Khảo sát tỉ lệ hla b 5801 trên bệnh nhân dị ứng da do điều trị bằng allopurinol

Tỷ lệ mang gien HLA-B*58:01 và mối liên hệ với dị ứng da nặng trong các nghiên cứu tương tự trên thế giới.. Tỷ lệ mang gien HLA-B*58:01 và mối liên hệ với dị ứng nặng và nhẹ trong các ng

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

KHẢO SÁT TỈ LỆ HLA-B*5801 TRÊN BỆNH NHÂN

DỊ ỨNG DA DO ĐIỀU TRỊ BẰNG ALLOPURINOL

Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Bộ môn Sinh lý-Sinh lý bệnh Miễn dịch, Khoa Y Chủ trì nhiệm vụ: TS MAI PHƯƠNG THẢO - TS ĐỖ ĐỨC MINH

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

KHẢO SÁT TỈ LỆ HLA-B*5801 TRÊN BỆNH NHÂN

DỊ ỨNG DA DO ĐIỀU TRỊ BẰNG ALLOPURINOL

Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Bộ môn Sinh lý-Sinh lý bệnh Miễn dịch, Khoa Y Chủ trì nhiệm vụ: TS MAI PHƯƠNG THẢO - TS ĐỖ ĐỨC MINH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2019

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu:

STT Họ và tên Chuyên ngành Cơ quan công tác

Thạch

3 Lê Gia Hoàng Linh Y sinh học phân tử ĐH Y Dược TP.HCM

Nơi thực hiện đề tài: Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh

MỤC LỤC

Bảng chữ viết tắt 4

Danh mục bảng 5

Danh mục hình và biểu đồ 6

ĐẶT VẤN ĐỀ 8

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1.1 Bệnh gout 10

1.2 Dị ứng da do thuốc 13

1.3 Biến thể HLA-B*58:01 18

1.4 Tình hình nghiên cứu về HLA-B*58:01 21

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp phân tích gien 27

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 31

2.5 Y đức 32

Chương 3 KẾT QUẢ 33

3.1 Tỷ lệ mang gien HLA-B*58:01 34

3.2 Mối liên hệ giữa kiểu gien HLA-B*58:01 và các dạng dị ứng da do allopurinol 35

Chương 4 BÀN LUẬN 37

4.1 Tỷ lệ mang gien và mối liên hệ giữa kiểu gien HLA-B*58:01 và các dạng dị ứng da do allopurinol 38

4.2 Giá trị chẩn đoán và ứng dụng lâm sàng 42

KẾT LUẬN 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

CI Confidence interval - Khoảng tin cậy

DiHS Druginduced hypersensitivity syndrome

-Hội chứng quá mẫn cảm do thuốc

DIP Drug-induced pruritus - Ngứa do thuốc

DRESS Drug reaction with eosinophila & systemic symptoms

-Phản ứng da do thuốc tăng eosinophil và triệu chứng toàn thân

HLA Human leukocyte antigen - Kháng nguyên bạch cầu ở người

MPE Maculopapular exanthema - Phát ban dạng dát sẩn

OR Odds ratio - Tỷ số odds (tỷ số số chênh)

PCR Polymerase chain reaction

SJS Stevens-Johnson syndrome - Hội chứng Stevens-Johnson

SSP PCRsequence specific primers

-Kỹ thuật PCR sử dụng mồi đặc hiệu

TCR T-cell receptor - Thụ thể tế bào T

TEN Toxic epidermal necrolysis - Hoại tử thượng bì độc tính

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các thuốc thử trong bộ kit PG5801 29

Bảng 3.1 Tỷ lệ mang gien HLA-B*58:01 trong mẫu nghiên cứu 34

Bảng 3.2 Mối liên hệ giữa kiểu gien HLA-B*58:01 và các dạng dị ứng da 35

Bảng 3.3 Các giá trị chẩn đoán của kiểu gien HLA-B*58:01 đối với dị ứng da

nặng do allopurinol 35

Bảng 4.1 Tỷ lệ mang gien HLA-B*58:01 trong dân số chung và trong nhóm

dung nạp thuộc các chủng tộc khác nhau 38

Bảng 4.2 Tỷ lệ mang gien HLA-B*58:01 và mối liên hệ với dị ứng da nặng

trong các nghiên cứu tương tự trên thế giới 40

Bảng 4.3 Tỷ lệ mang gien HLA-B*58:01 và mối liên hệ với dị ứng nặng và

nhẹ trong các nghiên cứu tương tự trên thế giới 41

Bảng 4.4 Giá trị chẩn đoán của kiểu gien HLA-B*58:01 đối với dị ứng nặng

do allopurinol trong các nghiên cứu trên thế giới 43

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ mang gien HLA-B*58:01 của các nhóm khảo sát 34

Hình 1.1: Sơ đồ tóm tắt quá trình thoái giáng purine thành acid uric, và cơ chếtác động của các thuốc hạ acid uric máu (Nguồn: [16]) 12

Hình 2.2: Minh họa chức năng trình diện kháng nguyên cho tế bào T của phân

tử HLA lớp I và lớp II (Nguồn: [21]) 15

Hình 2.3: Minh họa cấu tạo của phân tử HLA lớp I (Nguồn: [21]) 15

Hình 2.4: Hình ảnh minh họa cho sự liên kết đặc hiệu TCR-HLA theo cơ chế

hapten (A) và cơ chế p-i (B) (Nguồn: [28]) 16

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các bước tiến hành nghiên cứu 26

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí các giếng của bộ kit PG5801 (Nguồn: [26]) 29

Hình 2.6 Hệ thống máy PCR (bên trái) và buồng thao tác (bên phải) dùng

trong phân tích kiểu gien HLA-B*58:01 (ảnh chụp thực tế) 30

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt các phân nhóm trong mẫu nghiên cứu 33

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

1 Thông tin chung:

 Tên đề tài: KHẢO SÁT TỈ LỆ HLA-B*5801 TRÊN BỆNH NHÂN DỊỨNG DA DO ĐIỀU TRỊ BẰNG ALLOPURINOL

 Thời gian thực hiện: từ 02/7/2018 đến 1/7/2019

2 Mục tiêu: Đánh giá tính khả thi của việc khảo sát HLA-B*5801 cho bệnh

nhân trước khi chỉ định điều trị bằng allopurinol nhằm giảm nguy cơ phảnứng nặng trên da

và tỷ lệ tử vong từ 25 đến 30% [3], [8], [12], [30].

Tác giả Hung (2005) đã tìm ra mối liên quan chặt chẽ giữa dị ứng danặng do allopurinol và gien HLA-B*58:01 trên người Đài Loan [13] Cụ thể,100% bệnh nhân dị ứng nặng có mang gien HLA-B*58:01, trong khi tỷ lệ này

ở nhóm dung nạp chỉ là 15% (OR 580,3) [13] Các nghiên cứu tiến hành sau

đó trên người Trung Quốc, Hồng Kông, Hàn Quốc và Thái Lan đều cho kếtquả tương tự (OR 97,8 - 348,3), và tỷ lệ mang gien trong dân số chung từ 8đến 20% [5], [8], [15], [36] Trong khi đó, nghiên cứu thực hiện trên ngườiNhật Bản và châu Âu lại cho tỷ lệ mang gien trong nhóm dị ứng da nặng thấphơn (dưới 60%), mối liên hệ yếu hơn (OR 40,8 - 80), và tỷ lệ gien trong dân

số chung cũng thấp hơn (dưới 2%) [9], [11], [16], [22], [37]

Hiện nay, việc tầm soát gien HLA-B*58:01 trước khi kê toa allopurinolnhằm dự phòng dị ứng da nặng vẫn chưa được thống nhất Hội Thấp học Hoa

Kỳ (ACR) năm 2012 khuyến cáo nên thực hiện tầm soát gien này trên một sốchủng tộc nguy cơ cao, gồm người Hán, Hàn Quốc và Thái Lan [17]

Tại Việt Nam, tác giả Đỗ Thị Quỳnh Nga (2015) khảo sát 22 trường hợp

cho tỷ lệ mang gien lần lượt là 95,5% và 18,7% (OR 91) [1] Kết quả nàybước đầu gợi ý Việt Nam thuộc nhóm chủng tộc châu Á nguy cơ cao, và cókhả năng việc tầm soát gien HLA-B*58:01 nhằm dự phòng dị ứng da nặng làhiệu quả và cần thiết.

Trong khi đó, hiện chưa có nghiên cứu tập trung đánh giá nguy cơ dị ứngtrên bệnh nhân gout đang điều trị với allopurinol tại Việt Nam, mặc dù ngườiViệt có nhiều đặc điểm di truyền tương đồng với người Hán và người Thái.Mặt khác, cũng chưa có nghiên cứu nào khảo sát mối liên hệ giữaHLA*B58:01 và dị ứng da nhẹ tại Việt Nam Do đó, chúng tôi thực hiệnnghiên cứu này nhằm khảo sát tỷ lệ kiểu gien HLA-B*58:01 trên đối tượngbệnh nhân gout điều trị với allopurinol, và mối liên hệ của kiểu gien này vớicác phản ứng dị ứng da mức độ nhẹ và nặng

MỤC TIÊU TỔNG QUÁT:

Khảo sát kiểu gien HLA-B*58:01 trên bệnh nhân gout đang điều trị vớiallopurinol tại phòng khám Viện Gút Thành phố Hồ Chí Minh và khoa BệnhNhiệt Đới bệnh viện Chợ Rẫy

MỤC TIÊU CỤ THỂ:

1 Xác định tỷ lệ mang gien HLA-B*58:01 trên bệnh nhân gout đang điềutrị với allopurinol

2 Phân tích mối liên hệ của kiểu gien HLA-B*58:01 với dị ứng da nặng

và nhẹ trên bệnh nhân gout đang điều trị với allopurinol

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 BỆNH GOUT

1.1.1 Định nghĩa và đặc điểm dịch tễ

Gout là dạng viêm khớp thường gặp và là một trong những bệnh ở ngườiđược mô tả sớm nhất Bệnh hình thành do sự tích tụ tinh thể urate trong khớp,gây phản ứng viêm, biểu hiện triệu chứng đau khớp cấp tính và làm biến dạngkhớp về sau [19] Đây là bệnh lý viêm khớp phổ biến nhất tại nhiều quốc gia

Tỷ lệ hiện mắc thay đổi tùy dân số nghiên cứu, cao tại các quốc gia Bắc Mỹ,châu Âu và Đài Loan (4-10%), thấp tại Nhật Bản và Hàn Quốc (dưới 1%).Mặt khác, cả tỷ lệ hiện mắc và tần suất mới mắc đều có xu hướng gia tăng tạinhiều quốc gia [6], [18], [19], [29] Tỷ lệ bệnh tăng dần theo độ tuổi, cùng sựphát triển của chăm sóc y tế và dân số ngày một già đi là những yếu tố thuậnlợi cho sự gia tăng này

1.1.2 Lâm sàng

Biểu hiện điển hình của gout là những cơn đau khớp dạng viêm cấp tínhmức độ nặng, xuất hiện đột ngột tại một hoặc nhiều khớp ở chi Các đợt bùngphát về sau thường ảnh hưởng nhiều khớp, khoảng nghỉ giữa các đợt rút ngắnlại, thời gian bệnh kéo dài hơn và tiến triển dần đến mạn tính, gây biến dạng

và mất chức năng vận động của khớp

1.1.3 Liệu pháp hạ acid uric máu

Nồng độ acid uric máu được xem là mục tiêu cốt lõi và quan trọng nhấttrong điều trị bệnh gout Hướng dẫn của ACR năm 2012 và tổ chức EULAR(European League Against Rheumatism) năm 2016 đặt điều trị theo mục tiêuacid uric máu làm trọng tâm, nhấn mạnh việc hạ thấp mức acid uric máu

bệnh lý, giảm triệu chứng, giảm số đợt bùng phát và ngăn ngừa các tổnthương khớp về lâu dài [17], [31].

Theo hướng dẫn của ACR năm 2012, bệnh nhân gout có chỉ định dùng

thuốc hạ acid uric máu khi có một trong 4 yếu tố sau: (1) có từ hai đợt cấp trởlên trong một năm, (2) nốt tophi trên lâm sàng hoặc hình ảnh học, (3) bệnhthận mạn giai đoạn 2 trở lên, (4) tiền căn sỏi hệ niệu [17] Trong thực hànhđiều trị bệnh gout, ngày càng phổ biến xu hướng sử dụng thuốc hạ acid uricmáu từ rất sớm Tại Anh và Mỹ, tỷ lệ bệnh nhân gout được chỉ định dùngthuốc hạ acid uric máu vào khoảng 50-60% [18]

Thuốc hạ acid uric máu gồm hai nhóm thuốc chính là chất ức chếxanthine oxidase (allopurinol và febuxostat) và chất tăng thải acid uric qua

nước tiểu (probenecid và benzbromarone) (Hình 2.1) Allopurinol là lựa chọn

ưu tiên trong điều trị tình trạng tăng acid uric máu và bệnh gout, đã được sửdụng hơn 50 năm nay và hiện là thuốc hạ acid uric máu phổ biến nhất trên thếgiới nhờ các ưu điểm: tác dụng dược lý kéo dài, dễ sử dụng (1 lần 1 ngày),mức độ an toàn cao và dễ dung nạp, kể cả trên bệnh nhân suy thận mạn.Febuxostat là chất ức chế xanthine oxidase mới, thay thế cho allopurinol trênnhững bệnh nhân không dung nạp, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về độ

an toàn và chưa có sẵn ở nhiều quốc gia Probenecid là thuốc thay thế chonhóm xanthine oxidase nhưng sử dụng bị hạn chế do đòi hỏi chức năng thậnbình thường và chống chỉ định trên bệnh nhân sỏi thận Benzbromarone có tácdụng mạnh hơn probenecid và dùng được khi chức năng thận suy giảm,nhưng gây độc gan [17], [31], [33]

Hình 1.1: Sơ đồ tóm tắt quá trình thoái giáng purine thành acid uric,

và cơ chế tác động của các thuốc hạ acid uric máu (Nguồn: [16])

1.1.4 Allopurinol

Allopurinol hiện vẫn là thuốc được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trịcác tình trạng tăng acid uric máu có triệu chứng Tại Canada trong giai đoạn2000-2012, allopurinol là thuốc được lựa chọn trong hơn 99% các trường hợp

có chỉ định dùng thuốc hạ acid uric máu [29] Nghiên cứu tại Anh cho thấy30% bệnh nhân gout sẽ được điều trị với allopurinol trong vòng một năm đầutiên sau chẩn đoán, và tỷ lệ này sau 9 năm là xấp xỉ 42% [6]

Đa số bệnh nhân dung nạp tốt với allopurinol Khoảng 2-6% bệnh nhân

có phản ứng quá mẫn cảm với thuốc, và tỷ lệ này đang có chiều hướng giatăng [12], [30] Biểu hiện lâm sàng rõ nhất ở da với mức độ thay đổi từ rấtnhẹ đến rất nặng thậm chí đe dọa tính mạng, và là biến chứng đáng lo ngạitrên nhóm đối tượng này

1.2 DỊ ỨNG DA DO THUỐC

1.2.1 Định nghĩa và phân loại

Thuật ngữ “phản ứng bất lợi ở da do thuốc” (cutaneous adverse drugreaction) là phản ứng của cơ thể trước tác nhân thuốc với biểu hiện chính ở hệ

da Trên lâm sàng, tổn thương này có biểu hiện và mức độ rất đa dạng, vàđược phân nhóm như sau:

Dị ứng da nhẹ bao gồm: phát ban dạng dát sẩn, hồng ban đa dạng, hồng

ban cố định, mề đay, viêm mạch máu, ngứa và nhiều thể lâm sàng khác.Trong đó, phát ban dạng dát sẩn (maculopapular exanthema, MPE) là dạng dị

ứng da thường gặp nhất [23] Dị ứng da nặng (severe cutaneous adverse

reaction, SCAR) là thể ít gặp hơn, đặc trưng bởi tình trạng phát ban da kèmtriệu chứng toàn thân, có thể kèm tổn thương cơ quan khác [20], [23]

Thể dị ứng nặng có biểu hiện nhẹ nhất bao gồm một số hội chứng cónhiều điểm tương đồng: hội chứng phát ban da do thuốc kèm tăng bạch cầu áitoan và triệu chứng toàn thân (drug reaction with eosinophila & systemicsymptoms, DRESS) và hội chứng quá mẫn do thuốc (drug-inducedhypersensitivity syndrome, DiHS) Phần lớn các tác giả xem DRESS và DiHScùng chỉ một tình trạng bệnh lý [20], [23]

Thể dị ứng nặng có biểu hiện nặng nề hơn bao gồm hội chứng Johnson (Stevens-Johnson syndrome, SJS), hoại tử thượng bì độc tính (toxicepidermal necrolysis, TEN), và hội chứng chồng lắp (SJS and TEN overlap,SJS/TEN), được xem là các mức độ khác nhau của cùng một tình trạng bệnh,

Stevens-có biểu hiện đặc trưng là sốt cao, tổn thương da dạng bóng nước hoặc hồngban tẩm nhuận xuất hiện nhanh và lan rộng, bong tróc thượng bì và trợt niêmmạc quanh các lỗ tự nhiên Tỷ lệ diện tích bong tróc quyết định nhóm hộichứng: <10% đối với SJS, 10-30% đối với SJS/TEN, >30% đối với TEN [23]

1.2.2 Đặc điểm dịch tễ

Kết quả tổng hợp từ nhiều nghiên cứu tại Đài Loan , Ý, châu Âu vàIsrael cho thấy allopurinol là tác nhân phổ biến nhất (từ 11 đến 17%) và cónguy cơ tương đối cao nhất gây ra dị ứng da nói chung, và dị ứng da nặng nói

riêng [3], [12] Trong nhóm đối tượng sử dụng allopurinol, tỷ lệ dị ứng nhẹ

vào khoảng 2%, tỷ lệ dị ứng nặng thay đổi từ 0,1 đến 0,4% [23], [33] 90% sẽxảy ra dị ứng trong vòng 60 ngày kể từ lần đầu tiên dùng thuốc, và hầu nhưkhông có trường hợp nào xảy ra sau 180 ngày [30], [34] Tỷ lệ tử vong trongvòng 6 tuần sau khởi phát triệu chứng của nhóm dị ứng nhẹ là 0%, của nhóm

dị ứng nặng là 14-25%, và riêng đối với thể SJS/TEN là 20-32% [3], [8], [12],[30]

1.2.3 Cơ chế bệnh sinh

Cơ chế bệnh sinh của tình trạng dị ứng thuốc có liên quan đến các đáp

ứng miễn dịch đặc hiệu, nổi bật là quá trình trình diện kháng nguyên cho bạchcầu lympho T (tế bào T) CD4+ và CD8+ Yếu tố tiên quyết để hình thành

đáp ứng miễn dịch đặc hiệu là tạo được liên kết giữa kháng nguyên lạ và dòng

tế bào T đặc hiệu cho kháng nguyên đó Trong đó, thành phần giữ vai trò trìnhdiện kháng nguyên cho tế bào T là phân tử HLA (Hình 1.2)

Phân tử HLA lớp I cấu tạo bởi 2 chuỗi polypeptide: chuỗi α và chuỗiβ2-microglobulin (Hình 1.3) Phần ngoại bào của chuỗi α có khe gắn peptide

là phần đa hình của phân tử HLA Đây là nơi gắn kháng nguyên (một đoạn

peptide dài 8-11 acid amin) để trình diện cho tế bào T Vì có tính đa hình vàgắn kết đặc hiệu, nên các phân tử HLA khác nhau sẽ gắn với các đoạn peptidekhác nhau, và được nhận diện bởi các dòng tế bào T khác nhau [21]

Hình 1.2: Minh họa chức năng trình diện kháng nguyên cho tế bào T

của phân tử HLA lớp I và lớp II (Nguồn: [21])

Hình 1.3: Minh họa cấu tạo của phân tử HLA lớp I (Nguồn: [21])

kháng nguyên

Vi sinh vật

Mảnhkháng nguyên

TCRTCR

Tế bào T CD4+

Tế bào T CD8+

Mảnhkháng nguyên

Khe gắn peptide Đoạn peptide

Vùng xuyên màng

Vị trí gắn với CD8

Có nhiều cơ chế giải thích cho các phản ứng dị ứng của cơ thể với phân

tử thuốc Phân tử thuốc có kích thước trung bình khoảng 1-3 acid amin, tứcnhỏ hơn khe gắn peptide của phân tử HLA, nên không thể tự mình kích hoạtđáp ứng miễn dịch Chỉ khi phân tử này liên kết cộng hóa trị với protein đểtạo ra một kháng nguyên mới (mảnh hapten-peptide) thì phản ứng miễn dịch

chống lại thuốc mới xảy ra Đây được gọi là đáp ứng miễn dịch theo cơ chế hapten (Hình 1.4A) [28].

Hình 1.4: Hình ảnh minh họa cho sự liên kết đặc hiệu TCR-HLA theo cơ chế hapten (A) và cơ chế p-i (B) (Nguồn: [28])

Mặt khác, bên cạnh khe gắn peptide, cấu trúc phân tử HLA còn có cáchốc Phân tử thuốc có thể gắn trực tiếp vào những hốc này bằng các liên kếtyếu không cộng hóa trị (phức hợp HLA-thuốc) Ở đây, phân tử thuốc không

đóng vai trò là hapten hay kháng nguyên, và được gọi là cơ chế p-i

(pharmacological-immunological interaction, thuốc có tương tác dược lý vớithụ thể miễn dịch) (Hình 1.4B) [28]

HLATCR

A Cơ chế hapten B Cơ chế p-i

Mảnh hapten-peptide

Phân tử thuốc

Sự gắn kết giữa HLA và thuốc là tương tác có tính đặc hiệu, tức phân

tử HLA cần có chuỗi trình tự acid amin và cấu trúc không gian nhất định mới

có thể gắn được với phân tử thuốc Mặt khác, chỉ có dòng tế bào T có ái lựccao với phức hợp HLA-thuốc mới được kích hoạt Như vậy, cơ thể ngườibệnh vừa phải có HLA đặc hiệu, vừa phải có dòng tế bào T có ái lực cao đểquá trình gắn kết và trình diện kháng nguyên xảy ra Các đặc điểm quan trọngcủa dị ứng da do allopurinol bao gồm:

1 Chỉ kích hoạt tế bào T CD8+ và liên quan với HLA lớp I

2 Có tính đặc hiệu rất cao

3 Có liên quan đến nồng độ thuốc

4 Có yếu tố chủng tộc

Theo phân tích của tác giả Ramasamy (2013), trong số 901 trường hợp

dị ứng da do allopurinol từ 320 báo cáo trên khắp thế giới được công bố tronggiai đoạn 1952-2012, có hơn 50% bệnh nhân là người gốc Đông Á và ĐôngNam Á [30] Mặc dù tỷ lệ tăng acid uric máu và tỷ lệ mắc bệnh gout tại cácquốc gia này thấp hơn so với phương Tây [19], tần suất dị ứng cao cho thấychủng tộc là một yếu tố nguy cơ của dị ứng da do allopurinol Điều này đượcphản ánh rõ rệt ngay trong cơ chế bệnh sinh, khi một trong những yếu tốquyết định phản ứng dị ứng có xảy ra hay không là sự tồn tại của phân tửHLA phù hợp và dòng tế bào T có ái lực cao Chính vì phân tử HLA giữ vaitrò quyết định, việc biết trước có sự hiện diện của HLA nguy cơ sẽ giúp dựđoán những biến cố dị ứng thuốc, vốn từ trước đến nay được xem là đặc dị vàkhông thể đoán trước Điều này đã mở ra hướng nghiên cứu các chỉ dấu sinhhọc giúp tầm soát gien nguy cơ trước khi sử dụng allopurinol, trong đó cóHLA-B*58:01

1.3 BIẾN THỂ HLA-B*58:01

1.3.1 Gien HLA

Gien HLA nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, trải dài trên 7 triệu

cặp nucleotide, gồm nhiều đoạn gien quy định HLA lớp I và lớp II Đoạn quyđịnh HLA lớp I gồm 3 gien chính là HLA-A, -B, -C Một bộ ba allele củaHLA-A, -B và -C hiện diện trên một nhiễm sắc thể được gọi là một haplotype

Vì loài người có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội nên mỗi cá thể mang 6 alleleHLA lớp I [21], [24] HLA là gien có tính đa hình nhất từng được biết đến ởngười Điều này khiến đa phần các cá thể trong dân số có các cặp allele HLA

là dị hợp tử, đặc biệt với những allele hiếm như HLA-B*58:01 [24]

Theo danh pháp, HLA-B*58:01 chỉ vị trí gien HLA-B, nhóm allele 58,

allele đặc hiệu 01 Người có HLA-B*58:01 dương tính có thể có 1 allele

HLA-B*58:01 (dị hợp tử, chiếm đa số) hoặc có 2 allele HLA-B*58:01 (đồng

hợp tử, rất hiếm gặp) Người có HLA-B*58:01 âm tính tức là không có allele HLA-B*58:01 nào Tỷ lệ mang gien là tỷ lệ phần trăm đối tượng HLA-

B*58:01 dương tính (gồm đồng hợp tử và dị hợp tử) trong quần thể Côngthức tính:

Tỷ lệ mang gien =Tổng số đối tượng HLA-B*58:01 dương tính

Tổng số đối tượng nghiên cứu × 100

Tổng hợp từ nhiều nghiên cứu phân tích đa gien được thực hiện trênkhắp thế giới trong suốt hơn 10 năm qua cho thấy: HLA-B*58:01 là biến thể

có mối liên quan mạnh nhất với tình trạng dị ứng da nặng do allopurinol Mặtkhác, chưa ghi nhận mối liên quan giữa allopurinol với một biến thể nào kháccủa HLA Tuy nhiên, cơ chế phân tử của sự gắn kết giữa HLA-B*58:01 vớiphân tử oxypurinol và khả năng kích hoạt miễn dịch mạnh mẽ của phức hợp

1.3.2 Phân tích HLA

Phân tích HLA (HLA typing) nhằm xác định thông tin đầy đủ về cácbiến thể HLA lớp I hoặc lớp II của đối tượng khảo sát Tùy theo kỹ thuậtđược sử dụng mà mức độ phân tích cụ thể, hay độ phân giải (resolution) củakết quả định phân nhóm, dưới nhóm HLA có thể thay đổi từ rất thấp (chỉdừng ở cấp độ nhóm hoặc phân nhóm HLA) đến rất cao (xác định chuỗi trình

tự DNA của đoạn gien quy định HLA) [4]

Trước đây, HLA được xác định bằng các phương pháp huyết thanh học(serological HLA typing) tìm kháng thể kháng HLA, vốn chỉ cho biết thôngtin khá bao hàm và mơ hồ về phân nhóm HLA của bệnh nhân và do đó có độphân giải rất thấp Kể từ sự xuất hiện và phát triển mạnh mẽ của kỹ thuậtPCR, việc phân tích HLA dựa trên ADN (DNA-based HLA typing) được ứngdụng rộng rãi nhờ có độ nhạy và độ phân giải cao Hơn nữa, việc phân tíchdựa trên chính chất liệu di truyền của tế bào có độ chính xác và độ tin cậyvượt trội so với phương pháp phân tích dựa trên kháng thể, cũng như linh hoạthơn khi có biến thể mới xuất hiện cần khảo sát (vì dễ dàng thiết kế bộ kit xétnghiệm đặc hiệu cho biến thể mới) [27]

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) có bản chất là sự sao chépmột hoặc vài đoạn ADN thành các phiên bản giống như khuôn mẫu, dựa trên

cơ chế nhân đôi ADN với sự tham gia của enzyme ADN polymerase Phảnứng nhân đôi được lặp đi lặp lại thành nhiều chu kỳ và tạo ra hàng triệu bảnsao của đoạn ADN này Các phương pháp phân tích HLA ứng dụng kỹ thuậtPCR đang được sử dụng phổ biến hiện nay được phân thành hai nhóm: (1)nhóm định tuýp HLA bao gồm kỹ thuật PCR-SSO và PCR-SSP; (2) nhómgiải trình tự gien gồm kỹ thuật SBT

1 Kỹ thuật PCR sử dụng oligonucleotide đặc hiệu (PCR-SSO)

PCR-SSO (PCR-sequence specific oligonucleotide) có bản chất là sựkhuếch đại các vùng đa hình của gien HLA Kỹ thuật này sử dụng đoạn mồiđặc hiệu cho exon 2 và 3 của đoạn gien quy định HLA lớp I rồi khuếch đạisản phẩm Sau đó, các đoạn oligonucleotide (khoảng 20 nucleotide) gắn cácmicrobead mã màu sẽ được cho vào hỗn hợp Các oligonucleotide này cótrình tự đặc hiệu và sự gắn kết chỉ xảy ra trong những điều kiện rất nghiêmngặt Sản phẩm sẽ trải qua nhiều công đoạn khác nhau (biotin hóa, tháo xoắn

và gắn với các đoạn dò có trình tự tương ứng với các microbead), sau đó được

xử lý bằng các kỹ thuật đánh giá mật độ huỳnh quang và phần mềm xử lý đểxác định biến thể HLA phù hợp Kỹ thuật PCR-SSO ngày càng trở nên thíchhợp khi số lượng biến thể HLA ngày một gia tăng, mặc dù thời gian thực hiệnkéo dài do phải trải qua rất nhiều bước Nhược điểm lớn nhất của kỹ thuật này

là có độ phân giải không cao và kết quả không rõ ràng [4], [27]

2 Kỹ thuật PCR sử dụng mồi đặc hiệu (PCR-SSP)

PCR-SSP (PCR-sequence specific primers) hiện là tiêu chuẩn vàngtrong xác định biến thể HLA Kỹ thuật này sử dụng đoạn mồi được thiết kếđặc hiệu để khuếch đại một allele nào đó, nếu allele đó có chuỗi trình tựtương ứng với đoạn mồi Sau đó, chất nhuộm sẽ gắn với các bản sao và phát

ra ánh sáng huỳnh quang Việc cá thể có mang allele đang khảo sát hay khôngđược xác định bởi số lượng ngưỡng chu kỳ cần thiết (cycle threshold, Ct) phảithấp hơn một ngưỡng đã được quy định trước Kỹ thuật PCR-SSP có ưu điểm

là đơn giản và cho kết quả nhanh chóng Tuy nhiên, quá trình thực hiện cầntrải qua nhiều chu kỳ phản ứng để đảm bảo có độ phân giải cao Vì sử dụngđoạn mồi đặc hiệu với từng biến thể, PCR-SSP là lựa chọn lý tưởng khi thực

nhất định PCR-SSP không phù hợp khi thực hiện trên số lượng mẫu lớn,hoặc cần đánh giá đồng thời nhiều biến thể HLA khác nhau, đặc biệt khi sốlượng biến thể HLA phát hiện được ngày càng nhiều [4], [27].

3 Kỹ thuật định danh bằng giải trình tự (SBT)

SBT (sequence-based typing) hiện là tiếp cận mới trong phân tích HLA

độ phân giải cao, nhằm phát hiện thêm những biến thể mới Kỹ thuật này dựatrên nguyên lý khuếch đại đặc hiệu theo locus hoặc theo nhóm, sau đó tiếnhành giải trình tự vòng lặp (cycle sequencing), sử dụng 4 loại nucleotide cógắn thuốc nhuộm có khả năng phát ra ánh sáng có bước sóng khác nhau Sau

đó, các mảnh DNA khác nhau được tách ra bằng kỹ thuật điện di, và phát hiệnnhờ ánh sáng huỳnh quang đặc trưng Kỹ thuật SBT cho phép phân tích HLAvới độ phân giải rất cao, giúp phát hiện thêm hơn 8.000 allele lớp I và II, mặc

dù hơn 40% trong số này chỉ mới được ghi nhận duy nhất một lần Tuy nhiên,

kỹ thuật này rất tốn kém, thời gian thực hiện dài, kết quả đôi khi khó diễn giải

và cần được kết hợp chung với SSO và SSP thành một tiến trình phân tíchHLA có độ phân giải và độ tin cậy cao [4], [27]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HLA-B*58:01

Với những hiểu biết về dị ứng da do allopurinol và mối liên hệ với B*58:01, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới được thực hiện nhằm mục tiêu:

HLA-(1) Khảo sát tỷ lệ mang gien HLA-B*58:01 trong các nhóm dân số,

(2) Xác định mối liên hệ giữa HLA-B*58:01 và các thể dị ứng da doallopurinol,

(3) Đánh giá hiệu quả về chi phí của việc tầm soát HLA-B*58:01trước khi điều trị với allopurinol

1.4.1 Nghiên cứu khảo sát tỷ lệ mang gien trong các nhóm đối tượng

Tại Việt Nam, nghiên cứu của tác giả Đỗ Thị Quỳnh Nga (2015) trên 75người Việt khỏe mạnh cho tỷ lệ mang gien là 18,7% Điểm đáng chú ý là tỷ lệnày chỉ thấp hơn người Đài Loan và cao hơn nghiên cứu trên các chủng tộccòn lại [1], [5], [13], [22], [36] Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào khảo sátkiểu gien HLA-B*58:01 trên người dung nạp với allopurinol tại Việt Nam.Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy tỷ lệ mang gien trong nhóm này khátương đồng nhưng có phần thấp hơn tỷ lệ trong dân số chung [5], [11], [13],[36]

1.4.2 Nghiên cứu xác định mối liên hệ giữa kiểu gien HLA-B*58:01

và các dạng dị ứng da do allopurinol

Đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá mối liên hệ giữa

HLA-B*58:01 và dị ứng da nặng do allopurinol Nhìn chung, HLA-B*58:01

có mối liên hệ mạnh mẽ với dị ứng nặng, rõ rệt nhất trên người Hán, HànQuốc và Thái Lan, với gần 100% trường hợp đều dương tính với HLA-B*58:01 (OR từ 97,8 đến 580,3) [5], [8], [13], [15], [36] Nghiên cứu trênngười Nhật Bản và châu Âu cũng cho thấy mối liên hệ tương tự nhưng yếuhơn (OR từ 13,6 đến 80,8) [9], [11], [16], [22], [37] Tại Việt Nam, nghiêncứu của tác giả Đỗ Thị Quỳnh Nga (2015) khảo sát 22 bệnh nhân dị ứng nặng

do allopurinol cho tỷ lệ mang gien là 95,5% (OR 91) [1]

Mặt khác, chưa có nhiều nghiên cứu thực hiện trên đối tượng bị dị ứng

da nhẹ do allopurinol Các báo cáo hiện có cũng rất khác nhau Nghiên cứu

trên người Trung Quốc cho kết quả HLA-B*58:01 liên hệ rất mạnh với dị ứng

da nhẹ (OR 339,0), trên người Thái Lan cho kết quả yếu hơn (OR 144,0) vàtrên người Bồ Đào Nha là không có mối liên hệ [5], [8], [11] Do đó vẫn chưa

có bằng chứng rõ ràng để xác định HLA-B*58:01 có phải là yếu tố nguy cơcủa dị ứng da nhẹ do allopurinol hay không.

Trong cả hai nghiên cứu tại Việt Nam, các chỉ số về HLA-B*58:01 củangười Việt Nam đều tương đương với các chủng tộc thuộc nhóm thứ nhất(người Hán, Hàn Quốc và Thái Lan), gợi ý Việt Nam thuộc nhóm nguy cơcao, có khả năng việc tầm soát HLA-B*58:01 là hiệu quả và cần thiết Nghiêncứu của tác giả Đỗ Thị Quỳnh Nga đã bước đầu cho thấy mối liên hệ mạnh

mẽ giữa HLA-B*58:01 và dị ứng nặng, nhưng lấy nhóm chứng là người khỏemạnh không dùng allopurinol nên độ mạnh chưa cao, và không khảo sát mốiliên hệ với dị ứng da nhẹ

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Dân số mục tiêu

Bệnh nhân gout đến khám và được điều trị với allopurinol tại phòngkhám Viện Gút Thành phố Hồ Chí Minh và khoa Bệnh Nhiệt Đới bệnh việnChợ Rẫy

2.1.2 Dân số nghiên cứu

Bệnh nhân gout đến khám và được điều trị với allopurinol tại phòngkhám Viện Gút Thành phố Hồ Chí Minh và khoa Bệnh Nhiệt Đới bệnh việnChợ Rẫy từ ngày 01/10/2017 đến ngày 31/5/2018

Lấy α = 0,05 tương ứng với độ tin cậy 95%, Z / = 1,96Lấy p = 18,7% theo số liệu của tác giả Đ.T.Q Nga (2015), d = 4,5%

Thay các giá trị này vào công thức trên, tính được n = 147 ca Chúng tôitiến hành chọn mẫu thuận tiện 150 ca