BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀPHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀPHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN KÉM PHÂN CỰC CỦA THỔ PHỤC LINH
(SMILAX GLABRA ROXB LILIACEAE)
Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương
Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀPHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN KÉM PHÂN CỰC CỦA THỔ PHỤC LINH
(SMILAX GLABRA ROXB LILIACEAE)
Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương
Ký tên
Thành phố Hồ Chí Minh – 2019
Trang 3MỤC LỤC
I ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1
II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 1
2.1 Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất và dụng cụ nghiên cứu…… 1
2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 2
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 5
3.1 Kết quả thử tinh khiết……… 5
3.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của Thổ phục linh… 5
3.3 Chiết xuất và phân tách các phân đoạn………6
3.4 Phân lập các phân đoạn trong cao ether dầu hỏa……… 7
3.5 Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập (SGH1 và SGM2)………… 10
3.6 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập………10
IV KẾT LUẬN ……… ……… 13
V TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 14
Trang 4I ĐẶT VẤN ĐỀ:
Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau
không chỉ ở Việt Nam mà còn nhiều nước trên thế giới, nhất là khu vực châu Á để làm thuốc chữa giang mai, đau xương, lợi tiểu, giải độc cơ thể, đặc biệt là nhiều bệnh liên quan tới viêm như: viêm gan, viêm thận, viêm da, chàm [10], [13], [53]
Mặc dù được dùng rộng rãi tuy nhiên ở Việt Nam, đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Thổ phục linh Để bổ sung cơ sở khoa
học, làm sáng tỏ tác dụng của Thổ phục linh, đề tài “Nghiên cứu hóa học và phân lập
một vài hợp chất trong phân đoạn kém phân cực của Thổ phục linh Smilax glabra
Roxb., Smilacaceae” được tiến hành với các nội dung sau:
- Thu mẫu và nghiên cứu thành phần hóa thực vật
- Chiết xuất hoạt chất toàn phần bằng EtOH
- Phân tách cao cồn thành các phân đoạn đơn giản
- Phân lập một vài hợp chất trong phân đoạn n-hexan
II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất và dụng cụ nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
Thân rễ Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) được thu hái tại Lâm Đồng từ tháng 9 đến
tháng 10 năm 2015 Nguyên liệu được rửa sạch, thái lát, phơi sấy khô và xay thành bột, bảo quản ở nhiệt độ phòng
2.1.2 Nguyên liệu, dung môi, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
- Dung môi dùng cho chiết xuất: cồn 96%
- Dung môi dùng lắc phân bố: petrolium ether, cloroform, ethyl acetat
- Dung môi dùng khai triển sắc kí: n-hexan, petrolium ether, cloroform, dicloromethan,
ethyl acetat, methanol
- Các thuốc thử: Fehling, Mayer, Dragendoff, Bouchardat, Folin Ciocalteur, VS, FeCl3
Trang 5- Ngoài ra còn có các hóa chất khác: HCl, H2SO4, KOH, Na2SO4,,HCOOH
- Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254
2.1.3 Dụng cụ trang thiết bị:
- Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18
(250 × 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6 mm; 5 µm)
- SKLM dùng bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Art 1.05554)
- SKC dùng silica gel hạt vừa (Trung Quốc), cỡ hạt 40- 63µm và silica gel hạt mịn (Merck)
cỡ hạt 15- 40µm)
Máy cô quay Buchi R300 (Nhật Bản) Bể siêu âm Ultrasonic Bath (Đức) Tủ sấy Gallentkamp (Anh) Nồi cách thủy Memmert WB-14 (Đức) Cột sắc ký và các dụng cụ thí nghiệm thông thường trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược liệu và Phòng nghiên cứu hóa các hợp chất tự nhiên thuộc Trung tâm Đào tạo và nghiên cứu phát triển thuốc nguồn gốc tự nhiên – ĐH Y Dược Tp HCM
- Máy đo khối phổ (Micromass Quattro microTM API – Waters)
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) BRUKER - AV - 500, tại Viện hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam - Hà nội
- Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18
(250 × 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6 mm; 5 µm)
- Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng trên máy HPLC
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Thu hái định danh mẫu: khảo sát đặc điểm hình thái, định danh mẫu, lưu mẫu tại Bộ môn Dược liệu – khoa Dược – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
2.2.1 Xác định độ tinh khiết
- Xác định độ ẩm: Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.6, PL-182
- Xác định tro toàn phần và tro không tan trong HCl: Thực hiện theo Dược điển Việt
Nam IV, phụ lục 9.8 và phụ lục 9.7., phương pháp 1
2.2.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật: Theo phương pháp Ciuley cải tiến
2.2.3 Chiết xuất và phân tách các phân đoạn
Trang 6- Chiết bằng cồn etylic: Bột thân rễ Thổ phục linh được chiết bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 96 %, bã chiết tiếp với cồn 50 %
- Thu hồi cồn để được cao lỏng và phân bố lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm: n-hexan, CHCl3, ethyl acetat, n-butanol, bay hơi dung môi, thu được các cao tương ứng và chỉ sử dụng cao CHCl3 để phân lập các hợp chất 2.2.4 Phân lập, kết tinh và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký
2.2.4.1 SKC nhanh
Điều kiện SK:
- Cột sắc ký: 9 x 50 cm
- Pha tĩnh: silica gel hạt trung bình: (40-63 µm, Merck), khối lượng: 600 g.
- Mẫu: cao n-hexan.
- Dung môi khai triển: Như trong phần thực nghiệm.
- Thể tích mỗi lọ hứng: 100 ml
- Hệ dung môi cho SKLM kiểm tra các phân đoạn: Như trong phần thực nghiệm
2.2.4.2 Phân lập phân đoạn B (của cột VLC) bằng SKC cổ điển 1
Điều kiện SK:
- Cột sắc ký: 3 x 40 cm.
- Pha tĩnh: 150 g silica gel kích thước hạt hạt 0,040 – 0,063 mm (Merck).
- Mẫu: Cao phân đoạn 2 và 3 (phân đoạn B)
- Dung môi khai triển: Như trong phần thực nghiệm
- Thể tích hứng mỗi ống nghiệm: 20 ml
- Hệ dung môi cho SKLM kiểm tra các phân đoạn: Như trong phần thực nghiệm.
Kiểm tra và gộp các phân đoạn: hứng các phân đoạn, kiểm tra trên SKLM, phát hiện bằng đèn UV 254 nm, UV 365 nm và TT VS Các phân đoạn gần giống nhau được gộp chung lại, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (cô quay chân không)
2.2.4.3 Phân lập phân đoạn C (của SKC cổ điển 1) bằng sắc ký cột cổ điển 2
Điều kiện sắc ký cột:
- Cột sắc ký: 3,0 × 40 cm (đường kính × chiều dài), rửa sạch, sấy khô.
- Pha tĩnh: silica gel hạt trung bình: (40-63 µm), khối lượng: 100 g.
- Mẫu: 850 mg cao phân đoạn 3 và 4 (phân đoạn C) của cột cổ điển 1
Trang 7- Dung môi khai triển: Như phần thực nghiệm
- Thể tích hứng mỗi phân đoạn: 10 ml
- Hệ dung môi kiểm tra trên SKLM: Như phần thực nghiệm
2.2.5 Kiểm tra độ tinh khiết trên SKLM
Thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn với các hệ dung môi sau:
n-hexan – CHCl3 (25:75); CHCl3 – EtOAc (9:1); n-hexan – EtOAc (8: 2)
2.2.6 Xác định cấu trúc các chất phân lập
Chất tinh khiết được phân tích bằng phương pháp phổ khối (MS), HPLC-PDA, NMR, so sánh đối chiếu với các dữ liệu về phổ NMR, MS của các chất tương tự đã công bố trong tài liệu
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy BRUKER – AV – 500, tại Viện hóa học thuộc Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam – Hà nội Mẫu được hòa tan trong CD3OD hoặc CD3COCD3 với TMS là chất chuẩn nội Phổ proton (1H-NMR) được
đo ở 500 MHz, phổ carbon (13C-NMR) được đo ở 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học
được tính theo thang ppm (δTMS = 0) với chuẩn là tín hiệu của TMS Các hằng số ghép (J) tính bằng Hertz (Hz)
Trang 8III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Kết quả thử tinh khiết
Bảng 3.1 Kết quả tro toàn phần, tro không tan trong acid Lần thử P mẫu (g) Độ ẩm (%) Tro toàn phần (%) Tro không tan trong acid (%)
3.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của Thổ phục linh (Bảng 3.2.):
Bảng 0.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật.
Nhóm hợp
chất
Thuốc thử Cách thực hiện
Dịch chiết - Kết quả Kết luận
alkaloid
trong kiềm
Trang 9Saponin TT Liebermann + + Có
Sơ bộ kết luận: Thân rễ Thổ phục linh có chứa các thành phần: triterpenoid tự do,
flavonoid, anthocyanosid, proathocyanidin, tannin ,saponin, acid hữu cơ, chất khử.
3.3 Chiết xuất và phân tách các phân đoạn
Thân rễ Thổ phục linh (8 kg) được chiết ngấm kiệt bằng cồn 96% (80 L) và sau đó là cồn 50% (40 L) Cô thu hồi dung môi để được cao lỏng (cao cồn 96 % và 50 %) Kiểm tra các cao trên SKLM và nhận thấy 2 cao có thành phần khá giống nhau nên gộp chung Cao lỏng được chiết phân bố lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm: ether dầu hỏa, CHCl3, EtOAc và phần còn lại không tan vào 4 dung môi trên
Cô thu hồi dung và thu được các cao tương ứng
Kết quả chiết xuất và phân lập được trình bày trong sơ đồ Hình 3.1 và Bảng 3.3
Bảng 0.3 Các cao phân đoạn Thổ phục linh Dịch chiết Cao Khối lượng (g)
Phần còn lại, không tan trong các dung môi trên
Trang 10Hình 3.1 Sơ đồ chiết và phân tách các phân đọan của Thổ phục linh 3.4 Phân lập các phân đoạn trong cao ether dầu hỏa
3.4.1 Phân lập các phân đoạn trong cao ether dầu hỏa bằng SKC nhanh (VLC)
3.4.1.1 Khảo sát hệ dung môi phân tích cao ether dầu hỏa
Tiến hành thăm dò trên một số hệ dung môi và đã chọn được hệ n-hexan – EtOAc (4:6)
và hexan – methanol – a.formic (9:1:0,5) làm hệ dung môi sắc kí phân tích cho cao n-hexan
3.4.1.2 Phân lập các chất trong cao n-hexan bằng SKC chân không (VLC)
Điều kiện sắc ký VLC:
- Cột sắc ký: 7 x 40 cm
Bột Thổ phục linh)
Dịch chiết EtOH
)
EtOH 96%, 50% - chiết ngấm kiệt
Thu hồi EtOH
Bã Thổ phục linh
)
Cao EtOH lỏng
Ether dầu hỏa
EtOAc
CHCl 3
Cao lỏng Cao ether
Trang 11- Pha tĩnh: silica gel hạt trung bình (40-63 µm, Ấn Độ), khối lượng 600 g.
- Mẫu: 50 g
- Dung môi khai triển: Khai triển hệ dung môi với dung môi ban đầu là n-hexan và tăng dần tỉ lệ methanol cho đến n-hexan – methanol (8:2)
- Thể tích hứng mỗi phân đoạn: 100 ml
- Kiểm tra các phân đoạn trên SKLM với hệ dung môi: n-hexan – CHCl3 (4:6) và n-hexan – methanol – a.formic (7:3:0,1)
- Phát hiện bằng cách soi dưới đèn UV 254 nm, UV 365 nm và phun TT VS Theo dõi sắc ký đồ và gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu các phân đoạn khác nhau đó
Kết quả:
- Từ 50 g cao ether, qua sắc ký cột nhanh thu được 13 phân đoạn khác nhau.
- Kiểm tra các phân đoạn trên SKLM cho thấy phân đoạn 2 và 3 (gọi tắt là phân đoạn
B) có thành phần khá giống nhau nên gộp chung, thu hồi dung môi thu được 3,2 g cao,
có thể phân lập tiếp trên SKC cổ điển
- Các phân đoạn khác chưa nghiên cứu
3.4.2 Phân lập phân đoạn B của VLC bằng sắc ký cột cổ điển
3.4.2.1 Thăm dò hệ dung môi sắc ký: SKLM cao phân đoạn B với một số hệ dung môi,
phát hiện bằng UV 254/ 365 nm, thuốc thử VS và đã chọn được hệ n-hexan – EtOAc (8:2) có khả năng tách khá tốt cho SKC
3.4.2.2 Tiến hành phân lập bằng SKC cổ điển 1
Phân đoạn B (3,2 g) được sắc ký cột cổ điển với điều kiện:
- Chuẩn bị mẫu: hòa tan 3,2 g phân đoạn B trong một lượng tối thiểu CHCl3, lọc lấy dịch
và trộn với lượng tối thiểu silica gel cỡ hạt 40 – 63 µm để được bột khá tơi xốp
- Chuẩn bị cột: nạp 150g silica gel 40 – 63 µm dạng hỗn dịch trong dung môi nền n-hexan
- Pha động: n-hexan – EtOAc (8:2) Thể tích hứng mỗi phân đoạn 20 ml
Theo dõi thành phần của các phân đoạn bằng SKLM với dung môi khai triển n-hexan – EtOAc (4:6) và n- hexan – methanol – a.formic (9:1:0,5), phát hiện bằng UV 254/365
Trang 12nm Gộp các phân đoạn chứa các vết có Rf tương tự nhau.
Kết quả: Đã thu được 6 phân đoạn, trong đó:
- Phân đoạn 3 và 4 (phân đoạn C- 850 mg) có thành phần khá đơn giản có thể phân lập
tiếp bằng SKC
- Các phân đoạn khác có khối lượng nhỏ hoặc thành phần khá phức tạp nên chưa được nghiên cứu tiếp
3.4.3 Phân lập phân đoạn C của VLC bằng sắc ký cột cổ điển 2
3.4.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký cột:
- Cột sắc ký: 3,0 × 40 cm (đường kính × chiều dài), rửa sạch, sấy khô.
- Pha tĩnh: silica gel hạt trung bình: (40-63 µm), khối lượng: 100 g.
- Mẫu: 850 mg cao phân đoạn 3 và 4 (phân đoạn C) của cột cổ điển 1
- Dung môi khai triển: cloroform-EtOAc (95:5)
- Thể tích hứng mỗi phân đoạn: 10 ml
- Hệ dung môi kiểm tra trên SKLM: n-hexan – EtOAc (4:6) và n- hexan – methanol –
a.formic (9:1:0,5)
3.4.3.2 Tiến hành phân lập
Tiến hành phân lập trên SKC với điều kiện sắc ký như trên, sau khi sắc ký thu được 4 phân đoạn và được thể hiện trong Bảng 3.4
Bảng 3.4 Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển 2 Phân đoạn Hệ dung môi Phân đoạn hứng Khối lượng (mg) Ghi chú
1
CHCl3-EtOAc (95:5)
nhạt
nhạt
(90:10)
Ghi chú:
- Phân đoạn 3, xuất hiện kết tinh, lọc lấy tinh thể Kết tinh lại bằng cách hòa tan trong
Trang 13methanol, để lạnh, lọc lấy tinh thể, rửa bằng methanol lạnh, làm khô (150 mg) Kiểm tra bằng SKLM cho thấy chỉ có 1 vết trên bản mỏng, đặt tên là SGH1
- Phân đoạn 4: xuất hiện kết tinh, lọc lấy tinh thể Kết tinh lại bằng cách hòa tan trong methanol, để lạnh, lọc lấy tinh thể, rửa bằng methanol lạnh, làm khô (36 mg) Kiểm tra bằng SKLM cho thấy chỉ có 1 vết trên bản mỏng, đặt tên là SGH2
- Các phân đoạn còn lại không tiếp tục nghiên cứu
3.5 Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập (SGH1 và SGM2)
Các hợp chất SGH1 và SGM2 được hòa trong CHCl3, chấm đậm trên 3 bản mỏng có kích thước 5 x 10 cm
Triển khai SKLM với 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, bao gồm:
- n-hexan – CHCl3 (25:75)
- CHCl3 – EtOAc (9:1)
- n-hexan – EtOAc (8: 2)
Kết quả: Cả hai chất SGH1 và SGH2 đều chỉ cho 1 vết trên SKLM, phát hiện bằng soi
UV và thuốc thử VS
3.6 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập
3.6.1 Xác định cấu trúc của hợp chất SGH1
- SGH1 kết tinh (trong methanol) dạng tinh thể không màu, cho màu tím không bền với thuốc thử VS trên sắc ký lớp mỏng
- Trên phổ MS (APCI+), MO-1 cho phân mảnh có m/z 397,37 = [M-H2O+H]+, M=414,37, tương ứng với công thức C29H50O với =5
- Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) chất SGH1 có 28 tín hiệu carbon trong đó có 2 tín hiệu
140,7 và 121,7 ppm là của carbon olefin, có 1 tín hiệu carbon 71,8 ppm của carbon hydroxy, và có 26 tín hiệu carbon ở 12,0-56,7 ppm của các hydrocarbon sp3.
- Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của chất SGH1 có tín hiệu 5,36 ppm của hydro olefin, tín hiệu 3,52 ppm của carbinol Ngoài ra, có tín hiệu ở vùng 0,68-1,99 của các hydro sp3
- So sánh dữ liệu phổ của SGM1 với dữ liệu phổ của β-sitosterol thấy có sự phù hợp ( Bảng 3.5)
Trang 14Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR chất SGH1 so sánh với β- sitosterol
Vị trí
carbon
CHn
SGM1 (CDCl3, 500 MHz) β- Sitosterol (CDCl3 , 13 C-NMR
(100 MHz) бC (ppm)
Trang 153.6.2 Xác định cấu trúc của hợp chất SGH2
SGH2 là bột kết tinh thể hình kim nhỏ màu trắng, tan trong CHCl3, ít tan trong MeOH, EtOAc Trên bản mỏng silica gel F254; vết SGH2 không hiện vết dưới UV 254/365, cho
1 vết với thuốc thử VS
So sánh dữ liệu phổ 13C- NMR của SGH2 với dữ liệu phổ của stigmasterol cho thấy có sự tương tự nhau nên có thể kết luận SGH2 là stigmasterol
Kết quả ghi nhận ở Bảng 3.6
Bảng 3.1 Bảng so sánh phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của SGH2 và stigmasterol
Vị trí C
SGH2 (MeOH,500 MHz) Stigmasterol (CDCl 3 , 600 MHz)
3 71,6 3,50 (m, 1H, J = 6 Hz) 72,1 3,51 (tdd, 1H, J = 4,5; 4,2; 3,8 Hz)
5 140,8 5,34 (t, 1H, J = 2,5 Hz) 141,1 5,31 (t, 1H, J = 6,1 Hz)
19 21,2 0,89 (d,3H, J = 6,5 Hz ) 21,7 0,91 (d, 3H, J = 6,2 Hz)