Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử quercetin định hướng ứng dụng làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn tách quercetin có tính chọn lọc cao

MỤC TIÊU− Khảo sát phản ứng tổng hợp polymer − Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử quercetin Quercetin-MIPs − Ứng dụng Quercetin-MIPs làm pha tĩnh trong chiết pha rắn để tách và làm giàuqu

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ QUERCETIN ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN TÁCH QUERCETIN CÓ TÍNH CHỌN LỌC CAO

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: TS Phan Văn Hồ Nam

Tp Hồ Chí Minh, 03/2019

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ QUERCETIN ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN TÁCH QUERCETIN CÓ TÍNH CHỌN LỌC CAO

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên)

Tp Hồ Chí Minh, 03/2019

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN

CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

1 Chủ nhiệm đề tài: TS Phan Văn Hồ Nam

2 Thành viên tham gia đề tài: Phan Nguyễn Huy Việt

3 Đơn vị thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, khoa Dược, Đại học YDược TP.HCM

MỤC LỤC

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ

TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC PHỤ LỤC viii

MỞ ĐẦU 1

TÍNH CẤP THIẾT 1

MỤC TIÊU 3

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ 3

Đối tượng nghiên cứu 3

Dung môi-hóa chất 3

Trang thiết bị 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4

Biện luận công thức tổng hợp polymer ban đầu 4

Khảo sát tính tan của các thành phần trong các dung môi 5

Khảo sát điều kiện polymer hóa 5

Kiểm tra khả năng giữ quercetin trên polymer 5

Tồng hợp NIP 5

Tổng hợp MIP 5

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer bằng phổ UV-Vis 6

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer bằng phổ IR 6

Tạo hạt bằng phương pháp kết tủa 6

Tổng hợp NIP 6

Tổng hợp MIP: 6

Tạo hạt (tiểu phân nano - nanoparticles): 6

Kiểm tra khả năng lưu giữ quercetin của MIP, và khả năng rửa giải của các dung môi 7

Kiểm tra khả năng tái hấp phụ của MIP và NIP 7

Khảo sát dung môi tạo hạt polymer 8

Hiệu suất tạo hạt từ gel polymer 8

Nhồi cột SPE 9

Khảo sát tỷ lệ monomer chức năng 9

Khảo sát một số đặc tính của cột SPE 10

Khảo sát độ lặp lại 10

Khảo sát khả năng tải mẫu 10

Khảo sát sơ bộ độ chọn lọc 10

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 12

CHƯƠNG 1 BIỆN LUẬN CÔNG THỨC TỔNG HỢP POLYMER BAN ĐẦU 12

CHƯƠNG 2 KHẢO SÁT DUNG MÔI POLYMER HÓA 13

CHƯƠNG 3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN POLYMER HÓA 13

CHƯƠNG 4 KIỂM TRA KHẢ NĂNG GIỮ QUERCETIN TRÊN POLYMER 14

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer ở dạng màng mỏng bằng phổ

UV-Vis 14

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer ở dạng rắn bằng phổ IR 15

Kiểm tra sự có mặt của quercetin trong polymer ở dạng hạt bằng phổ UV-Vis 16

CHƯƠNG 5 KIỂM TRA KHẢ NĂNG TÁI HẤP PHỤ CỦA POLYMER18 CHƯƠNG 6 KHẢO SÁT DUNG MÔI TẠO HẠT POLYMER 19

CHƯƠNG 7 HIỆU SUẤT TẠO HẠT CỦA PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA 24 CHƯƠNG 8 KHẢO SÁT TỶ LỆ MONOMER CHỨC NĂNG 24

CHƯƠNG 9 KIỂM TRA KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG CỦA SPE 27

CHƯƠNG 10 KIỂM TRA TÍNH CHỌN LỌC CỦA MIP 28

KẾT LUẬN 31

ĐỀ NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 33

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

MIP Molecularly imprinted polymer Polymer đóng dấu phân tửNIP Non impringting polymer Polymer không đóng dấu

MISPE Molecularly imprinted solid-phase

extraction

Chiết pha rắn sử dụngpolymer đóng dấu phân tửlàm pha rắn

FT-IR Fourier transform infrared Quang phổ hồng ngoại

AFM Atomic Force microscopy Kính hiển vi lực nguyên tửSTM Scanning tunneling microscopy Kính hiển vi quét chui hầmSEM Scanning electron microscope Kính hiên vi quét điện

HPLC High performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Thành phần sơ bộ tổng hợp polymer đóng dấu phân tử 4

Bảng 2 Khảo sát tỷ lệ monomer chức năng 9

Bảng 3 Công thức tổng hợp polymer ban đầu dựa theo tài liệu tham khảo [1, 3, 11] 12

Bảng 4 Khảo sát dung môi polymer hóa 13

Bảng 5 Kết quả khảo sát thời gian polymer hóa ở những điều kiện nhiệt độ, quang hóa khác nhau 13

Bảng 6 Rửa giải MIP và NIP bằng các dung môi khác nhau (Phụ lục 4.8-4.16 ) 16

Bảng 7 Rửa giải ống 1,2,3,4 tiếp với dung môi Methanol: Acid acetic (9:1) 17

Bảng 8 Kiểm tra khả năng tái hấp phụ quercetin (Phụ lục 4.17-4.18) 18

Bảng 9 Khảo sát tính chất của hạt polymer trong các dung môi và tỷ lệ khác nhau 19

Bảng 10 Hiệu suất thu hạt 24

Bảng 11 Kết quả định lượng quercetin cột SPE công thức 1 25

Bảng 12 Kết quả định lượng quercetin cột SPE công thức 2 25

Bảng13: Kết quả định lượng quercetin cột SPE công thức 3 26

Bảng14: Kiểm tra khả năng tái sử dụng trên một cột SPE 27

Bảng15: Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của MIP công thức 2 28

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Quá trình tổng hợp MIP[7] 2

Hình 2 Quy trình khảo sát dung môi rửa giải 8

Hình 3 Phổ truyền qua của màng mỏng MIP và NIP 14

Hình 4 Phổ IR của MIP 15

Hình 5 Phổ IR của NIP 15

Hình 6 Phổ IR của MIP đã được rửa giải với Methanol:acid acetic (9:1) 16

Hình 7 Hình chụp các hạt polymer được tạo trong các dung môi khác nhau 23

Hình 8 Hạt phương pháp nghiền 23

Hình 9 Hạt phương pháp kết tủa 23

Hình 10 Sắc ký đồ dịch rửa NIP bằng methanol:acid acetic (9:1) 29

Hình 11 Sắc ký đồ dịch rửa MIP bằng methanol:acid acetic (9:1) 29

Hình 12 Sắc ký đồ dịch rửa MIP bằng methanol 29

Hình 13 Sắc ký đồ dịch rửa NIP bằng methanol 30

Hình 14 Sắc ký đồ methanol rửa MIP dư 30

Hình 15 Sắc ký đồ methanol rửa NIP dư 30

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Đường tuyến tính nồng độ và độ hấp thu của quercetin trong Methanol:acid

acetic (9:1) 33

Phụ lục 2: Đường tuyến tính nồng độ và độ hấp thu của quercetin trong Methanol 33 Phụ lục 3: Phổ chuẩn rutin 34

Phụ lục 4: Phổ chuẩn của quercetin 34

Phụ lục 5: Phổ rửa MIP công thức 3 bằng methanol:acid acetic 35

Phụ lục 6: Phổ rửa MIP công thức 1 bằng Methanol:acid acetic (9:1) 35

Phụ lục 7: Phổ truyền qua của MIP và NIP 36

Phụ lục 8 Phổ UV-Vis rửa MIP bằng n-butanol 36

Phụ lục 9: Phổ UV-Vis rửa MIP với n-butanol đến hết quercetin 37

Phụ lục 10: Phổ UV-Vis rửa methanol:acid acetic (9:1) sau khi rửa bằng n-butanol 37

Phụ lục 11: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng ethanol 38

Phụ lục 12: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng ethanol đến hết quercetin 38

Phụ lục 13: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng methanol:acid acetic (9:1) sau khi rửa bằng ethanol 39

Phụ lục 14: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng nước 39

Phụ lục 15: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng methanol 40

Phụ lục 16: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng methanol đến hết 40

Phụ lục 17: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng methanol:acid acetic (9:1) sau khi rửa bằng methanol 41

Phụ lục 18: Phổ UV-Vis rửa MIP được tái hấp phụ bằng methanol 41

Phụ lục 19: Rửa MIP bằng methanol tái hấp phụ đến hết 42

Phụ lục 20: Phổ UV-Vis rửa MIP tái hấp phụ bằng methanol: acid (9:1) sau khi rửabằng methanol 42Phụ lục 21: Đường tuyến tính thể hiện tương quan giữa nồng độ quercetin và diệntích đỉnh 43Phụ lục 22: Đường tuyến tính thể hiện tương quan giữa nồng độ rutin và diện tíchđỉnh 43Phụ lục 23: Tính tuyết tính tương quan giữa nồng độ quercetin và diện tích đỉnh 44Phụ lục 24: Tính tuyết tính tương quan giữa nồng độ quercetin và diện tích đỉnh 46Phụ lục 25: Tính tương thích hệ thống quercetin 1Phụ lục 26: Tính tương thích hệ thống Rutin 1

MỞ ĐẦU

TÍNH CẤP THIẾT

Tuy Việt Nam vẫn còn là một nước đang phát triển nhưng hiện nay đã ứng dụng cáccông cụ phân tích hiện đại có chi phí cao và đòi hỏi chuyên môn sâu để vận hành, điểnhình như HPLC, GC, SPE… Mặc dù vậy, các phương pháp này cũng chưa cho thấy hiệuquả trong một số trường hợp như tách các chất đồng phân, tách hoạt chất trong hỗn hợp

có nguồn gốc từ dược liệu [5]

Gần đây polymer đóng dấu phân tử (Molecular imprinted polymers – MIPs) nổi lên như

là một sự thay thế các tác nhân nhận diện sinh học như kháng nguyên, enzyme hay cácphân tử thụ thể khác Mặc dù những tác nhân nhận diện sinh học này có tính chọn lọc vàđặc hiệu nhưng thường không ổn định, đắt tiền và có mật độ vị trí gắn kết thấp Sự pháttriển phương pháp đóng dấu phân tử cung cấp một lựa chọn thay thế đầy hứa hẹn liênquan tới nhận diện phân tử sinh học Polymer đóng dấu phân tử đã được ứng dụng rộngrãi như chiết pha rắn, cảm biến, chất xúc tác, kháng nguyên nhân tạo, kháng thể nhântạo…[4]

Trong phương pháp tách và làm giàu các chất phân tích có nồng độ rất thấp như chiếtlỏng-lỏng, chiết pha rắn, kết tủa, cộng kết, sắc ký thì chiết pha rắn là phương pháp hiệuquả nhất Nhờ vào đặc tính chọn lọc, độ bền cơ học, bền với nhiệt cũng như giá thànhthấp và dể chế tạo Chính vì vậy polymer đóng dấu phân tử là một lựa tốt để thay thế cácpha tĩnh truyền thống trong chiết pha rắn [10]

Phương pháp polymer đóng dấu phân tử nhận diện phân tử dựa trên nguyên tắc “chìakhóa và ổ khóa” (Hình 1)

Quercetin, một flavonoid có nhiều lợi ích đã được chứng minh, được lựa chọn làm phân

tử mẫu để lần đầu tiên tại Việt Nam áp dụng kỹ thuật đóng dấu phân tử định hướng tạovật liệu pha tĩnh cho kỹ thuật chiết pha rắn - solid phase extraction (SPE), định hướngứng dụng chiết và làm giàu quercetin [8, 10]

Do đó, đề tài Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử quercetin định hướng ứng dụng

làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn tách Quercetin có mục đích là nghiên cứu

và ứng dụng phương pháp polymer đóng dấu phân tử vào trong chiết và làm giàuquercetin với những ưu điểm riêng của nó phù hợp điều kiện kinh tế Việt Nam hiện nay

MỤC TIÊU

− Khảo sát phản ứng tổng hợp polymer

− Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử quercetin (Quercetin-MIPs)

− Ứng dụng Quercetin-MIPs làm pha tĩnh trong chiết pha rắn để tách và làm giàuquercetin

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ

Đối tượng nghiên cứu

Quercetin-MIPs: Vật liệu polymer đóng dấu phân tử quercetin (quercetin-MIP) có khảnăng lưu giữ, hấp phụ, tái hấp phụ chọn lọc quercetin, định hướng sử dụng là pha tĩnhchiết pha rắn

Dung môi-hóa chất

Dung môi, hóa chất thuốc thử đạt độ tinh khiết tùy mục đích sử dụng

− Nguyên liệu quercetin hàm lượng 95% xuất xứ Việt Nam

− 4-vinylpyridin (4-VP), acid methacrylic (MAA), ethylene glycol dimethacrylate(EDMA), Azobisisobutyronitril (AIBN) được sản xuất bởi Sigma-Aldrich

− Aceton, methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol, acid acetic, cloroform, n-hexanxuất xứ Trung Quốc

− Methanol, acetonitril, nước cất dành cho sắc ký lỏng

Trang thiết bị

Các thí nghiệm được thực hiện tại bộ môn Phân tích-Kiểm nghiệm Khoa Dược, Đại học

Y Dược thành phố Hồ Chí Minh với các trang thiết bị như sau:

− Máy cô quay chân không R-210S (Bucchi)

− Bếp cách thủy Memmert WB-14, tủ sấy Memmert WM 500 CO

− Bể siêu âm Elma-Đức

− Cân điện tử phân tích HR-200, cân điện tử kỹ thuật

− Máy HPLC Alliance Waters 2695-PDA

− Máy quang phổ UV Shimadzu UV-2450

− Máy khuấy từ gia nhiệt IKA

− Spin-coater

− Kính hiển vi Olympus CH20

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Biện luận công thức tổng hợp polymer ban đầu

Bảng 1 Thành phần sơ bộ tổng hợp polymer đóng dấu phân tử.

Dung môi tổng hợp polymer 300 μl

Dựa trên tài liệu tham khảo, công thức theo Bảng 1 được đưa ra làm cơ sở tiến hànhnghiên cứu Công thức thành phần tổng hợp polymer sử dụng 4-vinylpyridin, acidmethacrylic làm monomer chức năng, ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) là chấttạo liên kết chéo, azobisisobutyronitrile (AIBN) làm chất khơi mào

Khảo sát tính tan của các thành phần trong các dung môi

Dung môi sử dụng làm dung môi tổng hợp polymer phải hòa tan được các monomerchức năng, phân tử mẫu, chất tạo liên kết chéo, chất khởi tạo thì các thành phần này mới

có thể tương tác với nhau để thực hiện phản ứng polymer hóa Tổng hợp quercetin-MIPcho quercetin sử dụng liên kết hydro làm tương tác chính giữa monomer chức năng vàphân tử quercetin, do đó dung môi làm dung môi tổng hợp polymer không được quáphân cực vì nó sẽ cạnh tranh liên kết hydro giữa monomer chức năng và phân tử mẫu.Khảo sát các dung môi: methanol, isopropanol, aceton, tetrehydrofuran, cloroform,aceton + acid acetic

Khảo sát điều kiện polymer hóa

Chuẩn bị công thức polymer như Bảng 1 Thực hiện phản ứng polymer hóa ở các điềukiện khác nhau: nhiệt độ 45 oC, 60 oC, 75 oC hoặc chiếu tia UV 365 nm đến khi polymerhình thành trạng thái gel (gel point) , giai đoạn mà các oligomer được hình thành

Kiểm tra khả năng giữ quercetin trên polymer

Tồng hợp NIP

Tổng hợp polymer có thành phần như Bảng 1 tuy nhiên không thêm quercetin Polymerhóa ở điều kiện được lựa chọn trong mục “Khảo sát điều kiện polymer hóa” đến khi hỗnhợp đạt trạng thái gel, sử dụng polymer gel này cho các bước tiếp theo

Tổng hợp MIP

Tổng hợp polymer có thành phần như Bảng 1 Polymer hóa ở điều kiện được lựa chọntrong mục “Khảo sát điều kiện polymer hóa” đến khi hỗn hợp đạt trạng thái gel,sử dụngpolymer gel này cho các bước tiếp theo

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer bằng phổ UV-Vis

Khi các chuỗi polymer vẫn ở dạng oligomer thì nó ở dạng gel, có khả năng bám dính.polymer gel tạo thành được dàn thành màng mỏng trên mặt kính Tiếp tục polymer hóa

ở nhiệt độ 75oC trong 3 giờ đến khi màng trên mặt kính cứng lại

Đo phổ truyền qua của polymer NIP và MIP trước và sau khi rửa giải với dung môi khácnhau: nước, methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol So sánh phổ của NIP và MIP đểxác định sự tồn tại quercetin trong polymer

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer bằng phổ IR

Thực hiện phản ứng polymer đến khi polymer hình thành trạng thái rắn, nghiền mịn Đophổ IR của MIP và NIP trước và sau khi rửa giải So sánh phổ của NIP và MIP để xácđịnh sự tồn tại quercetin trong polymer

Tạo hạt bằng phương pháp kết tủa

Tổng hợp NIP

Thực hiện tương tự mục “Kiểm tra khả năng giữ quercetin trên polymer”

Tổng hợp MIP:

Thực hiện tương tự mục “Kiểm tra khả năng giữ quercetin trên polymer”

Tạo hạt (tiểu phân nano - nanoparticles):

Cho 200 μl gel tạo được vào trong ống nghiệm thủy tinh 12 ml có nắp đậy có chứa sẵn5ml dung môi (nước cất 2 lần, methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol) Vortex trong

1 phút, khuấy từ với tốc độ 2000 rpm trong 12 giờ Hỗn hợp thu được dạng hỗn dịch vớicác hạt polymer có kích thước hàng micromet đến nanomet

Kiểm tra khả năng lưu giữ quercetin của MIP, và khả năng rửa giải của các dung môi

Đem hỗn dịch trên đi ly tâm 4000 vòng trong 5 phút, bỏ phần dịch, thu được các hạtpolymer (MIP hoặc NIP) Rửa sạch các hạt bằng aceton để loại bỏ phần dịch dư cóquercetin, đảm bảo không còn bám trên bề mặt của hạt và thành ống nghiệm

Sử dụng các dung môi khác nhau để rửa giải các hạt polymer tạo được bằng cách cho5ml dung môi vào ống nghiệm chứa hạt polymer, vortex trong 2 phút, sau đó ly tâm ởtốc độ 4000 rpm trong 5 phút lấy phần dịch đem quét phổ hấp phụ ở bước sóng 600 -

200 nm để xác định sự có mặt quercetin

Kiểm tra khả năng tái hấp phụ của MIP và NIP

Rửa tủa hạt polymer (MIP hay NIP) bằng dung môi methanol:acid acetic (9:1) đến khikhông còn quercetin trong cấu trúc polymer (dung dịch rửa không có quercetin) Cho 1

ml dung dịch quercetin nồng độ 1mg/ml trong aceton vào ống nghiệm chứa tủa hạt đãsạch quercetin Vortex trong vòng 5 phút, sau đó đem ly tâm với tốc độ 4000 rpm trong

5 phút Loại bỏ phần dịch và rửa với aceton để đảm bảo không còn quercetin thừa khônghấp phụ trong polymer Rửa tủa hạt polymer bằng dung môi methanol và methanol:acidacetic (9:1), đo quang phổ dịch rửa giải

Hình 2 Quy trình khảo sát dung môi rửa giải

Khảo sát dung môi tạo hạt polymer

Tổng hợp MIP tương tự như mục “Kiểm tra khả năng giữ quercetin trên polymer”, thuđược MIP đang ở dạng gel

Khảo sát tạo hạt với các dung môi khác nhau là: nước, methanol, ethanol, isopropanol,n-butanol, n-hexan, chloroform, ethyl acetat, aceton với các tỷ lệ khác nhau là 1:25, 1:50,1:100, 1:200

Hỗn hợp gel polymer và dung môi được khuấy trong máy khuấy từ trong vòng 24 giờ ởnhiệt độ ta thu được hỗn dịch mà các tiểu phân là các hạt MIP Đem hỗn dịch này trảithành một lớp mỏng bằng cách sử dụng máy spin-coat Sau đó đem soi dưới kính hiển

vi, xác định được kích thước, độ đồng nhất của các loại hạt được kết tủa trong từng loạidung môi khác nhau

Hiệu suất tạo hạt từ gel polymer

Hiệu suất tạo hạt được tính bằng phần trăm khối lượng hạt polymer thu được so với khốilượng gel polymer sử dụng

Nhồi cột SPE

Nhồi cột bằng 500 mg hạt polymer trong dung môi methanol dưới áp suất giảm Rửa cộtbằng dung môi thích hợp đến khi không còn quercetin trong dịch rửa Kiểm tra bằngcách đo độ hấp thu UV-Vis của dịch rửa giải Sau đó cột được ổn định bằng 10 ml dungmôi methanol

Tải 1 ml dung dịch mẫu quercetin trong methanol với nồng độ 100 μg/ml sau đó rửa lầnlượt với 16 ml methanol và 16ml methanol:acid acetic (9:1)

Khảo sát tỷ lệ monomer chức năng

Monomer chức năng giữ vai trò chính trong tương tác giữa polymer với mẫu, thông quacác nhóm chức –COOH, -NH2, Tỷ lệ các nhóm chức này sẽ ảnh hưởng tới khả nănglưu giữ mẫu của polymer Quercetin có 5 nhóm OH trong công thức, có tính acid yếu,nên tỷ lệ acid methacrylic và 4-vinylpirydin cần được khảo sát để tìm ra xác nhận nhómchức nào –COOH hay pyridin có ảnh hưởng tới liên kết hydro với quercetin

Tiến hành tổng hợp polymer với thành bảng như Bảng 2 và tạo hạt

Bảng 2 Khảo sát tỷ lệ monomer chức năng.

Tải 1 ml dung dịch mẫu quercetin trong methanol với nồng độ 100 μg/ml sau đó rửa lầnlượt với 16 ml methanol và 16ml methanol:acid acetic (9:1).

Xác nhận sự có mặt của quercetin trong dịch rửa giải bằng phổ UV-Vis

Khảo sát một số đặc tính của cột SPE

Khảo sát độ lặp lại

Tiến hành tái hấp phụ quercetin nhiều lần trên một cột SPE

Khảo sát khả năng tải mẫu

Tiến hành tái hấp phụ quercetin với những hàm lượng khác nhau

Khảo sát sơ bộ độ chọn lọc

Sử dụng rutin có cấu trúc gần giống với quercetin để kiềm tra tính chọn lọc của MIPđối với phân tử quercetin Tải quercetin với nồng độ 10 ppm bằng với khoảng nồng độtrong mẫu tự nhiên [2]

Tải 1 ml dung dịch gồm rutin, quercetin trong methanol với nồng độ quercetin 10 ppm

và rutin 10 ppm vào cột SPE sử dụng MIP đóng dấu quercetin làm pha rắn đã được ổnđịnh cột lần lượt với 5 ml methanol:acid acetic (9:1) và 5 ml methanol Tiến hành rửagiải theo thứ tự 16 ml methanol và 16 ml methanol:acid acetic (9:1), quercetin và rutintrong dịch rửa giải được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) Phương pháp được kiểm tra tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống và tínhtuyến tính trước khi tiến hành định lượng đồng thời quercetin, rutin trong dịch rửa giải.Điều kiện sắc ký:

✓ Pha tĩnh: Cột sắc ký Nucleosil CI 8 (250 x 4 mm, 5 μm)

✓ Pha dộng: Methanol - acetonitril – đệm phosphat 0,01M pH 3 (30:60:10)

✓ Thể tích tiêm: 20 μ.l

✓ Tốc độ dòng: 0,6 ml/ phút

✓ Detector UV: 355 nm.

✓ Nhiệt độ cột: 30 0C

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

CHƯƠNG 1 BIỆN LUẬN CÔNG THỨC TỔNG HỢP POLYMER BAN ĐẦU

Bảng 3 Công thức tổng hợp polymer ban đầu dựa theo tài liệu tham khảo [1, 3, 11]

để tạo ra vật liệu cấu trúc đủ cứng, duy trì sự ổn định các điểm nhân diện sau khi táchphân tử mẫu ra Trong công thức tỷ lệ của monomer chức năng thường cao hơn phân tửmẫu để tạo thuận lợi cho sự hình thành phức hợp monomer chức năng và phân tử mẫu,thường monomer chức năng phải dư thừa so với phân tử mẫu (4:1) Tuy nhiên, nếu tỷ lệmonomer chức năng quá lớn thì tạo ra những điểm gắn kết không đặc hiệu, giảm tínhchọn lọc của polymer đóng dấu phân tử, nếu monomer chức năng có tỷ lệ quá ít, sẽ tạo

ra số lỗ gắn kết quá ít

Tỷ lệ chất khơi mào trong phản ứng polymer thường thấp, khoảng 2% đến 3%

CHƯƠNG 2 KHẢO SÁT DUNG MÔI POLYMER HÓA

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN POLYMER HÓA

Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp kết tủa để tạo hạt polymer, do đó polymerphải ở dạng gel để tổng hợp polymer Trong quá trình tổng hợp polymer, trạng thái gelcủa polymer là trạng thái mà lúc đó dịch polymer có độ nhớt lớn, quan sát độ nhớtpolymer này bằng mắt thường

Bảng 5 Kết quả khảo sát thời gian polymer hóa ở những điều kiện nhiệt độ, quang hóa

Nhận xét: Như vậy theo Bảng 5 , trong khuôn khổ thời gian nghiên cứu có hạn, lựa chọn

điều kiện thực hiện phản ứng polymer hóa ở nhiệt độ 75 oC là phù hợp và thời gian phảnứng polymer hóa là 23 phút

CHƯƠNG 3 KIỂM TRA KHẢ NĂNG GIỮ QUERCETIN TRÊN POLYMER

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer ở dạng màng mỏng bằng phổ UV-Vis

Hình 3 Phổ truyền qua của màng mỏng MIP và NIP

So sánh phổ truyền qua của MIP và NIP cho thấy sự khác nhau, do đó có thể dùng phổtruyền qua UV-Vis để khảo sát sự có mặt của quercetin trong cấu trúc phân tử Sự khácnhau này chứng tỏ MIP có khả năng giữ quercetin trong cấu trúc của nó so với NIPkhông có

Khi sử dụng các dung môi dùng để rửa giải quercetin ra khỏi cấu trúc của MIP thì cácpolymer không còn khả năng bám dính trên bề mặt lam kính Hơn nữa cường độ hấp thucủa màng polymer khó kiểm soát, cao hơn ngưỡng nhận biết của máy dẫn đến phổ thuđược không có đỉnh rõ ràng Như vậy, sử dụng phương pháp này để kiểm tra khả năngrửa giải của các dung môi là không thích hợp

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer ở dạng rắn bằng phổ IR

Nhận xét: So sánh phổ của NIP và MIP tương đối giống nhau, tuy nhiên tại đỉnh cực đại

tại khoảng 1750 cm-1 tương ứng với nhóm chức C=O trong MIP và NIP có sự khác nhau

rõ, điều này có thể được giải thích bởi liên kết hydro hình thành giữa monomer chứcnăng và quercetin, ngoài ra đỉnh cực đại tại khoảng 3400 cm-1 tương ứng với nhóm OHcủa MIP cũng cao hơn và rõ hơn NIP chứng tỏ sự có mặt của quercetin (cấu trúc có 5nhóm OH) trong cấu trúc của MIP Sau khi rửa giải, các đỉnh hấp thu này trong phổ củaMIP giảm

Như vậy, trong cấu trúc của MIP có quercetin tương tác với polymer bằng liên kết hydro

Hình 4 Phổ IR của MIP

Hình 5 Phổ IR của NIP

Hình 6 Phổ IR của MIP đã được rửa giải với Methanol:acid acetic (9:1)

Kiểm tra sự có mặt của quercetin trong polymer ở dạng hạt bằng phổ Vis

UV-Tạo hạt polymer Sử dụng các dung môi khác nhau để rửa giải các hạt polymer tạo được.Dịch rửa giải này được quét phổ UV-Vis để tìm quercetin

Bảng 6 Rửa giải MIP và NIP bằng các dung môi khác nhau (Phụ lục 4.8-4.16 ).

(-): Trong dung dịch rửa không có quercetin

(+): Trong dung dịch rửa có quercetin

Các ống nghiệm 1, 2, 3, 4 sau khi rửa giải đến khi dịch rửa giải không còn quercetin (xácnhận bằng phổ UV-Vis), được rửa giải tiếp với methanol:acid acetic (9:1) Dịch rửa giải

này được quét phổ UV-Vis để tìm quercetin (Error! Reference source not found.).

Bảng 7 Rửa giải ống 1,2,3,4 tiếp với dung môi Methanol: Acid acetic (9:1)

(-): Trong dung dịch rửa không có quercetin

(+): Trong dung dịch rửa có quercetin

Nhận xét: Như vậy, khi rửa giải với các dung môi khác nhau chỉ có dung môi

methanol:acid acetic (9:1) là có thể rửa giải được hoàn toàn quercetin khỏi cấu trúc củaMIP, thậm chí sau khi rửa giải bằng các dung môi khác trước đó Methanol:acid acetic(9:1) là dung môi có tính phân cực cao hơn các dung môi khác do đó nó có thể cạnhtranh, bẻ gãy các liên kết hydro giữa phân tử quercetin và polymer, thay thế dung môivào các lổ trống đầy phân tử quercetin ra khỏi cấu trúc của polymer

CHƯƠNG 4 KIỂM TRA KHẢ NĂNG TÁI HẤP PHỤ CỦA POLYMER

Bảng 8 Kiểm tra khả năng tái hấp phụ quercetin (Phụ lục 4.17-4.18).

Như vậy, tương tác giữa polymer và phân tử mẫu quercetin tạo khả năng tái hấp phụ lưugiữ của MIP Dung môi methanol chỉ có khả năng rửa giải quercetin một ít ra khỏi MIPtuy nhiên khi dùng một dung môi phân cực hơn là methanol:acid acetic (9:1) toàn bộquercetin được giải phóng hoàn toàn ra khỏi cấu trúc MIP