Khảo sát một số hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân eurycoma longifolia jack và ứng dụng tạo sản phẩm thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng

Khảo sát một số hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân eurycoma longifolia jack và ứng dụng tạo sản phẩm thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng Khảo sát một số hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân eurycoma longifolia jack và ứng dụng tạo sản phẩm thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA

*

KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) VÀ ỨNG DỤNG TẠO SẢN PHẨM THỰC PHẨM CÓ

LỢI CHO SỨC KHỎE NGƯỜI TIÊU DÙNG

SVTH: ĐINH ANH TÙNG

Đà Nẵng – Năm 2017

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Từ xa xưa, con người đã khai thác và sử dụng thực vật vào nhiều mục đích khác nhau như để làm thuốc, thực phẩm, hương liệu Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, chúng ta đã có thể nghiên cứu sâu hơn, hiểu rõ hơn về các loại thực vật qua đó có cách sử dụng tốt nhất và thu được lợi ích lớn nhất từ chúng

Việc sử dụng các loại thuốc, các thực phẩm chức năng nhằm làm tăng sức khỏe, chữa bệnh tật, nhưng đâu đó vẫn còn những di chứng tiềm tàng hoặc các tác dụng phụ

do thuốc hay các thực phẩm chức năng đem lại sau khi uống [1] Việc ứng dụng các loại thảo dược, các loại thực vật chữa bệnh từ lâu đã được ứng dụng trong đông y đã chứng minh thực vật vừa có công dụng không thua kém các loại thuốc chữa bệnh vừa ít nguy hại cho cơ thể

Mật nhân hay còn gọi là bá bệnh, bách bệnh, có tên khoa học là Eurycoma

longifolia từ tên gọi đã có thể nêu bật lên được công dụng thần kỳ của loại thực vật

này Được ứng dụng để chữa nhiều bệnh cho con người như sốt rét, tiểu đường, loãng xương, kháng khuẩn, kháng khối u [2], tác dụng lớn nhất và được biết đến nhiều nhất của mật nhân đó là tăng cường hàm lượng hormon testosterone ở nam giới Sự suy giảm hormon testosteron thường gây nên sự rối loạn hoạt động cương cứng, giảm ham muốn tình dục ảnh hưởng đến hạnh phúc gia đình Đây là vấn đề rất cần được quan tâm và điều trị Mật nhân (bá bệnh, bách bệnh) là một loài thảo dược đã được chứng minh qua rất nhiều nghiên cứu trong nước và trên thế giới về tác dụng tráng dương và tăng cường chức năng sinh lý của nam giới [3]

Trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về các đặc tính hóa học

và sinh học, giá trị sử dụng của mật nhân Ở Việt Nam, từ lâu đã cho ra đời những bài thuốc dân gian, những loại thuốc với thành phần từ cây mật nhân hay phổ biến hơn là dùng mật nhân để ngâm rượu Nhất là đối với vùng nguyên liệu mật nhân ở xã Ayun

Pa thuộc tỉnh Gia Lai Đây là nơi có sản lượng mật nhân tốt nhất Việt Nam và được người khắp cả nước tin dùng [4] Tuy nhiên, tất cả chỉ gói gọn trong những kinh nghiệm truyền miệng, những bài thuốc dân gian mà không có một nghiên cứu khoa học cụ thể về vùng nguyên liệu mật nhân ở đây Với nhiều lợi ích như vậy, nếu có thể ứng dụng mật nhân hoặc các chiết xuất của nó vào thực phẩm hằng ngày sẽ làm tăng giá trị sử dụng và thu được lợi ích to lớn nên việc tìm hiểu và nghiên cứu về cây mật

nhân là quan trọng và cần thiết Chính vì điều đó, đề tài: “Khảo sát một số hoạt tính

sinh học từ dịch chiết rễ cây mật nhân (Eurycoma Longifolia Jack) và ứng dụng tạo sản phẩm thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng” có tính cấp thiết cao

3 Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của đề tài

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây mật nhân

1.1.1 Giới thiệu về cây mật nhân

Cây mật nhân hay còn gọi là mật nhơn, cây bá bệnh, cây bách bệnh hay cây hậu phác nam, Tongkat Ali ( Malaysia ), Pasak bumi ( Indonesia ), Tho nan ( Lào )… và

tên tiếng Anh là longjack Cây mật nhân thuộc họ Simaroubaceae (thanh thất), mang

những hình thái đặc trưng của họ thanh thất như cây nhỡ, cao 2 - 8m, có lông ở nhiều

bộ phận, lá kép gồm 10 - 36 đôi lá chét không cuống, mọc đối mặt trên xanh bóng, mặt dưới trắng xóa, cuống lá màu nâu đỏ Cụm hoa hình chùm kép hoặc chùm tán mọc ở ngọn, cuống có lông màu gỉ sắt Hoa màu đỏ nâu,đài hoa chia thành 5 thuỳ hình tam giác có tuyến ở lưng; tràng hoa 5 cánh hình thoi cũng có tuyến, nhị 5 có lông dày và hai vảy ở gốc, bầu có 5 noãn, hơi dính nhau ở gốc, đầu nhuỵ rời Quả hình trứng hơi dẹt, có rãnh giữa, khi chín màu vàng đỏ, chứa một hạt, trên mặt hạt có nhiều lông ngắn

Hình 1.1 Hình ảnh về cây mật nhân

Có thể tóm tắt vị trí phân loại của Eurycoma longifolia như sau:

Cây mật nhân ở nước ta phân bố nhiều nhất là ở miền Trung, Tây Nguyên, Tây Ninh, đặc biệt quanh vùng Biên Hoà, Trảng Bom và Định Quán, Đồng Nai

Ngoài ra cây còn có ở một số nước Đông Nam Á và vùng ranh giới Ấn Độ - Trung Quốc như Indonesia, Malaysia, Lào, Campuchia, Philippines Ở Indonesia cây tự nhiên mọc duy nhất ở Sumatra và Kalimanta [5]

1.1.2 Giới thiệu một số thành phần hóa học chính trong cây mật nhân

Từ kết quả của một số nghiên cứu trong và ngoài nước đã xác định được một số thành phần hóa học chính của cây mật nhân, từ đó làm nền tảng cho các ứng dụng khoa học sau này

Năm 1968, từ cao eter dầu trích từ vỏ và lá cây, sắc ký cột hấp phụ trên alumin, thầy

Lê Văn Thới và cô Nguyễn Ngọc Sương, trường đại học khoa học Sài Gòn đã cô lập hợp chất −sitosterol, campesterol, 2,6- dimetoxybenzoquinon và một số hợp chất có

Năm 1982, nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Y dược Hiroshima, Nhật, từ rễ cây có nguồn gốc Indonesia đã cô lập được hai hợp chất quassinoid có số oxy hoá cao

có tên là eurycomanon và eurycomanol [7]

Cũng vào năm đó, bằng phương pháp sắc ký, phương pháp nhiễu xạ tia X để xác định cấu trúc, Nguyễn Ngọc Sương, S.Bhatnagar, J.Polonsky, M.Vuihorgne, T.Drange

và C.Pascard đã cô lập được hai hợp chất thuộc nhóm quassinoid 20 carbon, đó là laurylacton A và 18 carbon là laurylacton B

Hai năm sau (1984 – 1985), K.L.Chan, M.J.Oneill, J.D.Phillipson và D.C.Warhurst, từ cao eter dầu trích từ rễ cây, không những tìm thấy hợp chất mới thuộc nhóm quassinoid như 3,4-dihyroeurycomalacton, 5,6-dehyroeurycomalacton, 6-hydroxy-5,6-dehydroeurycomalacton mà còn phát hiện sự hiện diện của các alkaoid có

tên là 10-hydroxycantin-6-on, tinh thể màu vàng Đồng thời, với cao chloroform trích

từ rễ cây cô lập được một hợp chất coumarin là scopoletin [8]

Năm 1989, K.Lchan, S.P.Lee, T.W.Sam và B.H.Han, trích từ cao n-butanol rễ cây

cô lập được một quassinoid glycoside có tên là eurycomanol-2-O-glucopyranosid [9]

-D-Năm 1990, H.Tada, F.Yasuda, K.Otani, M.doteuchi, Y.Ishihar và M.Shiro, trong quá trình thử nghiệm hoạt tình sinh học của cây pasakbumi (mật nhân) bên cạnh việc phân lập hợp chất paskbumin A (eurycomanon) còn phân lập được hai hợp chất mới cũng có khung sườn quassinoid là pasakbumin B, pasakbumin C từ cao metanol [10]

Cùng thời điểm trên, nghiên cứu cao n-butanol trích ly từ rễ cây mật nhân thu hái ở Indonesia, nhóm nghiên cứu đã tìm ra bốn hợp chất

Năm 1993, nhóm còn cô lập thêm hợp chất quassinoid mới từ n-butanol có tên seo-1-nor-6-(5-10)-abeo-picrasan-2,5-olide

1,2-Ngoài ra, khi tiến hành khảo sát dịch trích từ lá cây mật nhân bằng dung môi CH2Cl2 thu được hai hợp chất mới là 6-dehydrolongilacton, C19H26O6 và 7 -hydroxyeurycomalacton

Năm 1991, nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Y dược, Tokyo, Nhật trong quá trình nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây mật nhân đã phân lập được hai hợp chất mới với khung squallan Đây đồng thời là hai đồng phân lập thể của nhau, một là eurylen, đồng phân kia là teurylen Cả hai đều có dạng tinh thể không màu, có công thức phân tử là C34H58O8.

Ngoài ra, từ dịch trích từ rễ cây với eter dầu, K.L.Chan, S.P.Lee, T.W.Sam, S.C.Tan, H.Noguchi và U.Sankawa cô lập được hợp chất 18-Dihydroeurycomanol, kết tinh trong methanol [11]

Một năm sau khi phát hiện ra hợp longilacton (1990), với cao metanol, H.Itokawa, E.Kishi, H.Morita, K.Takeya và Y.Iitaka, thuộc trường đại hoc dược Tokyo, Nhật đã

cô lập được một hợp chất mang khung squallan tên là longilen peroxid Đây là một hợp chất không màu, C30H52O8

Bên cạnh những hợp chất thuộc nhóm triterpen với hệ thống khung quassinoid là chính, khi nghiên cứu hoạt tính sinh học của các cao trích từ rễ cây mật nhân thu hái ở Kalimantan, Idonesia, nhóm nghiên cứu của trường Đại học Dược Illinois, Chicago đã chứng tỏ trong cây còn chứa các alkaloid như cantin-6-on alkaloid và  -carbolin alkaloid

Năm 1992, tại trường đại học Tokyo, Nhật hợp chất 6-hydroxyeurymalacton và 11-dehydroklaineanon cũng được phân lập từ cây

Đồng thời, tại đây H.Itokawa, E.Kishi, H.Morita, K.Takeya còn phát hiện thêm một số hợp chất thuộc nhóm triterpen với khung tirucallan, niloticin, hydroniloticin, piscidinol A, bourjotinolon A, 3-episapelin A, melianon, hispidon, các hợp chất này được công bố có độc tính đối với một số loại tế bào ung thư [12]

Cũng vào năm 1992, nhóm còn cô lập được bốn hợp chất mới thuộc nhóm chất biphenylneolignan Trong đó có hai đồng phân của nhau: 2,2-dimetoxy-4-(3-hyroxy-1-propenyl)-4-(1,2,3-trihydroxypropyl)diphenyleter

Một đồng phân có nhiệt độ nóng chảy 56-580C,[]D=+1,30, chất kia có nhiệt độ nóng chảy từ 60-620C, []D=-2,50 là 2-hydroxy-3,2’,6’-trimetoxy-4’-(2,3-epoxy-1-hydroxypropyl)-5-(3-hydroxy-1-propenyl)biphenyl, màu vàng và 2-hydroxy-3,2’-dimetoxy-4’-(2,3-epoxy-1-hydroxypropyl)-5-(3-hydroxy-1-propenyl)biphenyl màu vàng

Năm 1993, từ n-butanol, ngoài eurylacton 2,5-olide), nhóm nghiên cứu tại trường đại học Y dược Tokyo, Nhật còn cô lập thêm một hợp chất mới là 14-deactyl eurylen [13]

(1,2-seco-1-nor-6-(5-10)-abeo-picrosan-1.1.3 Công dụng và một số ứng dụng của cây mật nhân trong đời sống

Cây chữa được nhiều chứng bệnh nên còn có tên khác là bách bệnh thế nên được ứng dụng nhiều nhất trong lĩnh vực y học mà cụ thể là các bài thuốc đông y

1.1.3.1 Tác dụng kích thích sinh dục

Đây là tác dụng chính, vượt trội của cây mật nhân, đã được chứng nhận và công

bố rộng rãi với nhiều đề tài nghiên cứu khoa học trên thế giới Đó là khả năng tăng cường sức khoẻ tình dục cho nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormon giới tính nam (testosterone) một cách tự nhiên, duy trì sự hưng phấn và phong độ tình dục ở nam giới, ngăn chặn các dấu hiệu suy giảm khi bước vào tuổi trung niên

Một nghiên cứu “Eurycoma longifolia Jack trong việc quản lý vô sinh nam vô căn” được thực hiện tại Malaysia đã cho thấy kết quả khi tiến hành trên 350 bệnh nhân nam

vô sinh vô căn, họ được sử dụng hàng ngày 200 mg cao nước từ rễ mật nhân và được theo dõi phân tích tinh dịch mỗi 3 tháng trong 9 tháng, chỉ có 75/350 bệnh nhân hoàn thành thử nghiệm Sự phân tích tinh dịch ở những bệnh nhân này cho thấy có sự cải thiện đáng kể với mọi thông số lý hoá của tinh dịch và chất lương tinh trùng, 11 bệnh nhân (14,7%) sau đó có thể cho thụ thai tự nhiên [3]

1.1.3.2 Tác dụng kháng sốt rét

Có nhiếu nghiên cứu ở nhiều nước như Thái Lan, Malaysia… đã cho thấy dịch chiết từ cây mật nhân có tác dụng này

Một nghiên cứu tiến hành với dịch chiết từ rễ cây mật nhân trên P.falciparum với

Lactat dehydrogenase cũng cho thấy 4 quassinoid gồm eurycomalacton; dihydroeurycomanon; 13-α-(21)-epoxyeurycomanon; euryomanon đều cho tác dụng Trong đó, eurycomanon cho tác dụng mạnh nhất [14]

13,21-1.1.3.3 Tác dụng kháng khối u

Năm 2004, Ping C.Kuo và công sự đã định danh được khoảng 65 hợp chất từ rễ cây mật nhân có tiềm năng kháng sốt rét, kháng khối u, độc tế bào và kháng HIV trên các thử nghiệm in vitro Trong số đó, có 8 hợp chất cho tác dụng mạnh trên ung thư phổi, 7 hợp chất có tác dụng mạnh trên ung thư vú

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Kardono đã phân lập được 5 alkaloid có độc tính

tế bào từ rễ cây Mật nhân thu được ở Indonesia 4/5 alkaloid này có tác dụng ức chế sự sinh sản của các tế bào ung thư (vú, đại tràng, phổi, u ác tính, fibrosarcoma)

Trong một nghiên cứu khác, 6 quassinoid từ rễ mật nhân được thử in vitro về khả năng kháng ung thư Kết quả cho thấy 14,15β-dihydroklaineanon có tác dụng ức chế khối u mạnh nhất (IC50 5 μM) Tác dụng này mạnh hơn quercetin (IC50 23μΜ) và β-caroten (IC50 30 μΜ) là hai hợp chất kháng ung thư đã được biết [14]

1.1.3.4 Tác dụng trị tiểu đường

Lá và rễ cây Mật nhân đã được dùng để kiểm soát đường huyết Nhóm của Husen

đã thử dịch chiết nước của rễ Mật nhân ở 3 liều (50; 100 và 150 mg/kg) theo mô hình Steptozotocin trên chuột bình thường và chuột có đường huyết cao Kết quả cho thấy ở nồng độ 150 mg/kg cao nước rễ Mật nhân có khả năng làm hạ đường huyết ở lô thử và không gây giảm có ý nghĩa ở lô chứng [15]

1.1.3.5 Tác dụng kháng khuẩn

Farouk đã thử nhiều dịch chiết khác nhau (MeOH, cồn, aceton, nước) từ lá, thân

và rễ Mật nhân trên hoạt tính kháng khuẩn Gram (-) và (+) Kết quả cho thấy dịch chiết lá và thân có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram (-) và (+), ngoại trừ 2 chủng Gram (-) là E.coli và S.typhi Dịch chiết nước từ lá cũng có tác dụng trên S.aureus và Serratia marscesens Tuy nhiên, dịch chiết rẽ lại không cho bất kỳ tác dụng kháng khẩn nào [16]

1.1.3.6 Tác dụng chống loãng xương

Tác dụng chống loãng xương cúa Mật nhân trên mô hình chuột thiến (do tinh hoàn

bị cắt nên việc sản xuất ra androgen bị thiếu hụt, dẫn đến loãng xương) Kết quả cho thấy cao rễ Mật nhân cho tác dụng androgenic rõ rệt (chống loãng xương và có khả năng thay thế cho testosterol) Do vậy, mật nhân có thể dùng như một liệu pháp thay thế triển vọng ở người loãng xương do thiếu hụt hay suy giảm androgen [17]

1.1.3.7 Tác dụng giảm stress và trạng thái căng thẳng

Một kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, sau khi khảo sát trên 63 người, được uống dịch cao chiết từ cây mật nhân thì có 11% xác nhận giảm căng thẳng, 12% giảm Anger,

15% cảm thấy tỉnh táo hơn Đồng thời huyết áp cũng được giảm khi được bổ sung cao chiết, hàm lượng testosterone tăng cao hơn so với mức bình thường [18]

1.1.4 Một số chế phẩm mật nhân đã có mặt ngoài thị trường

Viên giải độc gan Tuệ Linh: chứa 250mg cao mật nhân

Hình 1.2 Viên giải độc gan Tuệ Linh Khang dược mật nhân: chứa 400mg mật nhân

Hình 1.3 Khang dược điều chế từ mật nhân, nhân sâm và linh chi

Sâm Alipas: mỗi viên chứa 160mg tinh chất mật nhân

Hình 1.4 Sâm Alipas

Rượu mật nhân

Hình 1.5 Rượu mật nhân

1.2 Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Tổng quan về phương pháp chiết

1.2.1.1 Phương pháp chiết [19]

Chiết suất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch bao gồm các chất hòa tan trong dung môi, dung dịch này được gọi là dịch chiết Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là:

- Sự hòa tan của chất tan vào dung môi

- Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi

- Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật

Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt

độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu, thời gian chiết ) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết suất

Nguyên liệu trước khi chiết suất cần kiểm tra về mặt thực vật xem có đúng loài, đôi khi còn đúng thứ hay chủng mà ta cần hay không Cần ghi rõ nơi thu hái, thời gian thu hái Tùy theo trường hợp mà đặt vấn đề về thời vụ thu hái, để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất Dược liệu sau đó có thể làm khô hoặc để tươi mà chiết Nhiều hoạt chất rắn rất dễ bị biến đổi trong quá trình làm khô hoặc ngay khi còn tươi nếu không xử lý để diệt enzym Kích thước của bột nguyên liệu cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết

1.2.1.1 Phân loại các phương pháp chiết

Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau như chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường) hoặc chiết ở nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng), chiết với các thiết bị khác nhau như: soxhlet, kumagawa tùy yêu

cầu, điều kiện mà chọn kỹ thuật chiết thích hợp Ngoài phân loại phương pháp chiết theo nhiệt độ ra ta có thể phân loại các phương pháp chiết như sau:

Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, ta chọn phương pháp chiết là chưng ninh vì đây là phương pháp cho tỉ lệ cao chiết nhiều nhất theo những báo cáo trước đây [20], đồng thời đây cũng là phương pháp thích hợp cho mô hình sản xuất công nghiệp

1.2.1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng tới phương pháp chiết

Các phương pháp chiết khác nhau cho hiệu suất chiết khác nhau Ngoài ra còn phải

kể đến một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết như: nguyên liệu chiết (tính chất lý hóa của nguyên liệu), dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ giữa nguyên liệu chiết và dịch chiết

Đối với bản nguyên liệu chiết, nguyên liệu có kích thước càng nhỏ, mịn thường sẽ cho hiệu suất chiết tốt hơn so với nguyên liệu còn thô, cứng Tuy nhiên kích thước nguyên liệu quá nhỏ sẽ gây khó khăn và mất thời gian hơn cho các quá trình xử lý sau

đó như lọc hay thu hồi dung môi

Về nhiệt độ chiết, là một yếu tố biến thiên không có quy luật so với hiệu suất chiết Trong một số phương pháp chiết như: soxhlet, nhiệt độ chiết cũng được xác định như nhiệt độ bay hơi của dung môi

Đối với dung môi chiết, tùy thuộc vào tính chất hóa học của dung môi như dung môi phân cực, dung môi không phân cực, phân cực mạnh hay yếu mà cho hiệu suất chiết cũng như các cấu tử chiết khác nhau Đối với phương pháp chiết soxhlet, dung môi sử dụng không được có nhiệt độ bay hơi quá cao để tránh làm hao hụt một số chất

có trong dịch chiết mà nhiệt độ bay hơi của các chất đó bé hơn nhiệt độ bay hơi của dung môi

Về thời gian chiết, thời gian chiết cang cao thì hiệu suất chiết càng tăng, tuy nhiên đạt đến một giá trị thời gian nhất định, đạt đến sự cân bằng của dung môi ngấm vào và lượng chất chiết đi ra nên hiệu suất chiết không tăng nữa Tiếp tục trong thời gian dài,

sẽ có sự bay hơi dung môi, khi đó yếu tố cân bằng bị phá vỡ, lúc này hiệu suất chiết sẽ giảm so với ban đầu

1.2.1.3 Ưu và nhược điểm một số phương pháp chiết

a Phương pháp chưng ninh

Phương pháp chưng ninh là phương pháp có từ lâu đời và đơn giản nhất Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng phương pháp này, cây mật nhân (mật nhân) cũng từng là đối tượng được nghiên cứu trước đó

Định hướng từ các nghiên cứu như:

- Kiểm tra thành phần hóa học và khả năng kháng khuẩn của trễ và thân cây mật

nhân- Zakia Khanam (2014) [21]

- Định tính và định lượng terpenoid và alkaloid trong rễ và thân cây mật nhân-

Anisa Rahmalia, Rizkita R Esyanti và Iriawati (2011) [22]

- Phân tích thành phần hóa học của cây mật nhân bằng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao- Kit-Lam Chan, Chee-Yan Choo, Hiroshi Morita và Hideji Itokawa

- Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết

b Phương pháp chiết soxhlet

Phương pháp chiết Soxhlet thuộc loại phương pháp chiết bán liên tục, nguyên liệu cho vào bộ soxhlet và đứng yên trong khi dung môi chuyển động liên tục

Phương pháp chiết Soxhle cũng là một trong những phương pháp sử dụng nhiều trong các nghiên cứu có quá trình trích ly Một số bài báo hay nghiên cứu khoa học ta

có thể tham khảo như:

- Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng Eurycomanone

trong rễ cây mật nhân-Nursyazura Khari, Abdalrahim FA Aisha and Zhari Ismail

(2014) [24]

- Khảo sát đặc tính sát khuẩn của cây mật nhân- Tee Thiam Tsui, Azimahtol

Hawariah Lope Pihie (2004) [25]

- Nghiên cứu chiết tách và xác định xanthones từ vỏ quản măng cụt- Đào Hùng

Cường, Nguyễn Thị Tú Vân (2010) [26]

• Ưu điểm:

- Dược liệu được chiết kiệt

- Tiết kiệm được dung môi (thu hồi dung môi)

• Nhược điểm:

- Lượng nguyên liệu chiết phụ thuộc nhiều vào thể tích thiết bị

- Cách tiến hành phức tạp hơn so với phương pháp ngâm

- Thiết bị đắt tiền

Tuy nhiên, trong phạm vi của đề tài nghiên cứu, tôi quyết định chọn phương pháp chưng ninh vì đây là phương pháp phù hợp với điều kiện thực tế về công nghiệp

1.2.2 Tổng quan về các hoạt tính sinh học

Trong dược học, hoạt tính sinh học mô tả các tác dụng có lợi hoặc bất lợi của hợp chất đối với chất sống Khi một loại thuốc là một hỗn hợp hóa học phức tạp, hoạt tính này được kích hoạt bởi thành phần hoạt chất hoặc dược phẩm của chất này nhưng có thể được thay đổi bởi các thành phần khác Trong số các tính chất khác nhau của các hợp chất hóa học, hoạt tính dược học/sinh học đóng một vai trò quan trọng vì nó cho thấy việc sử dụng các hợp chất trong các ứng dụng y tế Tuy nhiên, các hợp chất hóa học có thể cho thấy một số tác dụng bất lợi và độc hại có thể ngăn cản việc sử dụng chúng trong thực hành y khoa Hoạt động nói chung lệ thuộc vào liều lượng Hơn nữa, thông thường có những ảnh hưởng khác nhau, từ lợi ích đối với một chất khi đi từ liều thấp đến liều cao Hoạt động phụ thuộc rất nhiều vào việc thực hiện các tiêu chí ADME Để trở thành một loại thuốc có hiệu quả, hợp chất không chỉ phải hoạt động

chống lại mục tiêu, mà còn có các đặc tính ADME (Hấp thụ, Phân bố, Chuyển hóa và bài tiết) thích hợp để làm cho nó thích hợp để sử dụng như một loại thuốc Trong khi một vật liệu được coi là hoạt tính sinh học nếu nó có tương tác hoặc tác động lên bất

kỳ mô tế bào nào trong cơ thể người, hoạt động dược lý thường được dùng để mô tả những ảnh hưởng có lợi, nghĩa là ảnh hưởng của các viên thuốc cũng như độc tính của một chất [27] Trong hoạt tính kháng khuẩn, ta có thể xác định nhiều khả năng của hợp chất như: hoạt tính kháng khuẩn, khả năng kháng oxy hóa, chống tiểu đường, trị ung thư… Tuy nhiên trong điều kiện thí nghiệm cho phép, em chỉ thực hiện xác định hoạt tính kháng khuẩn và khả năng kháng oxy hóa của cây

(S.aureus), E.coli, Samonella, P.aeruginosa …

Tuy nhiên trong phạm vi bài nghiên cứu, em chỉ thực hiện trên 2 chủng vi sinh vật

là S.aureus và E.coli do mức độ có mặt thường xuyên trong thực phẩm, cũng như phù

hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

Một số các phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn:

+ Phương pháp đo vòng kháng khuẩn [28]

+ Phương pháp đếm khuẩn lạc [29]

1.2.2.2 Khả năng kháng oxy hóa

Khả năng kháng oxy hóa của một chất là khả năng làm ức chế quá trình oxy hóa của các phân tử khác Oxy hóa là một phản ứng hóa học có thể tạo ra các gốc tự do, dẫn đến các phản ứng dây chuyền có thể làm hỏng các tế bào Các chất kháng oxy hóa như thiolis hay Vitamin C có thể chấm dứt các phản ứng dây chuyền này để ngăn cản quá trình oxy hóa xảy ra

Một số các phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa [30]:

- Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity): Xác định hoạt tính kháng oxi hóa so với khả năng chống oxi hóa của Trolox

- Phương pháp DPPH (Scavenging ability towards DPPH radicals): Khả năng khử gốc tự do DPPH

- Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity): xác định khả năng

- Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): Khả năng kháng oxi hóa bằng cách bẫy các gốc tự do

- Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power): lực kháng oxi hóa bằng phương pháp khử sắt

- Phương pháp reducing power: lực kháng oxy hóa bằng phương pháp khử Fe

- Phương pháp Conjugated Diene: khảo sát nối đôi liên hợp

Trong phạm vi bài nghiên cứu này em thực hiện bằng phương pháp DPPH để xác định hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết rễ cây mật nhân vì đây là phương pháp đơn giản, các hóa chất dễ kiếm, đồng thời phòng thí nghiệm có đầy đủ các thiết bị

Phương pháp DPPH

DPPH (1,1 diphenyl- 2 picrylhydrazyl) là phương pháp nhặt các gốc tự do theo nguyên tắc: các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt

Hình 1.6 Phản ứng làm mất màu dung dịch DPPH của các chất có khả năng chống

oxy hóa

Ưu điểm: DPPH có thể được sử dụng trong các dung môi hữu cơ và dung dịch nước không phân cực và có thể được sử dụng để kiểm tra cả hai chất kháng oxy hóa ưa nước hay ưa béo Có độ chính xác cao, dễ dàng thực hiện và có giá trị kinh tế cao DPPH được phép phản ứng với toàn bộ mẫu và đủ thời gian nhất định trong phương pháp này

Nhước điểm: DPPH chỉ có thể được hòa tan trong dung môi hữu cơ và sự can thiệp

từ việc các chất mẫu hấp thụ có thể gây khó khăn cho phân tích định lượng Ngoài ra

độ hấp thụ của DPPH trong methanol và acetone giảm dưới ánh sáng

1.2.3 Độc tính cấp của cây

1.2.3.1 Khái niệm độc tính cấp:

Thuật ngữ này biểu thị sự tác động xấu hay sự tử vong của sinh vật ngay sau khi tiếp xúc với chất độc Độc tính cấp xảy ra do tiếp xúc với đơn hoặc đa yếu tố trong một thời gian ngắn và tác động cấp tính là tác động xảy ra trong vòng một vài ngày hoặc thậm chí là một vài giờ đầu tiên sau khi tiếp xúc với chất độc, thông thường thời gian gây độc cấp tính phải ít hơn hai tuần Mặt khác, vì những tác động mãn tính chỉ xuất hiện sau khi tiếp xúc lặp lại với một chất độc, trong nhiều trường hợp cần phải tiếp xúc liên tục hàng tháng Trong khi đó, tác nhân gây độc tính cấp được hấp thụ nhanh chóng vào

cơ thể và sản sinh ra ngay lập tức các hiệu ứng độc cho cơ thể, song cũng có trường hợp, tiếp xúc cấp tính bị suy giảm độc tính [31]

1.2.3.2 Khái niệm về LC 50 và LD 50 [ 32]

LD là viết tắt của "Lethal Dose" LD50 là liều lượng của hoá chất phơi nhiễm trong cùng một thời điểm, gây ra cái chết cho 50% (một nửa) của một nhóm động vật dùng thử nghiệm LD50 là một cách thức đo lường khả năng ngộ độc ngắn hạn (độc tính cấp tính) của một hoá chất Chất độc có thể thử nghiệm trên nhiều loại động vật, nhưng thường xuyên nhất được thực hiện với chuột Nó thường được biểu diễn bằng 01 liều lượng hóa chất (ví dụ, milligrams)/ phơi nhiễm trên mỗi 100 gram (cho động vật nhỏ hơn) hoặc trên một kg (đối với đối tượng thử nghiệm lớn hơn) trọng lượng cơ thể của động vật thử nghiệm LD50 có thể được xem như là 01 phương pháp quản lý dựa bất kỳ đường phơi nhiễm nào nhưng phơi nhiễm qua da (áp dụng cho da) và uống (qua miệng) là phổ biến nhất .

LC là viết tắt của "Lethal Concentration" giá trị LC thường tham khảo với nồng độ của một hóa chất trong không khí, nhưng trong nghiên cứu môi trường, nó cũng có thể

có nghĩa là nồng độ của một chất hóa học trong nước Nồng độ của hóa chất cho các thí nghiệm hít phải trong không khí có thể tiêu diệt 50% các loài động vật thử nghiệm trong một thời gian nhất định (thường là bốn giờ) là giá trị LC50

1.3 Tổng quan về các nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan tới đề tài

1.3.1 Các nghiên cứu trong nước

Năm 1968 từ cao ete dầu hỏa của vỏ và lá cây mật nhân, nhóm tác giả Nguyễn

Ngọc Sương, trường đại học khoa học Sài Gòn đã phân lập được 7 hợp chất là

β-sistosterol, campesterol, 2,6-dimethoxybenzoquinone, eurycomalacton, dihydroeurycomalacton A, laurylaton, laurylaton B [6]

Năm 2007, nhóm tác giả Trần Anh Tuấn, Trần Thị Thu Hương, Trần Hồng Quang, Nguyễn Tiến Hùng, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh, đã nghiên cứu thành phần hoá

dihydroeurycomanon, Kaempferol -3-0-α-rhamnpyrannoisid, eurycomanon, eurylen, 9-methoxylcanthin-6-on [33]

Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Trương Thị Minh Hạnh, Trần Ý Đoan Trang, đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học, của dịch chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh, nhằm rút ra điều kiện chiết tối ưu đối với phương pháp chưng ninh [20]

1.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu về hiệu quả trị bệnh từ cây Eurycoma longifolia đã làm tăng lượng tinh

dịch ở nam giới, nồng độ tinh trùng, tỉ lệ hình thái, nhu động của tinh trùng bình thường Nhóm nghiên cứu Tambi và cộng sự (2012) nghiên cứu trên 350 bệnh nhân

uống liều 200 mg chiết xuất từ Eurycoma longifolia, cho uống hàng ngày và theo dõi

chu kỳ 3 tháng 1 lần trong vòng 9 tháng Trong số 350 bệnh nhân thì có 75 bệnh nhân được khám đủ 3 lần trong 9 tháng Phân tích tinh dịch thì những bệnh nhân đều có tinh dịch tăng lên đáng kể [34]

Miyake và cộng sự (2010) đã cô lập được 24 chất quassinoid từ rễ eurycoma được phát hiện ra là những chất có tác dụng gây độc đến tế bào, chống lại 4 dòng tế bào ung thư, bao gồm 3 dòng tế bào ở chuột [ dòng ung thư đại tràng (26-L5), u ác tính (B16-BL6) và tế bào ung thư phổi (LLC)], và dòng tế bào phổi ở người (A549) [35]

Shuid và cộng sự (2011) nghiên cứu trên mô hình chuột 12 tháng tuổi gây loãng

xương Sau 6 tuần thì nhóm cho uống Eurycoma longifolia và nhóm thay thế

testosterone có thể ngăn chặn sự mất canxi xương ở chuột Eurycoma có tiềm năng trong điều trị bệnh loãng xương thiếu hụt androgen [36]

Low và cộng sự (2011) đã phân tích huyết tương để tìm hiểu về thời gian bán hủy của 4 chất thuộc nhóm quasinoid gồm 13α(21)-epoxyeurycomaone (EP), eurycomanone (EN), 13α,21-dihydroeurycomanone (ED), eurycomanaol (EL) sau khi

cho chuột uống Fr 2 (chiết xuất từ trong Eurycoma longifolia Jack ) liều 200 mg/kg và

tiêm qua đường tĩnh mạch liều 10 mg/kg Qua phân tích thấy EP và EN xuất hiện trong huyết tương, EP có thời gian bán hủy lâu hơn và nồng độ cao hơn Còn EL, EP không thấy xuất hiện trong huyết tương vì nó biến chất trong dịch tiết của dạ dày sau 2 giờ EP và EN có thể là những chất có tác dụng trong điều trị bệnh sốt rét [37]

1.4 Kết luận

Với đối tượng nghiên cứu là rễ cây mật nhân hay còn gọi là bá bệnh được nhiều nước chủ yếu là ở Châu Á nói riêng và trên thế giới nói chung nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực chủ yếu là dược phẩm vì các đặc tính y lý thần kỳ của nó Ở Việt Nam cũng có

một số nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tính chất chữa bệnh của cây, tuy vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học mật nhân ở vùng Gia Lai và ứng dụng chúng vào thực phẩm tiêu dùng hằng ngày lại chưa có Vì vậy đề tài này của em là nhằm khảo sát một số hoạt tính sinh học của cao chiết rễ cây mật nhân tại vùng nguyên liệu giàu tiềm năng này và nghiên cứu cách bổ sung các thành phần có lợi từ dịch chiết vào thực phẩm phục vụ cho tiêu dùng hằng ngày