Thu nhận enzyme Lysozyme từ lòng trắng trứng và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCMKHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN: THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC ĐỀ TÀI: THU NHẬN LYSOZYME TỪ LÒNG TRẮNG TRỨNG VÀ ỨNG DỤNG TRO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÔN: THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

ĐỀ TÀI:

THU NHẬN LYSOZYME TỪ LÒNG TRẮNG TRỨNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN THỰC PHẨM

GVHD: NGÔ ĐẠI NGHIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN:

TP HỒ CHÍ MINH-2018

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH iii

I TỔNG QUAN 1

1.1 Lịch sử của Lysozyme 1

1.2 Phân loại Lysozyme 1

1.3 Đặc tính của Lysozyme 3

II Lysozyme là chất kháng khuẩn 3

2.1 Hoạt tính chống Vi sinh vật của Lysozyme 3

2.2 Cơ chế Lysozyme phá hủy thành tế bào vi sinh vật 4

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Lysozyme 8

2.3.1 pH 8

2.3.2 Nhiệt độ 8

2.3.3 Sự có mặt của chất điện ly 8

2.3.4 Điều kiện canh trường 8

III SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH LYSOZYME TỪ LÒNG TRẮNG TRỨNG 8

3.1 Đặc điểm các kỹ thuật tách Lysozyme từ lòng trắng trứng 8

3.2 Sắc ký trao đổi ion để tách Lysozyme 9

3.2.1 Bản chất của sắc ký trao đổi ion 9

3.2.2 Nguyên tắc của sắc ký trao đổi ion 10

3.2.3 Cơ sở lý thuyết để tách Lysozyme bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi cation 11

3.2.4 Ưu điểm của nhựa Amberlite FPC 3500 trong sắc ký ion trao đổi tách Lysozyme từ lòng trắng trứng 12

3.2.5 Quy trình tách Lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion dương 13

IV ỨNG DỤNG LYSOZYME TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM 15

V KẾT LUẬN 19

TÀI LIỆU THAM KHẢO 21

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.Phân loại Lysozyme 2

Bảng 2 Hàm lượng Lysozyme ở các nguồn khác nhau 2

Bảng 3 Đặc tính hóa học và vật lý của Lysozyme 3

Bảng 4 Đặc điểm của Protein trong lòng trắng trứng 12

Bảng 5 Ảnh hưởng của Lysozyme đến việc bảo quản các loại thực phẩm 18

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Một phần của thành phần polysaccharide của thành tế bào vi sinh vật 4

Hình 2 Chuỗi amino acid của HEW Lysozyme 5

Hình 3 Mô hình không gian của Lysozyme 6

Hình 4 Cơ chế xúc tác của Lysozyme 7

Hình 5 Bản chất của sắc ký trao đổi ion 10

Hình 6 Sắc ký trao đổi ion dùng phân tách các Protein 11

Hinh 7 Quy trình tách Lysozyme từ lòng trắng trứng bằng sắc ký trao đổi Cation 14

I TỔNG QUAN

Lysozyme (ký hiệu E.C.3.2.1.17) được biết như một protein chống vi sinh vậttrong lòng trắng trứng, lòng trắng trứng gà là nguồn cung cấp dồi dào để sản xuấtLysozyme

Lysozyme từ trứng gà thuộc Lysozyme type c, nó được nghiên cứu nhiều nhất.Lysozyme được biết như một enzyme phân cắt liên kết β –1,4 glycoside Lysozyme cóhoạt tính chống Vi sinh vật rộng đặc biệt là gram dương và có thể tăng phổ tác dụngđến gram âm Lysozyme ở dạng tinh khiết cao, được chiết xuất tốt sẽ được dùng để kéodài thời gian bảo quản của nhiều loại thực phẩm, như chất bảo quản và được xem nhưchất bảo quản an toàn trong thực phẩm

Ngoài ra, Lysozyme còn được sử dụng trong ngành dược phẩm như kháng sinh tựnhiên

xạ tia X với độ phân giải rất cao, hiện nay là loại cấu trúc protein có độ phân giải caonhất: 0,94 Å

1.2 Phân loại Lysozyme

Lysozyme đã được lấy ra từ nhiều nguồn: vi sinh vật, virus, côn trùng, cây, độngvật Người ta phân loại Lysozyme thành những nhóm nhỏ dựa trên nguồn gốc, thứ tựcác acid amin và chiều dài

Lòng trắng trứng là nguồn giàu Lysozyme nhất, chứa khoảng 0,3 – 0,4 gLysozyme trong một quả trứng Lysozyme trong lòng trắng trứng là đại diện cho họ cácLysozyme và được gọi là Lysozyme type-c Những nghiên cứu đã cho thấy rằng lớpbiểu bì và vỏ trứng chứa ít Lysozyme trong khi màng ngoài và màng trong thì nhiềuLysozyme Lysozyme type-g có mặt trong các loài chim Lysozyme type-c vàLysozyme type-g có khối lượng phân tử khác nhau và trạng thái khác nhau

Lysozyme cũng có mặt trong mô động vật, huyết thanh và các cơ quan Lá láchcủa gia súc chứa một lượng Lysozyme lớn nhất Lysozyme trong sữa bò có cùng khối

lượng phân tử với Lysozyme lòng trắng trứng nhưng hoạt độ thì gấp 2 lần Lysozymetype-v (viral) là Lysozyme của virus, được xác định là khác với những Lysozyme khác

ở chỗ đây là loại transglycosidase Lysozyme từ thực vật là Lysozyme type-h và type-btùy thuộc vào nguồn gốc của Lysozyme

Bảng 1.Phân loại Lysozyme

Bảng 2 Hàm lượng Lysozyme ở các nguồn khác nhau

Type-c Lòng trắng trứng gà Chipman và Sharon, 1969

Type-i Động vật thân mềm, côn trùng Jolles và Jolles, 1975

Bảng 3 Đặc tính hóa học và vật lý của Lysozyme.

II Lysozyme là chất kháng khuẩn

2.1 Hoạt tính chống Vi sinh vật của Lysozyme.[2]

Hoạt tính kháng khuẩn của Lysozyme hiệu quả với vi khuẩn gram dương Thành

tế bào của các vi sinh vật này bao gồm chủ yếu là lớp peptidoglycan.Vi khuẩn gram âm

ít nhạy cảm với enzyme này vì chúng có cấu tạo thành tế bào phức tạp hơn Lớppeptidoglycan là cơ chất của Lysozyme, được bao phủ thêm bên ngoài lipoprotein,lipopolysaccharides và peptide kỵ nước Lớp ngoài đóng vai trò rào cản để ngăn chặnenzyme tiếp cận đến vị trí hoạt động của nó.Gần như Lysozyme ít hoặc không tác dụngvới vi khuẩn gram âm

Các nghiên cứu chỉ ra rằng để mở rộng phổ tác dụng của Lysozyme có thể thayđổi hiệu chỉnh Lysozyme hoặc hóa học kết hợp các chất bảo quản khác Lysozyme kếthợp với peptide kị nước hoặc acid béo của thành phần lysine, nó làm tăng sự thâmnhập và phá vỡ màng vi khuẩn, giúp mở rộng phạm vi hoạt động của Lysozyme với vi

khuẩn gram âm, bao gồm Escherichia coli K12 (Ibrahim và cộng sự, 1993, 1994).

Glycosyl hóa cũng có thể mở rộng hoạt tính chống vi sinh vật đến vi khuẩn gram âm(Nakamura và cộng sự, 1997) Thêm ethylene di - amine tetra acetic acid (EDTA)(Charter and Lagarde 2004 ), acid hữu cơ, nicin (Losso và cộng sự, 2000) trypsin, hoặc

lactoferrin (Baron và Rehault,2007) giúp làm mất ổn định màng ngoài các sinh vậtGram âm, do đó cho phép Lysozyme xâm nhập qua màng ngoài từ đó mở rộng phổhoạt tính Lysozyme Quá trình đồng hóa áp suất cao thúc đẩy sự thay đổi cấu trúc tạicác vị trí hoạt động Lysozyme và làm tăng hoạt tính kháng khuẩn chống lại

Lactobacillus plantarum (Vannini và cộng sự, 2004).

2.2 Cơ chế Lysozyme phá hủy thành tế bào vi sinh vật.[4]

Lysozyme xúc tác quá trình thủy phân các liên kết glycoside, là liên kết axit acetylmuramic (NAM) và N-acetylglucosamine (NAG) trong các polysaccharides củathành tế bào vi khuẩn Khi làm như vậy, nó làm hư hỏng tính toàn vẹn của thành tế bào

N-và do đó hoạt động như một tác nhân diệt khuẩn Mối liên kết NAM-NAG với vị trí

phân chia bởi Lysozyme đã chỉ ra ở Hình 1.

Hình 1 Một phần của thành phần polysaccharide của thành tế bào vi sinh

vật, cho thấy sự luân phiên giữa axit acetylmuramic (NAM) và

N-acetylglucosamine (NAG) Polysacharide này là cơ chất cho Lysozyme, nó

sẽ phân cắt liên kết glycoside ở vị trí chỉ định

Lysozyme của lòng trắng trứng gà là chuỗi polypeptide đơn có độ dài là 129

amino acid ( Hình 2 ) với phân tử lượng là 14400 Da Từ dữ liệu X-Ray, chúng ta có

thể thấy có một khe rảnh trong cấu trúc của Lysozyme (Hình 3) Trung tâm hoạt động nằm ở khe rảnh này.Trình tự các amino acid ở Hình 2 và cấu trúc không gian của Lysozyme Hình 3 , chuỗi amino acid này trong rảnh sẽ được gấp lại trong Protein và

đã được đánh dấu trong hình

Hình 2 Chuỗi amino acid của HEW Lysozyme,với thành phần amino nền

liên kết với nhau được đánh dấu bằng màu xám Asp 52 và Glu 35, thành

phần chính trong trung tâm hoạt động, được đánh dầu bằng đỏ và vàng

tương ứng

Hình 3 Mô hình không gian của Lysozyme, trong đó thành phần chính

được đánh dấu Asp với màu đỏ, Glu màu vàng và một số chất nền liên kết

với màu xám

Trung tâm hoạt động của Lysozyme là một rảnh dài có chứa 6 đường củapolysaccharide tại một thời điểm.Khi liên kết với polysaccharide, enzyme thủy phânmột liên kết glucoside Nếu 6 đường trong đoạn polysaccharide được đánh dấu từ A-F

thì vị trí phân cắt sẽ giữa D và E như được chỉ ra trong Hình 1 Hai mảnh polysaccharide được giải phóng Hình 4 sẽ mô tả các giai đoạn của phản ứng này.Và sẽ

được mô tả chi tiết bên dưới

Hình 4 Cơ chế xúc tác của Lysozyme Lưu ý chỉ amino acid chính liên

quan đến xúc tác (Glu 35 và Asp 52 ) được đề cập.Các giai đoạn này sẽ

đươc mô tả chi tiết (dựa trên Phillips, 1966)

1) Khi liên kết với enzyme, cơ chất cần phải thay đổi cấu tạo hình dạng Ở đây vịtrí D sẽ bị thay đổi cấu tạo (không được thể hiện trong sơ đồ) để chứa mộtnhóm -CH2OH nếu không sẽ gây ra tiếp xúc không thuận lợi với enzyme Bằngcách này enzyme buộc cơ chất chấp nhận một cấu hình gần đúng với trạng tháithay đổi

2) Amino acid ở vị trí 35 là Glutamic acid (Glu 35) với 1 proton mà nó dễ dàngchuyển tới cực của nguyên tử oxy của liên kết glycoside, bằng cách này liên kết

của C-O trong chất nền bị cắt (Hình 4a và b)

3) Ở vị trí D trong chuỗi polysaccharide lúc này sẽ có điện tích dương Phản ứng

trung gian này được gọi axonium ion (Hình 4b) Enzyme ổn định chất trung

gian này theo 2 cách Thứ nhất, nhóm cacboxylat của Asp 52 gần đó nằm gần đó

có điện tích âm, tương tác với điên tích dương của oxonium ion (sự chia sẻ điệntích của nguyên tử C và O này được gọi là sự cộng hưởng cũng giống như chia

sẻ các electron giữa các nguyên tử của nhóm peptide).Như vậy oxonium trunggian là trạng thái chuyển tiếp Thông thường, một trung gian như vậy sẽ rấtkhông ổn định và phản ứng.Asp 52 giúp ổn định oxonium ion nhưng sẽ khôngphản ứng với nó.Điều này là do, ở khoảng cách 3 Å, các nhóm phản ứng quá xanhau

4) Enzyme bây giờ tách vị trí E với polysaccharide đính kèm của nó, sản sinh ramột chất Glycosyl-Enzyme trung gian Oxonium phản ứng với một phân tử

nước từ môi trường,tạo ra một nhóm hydroxyl và tái proton hóa Glu 35.(Hình 4c và d)

5) Enzyme giải phóng vị trí D với polysaccharide đính kèm của nó và phản ứnghoàn thành

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Lysozyme

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của Lysozyme, ví dụ như: pH, nhiệt

độ, các ion, khả năng tiếp cận với liên kết để phá hủy trong thành tế bào vi khuẩn…

2.3.1 pH

Đối với Lysozyme lòng trắng trứng, khi các thí nghiệm được tiến hành ở dung dịchtrung tính và dung dịch acid, hoạt động của Lysozyme trong dung dịch acid luôn luônmạnh hơn so với trong môi trường trung tính Sự ức chế hoạt động của Lysozyme bắtđầu tại pH 5,7, pH tối ưu của Lysozyme khoảng 6,2 và khả năng dung giải tốt nhất ở

pH 6,0-7,0 (Boasson, 1938; Smolelis và Hartsell, 1949)

2.3.4 Điều kiện canh trường

Sự dung giải tế bào vi khuẩn bao gồm sự phá vỡ cấu trúc bề mặt của tế bào Vì thế,yếu tố ảnh hưởng đến sự bền của cấu trúc bề mặt tế bào hay bất cứ chất nào ngăn cản

sự tiếp xúc giữa Lysozyme và cơ chất của nó đều ảnh hưởng đến hoạt động dung giảicủa Lysozyme (Salton, 1957)

III SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH LYSOZYME

TỪ LÒNG TRẮNG TRỨNG.

3.1 Đặc điểm các kỹ thuật tách Lysozyme từ lòng trắng trứng.[5]

Có nhiều phương pháp tách Lysozyme từ lòng trắng trứng đã được phát triển.Hầuhết chúng được tiến hành trong phòng thí nghiệm để có enzyme có hoạt tính cao nhưngchỉ một số trong đó có tính khả thi trên quy mô thương mại như quy trình kết tủa và kếttinh lọc màng , sắc ký gel, sắc ký ái lực, siêu lọc

Phương pháp kết tủa là phương pháp cổ điển trong phòng thí nghiệm và quy trìnhthương mại để tách Lysozyme từ lòng trắng trứng dựa trên sự kết tủa trực tiếp củaenzyme với muối NaCl 5% Cần phải thực hiện một vài quá trình hòa tan và tái kết tinh

để thu được enzyme có độ tinh khiết cao Để giảm nồng độ muối trong phần lòng trắngtrứng sau khi tách Lysozyme bằng siêu lọc

Nói về đặc tính hóa lý của Lysozyme, khối lượng phân tử thấp là đặc điểm để kỹthuật lọc màng có tính khả thi, đặc biệt là kỹ thuật siêu lọc để tách Lysozyme Tuynhiên, khả năng Lysozyme tĩnh điện và liên kết với ovomucin và các protein tĩnh điệnkhác trong lòng trắng trứng là giảm khả năng khuyếch tán qua màng

Cơ chế nhận biết cơ chất là cơ sở của phương pháp sắc ký ái lực Chất hấp phụđầu tiên được sử dụng là chitin, sau đó những vật liệu mới được cải tiến nhưglucochitin hoặc chitosan cũng được sử dụng để phục hồi Lysozyme Kỹ thuật sắc ký

ái lực không được chập nhận để sản xuất quy mô lớn vì chi phí cao, chọn lọc ligands,dòng chảy của lòng trắng trứng không pha loãng kém, quy trình rửa giải tốn kém, mấtnhiều thời gian và không đặc hiệu với các protein khác trong lòng trắng trứng

Điểm đẳng điện rất cao của Lysozyme giúp tách enzyme khỏi các protein tronglòng trắng trứng khác bằng sắc ký trao đổi ion Việc ứng dụng nhựa trao đổi ion là mộtbước tiến hiệu quả của việc tách enzyme Các loại hạt nhựa như carboxymethylcellulose (CMC), carboxymethyl-sephadex,… đều có mặt trên thị trường với mức giávừa phải, có thể sử dụng cho việc trao đổi trong một thời gian dài

Sấy thăng hoa và sấy phun được sử dụng để làm mất nước các chế phẩmLysozyme dạng lỏng.Cả hai kỹ thuật đều không giảm hoạt tính của enzyme

3.2 Sắc ký trao đổi ion để tách Lysozyme

3.2.1 Bản chất của sắc ký trao đổi ion

Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linhđộng của pha tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích khi cho dung dịch đi quacột được nạp đầy pha tĩnh.Pha tĩnh trong trường hợp này gọi là các chất trao đổi ion(ionit).Bản chất quá trình tách này là do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịchvới các nhóm chứa ion của ionit

Hình 5 Bản chất của sắc ký trao đổi ion.

3.2.2 Nguyên tắc của sắc ký trao đổi ion

 Trước tiên protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác iongiữa các nhóm mang điện tích trái dấu

 Sau đó protein được chiết rút riêng biệt nhờ việc tăng dần lực ion làm cho tươngtác ion bị bẻ gãy thông thường dùng gradient muối NaCl hay gradient pH

Bởi vì các nhóm có chứa điện tích của các phân tử đều có thể điều chỉnh được, do

đó điện tích bề mặt phụ thuộc nhiều vào pH của dung dịch Trong trường hợp cácprotein được cấu tạo từ nhiều acid amin khác nhau, nên điện tích bề mặt của nó sẽ thayđổi nếu ta thay đổi pH bề mặt của môi trường

Một protein không chứa điện tích tại điểm pH bằng pI Tuy nhiên ,Ở môi trường

pH > Pi phân tử P thể hiện tính axit cho ion H+, do đó số điện tích âm lớn hơn số điệntích dương , đa anion , tích điện âm Nếu pH<Pi P tích điên dương, số điện tích dươngnhiều hơn điện tích âm.[1]

Dựa vào tính chất đó mà ta có thể tiến hành phân tách hay tinh sạch protein theophương pháp sắc ký trao đổi ion

Hình 6 Sắc ký trao đổi ion dùng phân tách các Protein.

3.2.3 Cơ sở lý thuyết để tách Lysozyme bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi cation

Thành phần và tính chất của protein trong lòng trắng trứng để thể hiện qua Bảng 4.

Bảng 4 Đặc điểm của Protein trong lòng trắng trứng (Powrie và Nakai,1985) Protein Thành phần (%) Điểm đẳng điện Trọng lượng phân

Qua Bảng 4 ta thấy Lysozyme có điểm đẳng điện pI cao là 10.7 phù hợp với việc

tách Lysozyme khỏi các Protein khác bằng kỹ thuật sắc ký ion dương với dung dịchđệm pH từ 7-10 Vì Lysozyme mang điện tích dương sẽ được giữ lại trong cột Cácprotein khác có điện tích càng âm sẽ được rửa giải ra trước

3.2.4 Ưu điểm của nhựa Amberlite FPC 3500 trong sắc ký ion trao đổi tách

Lysozyme từ lòng trắng trứng[6]

Carboxymethyl cellulose (CMC) đã được sử dụng trong quá khứ để giữLysozyme (Strang, 1984) Tuy nhiên, do kích thước hạt mịn của nó, xử lý khó khăn vàdòng chảy tốc độ rất chậm đối với cột sắc ký Magnetic cation trao đổi cation (Safarik

và cộng sự, 2007), siêu lọc (Wan và cộng sự, 2006) là một số các phương pháp khácđược sử dụng để tách protein Tuy nhiên, tất cả các phương pháp này có vấn đề trongviệc sản xuất quy mô thương mại và β-mercaptoethanol không thể được sử dụng trongngành công nghiệp thực phẩm Lysozyme được tách ra bằng sắc ký trao đổi cation.Amberlite FPC 3500 (styrene-divinylbenzene, khả năng trao đổi ion >2.6 mEq/g), được

sử dụng làm nhựa trao đổi cation

Ưu điểm:

Việc sử dụng nhựa Amberlite FPC 3500 dễ dàng hơn, đơn giản hơn và hiệu quảhơn Amberlite FPC 3500 hoạt động tốt hơn hơn CMC Một vấn đề của nhựa CMC làcác hạt mịn của CMC nổi trên bề mặt của chất lỏng và dẫn đến sự mất mát của nhựatrong suốt bước cân bằng và rửa giải để nghiên cứu quy mô công nghiệp Nhựa