Thiết kế quy trình phân tích alpha lipoic acid trong một số thực phẩm chức năng

Alpha Lipoic Acid ALA là một trong những chất chống oxy hóa hiện diện tự nhiên trong tất cả các tế bào nhân sơ và sinh vật nhân thực ALA có chức năng tổng hợp nội sinh là một trong yếu tố tạo thành cho một số phức hợp enzyme quan trọng trong ty thể Do đặc tính chống oxy hóa độc đáo của nó nó đã được sử dụng trong nhiều bệnh liên quan đến mất cân bằng oxy hóa và thường có sẵn trên thị trường dưới dạng thực phẩm bổ sung Mục đích của công việc nghiên cứu hiện tại là xây dựng và tối ưu phương pháp phân tích để xác định hàm lượng ALA trong thực phẩm bổ sung khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Thiết kế quy trình phân tích bao gồm Điều kiện sắc ký HPLC Điều kiện xử lý mẫu Đánh giá xác nhận giá trị của phương pháp Thử nghiệm thành thạo hay so sánh liên phòng Phân tích mẫu ở địa phương Tác giả đã tóm tắt các kết quả đạt được và đưa ra các hướng phát triển tiếp theo

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KỸ THUẬT HÓA HỌC

Đà Nẵng 2019

Chuyên ngành : Kỹ thuật hóa học

Mã số : 8520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Diệu Hằng

Đà Nẵng 2019

Sau thời gian học tập nghiên cứu và tổ chức thí nghiệm dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Diệu Hằng

Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

PGS.TS Nguyễn Thị Diệu Hằng, Phó trưởng phòng Đào tạo Trường Đại học

Bách Khoa Đà Nẵng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý cho tôi những kiến thức quý báu và chỉ ra những thiếu xót để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Các thầy cô giảng viên khoa Hóa, phòng Đào tạo Trường Đại học Bách Khoa

Đà Nẵng đã tham gia giảng dạy, hổ trợ những kiến thức nền, góp ý phản biện bảo vệ

đề tài này

Viện An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc gia đã tổ chức đánh giá so sánh liên

phòng giúp đề tài nghiên cứu có độ chính xác và tin cậy cao hơn

Trung Tâm Kiểm Nghiệm Thuốc, Mỹ Phẩm, Thực Phẩm Quảng Ngãi và các anh chị trong Khoa Mỹ Phẩm – Thực phẩm đã giúp đỡ, hỗ trợ chia sẻ những

khó khăn với tôi trong công việc

Và cuối cùng tôi xin chúc các quý thầy cô và các tổ chức; cá nhân ở trên lời chúc sức khỏe và thành công

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Diệu Hằng Các số liệu, kết quả nên trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Bùi Minh Đức

THIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG

MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Học viên: Bùi Minh Đức Chuyên Ngành: Kỹ thuật hóa học

Mã số: 8520301 Khóa: 2017-2019 Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN

Tóm tắt - Alpha Lipoic Acid (ALA) là một trong những chất chống oxy hóa hiện diện tự

nhiên trong tất cả các tế bào nhân sơ và sinh vật nhân thực ALA có chức năng tổng hợp nội sinh là một trong yếu tố tạo thành cho một số phức hợp enzyme quang trọng trong ty thể Do đặc tính chống oxy hóa độc đáo của nó, nó đã được sử dụng trong nhiều bệnh liên quan đến mất cân bằng oxy hóa và thường có sẵn trên thị trường dưới dạng thực phẩm bổ sung Mục đích của công việc nghiên cứu hiện tại là xây dựng và tối ưu phương pháp phân tích để xác định hàm lượng ALA trong thực phẩm bổ sung khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Thiết kế quy trình phân tích bao gồm: Điều kiện sắc ký HPLC; Điều kiện sử lý mẫu; Đánh giá xác nhận giá trị của phương pháp; Thử nghiệm thành thạo hay so sánh liên phòng; Phân tích mẫu ở địa phương Tác giả đã tóm tắt các kết quả đạt được và đưa ra các hướng phát triển tiếp theo

Từ khóa - Alpha Lipoic Acid (ALA); Đánh giá phương pháp; So sánh liên phòng; Tối ưu

phương pháp; Điều kiện sử lý mẫu

DESIGN OF ALPHA LIPOIC ACID ANALYSIS PROCESS IN

SUPPLEMENTS FOOD

Abstract - Alpha Lipoic Acid (ALA) is a universal antioxidant present naturally in all

prokaryotic and eukaryotic cells Endogenously synthesized ALA functions as a cofactor for several important mitochondrial enzyme complexes Due to its unique antioxidant properties, it has been administered in many oxidative stress related diseases and is also commercially available in the form of supplements food The aim of the present research work was to build and optimal analytical method to determine ALA content in various supplement food using high performance liquid chromatography (HPLC) Analysis process design includes: HPLC conditions; Sample handling conditions; Selection, verification and validation of method; Proficiency testing inter-laboratory comparision; Analyzing samples in the locality The achieved results are summarized and perspective

of the work is provided

Key words - Alpha lipoic acid (ALA); verification and validation of method;

inter-laboratory comparision; optimal analytical method; Sample handling conditions

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

6 Cấu trúc của luận văn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát về thực phẩm chức năng 3

1.2 Tổng quan về Alpha Lipoic Acid 4

1.3 Sản xuất ALA trong công nghiệp 6

1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng HPLC 6

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện đo sắc ký lỏng 31

3.2 Kết quả Khảo sát và tối ưu điều kiện Xử lý mẫu trên modde 5 36

3.3 Đánh giá quy trình phân tích ala 41

3.4 Đánh giá phương pháp bằng so sánh liên phòng 54

3.5 Phân tích một số mẫu lấy trên địa bàn 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC

QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao)

Từ viết tắt Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

ALA Alpha-Lipoic Acid Alpha Lipoic Acid

AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội những nhà hóa học

phân tích chính thức

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ISO International Oranization for

Standardization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

Yêu cầu bổ sung để công nhận các phòng thử nghiệm lĩnh vực hóa

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

DAD Diode Array Detector Đầu dò Diode Array

UV-Vis Ultraviolet – Visible spectroscopy Quang phổ tử ngoại khả kiến RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

EURACHEM Analytical Chemistry in Europe Hiệp hội Phân tích Hóa học

Châu Âu

ISO

17025:2017

Tiêu chuẩn quốc tế qui định các yêu cầu nhằm đảm bảo năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn

3.4 Kiểm tra lại quá trình quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm 40 3.5 Bảng kết quả phân tích và độ chệch đường chuẩn 44

3.10 Kết quả đánh giá độ tái lặp nội bộ nền mẫu 1 48 3.11 Kết quả đánh giá độ tái lặp nội bộ nền mẫu 2 48 3.12 Kết quả đánh giá độ tái lặp nội bộ của nền mẫu 3 49

3.16 Kết quả đánh giá độ không đảm bảo đo nền mẫu 1 52 3.17 Kết quả độ không đảm bảo đo nền mẫu 2 53 3.18 Đánh giá độ không đảm bảo đo trên nền mẫu 3 53 3.19 Kết quả đánh giá so sánh liên phòng Alpha Lipoic Acid 54 3.20 Kết quả phân tích ALA trong các mẫu lấy trên địa bàn tỉnh

Số hiệu

1.2 Một số thực phẩm chức năng có chứa ALA trên thị trường 5

2.4 Đường chuẩn và phuơng trình hồi quy của một chất 242.5 Xác định LOD, LOQ bằng nhiễu đường nền 263.1 Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,001M 313.2 Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,005M 323.3 Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,01M 323.4 Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,05M 323.5 Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,025M 333.6 Sắc ký đồ chuẩn ALA khi chạy tỉ lệ ACN:H3PO4 (50:50) 333.7 Sắc ký đồ chuẩn ALA khi chạy tỉ lệ ACN:H3PO4 (30:70) 33

3.8 Sắc kí đồ chuẩn với hệ pha động ACN: 0,025M H3PO4 (40:60)

hình

3.15 Mô hình ma trận các yếu tố trên Modde 5 373.16 Phương án thí nghiệm và kết quả phân tích mẫu Modde 5 383.17 Tỷ lệ và tương quan của các hệ số hồi quy 383.18 Hệ số và kết quả kiểm tra các hệ số phương trình hồi quy 39

3.26 Phổ UV-Vis của dung dịch chuẩn và các nền mẫu thử 43

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chất lượng thực phẩm chức năng là một vấn đề cần phải được quan tâm bởi vì được sử dụng trực tiếp vào trong cơ thể con người Nếu thực phẩm chức năng giả, kém chất lượng, không đảm bảo nguồn gốc thì có khả năng ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người Trong khi “Thuốc” có những quy định rất chặt chẽ như cần phải ghi rõ nguyên liệu, công dụng và luật định, sự chuyển hóa trong cơ thể, đào thải ra sao, tác dụng phụ, hàm lượng… thì thực phẩm chức năng lại không có những yêu cầu khắt khe Do vậy, việc sản xuất thực phẩm chức năng trở nên dễ dàng hơn, nhất là trong khâu đăng ký sản xuất hay các khâu kiểm định chất lượng

Trong thời gian qua, việc sản xuất, kinh doanh thực phẩm chức năng không đảm bảo chất lượng, không rõ nguồn gốc xuất xứ, chưa đăng ký bản công bố với cơ quan quản lý, đặc biệt kinh doanh qua mạng điện tử có chiều hướng diễn biến phức tạp, ảnh hưởng đến quyền lợi và sức khỏe người tiêu dùng, gây bức xúc với xã hội

Ngày 19/06/2018, Thử tướng Chính phủ đã ban hành Chỉ thị số 17/CT-TTg về việc “Tăng cường đấu tranh chống buôn lậu, gian lận thương mại, sản xuất, kinh doanh hàng giả, hàng kém chất lượng thuộc nhóm hàng dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm chức năng, dược liệu và vị thuốc y học cổ truyển”

Hiện nay trong thị trường có nhiều loại thực phẩm chức năng có thành phần chính là Alpha Lipoic Acid (ALA) Tuy nhiên chất lượng của các sản phẩm là vấn đề cần quan tâm chính vì vậy cần có phương pháp tối ưu để phân tích định lượng hàm lượng hoạt chất trên trong sản phẩm Trong đó hầu như các quy trình phân tích chỉ được tham khảo từ các tiêu chuẩn và các kênh nước ngoài Các hệ thống TCVN; QCVN; Dược Điển Việt Nam; Dược Điển Anh… hiện tại chưa thấy có quy trình chính thức về phân tích chất lượng Alpha Lipoic Acid và chưa tìm ra các bài báo khoa học ở Việt Nam nói về việc xây dựng quy trình và tối ưu điều kiện chiết xuất phân tích ALA trong thực phẩm chức năng Các quy trình phân tích ở Việt nam chỉ là các quy trình nội bộ cho nên điều kiện phân tích thiết bị hóa chất khác nhau, và chưa được đánh giá tối ưu theo điều kiện phân tích Chính vì vậy cần xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá và tối ưu để hoàn thiện quy trình phân tích này

Ngoài ra thực trạng nhu cầu về quản lý trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi cần tìm hiểu

về chất lượng các sản phẩm thực phẩm chức năng, đặc biệt là những hoạt chất mới, những hoạt chất đáng quan tâm và được sử dụng nhiều như ALA

Với những lý do và các vấn đề thực tiễn trên tôi xin được lựa chọn đề tài “Thiết

kế quy trình phân tích Alpha Lipoic Acid trong một số thực phẩm chức năng”

2 Mục tiêu nghiên cứu

1 Xây dựng và đánh giá được quy trình phân tích ALA trong một số thực phẩm chức năng, quy trình này phải tối ưu và phân tích được hầu hết các mẫu thực phẩm chức năng có chứa ALA trên thị trường

2 Từ quy trình đã xây dựng lập hướng dẫn phương pháp ở cơ quan đơn vị để phân tích các mẫu nghiên cứu có trên địa bàn

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Thực phẩm chức năng có chứa ALA trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi

- Sắc ký lỏng cao áp HPLC

4 Phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu lý thuyết

- Phân tích dữ liệu

- Xây dựng quy trình

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Xây dựng và lựa chọn quy trình phân tích, lựa chọn các thông số và điều kiện quy trình phân tích

- Xây dựng và tối ưu được quy trình xử lý mẫu phân tích

- Xây đựng quy trình và đánh giá quy trình phân tích Sau đó tiến hành thực hiện phân tích đối chứng về quy trình với các phòng thí nghiệm khác nhau

- Phân tích một số mẫu đối chứng trên địa bàn

6 Cấu trúc của luận văn

Cấu trúc luận văn gồm các Chương sau:

- Chương 1: Tổng quan

- Chương 2: Đối tượng, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Thực nghiệm và thảo luận

- Chương 4: Kết luận

Vào nửa cuối thập niên 1990, Ủy ban Châu Âu xây dựng và thảo luận về khái niệm thực phẩm chức năng Tại cuộc họp này góp mặt với nhiều chuyên gia về dinh dưỡng và các ngành khoa học liên quan khác để đưa ra một khái niệm đồng thuận và

từ đó đã được sử dụng rộng rãi Theo đó “Thực phẩm chức năng là các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc là thực phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm các chất chức năng Cũng như thực phẩm thuốc, thực phẩm chức năng nằm giữa nơi giao thoa thực phẩm và thuốc cho nên đôi khi người ta cũng gọi thực phẩm chức năng là thực phẩm thuốc Sở dĩ thực phẩm chức năng có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh và phòng ngừa bệnh vì nó có khả năng phục hồi tất cả các cấu trúc tế bào trong cơ thể đang bị tổn thương”

Bộ Y tế Việt Nam định nghĩa thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cở thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh Tùy theo công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng còn có các tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo

vệ sức khỏe, sản phẩm dinh dưỡng y học

Phân loại thực phẩm chức năng

1.1.2.

Thực phẩm chức năng được phân loại như sau [2]:

Thực phẩm bổ sung (Supplemented Food) là thực phẩm thông thường được bổ

 Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzym, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác

 Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cô đặc và chuyển hóa

Thực phẩm dinh dưỡng y học còn gọi là thực phẩm dinh dưỡng dùng cho mục



đích y tế đặc biệt (Food for Special Medical Purposes, Medical Food) là loại thực phẩm có thể ăn bằng đường miệng hoặc bằng ống xông, được chỉ định để điều chỉnh chế độ ăn của người bệnh và chỉ được sử dụng dưới sự giám sát của nhân viên y tế

Thực phẩm dùng cho chế độ ăn đặc biệt (Food for Special Dietary Uses) dùng



cho người ăn kiêng, người già và các đối tượng đặc biệt khác theo quy định của Ủy ban tiêu chuẩn thực phẩm quốc tế (CODEX) là những thực phẩm được chế biến hoặc được phối trộn theo công thức đặc biệt nhằm đáp ứng các yêu cầu về chế độ ăn đặc thù theo thể trạng hoặc theo tình trạng bệnh lý và các rối loạn cụ thể của người sử dụng Thành phần của thực phẩm này phải khác biệt rõ rệt với thành phần của những thực phẩm thông thường cùng bản chất, nếu có

Yêu cầu kiểm nghiệm của thực phẩm chức năng [2]

1.1.3.

Việc lấy mẫu kiểm nghiệm định kỳ được thực hiện bởi tổ chức, cá nhân hoặc tổ chức, cá nhân chủ động mời cơ quan có thẩm quyền thực hiện

Các chỉ tiêu để kiểm nghiệm định kỳ là các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu đã công

bố trong bản thông tin chi tiết về sản phẩm hoặc trên nhãn sản phẩm đang lưu hành; một số chỉ tiêu hóa lý, vi sinh vật đã công bố trong bản thông tin chi tiết về sản phẩm hoặc theo quy định của pháp luật

Các hoạt chất có tác dụng chính tạo nên công dụng của sản phẩm, mà các đơn

vị kiểm nghiệm trong nước thực hiện kiểm nghiệm được thì phải định lượng hoạt chất chính đó trong sản phẩm

Hoạt chất chính mà các đơn vị kiểm nghiệm trong nước chưa có phương pháp thử, mẫu chuẩn để kiểm nghiệm định lượng được thì yêu cầu công bố hàm lượng thành phần có chứa hoạt chất chính trong hồ sơ công bố

1.2 Tổng quan về Alpha Lipoic Acid

Cấu tạo và tính chất lý hóa

1.2.1.

Alpha Lipoic Acid (ALA) có tên hóa học là 1,2-dithiolane-3-pentanoic acid Một số tên khác của ALA: 1,2-dithiolane-3-valeric acid; acetate-replacing factor; iletan; 5-(1,2dithiolan-3-yl) valeric acid; 6,8-dithiooctanoic acid; Heparlipon; lipoic acid; Liposan; Lipothion; protogenA; pyruvate oxidation factor; Thioctacid; thioctic acid; 6,8-thioctic acid; 6-thioctic acid; thioctidase; thiooctanoic acid; Tioctan

S S

O

OH

Công thức cấu tạo của ALA Hình 1.1.

 Độ hòa tan: Không tan trong nước, hòa tan trong dung môi chất béo

Công dụng đối với sức khỏe

ALA là một chất chống oxy hóa mạnh đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm thực phẩm chức năng:

 Kích thích tổng hợp glutathione

 Tăng cường tác dụng của các chất chống oxy hóa khác (ví dụ: Vitamin C và E)

 Tăng cường hoạt động insulin

 Giảm sơ hóa niêm mạc

 Ngăn ngừa và điều trị hóa trị gây ra tác dụng phụ, chẳng hạn như bệnh thần kinh ngoại biên Hơn nữa, có một số báo cáo về ALA đang được sử dụng như một tác nhân có đặc tính chống ung thư

Hiện nay trên thị trường có các loại thực phẩm chức năng có chứa ALA thường được bào chế dưới dạng thuốc có hàm lượng dao động từ 50mg đến 600mg/viên và dạng bào chế thường: Viên nén, viên bao phim, gói bột thuốc, viên nang cứng hay mềm

Một số thực phẩm chức năng có chứa ALA trên thị trường Hình 1.2.

1.3 Sản xuất ALA trong công nghiệp [13]

Acid lipoic có thể được điều chế bằng cách phản ứng:

Acid 6,8-dichlorooctanoic + Natri disulfide

Trong sản xuất công nghiệp acid-lipoic người ta sử dụng phương pháp chuyển đổi monomethyl hoặc monoethyl adipate thành acid clorua tương ứng bằng phản ứng với thionyl clorua Hỗn hợp này được xử lý bằng ethylene và nhôm clorua khan tạo ra một hợp chất trung gian sau khi khử được xử lý bằng natri disulfide Quá trình tạo ra este dithionooctyl sau đó tạo ra acid-lipoic sau khi thủy phân

1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng HPLC [1]

Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột

Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể

Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu

dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị) Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector

Nguyên lý hoạt động của hệ thống HPLC Hình 1.3.

Hệ thống bơm

1.4.2.

Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưu lượng không đổi Những biến đổi áp suất sẽ được giảm thiểu, ví dụ cho dung môi chạy qua một thiết bị giảm xung Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm Các bơm có thể được lắp với thiết bị loại bỏ bọt khí

Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động hoặc hằng định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần (rửa giải gradient) theo một chương trình xác định Trong trường hợp rửa giải gradient, hệ thống bơm lấy các dung môi từ một vài bình chứa và các dung môi có thể được trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc áp suất cao

Bộ phận tiêm mẫu

1.4.3.

Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động hoặc vào vị trí gần đầu hoặc đầu cột nhờ một bộ phận tiêm mẫu có khả năng hoạt động ở áp suất cao Có thể dùng vòng chứa mẫu thử, có thể tích cố định hoặc thiết bị có thể tích thay đổi, có thể vận hành bằng tay hoặc tự động Khi tiêm mẫu bằng tay có thể gây ra sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ

Pha tĩnh

1.4.4.

Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng, bao gồm:

 Silica (silicon dioxide), nhôm oxide hoặc than graphit xốp thường được dùng trong sắc ký pha thuận mà quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về khả năng hấp phụ hoặc phân bố khối lượng;

 Nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức acid hoặc base, sử dụng trong sắc

ký trao đổi ion mà trong đó sự chia tách được thực hiện dựa trên sự cạnh tranh giữa các ion cần tách và các ion trong pha động;

 Silica xốp hoặc polymer, sử dụng trong sắc ký rây phân tử, ở đó sự chia tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, tương ứng với sự loại trừ không gian;

 Rất nhiều chất mang biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica gel hoặc than graphit xốp được dùng trong sắc ký lỏng pha đảo mà ở đó sự chia tách về nguyên tắc cơ bản dựa trên sự phân bố phân tử các chất giữa pha động và pha tĩnh;

 Pha tĩnh loại biến đổi hóa học đặc biệt, ví dụ dẫn xuất của celulose hoặc amylose, protein hoặc peptid, cyclodextrin v.v dùng để tách các đồng phân đối quang (sắc ký đối quang)

Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi hóa học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động Bề mặt của chất mang, ví dụ như các nhóm silanol của silica được phản ứng với các thuốc thử silan khác nhau tạo thành các dẫn xuất silyl có liên kết cộng hóa trị, che phủ một số lượng khác nhau các

vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang Bản chất của các pha liên kết là tham số quan trọng để xác định các tính chất tách của hệ sắc ký

Các pha liên kết dùng phổ biến là:

Đặc điểm và yêu cầu của pha tĩnh sắc ký:

Trừ khi có tiêu chuẩn riêng của nhà sản xuất, thông thường các cột sắc ký pha

nhất từ 3 µm đến 10 µm Các hạt có thể hình cầu hoặc không có hình dạng nhất định,

có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu Những tham số này cấu thành biểu hiện sắc ký của từng pha tĩnh cụ thể Trong trường hợp pha đảo, các yếu tố bổ sung như bản chất của pha tĩnh, mức độ liên kết, ví dụ như độ dài mạch carbon liên kết, hoặc các nhóm hoạt động bề mặt của pha tĩnh có được che phủ hết hay không Sự kéo đuôi pic, đặc biệt của các chất base, có thể xảy ra khi có mặt các nhóm silanol bề mặt của silica

 Cột được làm bằng thép không gỉ trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, có chiều dài và đường kính trong () khác nhau được sử dụng cho phân tích sắc

ký Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là vi cột Nhiệt độ của pha động và cột phải được giữ ổn định trong suốt thời gian phân tích Phần lớn quá trình tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60°C

vì khả năng phân hủy của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra

Pha động

1.4.5.

Đối với sắc ký pha thuận, thường sử dụng dung môi ít phân cực Sự có mặt của

nước trong pha động phải được hạn chế và kiểm tra chặt chẽ nhằm thu được kết quả tái lặp lại Đối với sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng pha động chứa nước, có hoặc không có dung môi hữu cơ

Các thành phần của pha động thường được lọc nhằm loại bỏ các tiểu phân lớn hơn 0,45 m Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị bằng cách đong các thể tích qui định (trừ khi có chỉ định về khối lượng) của các thành phần riêng lẻ rồi sau đó trộn lẫn với nhau Ngoài ra, dung môi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điều khiển bằng các van chia tỷ lệ, để có thể trộn lẫn theo các tỷ lệ mong muốn Dung môi thường được loại khí trước khi bơm bằng cách sục khí Heli, lắc siêu âm hoặc sử dụng

hệ thống lọc màng lọc/chân không trực tuyến nhằm tránh sự tạo bọt khí trong cốc đo của detector

Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường không được chứa các chất làm ổn định và phải trong suốt (không hấp thụ quang) ở vùng bước sóng phát hiện, nếu như sử dụng detector tử ngoại Dung môi và những thành phần khác được dùng phải có chất lượng phù hợp Khi cần điều chỉnh pH chỉ thực hiện với thành phần nước của pha động mà không điều chỉnh với hỗn hợp Nếu sử dụng dung dịch đệm, cần phải rửa hệ thống bằng hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ (5 % v/v) nhằm ngăn chặn sự kết tinh muối sau khi kết thúc quá trình sắc ký

Pha động có thể chứa những thành phần khác, ví dụ một ion trái dấu trong sắc

ký tạo cặp ion hoặc một chất chọn lọc đối quang trong trường hợp sắc ký sử dụng pha tĩnh không chọn lọc đối quang

Detector

1.4.6.

Detector hấp thụ tử ngoại/khả kiến gồm cả detector chuỗi diod là được sử dụng phổ biến nhất Detector huỳnh quang, detector khúc xạ vi sai, detector điện hóa, detector khối phổ, detector tán xạ ánh sáng bay hơi, detector phóng xạ hoặc các loại detector đặc biệt khác cũng có thể được sử dụng

Các thông số trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4.7.

1.4.7.1 Sắc đồ

Sắc đồ (hay sắc ký đồ) là một đồ thị hay một cách trình bày khác mô tả sự thay đổi của đáp ứng của detector (hay nồng độ của chất hay một đại lượng khác dùng làm thước đo nồng độ của chất) theo thời gian, thể tích hay khoảng cách Một sắc đồ lý tưởng có dạng một chuỗi các pic kiểu Gauss trên một đường nền

1.4.7.2 Thời gian lưu và thể tích lưu

Trong sắc ký rửa giải, sự lưu giữ của một chất có thể được biết dưới dạng thời gian lưu tR Thời gian lưu được xác định trực tiếp trên sắc đồ bởi vị trí của đỉnh pic Từ thời gian lưu có thể tính được thể tích lưu VR dựa trên công thức:

wh = 1,18 wi

Pic của một chất Hình 1.4.

1.4.7.4 Hệ số đối xứng

Hệ số đối xứng (As) (hay hệ số kéo đuôi) của một pic được tính theo công thức:

Trong đó:

w 0,05 là chiều rộng của pic ở 1/20 chiều cao của pic;

d là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của pic ở 1/20 chiều cao của pic

Khi As = 1,0 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tưởng)

Hệ số đối xứng trong sắc ký Hình 1.5.

R

R υ t

2d w

AS  0,05

1.4.7.5 Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến

Tùy theo kỹ thuật được sử dụng, dựa trên các dữ liệu thu được trong điều kiện đẳng nhiệt, đẳng dòng hay đẳng mật độ, hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của cột), biểu thị dưới dạng số đĩa lý thuyết biểu kiến (N), có thể tính được theo công thức dưới đây:

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu và đặc điểm của đối tượng nghiên cứu

2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu là các mẫu thực phẩm chức năng bao gồm: các nền mẫu

tự tạo, các nền mẫu dùng để xây dựng quy trình thẩm định và các mẫu lưu hành trên thị trường có thành phần và thể chất phức tạp, tiêu chí phân tích đa dạng

Nền mẫu 1: Dung dịch tiêm truyền Thiotic acid 300mg/12ml (nền mẫu ALA

(nền mẫu ALA ưa dầu)

Nội dung nghiên cứu

Thực hiện mô hình quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm trên nền mẫu thêm



chuẩn, từ đó đưa ra các thông số tối ưu cho quá trình chiết tách ALA trên các nền mẫu thực phẩm Nhằm mục đích chiết tách sản phẩm được tối đa và mức độ chiết cao nhất

Xây đựng quy trình và đánh giá quy trình phân tích Sau đó tiến hành thực hiện



phân tích đối chứng về quy trình với các phòng thí nghiệm khác nhau

Khảo sát một số mẫu thực phẩm chức năng theo quy trình đã tối ưu

quy chuẩn trong phòng thí nghiệm

Chất chuẩn, dung môi, hóa chất

2.1.4.

2.1.4.1 Chất chuẩn

Chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu gồm có:

Alpha Lipoic Acid (Hàm lượng: 99,0 %; Nơi sản xuất: Trung Quốc; Hạn dùng:



03/2021; Đã kiểm tra và thực hiện nối chuẩn)

Alpha Lipoic Acid (Hàm lượng: 99,9%; Viện An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm



Quốc Gia)

2.1.4.2 Dung môi, hóa chất

Một số dung môi, hóa chất khác được sử dụng trong nghiên cứu gồm có:

Acetonitrile (Merck; Lô: K49707491; Hạn dùng: 30/11/2020)

Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao (Model: U-3000; Nơi sản xuất: Dionex)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Xác định nồng độ ALA trong các mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng 2.2.1.

hiệu năng cao HPLC

Trong nghiên cứu này, việc xác định nồng độ ALA trong các mẫu được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trên máy Ultimate 3000, Hãng Dionex – Mỹ:

Bơm dung môi 4 kênh (Model: LPG-3400SD; tốc độ dòng 0,001 – 10,0

Hệ thống máy HPLC Ultimate 3000 Hình 2.1.

Phần mềm điều khiển Chromeleon



Giao diện phần mềm Chromeleon của máy HPLC Ultimate 3000 Hình 2.2.

2.2.1.2 Khảo sát cột sắc ký lỏng

a) Bàn luận hướng nghiên cứu:

Khi nghiên cứu cấu tạo và tính chất của ALA, cho thấy ALA là hoạt chất có khối lượng phân tử nhỏ (<5000g/mol), tan tốt trong các dung môi hữu cơ Vì vậy nghiên cứu này lựa chọn phương pháp sắc ký pha đảo với 2 loại cột sau:

 C18–Octadecyl silane: Octadecyl silane liên kết với silicagel xốp kích thước từ

Bảng 2.1 Danh mục các loại cột khảo sát trong quá trình nghiên cứu

1 Lichrospher Rp-18e (5μm) Merck 150x4.6 mm

2 Purospher Star RP-18e (5μm) Merck 2504.6 mm

3 Purospher Star RP-18e (5μm) Merck x4.6 mm

a) Bàn luận hướng nghiên cứu:

Việc lựa chọn pha động phải yêu cầu: Hòa tan được mẫu phân tích, phải trơ với pha tĩnh, bền vững theo thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký, phù hợp với các loại đầu dò để phát hiện chất phân tích, có độ nhớt thấp

để tránh áp suất dội lại cao, ngoài ra phải có tính kinh tế

Bảng 2.2 Đặc điểm các dung môi làm pha động thường dùng trong sắc ký pha đảo [7]

Dung môi Độ phân

cực (ɛ)

Độ rửa giải (ξ)

Độ nhớt (25 o C), cP

Chỉ số khúc xạ (25 o C)

Nhiệt độ sôi o C

Ngoài ra ở các dạng chất hữu cơ trong mẫu nghiên cứu thường tồn tại ở các dạng muối và kết tinh trên cột khi gặp MeOH hay ACN chính vì vậy cần sử dụng môi trường pH thấp để tránh tắt nghẽn cột Các loại acid thường dùng trong HPLC thường acid yếu như: acid acetic, acid formic, acid phosphoric…

Khảo sát các loại acid trên ta thấy acid phosphoric H3PO4 tốt nhất Ngoài ra nó

là acid vô cơ, ít hấp thụ ở các bước sóng tử ngoại Tiến hành khảo sát nồng độ phù hợp nhất của acid H3PO4 sao cho pH phù hợp tách tốt mà không làm ảnh hưởng đến biến đổi trong pha tĩnh

Bên cạnh H3PO4, sau khi khảo sát thăm dò các loại dung môi ở bảng trên nhận thấy ACN là dung môi hữu cơ phù hợp nhất Acetonitril cung cấp lợi ích kép là gây nhiễu thấp do độ hấp thụ UV ở mức kém và tuổi thọ của cột được kéo dài, cũng như

nó cho phép việc phân tích diễn ra ở áp suất thấp nên sẽ chọn ACN phối hợp với

H3PO4 làm pha động để khảo sát nghiên cứu

Thể tích tiêm: 20µl

Nhiệt độ cột: 30oC Cột tách: RP-18e (5μm; 250 x 4.6mm) Pha động: Lựa chọn tỉ lệ ACN: H3PO4

 Các nồng độ H3PO4 dưới đây hay dùng trong sắc kí lỏng pha đảo nên sẽ chọn thứ tự để khảo sát và chọn ra nồng độ nào phù hợp nhất cho quá trình phân tích

2.2.1.4 Khảo sát bước sóng [11]

a) Bàn luận hướng nghiên cứu:

Trong phần khảo sát pha động, cài đặt trong hệ thống phân tích sắc ký với đầu dò DAD điều kiện quét phổ UV-VIS từ 190nm đến 700nm Nhận thấy ở bước sóng từ 190nm đến 220nm độ hấp thu của ALA cho những tín hiệu tốt Việc quét phổ UV-Vis

ở trên máy HPLC khác với quét trên máy quang phổ Như hình 3.9 quá trình quét phổ này được chia làm 3 vùng trên một pic bao gồm vùng: Upslope 50%; Apex 100%; Downslope 50% Từ 2 vùng 50% trước và sau một pic để đối chiếu với vùng chính giữa 100% cho ra độ phù hợp hay còn gọi là độ tinh khiết của pic Độ tinh khiết > 999

là đạt yêu cầu

Nghiên cứu này tiến hành khảo sát ở 4 bước sóng sau đây: 208nm, 215nm, 218nm, 220nm Riêng các bước sóng gần và dưới 200nm không thực hiện khảo sát vì đây là vùng giới hạn dưới của đèn HPLC nên dễ gây sai số

Phổ UV-VIS của hoạt chất ALA Hình 2.3.

b) Cách tiến hành:

 Tiến hành với điều kiện sắc ký sau:

Cột tách: RP-18e (5μm; 250 x 4.6mm)

Hệ pha động: ACN: 0,025M H3PO4 (40:60), (v/v) Bước sóng: 208nm, 215nm, 218nm, 220nm Thể tích tiêm: 20µl

Tốc độ dòng: 1,5ml/min

 Pha dung dịch chuẩn: Thực hiện với 5 nồng độ 0,1mg/ml; 0,2mg/ml; 0,3mg/ml; 0,4mg/ml; 0,5mg/ml (Đây là khoảng nồng độ làm việc sau này khi phân tích mẫu) Các dung dịch chuẩn này được pha trong dung dịch ACN Sau đó xây dựng đường chuẩn để tìm ra ở bước sóng nào tốt nhất để lựa chọn phân tích

2.2.1.5 Lựa chọn tốc độ dòng

a) Bàn luận hướng nghiên cứu:

Tốc độ dòng cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hường đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động

Tuy nhiên quá trình phân tích mẫu nếu có hiện tượng chồng pic giữa các chất với nhau ta có thể thay đổi tốc độ dòng sao cho phù hợp Điều này được quy định khá

rõ trong Dược điển Việt Nam: Tốc độ dòng có thể thay đổi ± 50% so với phương pháp phân tích ban đầu hay qui trình phân tích

b) Cách tiến hành:

Ở phần nghiên cứu hệ pha động và các điều kiện pha động với hệ dung môi là ACN:H3PO4 0,025M (40:60);(v/v), các giá trị tốc độ dòng được khảo sát là 0,9ml/min;

1,1ml/min; 1,3ml/min; 1,5ml/min; 1,7ml/min

Quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm

2.2.2.

2.2.2.1 Khái niệm về quy hoạch thực nghiệm

Quy hoạch thực nghiệm là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng

Đối tượng quy hoạch thực nghiệm là một quá trình hoặc hiện tượng nào đó có những tính chất, đặc điểm chưa biết cần nghiên cứu Người nghiên cứu có thể chưa hiểu biết đầy đủ về đối tượng nhưng đã có một số thông tin tiên nghiệm (dự đoán) dù chỉ là sự liệt kê sơ lược những thông tin biến đổi, ảnh hưởng đến tính chất đối tượng

2.2.2.2 Khái niệm về tối ưu hóa

Tối ưu hóa là quá trình tìm kiếm điều kiện tối nhất (điều kiện tối ưu) của hàm

số được nghiên cứu Đây là quá trình xác định cực trị của hàm hay tìm điều kiện tối ưu tương ứng để thực hiện một quá trình cho trước

Để đánh giá điểm tối ưu thì cần lựa chọn chuẩn tối ưu

2.2.2.3 Các bước quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm [5]

Quy hoạch thực nghiệm bằng phương pháp trực giao bậc 2:

 Lựa chọn yếu tố và mức yếu tố ảnh hưởng, xác định tâm quy hoạch, khoảng biến thiên

 Xây dựng mô hình ma trận hóa với số lần thực hiện N thí nghiệm: N = 2k + 2k + no

Trong đó:

2k là số thí nghiệm ở nhân phương án

2k là số thí nghiệm ở các điểm (*) (Ví dụ: k = 3, 2k = 6, số thí nghiệm tại 9,10,11,12,13,14 có các tọa độ +α 0 0; -α 0 0 ; 0 +α 0; 0 –α 0; 0 0 +α; 0 0 –α)

 Thực hiện thí nghiệm theo mô hình đã thiết lập lấy kết quả để xây dựng phương trình hồi quy

 Phương pháp trực giao cấp 2 có phương trình hồi qui có dạng sau: Y1 = b0 +

b1x1 + … + bkxk + b12x1x2 + … + b11x12 + … + bkkxk2

Sau khi thực hiện quy hoạch xong kiểm tra phương trình hồi quy nếu tương thích và phù hợp với thực nghiệm thì ta tiến hành thực hiện các phương pháp tối ưu thực nghiệm tìm ra các thông số của các yếu tố phù hợp nhất bằng nhiều phương pháp khác nhau

Để nhanh chóng và thuận lợi, các công việc quy hoạch và tối ưu hóa được thực hiện trên phần mềm Modde 5

2.2.2.4 Xây dựng điều kiện xử lý mẫu bằng quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm

a) Bàn luận hướng nghiên cứu

Nhận thấy ALA hòa tan tốt trong ACN và các dung môi hữu cơ, vì vậy nghiên cứu này dùng ACN để chiết xuất lượng hoạt chất ALA trong mẫu thử Ngoài ra vì trong thực phẩm chức năng có nhiều thành phần phức tạp nên cần phối hợp tỷ lệ thích hợp giữa ACN: H2O để tăng khả năng chiết xuất và hòa tan mẫu

Việc chiết tách ALA yêu cầu phải trộn đều mẫu, nghiền mẫu thật kỹ, để đảm bảo tính đồng nhất Quá trình chiết tách được tiến hành trong thiết bị siêu âm ở điều kiện nhiệt độ nhất định Chính vì vậy cần khảo sát điều kiện nhiệt độ môi trường chiết tách và thời gian siêu âm để hòa tan và chiết hoàn toàn lượng ALA ra khỏi mẫu phân tích

Để tính toán và xây dựng quy trình xử lý mẫu, công việc xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm Modde 5, sử dụng phương pháp quy hoạch trực giao cấp 2 và tối ưu hóa trực tiếp trên phần mềm

Việc chọn mẫu nghiên cứu: Do không biết chính xác được hàm lượng hoạt chất ALA trong các mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường, vì vậy rất khó để xác định việc chiết tách và hòa tan mẫu có hoàn toàn hay không Do đó nghiên cứu này sử dụng nền mẫu tự tạo là nền mẫu đã biết trước nồng độ ALA Nền mẫu này là nền mẫu thực phẩm chức năng không có ALA nhưng sau đó được bổ sung một lượng ALA nhất định

để đưa vào nghiên cứu

Mục đích yêu cầu là hàm mục tiêu sao cho lượng ALA được hòa tan và chiết tách là lớn nhất và lượng này phải đảm bảo điều kiện thu hồi trong phụ lục F của AOAC

b) Cách tiến hành

Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn ALA:

Mẫu thử: Sử dụng nền mẫu thực phẩm chức năng tự tạo có bổ xung thành



phần (Tinh bột; Saccharose; Acetanilid; Lipid) mang đặc trưng gần giống dạng thực phẩm nhất gồm (Đường; protein; béo; chất xơ), sau đó được bổ sung thêm một lượng chuẩn vào mẫu, tiến hành nghiền mịn, trộn đều và đồng nhất mẫu Mẫu này có nồng

độ 500mg/g ALA (Ta chọn nồng độ này vì đa số các dạng thuốc thực phẩm chức năng trên thị trường bao gồm viên ALA 600mg, 300mg, 100mg có hàm lượng như vậy)

Chuẩn bị mẫu thử: Cân khoảng 0,2g mẫu thử (tương ứng với 100mg ALA)

 Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân tương ứng khoảng 100mg ALA + 5ml NaOH 0,1N rồi lắc đều, định mức vừa đủ 100 ml bằng dung dịch ACN Hút chính xác 10ml dung dịch này cho vào bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất và lắc đều

Sau khi chuẩn bị xong ta tiến hành thực hiện thí nghiệm theo mô hình quy hoạch

và tối ưu hóa thực nghiệm trên phần mềm Mode 5

Xác nhận giá trị của phương pháp

2.2.3.

2.2.3.1 Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất Cụ thể, trong phép phân tích định tính, là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác

Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích

a) Bàn luận hướng nghiên cứu

Việc xác định tính đặc hiệu được thực hiện bằng cách sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích: Mẫu trắng, mẫu chuẩn và 03 nền mẫu thử có chất phân tích gồm thuốc tiêm truyền, thuốc viên nén, thuốc viên nang (theo mục 2.1.1)

Một số yêu cầu:

Ghi lại các sắc ký đồ: Xác định thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích; so



sánh chồng phổ UV-VIS của píc của mẫu thử với mẫu chuẩn

Sắc ký đồ của dung dịch thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý



nghĩa thống kê với các pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn (thường trên mặc định của máy sắc ký do nhà sản xuất thì độ lệch thời gian lưu giữa chuẩn và thử không quá 5%) Trên sắc ký đồ của mẫu thử pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn khỏi các pic khác nếu có trên nền mẫu

Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không xuất hiện pic ở trong khoảng thời



gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn

Pic của chất cần phân tích trong sắc ký đồ của dung dịch thử phải tinh khiết,

 Nền mẫu 3: Lấy 20 viên nang mềm, lấy hỗn dịch trong nang trộn đều Cân

và xử lý mẫu theo quy trình trên

2.2.3.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn này), tại đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính như đã nêu

Đường chuẩn được tính bằng chất chuẩn tinh khiết, thường trong thực phẩm hay thực phẩm chức năng người ta lấy ít nhất 05 điểm chuẩn đem đo lấy tín hiệu chuẩn

để khảo sát và biều diễn phương trình đường chuẩn Phương trình đường chuẩn có dạng: y = ax + b và được đánh giá bằng hệ số tương quan R2 R2 càng tiệm cận với 1,000 càng tốt

Đường chuẩn và phuơng trình hồi quy của một chất Hình 2.4.

a) àn luận hướng nghi n cứu [6]

Việc khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp liên quan đến các giá trị sau:

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 5 nồng độ) Xác định các giá trị đo



được y theo nồng độ x (lặp lại 2 lần lấy giá trị trung bình) Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình:

Y = ax + b Trong đó: a: giá trị độ dốc Slope

b: giá trị hệ số chặn intercept

và hệ số tương quan:

∑ ̅ ̅̅̅

√∑ ̅ ∑ ̅ Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:



 Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ tiêu đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêu cầu là hệ số tương quan hồi quy (Coefficient of correlation) R phải đạt yêu cầu sau :

0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2

≤ 1 : Có tương quan tuyến tính rõ rệt

 Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Sau khi lập đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn, từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức sau :

y = 99,9686x + 0,0960 R² = 1,0000

0 10

Trong đó :

Δi : Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct : Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc : Nồng độ của các điểm chuẩn

Theo quy định của nhiều tổ chức của Mỹ, Canada, Châu Âu, giá trị Δkhông được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ [6]

b) Cách tiến hành

Chuẩn bị chất chuẩn: Cân tương ứng khoảng 50mg chuẩn ALA + 5ml NaOH 0,1N, lắc đều, định mức vừa đủ 100 ml bằng dung dịch ACN:H2O (63:37); (v/v) Hút chính xác 5,8,10,20,25 ml dung dịch này cho vào bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất và lắc đều Nồng độ chuẩn từ 0,05mg/ml đến 0,25mg/ml

Điều kiện sắc ký chạy như quy trình trên

2.2.3.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn đ nh lư ng

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng)

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử

mà có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn

LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng

a) Bàn luận hướng nghiên cứu [6]

Cách tính giới hạn phát hiện (LOD) dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu (S/N) Cách này áp dụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các công cụ có nhiễu đường nền Thông thường cách tính này áp dụng phổ biến cho các phương pháp sắc ký, điện di

Một số yêu cầu :

Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp



có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại 3-4 lần Xác định

tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

Trong đó : S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích

đường nền, thông thường lấy S/N =3

Xác định LOD, LOQ bằng nhiễu đường nền Hình 2.5.

Tính giới hạn định lượng (LOQ) dựa trên tính hiệu nhiễu cách này chỉ áp

đường nền, thông thường thường lấy S/N = 10

Tuy nhiên phương pháp này đang dùng để định lượng nên ta chỉ cần quan tâm

2.2.3.4 Đánh giá độ chụm của phương pháp

Trong nhiều trường hợp các phép thử nghiệm trên những đối tượng và với những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau Điều này do các sai

số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, người thao tác không thể kiểm soát được hoàn toàn tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm Do đó, để kiểm soát được các sai số này, phải dùng đến khái niệm độ chụm Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn

Độ chụm có thể phân ra thành ba trường hợp sau: Độ lặp lại; Độ chụm trung gian; Độ tái lặp nội bộ

Đối với phương pháp thẩm định ở phòng thí nghiệm thì cần xác định độ lặp lại

và độ tái lặp nội bộ Còn độ chụm trung gian cần sự phối hợp nhiều phòng thí nghiệm nên có thể tham gia đánh giá liên phòng hoặc thử nghiệm thành thạo để đánh giá kết quả này

a) Tính toán độ lặp lại [19]

Chuẩn bị một lượng mẫu đủ để phân tích lặp lại tối thiểu 7 đến 10 lần, mẫu phải đảm bảo độ bền, không biến tính trong suốt thời gian phân tích Bố trí thí nghiệm độc lập cho từng loại nền mẫu khác nhau Tiến hành thực hiện phép thử trong thời gian một ngày đối với kiểm nghiệm viên 1 và lặp lại 10 lần đối với từng nền mẫu Thực hiện xử lý mẫu và phân tích mẫu theo đúng quy trình cần đánh giá

Xử lý kết quả:

 Độ lặp lại của kết quả đo được tính theo công thức sau:

 Với: ̅ là giá trị trung bình của n lần đo và Sr được tính là độ lệch chuẩn của

n lần đo theo công thức sau:

Theo AOAC, đối với phòng thí nghiệm để đạt kết quả tốt nhất, giới hạn cho phép đối với độ lặp lại nên nằm trong khoảng ½ giá trị RSDr (Horwitz) Do đó, phòng thí nghiệm áp dụng tiêu chuẩn chấp nhận đối với RSDr(thực nghiệm) là:

RSDr < PRSDr = 1/2RSDr (Horwitz)

Áp dụng tỷ lệ Horwitz – HorRat (r) (là tỷ số giữa RSDr (thực nghiệm) và PRSDr) để đánh giá khả năng áp dụng phương pháp Phương pháp được chấp nhận khi

tỷ số HorRat (r) nằm trong khoảng từ 0,3 đến 1,3

b) Tính toán độ tái lặp nội bộ [6]

Chuẩn bị một lượng mẫu đủ lớn cho quá trình phân tích kéo dài cho các nền mẫu Thực hiện phân tích ở mức nồng độ trong khoảng làm việc của phương pháp Hai kiểm nghiệm viên tiến hành phân tích trong thời gian 10 ngày làm việc, mỗi người phân tích

bộ thì yêu cầu ít khắc khe hơn là độ lặp lại

2.2.3.5 Đánh giá độ đúng của phương pháp

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng

Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng (gọi là giá trị đúng)

a) Bàn luận hướng nghiên cứu

Để đánh giá độ đúng của phương pháp, cần tiến hành đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp bằng cách sử dụng nền mẫu là các mẫu được chuẩn bị tại phòng thí nghiệm Đây chính là các mẫu được sử dụng để đánh giá độ chụm của phương pháp với 3 nền mẫu Tính toán lượng cân thử và tiến hành thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ làm việc của phương pháp là 50%; 100%; 150%

tiêu thuộc nhóm độc, có quy định giới hạn cho phép) thêm chuẩn vào mẫu ở 3 mức nồng độ tại 0,5 lần, 1 lần và 2 lần Đối với phương pháp đánh giá thực phẩm chức năng ta chỉ cần thêm chuẩn vào mẫu 0,5; 1; 1,5 lần như trên

Mỗi nền mẫu lặp lại 4 lần



Đo mẫu đã chuẩn bị, khi đó độ thu hồi được tính như sau [6]:



Trong đó:

F là tổng hàm lượng ALA của mẫu đã thêm chuẩn

I là hàm lượng ALA của mẫu nền (là hàm lượng trung bình ở độ lặp lại của phần độ chụm)

(F-I) là hàm lượng thêm tính được theo thực tế

A là hàm lượng chuẩn thêm vào tính toán trên lý thuyết

Đánh giá độ thu hồi theo phụ lục F của AOAC, tùy theo nồng độ các chất phân tích

b) Cách tiến hành

Cân tương ứng 25mg ALA có trong từng nền mẫu thử, thêm một lượng chuẩn tương ứng 25mg; 75mg; 125mg, để có hàm lượng trong mẫu là 50mg; 100mg; 150mg (tương ứng với khoảng hàm lượng làm việc của phương pháp là 50%; 100%; 150%)

Tiến hành xử lý và phân tích mẫu theo quy trình, mỗi nền mẫu phân tích lặp lại

4 lần ở 3 khoảng nồng độ làm việc của phương pháp

2.2.3.6 Đánh giá độ không đảm bảo đo

Độ không đảm bảo đo của phép đo là thông số gắn với kết quả của phép đo, thông số này đặc trưng cho mức độ phân tán của các giá trị có thể chấp nhận được quy cho đại lượng của phép đo

Độ không đảm bảo đo nói lên độ tin cậy của phép đo

Các nguồn gây ra độ không đảm bảo đo thường là: mẫu thử, điều kiện bảo quản, quá trình chuẩn bị mẫu, dung môi thuốc thử, thiết bị, con người và các nguồn ngẫu nhiên khác

a) Bàn luận hướng nghiên cứu

Hiện nay đánh giá độ không đảm bảo đo có nhiều cách trong đó bao gồm: Cách thứ nhất tính từ tất cả các yếu tố cấu thành nên nó theo hướng dẫn của EURACHEM (Sử dụng biểu đồ xương cá tính các sai số của thiết bị; hóa chất; con người….) và cách thứ hai là ước lượng độ không đảm bảo đo tổng từ việc bố trí thí nghiệm và xác định theo phương pháp thống kê

Đối với một phương pháp đã thẩm định việc tính toán độ không đảm bảo đo

theo từng bước như cách thứ nhất rất tốn kém thời gian và công sức nên ở đây ta chỉ cần tính theo cách hai là đủ tính khoa học và tiết kiệm

Độ không đảm bảo đo được tính theo công thức sau [6]:

(%) CV t

(%)

Trong đó: U: Độ không đảm bảo đo tổng (%)

CV: Hệ số biến thiên của kết quả đo hay còn gọi là RSD (%) n: Số lần phân tích lặp lại

k ,

t : Giá trị t tra bảng với mức ý nghĩa α = 0,05; bậc tự do k = n-1 (Với 20 lần thì tα,k = 1,729)

b) Cách tiến hành

Phân tích 3 nền mẫu như trên, mỗi nền mẫu lặp lại 20 lần tính kết quả các lần



phân tích (Các lần phân tích nên được bố trí các ngày khác nhau)

Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên của kết quả phân