau không chỉ ở Việt Nam mà còn nhiều nước trên thế giới, nhất là khu vực châu Á
để làm thuốc chữa giang mai, đau xương, lợi tiểu, giải độc cơ thể, đặc biệt là nhiềubệnh liên quan tới viêm như: viêm gan, viêm thận, viêm da, chàm [10], [13], [53].Mặc dù được dùng rộng rãi tuy nhiên ở Việt Nam, đến nay vẫn chưa có nhiềunghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Thổ phục linh Để bổ
sung cơ sở khoa học, làm sáng tỏ tác dụng của Thổ phục linh, đề tài “Nghiên cứu
phân lập một vài hợp chất trong phân đoạn ethyl acetat của Thổ phục linh
Smilax glabra Roxb., Smilacaceae” được tiến hành với các nội dung sau:
- Thu mẫu và nghiên cứu thành phần hóa thực vật
- Chiết xuất hoạt chất toàn phần bằng EtOH
- Phân tách cao cồn thành các phân đoạn đơn giản
- Phân lập một vài hợp chất trong phân đọan EtOAc
II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất và dụng cụ nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
Phần thân rễ Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) được thu hái và định danh Dược
liệu được phơi hoặc sấy ở 50 – 70 oC đến khô Xay thành bột thô
2.1.2 Nguyên liệu, dung môi, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
- Dung môi: cồn 96%, methanol, n-hxan, chloroform, ethylacetat, ether dầu hỏa đạt
tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (AR)
2.1.3 Dụng cụ trang thiết bị:
- Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire
C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6 mm; 5 µm)
- SKLM dùng bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Art 1.05554)
- SKC dùng silica gel hạt vừa (Trung Quốc), cỡ hạt 40- 63µm và silica gel hạt mịn(Merck) cỡ hạt 15- 40µm)
Máy cô quay Buchi R300 (Nhật Bản) Bể siêu âm Ultrasonic Bath (Đức) Tủ sấyGallentkamp (Anh) Nồi cách thủy Memmert WB-14 (Đức) Cột sắc ký và các dụng
Trang 5cụ thí nghiệm thông thường trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược liệu vàPhòng nghiên cứu hóa các hợp chất tự nhiên thuộc Trung tâm Đào tạo và nghiêncứu phát triển thuốc nguồn gốc tự nhiên – ĐH Y Dược Tp HCM.
- Máy đo khối phổ (Micromass Quattro microTM API – Waters)
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) BRUKER - AV - 500, tại Viện hóahọc thuộc Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam - Hà nội
- Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire
C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6 mm; 5 µm)
- Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng trênmáy HPLC
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Thu hái định danh mẫu: khảo sát đặc điểm hình thái, định danh mẫu, lưu mẫu tại
Bộ môn Dược liệu – khoa Dược – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
2.2.1 Xác định độ tinh khiết
- Xác định độ ẩm: Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.6, PL-182
- Xác định tro toàn phần và tro không tan trong HCl: Thực hiện theo Dược điển
Việt Nam IV, phụ lục 9.8 và phụ lục 9.7., phương pháp 1
2.2.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật: Theo phương pháp Ciuley cải tiến2.2.3 Chiết xuất và phân tách các phân đoạn
- Chiết xuất: bột rễ Thổ phục linh được chiết ngấm kiệt với cồn, thu hồi dung môi
để được cao lỏng Lắc phân bố cao lỏng với các dung môi có tính phân cực tăng dầnlần lượt là n-hexan, CHCl3, ethyl acetat, n-BuOH và phần còn lại không phân bố
vào các dung môi trên Bay hơi dung môi để thu được các cao tương ứng
- Kiểm tra cao chiết trên SKLM
2.2.4 Phân lập, kết tinh và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký
Trang 6- Pha tĩnh: silica gel hạt trung bình: (40-63 µm, Merck), khối lượng: 1000 g.
- Mẫu: 45 g cao EtOAc.
- Dung môi khai triển: ethyl acetat-methanol Tăng dần tỉ lệ methanol từ 0% - 15%.
- Thể tích mỗi lọ hứng: 80 ml
- Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM, hệ dung môi: ethyl acetat–methanol–acid acetic 9:0,5:0,5
- Kiểm tra và gộp các phân đoạn: hứng các phân đoạn, kiểm tra trên SKLM, phát hiện
bằng đèn UV 254 nm, UV 365 nm và TT VS Các phân đoạn gần giống nhau được gộpchung lại, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (cô quay chân không)
2.2.4.3 Phân lập bằng HPLC
Điều kiện SK:
- Hệ thống sắc ký: máy sắc ký điều chế Waters 2767, đầu dò PDA 2996
- Cột sắc ký: cột bán điều chế Sunfire C18 (10 x 150 mm; 5 μm) và tiền cột C18 (10
- Pha động: nước (A) - methanol (B).
- Chương trình rửa giải: nước - methanol (55 : 45) trong thời gian 22 phút.
Trang 7- Tinh chế: Các phân đoạn sau khi cô quay được kết tinh hay kết tinh phân đoạn
trong lượng tối thiểu dung môi thích hợp (có gia nhiệt) Kiểm tra chất kết tinh trênSKLM với ít nhất 2 hệ dung môi khác nhau
2.2.5 Kiểm tra độ tinh khiết:
2.2.21 Kiểm tra độ tinh khiết trên SKLM
- Thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn với các hệ dung môi sau:
- Cloroform-methanol-acid acetic (8:1,5:0,5)
- Ethyl acetat-methanol-acid acetic (9:0,5:0,5)
- n-Butanol-methanol (8:2)
2.2.5.2 Kiểm tra độ tinh khiết trên UPLC
- Mẫu được pha trong dung môi methanol, nồng độ 0,1 mg/ml.
- Thiết bị sắc ký: Máy UPLC ACQUITY HCLASS - Waters, đầu dò PDA 2998 Cột
UPLC BEH C18 1,7 µm; 2,1 × 5 mm Nhiệt độ cột: 25 o C.
- Thể tích tiêm: 2 µl Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút.
- Pha động: acid formic 0,1% - MeOH (tỉ lệ khởi đầu 95:5 đến kết thúc 0:100).
- Thời gian phân tích: 60 phút với mẫu SG01 và SG05, 30 phút với SG02
2.2.6 Xác định cấu trúc các chất phân lập
Chất tinh khiết được phân tích bằng phương pháp phổ khối (MS), HPLC-PDA,NMR, so sánh đối chiếu với các dữ liệu về phổ NMR, MS của các chất tương tự đãcông bố trong tài liệu
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy BRUKER – AV – 500, tạiViện hóa học thuộc Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam – Hà nội Mẫuđược hòa tan trong CD3OD hoặc CD3COCD3 với TMS là chất chuẩn nội Phổproton (1H-NMR) được đo ở 500 MHz, phổ carbon (13C-NMR) được đo ở 125
MHz Độ dịch chuyển hóa học được tính theo thang ppm (δTMS = 0) với chuẩn là tínhiệu của TMS Các hằng số ghép (J) tính bằng Hertz (Hz)
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Chiết xuất và phân tách các phân đoạn
9 kg dược liệu được chiết ngấm kiệt bằng cồn 96%, thu hồi dung môi để được caolỏng và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm:
Trang 8ether dầu hỏa, CHCl3, EtOAc, n-butanol và phần còn lại không tan vào 4 dung môitrên Cô thu hồi dung và thu được các cao tương ứng.
Với phân đoạn EtOAc, khi thu bớt dung môi, để nguội có xuất hiện tủa, lọc lấyriêng tủa (gọi là tủa EA), phần dịch lọc cô đến cao để cho ra cao EA
Với phân đoạn không tan vào 4 dung môi trên, bay hơi bớt dung môi và để nguội cóxuất hiện tủa, lọc lấy tủa (gọi là tủa N1) Dịch lọc cô đến cao, gọi là cao N2 Kếtquả chiết xuất và phân lập đựơc trình bày trong sơ Bảng 3.1 và Hình 3.1
Bảng 0.1 Các cao phân đoạn Thổ phục linh
Trang 9Hình 0.1 Sơ đồ chiết xuất và phân bố cao cồn 96%
Trang 103.3 Phân lập cao EA trên SKC nhanh và HPLC.
Tiến hành với điều kiện như trong phần Phương pháp nghiên cứu Kết quả thu được
5 phân đoạn, trong đó phân đoạn 2 khi cô dung môi có xuất hiện tủa, lọc lấy tủa(500 mg) Kiểm tra tủa cho thấy chưa phải là chất tinh khiết nên phân lập tiếp trênHPLC điều chế với điều kiện sắc ký như sau:
- Hệ thống sắc ký: máy sắc ký điều chế Waters 2767, đầu dò PDA 2996
- Cột sắc ký: cột bán điều chế Sunfire C18 (10 x 150 mm; 5 μm) và tiền cột C18 (10
- Pha động: nước (A) - methanol (B)
- Chương trình chạy: isocratic nước - methanol (55 : 45) trong 22 phút
Tiến hành chạy nhiều lần trên cột HPLC điều chế trong cùng điều kiện Dịch thuđược, cô bớt dung môi, đông khô và kết tinh lại, thu được 12 mg hợp chất đặt tên làSG02 và 15 mg hợp chất SG05
Trang 113.4 Xác định độ tinh khiết các chất phân lập được
• Kiểm tra độ tinh khiết của SG01, SG02 và SG05 trên SKLM với 3 hệ dung môi sau:
• Kiểm tra độ tinh khiết trên UPLC
- Mẫu được pha trong dung môi methanol, nồng độ 0,1 mg/ml
- Thiết bị sắc ký: Máy UPLC ACQUITY HCLASS - Waters, đầu dò PDA 2998.
Cột UPLC BEH C18 1,7 µm; 2,1 × 5 mm Nhiệt độ cột: 25 oC
- Thể tích tiêm: 2 µl Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút
- Pha động: acid formic 0,1% - MeOH (tỉ lệ khởi đầu 95:5 đến kết thúc 0:100)
- Thời gian phân tích: 60 phút với mẫu SG01 và SG05, 30 phút với SG02
- Thời gian lưu và độ tinh khiết của SG01 như Hình 3.9 và Bảng 3.17
Hình 0.2 Sắc ký đồ SG01 trên UPLC
Trang 14- Phổ MS: Trên phổ MS (ESI+), SG1 cho phân mảnh chính [M+Na] với m/z 473,1tương ứng với phân tử khối là 450 đvC.
Hình 3.6 Phổ MS của SG01
- Phổ NMR
Phổ 13C-NMR (PL-2) kết hợp phổ DEPT (PL-3): có 21 tín hiệu cacbon, trong đó có
8 cacbon bậc IV, 12 cacbon methin (-CH) và 1 nhóm methyl (-CH3) 12 tín hiệu củavòng benzen nằm trong vùng C 96,2 – 168,6 ppm; nhóm cacbonyl (C=O) ở C
195,9 ppm và 2 nhóm oxymethin ở C 83,9 và 78,5 ppm, dự báo khung cấu trúc
flavonoid (C6-C3)-C6 Bên cạnh đó cũng thấy dấu hiệu của đường rhamnose (1nhóm methyl ở vùng trường cao C 17,8 ppm, 4 carbon CH-O quanh C 70 ppm, 1
carbon anome ở C 102,1 ppm chỉ ra C-1” của đường bị glycosid hóa).
Trên phổ proton 1H-NMR (PL-1) của SG01, kết hợp với phổ COSY (PL-6), HSQC(PL-4): có sự hiện diện của 5 proton của 2 vòng benzen Tín hiệu proton benzen tại
δH 5,94 ppm (d; J = 2,5 Hz) ghép cặp meta với proton benzen tại δH 5,92 ppm (d; J
= 2 Hz) Tín hiệu proton benzen tại δH 6,87 ppm (dd J =2 và 8 Hz) ghép cặp meta với proton benzen δH 4,08 ppm (d; J = 1,5 Hz) và ghép cặp ortho với proton benzen
tại δH 46,83 ppm (d J = 8 Hz) Tín hiệu của các proton H-2, H-3 là các doudlet ở δH
5,09 ppm (d, J = 10,5; 1H) và δH 4,59 ppm (d, J = 11 Hz), với hằng số tương tác lớn
thể hiện 2 proton này ở vị trí khác phía so với mặt phẳng phân tử H-1” trên HMBC(PL-5) quan sát thấy C-3, do đó đường đã tạo liên kết glycosid với OH tại C-3; H-
1” J = 1,5 Hz, hằng số tương tác nhỏ chứng tỏ H-1” và H-2” là liên kết equatorial
còn OH-1” và OH-2” là liên kết axial Cũng trên HMBC, H-2’ và H-6’ quan sátthấy C-2, do đó vòng B gắn vào C-2 Từ thực nghiệm đối chiếu tài liệu tham khảo,
Trang 15Hình 0.7 Cấu trúc SG01
Bảng 0.7 Các dữ liệu phổ NMR của SG01 SG01
(CD 3 OD, 500 MHz)
Astilbin (CD 3 OD, 500 MHz) [43]
Trang 17cacbonyl (-C=O) ở C 192,8 ppm và 2 nhóm oxymethin ở C 80 và 73 ppm, dự báo
khung cấu trúc flavonoid (C6-C3)-C6 2 tín hiệu carbon đối xứng cách nhau 13,6
ppm, thể hiện vòng B chỉ có 1 nhóm thế Bên cạnh đó cũng thấy dấu hiệu của đường
rhamnose (1 nhóm methyl ở vùng trường cao C 17,6 ppm, 4 carbon CH-O quanh
C 70 ppm, 1 carbon anome ở C 98,5 ppm chỉ ra C-1” của đường bị glycosid hóa).
Trên phổ proton 1H-NMR (PL-7) của SG02, kết hợp với phổ COSY (PL-12),HSQC (PL-10): có sự hiện diện của 6 proton của 2 vòng benzen Tín hiệu protonbenzen tại δH 5,95 ppm (d; J = 2 Hz) ghép cặp meta với proton benzen tại δH 5,92
ppm (d; J = 2 Hz) Tín hiệu 2 proton benzen tại δH 6,75 ppm (d J =2 Hz; 2H) ghép cặp meta với proton benzen δH 7,25 ppm (d; J = 2Hz; 2H) Tín hiệu của các proton
H-2, H-3 là các doudlet ở δH 5,61 ppm (d, J = 10,5; 1H) và δH 4,17 ppm (d, J = 11
Hz), với hằng số tương tác bé thể hiện 2 proton này ở vị trí cùng phía so với mặtphẳng phân tử H-1” trên HMBC (PL-11) quan sát thấy C-3, do đó đường đã tạo
liên kết glycosid với OH tại C-3; H-1” J = 1,5 Hz, hằng số tương tác nhỏ chứng tỏ
H-1” và H-2” là liên kết equatorial còn OH-1” và OH-2” là liên kết axial Cũng trênHMBC, H-2’ và H-6’ quan sát thấy C-2, do đó vòng B gắn vào C-2 Từ thựcnghiệm, đối chiếu tài liệu tham khảo [26], [46], xác định được SG02 là isoengeletin
Trang 18Hình 0.10 Cấu trúc SG02
Bảng 0.8 Phổ NMR của SG02 SG02
Trang 20- Phổ NMR
Phổ 13C-NMR (PL-14) kết hợp phổ DEPT (PL-15): có 21 tín hiệu cacbon, trong đó
có 8 cacbon bậc IV, 12 cacbon methin (-CH) và 1 nhóm methyl (-CH3) 12 tín hiệucủa vòng benzen nằm trong vùng C 95,1 – 167,04 ppm; nhóm cacbonyl (C=O) ở C
193,05 ppm và 2 nhóm oxymethin ở C 73,3 và 79,9 ppm, dự báo khung cấu trúc
flavonoid (C6-C3)-C6 Bên cạnh đó cũng thấy dấu hiệu của đường rhamnose (1nhóm methyl ở vùng trường cao C 17,5 ppm, 4 carbon CH-O quanh C 70 ppm, 1
carbon anome ở C 98,8 ppm chỉ ra C-1” của đường bị glycosid hóa).
Trên phổ proton 1H-NMR (PL-13) của SG02, kết hợp với phổ HSQC (16): có sựhiện diện của 5 proton của 2 vòng benzen Tín hiệu proton benzen tại δH 5,94 ppm (d; J = 2 Hz) ghép cặp meta với proton benzen tại δH 5,91 ppm (d; J = 2 Hz) Tín
hiệu proton benzen tại δH 6,73 ppm (dd J =2 và 8 Hz) ghép cặp meta với proton benzen δH 4,75 ppm (d; J = 1,5 Hz) và ghép cặp ortho với proton benzen tại δH 6,71
ppm (d J = 8,5 Hz) Tín hiệu của các proton H-2, H-3 là các doudlet ở δH 5,54 ppm (d, J = 2,5 Hz) và δH 4,21 ppm (d, J = 2,5 Hz), với hằng số tương tác bé thể hiện 2
proton này ở vị trí cùng phía so với mặt phẳng phân tử H-1” trên HMBC (PL-17)
quan sát thấy C-3, do đó đường đã tạo liên kết glycosid với OH tại C-3; H-1” J =
1,5 Hz, hằng số tương tác nhỏ chứng tỏ H-1” và H-2” là liên kết equatorial còn 1” và OH-2” là liên kết axial Cũng trên HMBC, H-2’ và H-6’ quan sát thấy C-2, do
OH-đó vòng B gắn vào C-2 Từ thực nghiệm đối chiếu với tài liệu tham khảo, xác địnhđược SG05 là isoastilbin
Trang 22IV KẾT LUẬN
Đề tài đã đạt được các kết quả sau:
- Sơ bộ thành phần hóa học, xác định thân rễ Thổ phục linh có chứa các triterpenoid tự
do, flavonoid, saponin, acid hữu cơ và chất khử
- Từ 9 kg dược liệu chiết xuất bằng cồn 96% phân lập được 3 chất tinh khiết: SG01(astilbin, 20 mg), SG02 (isoengeletin, 12 mg) và SG05 (isoastilbin, 15 mg) 3 chất trên đãđược báo cáo trong các công trình nghiên cứu của nước ngoài nhưng isoengeletin vàisoastilbin lần đầu tiên được báo cáo trong nước từ cây Thổ phục linh ở Lâm Đồng