Nghiên cứu tinh sạch dịch chiết mangiferin từ lá xoài bằng phương pháp chiết phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin sau tinh sạch

Mangiferin C19H18O11 là một C – glucoside xanthone với nhiều hoạt tính dược lý quan trọng như kháng oxy hóa kháng khuẩn điều hòa miễn dịch đặc biệt trong điều trị đái tháo đường loại 2 được tìm thấy chủ yếu trong lá xoài Cao chiết mangiferin thô trong ethanol từ lá xoài còn nhiều tạp chất được nghiên cứu làm sạch bằng phương pháp chiết phân đoạn lỏng – lỏng với diclometan và ethyl acetate thu được các cao phân đoạn có độ phân cực khác nhau và chứa ít hợp chất hơn cao chiết thô ban đầu Từ đó chọn ra cao ethyl acetate để tục tiếp tách bằng sắc ký cột hở với pha tĩnh được nhồi bởi silica gel 60 0 040 – 0 063 mm sử dụng pha động là hỗn hợp chloroform ethanol với độ phân cực tăng dần Trong nghiên cứu này các cao phân đoạn được định tính bằng sắc ký lớp mỏng định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đồng thời khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa Kết quả cho thấy trong cao ethyl acetate chứa hàm lượng mangiferin khá cao 107 233 mg g mangiferin tinh sạch được có độ tinh khiết 94 2 so với mangiferin chuẩn và hàm lượng mangiferin trong 1 g bột lá xoài nghiên cứu là 8 2 mg g Mangiferin tinh sạch có khả năng kháng oxy hóa IC50 15 5479 μg mL cao hơn cao thô IC50 27 522 μg mL 1 77 lần cao hơn mangiferin chuẩn IC50 16 383 μg mL 1 05 lần và thấp hơn so với vitamin C IC50 2 5508 μg mL 6 09 lần Tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm của cao thô các cao phân đoạn mangiferin chuẩn và mangiferin tinh sạch bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên môi trường thạch đối với vi khuẩn Escherichia coli E coli Salmonella và nấm mốc Aspergillus flavus kết quả cho thấy cao thô có khả năng kháng tốt vi khuẩn E coli còn cao ethyl acetate có khả năng kháng tốt cả vi khuẩn E coli và Salmonella tuy nhiên tại nồng độ đem khảo sát hoạt tính kháng khuẩn thì mangiferin chuẩn và mangiferin tinh sạch vẫn chưa có khả năng kháng các chủng vi sinh vật thử nghiệm này Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm 3 chương Mở đầu Chương 1 Tổng quan Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Chương 3 Kết quả và thảo luận Kết luận và kiến nghị

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

MANGIFERIN SAU TINH SẠCH

Người hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ TRÚC LOAN

Sinh viên thực hiện: HỒ THỊ CỎ MAY

Số thẻ sinh viên: 107150155

Lớp: 15H2B

Đà Nẵng, 12/2019.

Tên đề tài: Nghiên cứu tinh sạch dịch chiết mangiferin từ lá xoài bằng phương pháp chiết phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin sau tinh sạch Sinh viên thực hiện: Hồ Thị Cỏ May

Số thể SV: 107150155 Lớp: 15H2B

Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm 3 chương:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Kết luận và kiến nghị

Mangiferin (C19H18O11) là một C – glucoside xanthone với nhiều hoạt tính dược

lý quan trọng như kháng oxy hóa, kháng khuẩn, điều hòa miễn dịch đặc biệt trong điều trị đái tháo đường loại 2 được tìm thấy chủ yếu trong lá xoài Cao chiết mangiferin thô trong ethanol từ lá xoài còn nhiều tạp chất được nghiên cứu làm sạch bằng phương pháp chiết phân đoạn lỏng – lỏng với diclometan và ethyl acetate, thu được các cao phân đoạn có độ phân cực khác nhau và chứa ít hợp chất hơn cao chiết thô ban đầu Từ

đó chọn ra cao ethyl acetate để tục tiếp tách bằng sắc ký cột hở với pha tĩnh được nhồi bởi silica gel 60 (0,040 – 0,063 mm), sử dụng pha động là hỗn hợp chloroform : ethanol với độ phân cực tăng dần Trong nghiên cứu này các cao phân đoạn được đ ịnh tính bằng sắc ký lớp mỏng, định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đồng thời khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa Kết quả cho thấy, trong cao ethyl acetate chứa hàm lượng mangiferin khá cao 107,233 mg/g; mangiferin tinh sạch được có độ tinh khiết 94,2% so với mangiferin chuẩn và hàm lượng mangiferin trong 1 g bột lá xoài nghiên cứu là 8,2 mg/g Mangiferin tinh sạch có khả năng kháng oxy hóa (IC50 = 15,5479 μg/mL) cao hơn cao thô (IC50 = 27,522 μg/mL) 1,77 lần, cao hơn mangiferin chuẩn (IC50 = 16,383 μg/mL) 1,05 lần và thấp hơn so với vitamin C (IC50 = 2,5508 μg/mL ) 6,09 lần Tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao thô, các cao phân đoạn, mangiferin chuẩn và mangiferin tinh sạch bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên môi trường thạch

đối với vi khuẩn Escherichia coli (E coli), Salmonella và nấm mốc Aspergillus flavus, kết quả cho thấy cao thô có khả năng kháng tốt vi khuẩn E coli, còn cao ethyl acetate

có khả năng kháng tốt cả vi khuẩn E coli và Salmonella; tuy nhiên tại nồng độ đem

khảo sát hoạt tính kháng khuẩn thì mangiferin chuẩn và mangiferin tinh sạch vẫn chưa

có khả năng kháng các chủng vi sinh vật thử nghiệm này

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

KHOA HÓA

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Họ tên sinh viên: Hồ Thị Cỏ May Số thẻ sinh viên: 107150155

1 Tên đề tài đồ án: “Nghiên cứu tinh sạch dịch chiết mangiferin từ lá xoài bằng phương pháp chiết phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin sau tinh sạch”

2 Đề tài thuộc diện:  Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ đối với kết quả thực hiện

3 Các số liệu và dữ liệu ban đầu:

4 Nội dung các phần thuyết minh và tính toán:

- Nhiệm vụ

- Lời mở đầu

- Chương 1: Tổng quan

- Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

- Kết luận và kiến nghị

- Tài liệu tham khảo

- Phụ lục

5 Các bản vẽ, đồ thị (ghi rõ các loại và kích thước bản vẽ):

6 Họ tên người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Trúc Loan

7 Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 01/09/2019

8 Ngày hoàn thành đồ án: 18/12/2019

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019

Sau hơn 3 tháng thực hiện đề tài “Nghiên cứu tinh sạch dịch chiết mangiferin

từ lá xoài bằng phương pháp chiết phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin sau tinh sạch”, dưới sự hướng dẫn tận tình của TS Nguyễn Thị Trúc

Loan cùng với sự giúp đỡ của Th.S Đặng Thanh Long và các bạn sinh viên phòng thí nghiệm, em đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến quý Thầy Cô trong khoa Hóa nói chung và Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm nói riêng đã luôn tận tình truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường Và đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Trúc Loan đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em từ khi nhận đề tài đến lúc hoàn thành đồ án tốt nghiệp này Cô

đã dẫn dắt em vào bước đầu của con đường nghiên cứu khoa học, động viên khích lệ tinh thần mỗi khi em thiếu kiên trì Mặc dù công việc rất bận nhưng Cô vẫn luôn dành thời gian và tâm huyết trong việc hướng dẫn em, cung cấp cho em nhiều kiến thức bổ ích, luôn định hướng, góp ý và sửa chữa những lỗi sai để em có thể hoàn thành đồ án một cách tốt nhất

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Đặng Thanh Long – Trưởng phòng thí nghiệm phân tích, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, hỗ trợ cơ sở vật chất và tạo mọi điều kiện tốt nhất để cho em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp này Ngoài ra, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Văn Hiệp và các bạn sinh viên phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong thời gian làm nghiên cứu tại Viện

Em cũng chân thành cảm ơn quý Thầy Cô trong Hội đồng Bảo vệ Tốt Nghiệp đã dành thời gian để đọc và nhận xét cho đồ án tốt nghiệp của em

Đà Nẵng, ngày 30 tháng 11 năm 2019

Sinh viên thực hiện

Hồ Thị Cỏ May

CAM ĐOAN

Tôi – Hồ Thị Cỏ May xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tinh sạch

dịch chiết mangiferin từ lá xoài bằng phương pháp chiết phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin sau tinh sạch” dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị

Trúc Loan là công trình nghiên cứu độc lập được thực hiện bởi bản thân tôi Các kết quả số liệu thu được đều trung thực, khách quan, không có chỉnh sửa, sao chép Tài liệu tham khảo sử dụng trong đồ án được trích dẫn đầy đủ và đúng quy định Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Sinh viên thực hiện

Hồ Thị Cỏ May

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN

TÓM TẮT

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI NÓI ĐẦU i

CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ vii

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây xoài và mangiferin 3

1.1.1 Tổng quan về cây xoài 3

1.1.2 Cấu trúc và thành phần hóa học của mangiferin 4

1.1.3 Tính chất của mangiferin 5

1.1.4 Tác dụng dược lý của mangiferin 6

1.2 Tổng quan về các phương pháp chiết tách và tinh sạch hợp chất thiên nhiên từ thực vật 9

1.2.1 Phương pháp chiết rắn – lỏng 9

1.2.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 10

1.3 Tổng quan về sắc ký 11

1.3.1 Phương pháp sắc ký 11

1.3.2 Sắc ký cột hở cổ điển 12

1.3.3 Sắc ký lớp mỏng 12

1.3.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 15

1.4 Tổng quan về kháng oxy hóa và kháng khuẩn 16

1.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp thử nghiệm sử dụng gốc tự do DPPH 16

1.4.2 Tổng quan về kháng khuẩn 19

1.5 Tình hình nghiên cứu về tinh sạch và khảo sát hoạt tính của mangiferin ở Việt Nam và trên thế giới 20

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị sử dụng 28

2.2.1 Hóa chất 28

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 28

2.3 Nội dung nghiên cứu 28

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tinh sạch mangiferin từ cao chiết mangiferin thô 28

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 30

2.4 Phương pháp nghiên cứu 33

2.4.1 Phương pháp định tính mangiferin 33

2.4.2 Phương pháp định lượng mangiferin bằng HPLC 34

2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH 35

2.4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên môi trường thạch 37

2.4.5 Phương pháp tính độ tinh khiết 38

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 39

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả định tính mangiferin trong cao chiết thô từ lá xoài 40

3.1.1 Kết quả định tính mangiferin trong cao thô bằng phản ứng màu đặc trưng 40

3.1.2 Kết quả định tính mangiferin trong cao thô bằng SKLM 41

3.2 Kết quả định lượng hàm lượng mangiferin trong cao thô bằng HPLC 41

3.3 Kết quả định tính mangiferin trong cao phân đoạn khi chiết lỏng – lỏng với diclometan bằng SKLM 43

3.4 Kết quả định tính mangiferin trong cao phân đoạn khi chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate bằng SKLM 44

3.5 Kết quả định lượng hàm lượng mangiferin trong cao phân đoạn khi chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate bằng HPLC 45

3.5.1 Định lượng hàm lượng mangiferin trong cao lớp dưới ethyl acetate 45

3.5.2 Định lượng hàm lượng mangiferin trong cao lớp trên ethyl acetate 46

3.6 Kết quả quá trình tinh sạch mangiferin bằng sắc ký cột silica gel pha thường 47

3.7 Kết quả quá trình rửa kết tinh bằng các dung môi khác nhau 48

3.8 Kết quả hiệu suất thu cao thô và mangiferin tinh sạch 50

3.9 Kết quả đánh giá khả năng kháng oxy hóa 52

mangiferin chuẩ n và mangiferin tinh sạch 53

3.10.1 Đối với vi khuẩn E coli 53

3.10.2 Đối với vi khuẩn Salmonella 56

3.10.3 Đối với nấm mốc Aspergillus flavus 57

3.11 Đề xuất quy trình công nghệ tinh sạch mangiferin 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

Bảng 1.1 Phân loại thực vật học của xoài .4

Bảng 1.2 Các loại pha tĩnh và pha động sử dụng trong kỹ thuật sắc ký 12

Bảng 3.1 Hàm lượng mangiferin trong cao thô 43

Bảng 3.2 Hàm lượng mangiferin trong cao phân đoạn ethyl acetate 46

Bảng 3.3 Xác định độ tinh khiết của mangiferin tinh sạch 50

Bảng 3.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của các mẫu 52

Bảng 3.5 Đường kính vòng kháng khuẩn đối với vi khuẩn E coli (mm) 53

Bảng 3.6 Đường kính vòng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Salmonella (mm) 56

Bảng 3.7 Đường kính vòng kháng đối với nấm mốc Aspergillus flavus (mm) 57

Hình 1.1 Cấu trúc của mangiferin và homomangiferin 5

Hình 1.2 Cấu trúc của mangiferin, homomangiferin và isomangiferin 5

Hình 1.3 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 10

Hình 1.4 Bình sắc ký lớp mỏng 13

Hình 1.5 Bản mỏng chưa khai triển và đã khai triển 13

Hình 1.6 Thiết bị HPLC 15

Hình 1.7 Dạng oxy hóa và dạng khử của DPPH 18

Hình 2.1 Bột lá xoài 27

Hình 2.2 Mangiferin chuẩn 28

Hình 2.3 Sơ đồ dự kiến để tinh sạch mangiferin 29

Hình 3.1 Mangiferin chuẩn phản ứng màu với các thuốc thử đặc trưng 40

Hình 3.2 Kết quả định tính sự có mặt của mangiferin trong cao chiết thô 40

Hình 3.3 Hình ảnh chạy SKLM mangiferin chuẩn và cao thô 41

Hình 3.4 SKĐ của mangiferin chuẩn ở nồng độ 1 mg/mL 42

Hình 3.5 SKĐ của cao thô ở nồng độ 10 mg/mL 42

Hình 3.6 Hình ảnh chạy SKLM các cao phân đoạn diclometan 43

Hình 3.7 Hình ảnh chạy SKLM các cao phân đoạn 44

Hình 3.8 SKĐ của cao lớp dưới ethyl acetate ở nồng độ 95 mg/mL 45

Hình 3.9 SKĐ của cao lớp trên ethyl acetate ở nồng độ 30 mg/mL 46

Hình 3.10 Hình ảnh SKLM sau giải ly cột 47

Hình 3.11 Hình ảnh SKLM trước và sau khi chạy sắc ký cột 47

Hình 3.12 SKĐ của kết tinh thu được khi chưa rửa 48

Hình 3.13 Hình ảnh chạy đối chứng chuẩn và mangiferin tinh sạch bằng SKLM 49

Hình 3.14 SKĐ của mangiferin tinh sạch ở nồng độ 0,8 mg/mL 50

Hình 3.15 Sơ đồ quy trình tóm tắt khối lượng các cao phân đoạn thu được 51

các nồng độ khác nhau 54

Hình 3.17 Đường kính kháng khuẩn đối với vi khuẩn E coli của cao thô, cao ethyl

acetate và mangiferin tinh sạch ở các nồng độ khác nhau 54

Hình 3.18 Đường kính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Salmonella của cao thô, cao

ethyl acetate ở các nồng độ khác nhau 56

Hình 3.19 Đường kính kháng đối với nấm mốc Aspergillus flavus của cao thô, cao

ethyl acetate và mangiferin tinh sạch và mangiferin chuẩn ở các nồng độ khác nhau 58Hình 3.20 Sơ đồ quy trình công nghệ đề xuất để tinh sạch mangiferin 60

DPPH -2,2 – diphenyl – 1 – picrylhydrazyl DMSO -dimethyl sulfoxide

SKLM -sắc ký lớp mỏng

SKĐ -sắc ký đồ

HPLC -high performance liquid chromatography

IC50 - half maximal Inhibitory Concentration

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đái tháo đường là một bệnh chuyển hóa được đặc trưng bởi tăng đường huyết dẫn đến hình thành hành động bài tiết insulin cùng với sự chuyển hóa bị suy yếu của glucose, lipid và protein [1], [2] Theo Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (IDF), tổng

số người mắc bệnh tiểu đường trên toàn cầu được dự đoán sẽ tăng từ 366 triệu vào năm 2011 lên 552 triệu vào năm 2030 [3] Hiện nay, có nhiều thuốc chống tăng đường huyết dùng trong lâm sàng và có hồ sơ ghi lại các tác dụng không mong muốn nghiêm trọng như nhiễm độc gan, tiêu chảy,… Quản lý bệnh tiểu đường mà không có bất kỳ tác dụng phụ nào vẫn là một thách thức đối với ứng dụng y sinh Điều này dẫn đến nhu cầu ngày càng tăng đối với các sản phẩm tự nhiên có đặc tính chống tiểu đường hiệu quả hơn và an toàn hơn

Xoài (Mangifera indica L.), là một trong những loại cây nhiệt đới được trồng phổ

biến ở Việt Nam Quả xoài được coi là sản phẩm kinh tế chính của cây, hầu hết các thành phần khác, đặc biệt là lá, được loại bỏ trong thời kỳ cắt tỉa như là một chất thải

và trở thành nguồn gây ô nhiễm Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng lá xoài sở hữu nhiều chất chống oxy hóa tuyệt vời Mangiferin là một trong những polyphenol chiếm ưu thế trong lá xoài và có nhiều đặc tính dược phẩm như chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, trị đái tháo đường, điều hòa miễn dịch, chống viêm và giảm đau, sử dụng trong điều trị hoặc phòng ngừa các bệnh mãn tính bao gồm ung thư, thoái hóa thần kinh và tim mạch [4] Các hợp chất phenolic khác có tính chất dược phẩm thú vị, chẳng hạn như quercetin, axit gallic, gallotannin và iriflophenones, cũng

đã được tìm thấy trong lá xoài Hàm lượng cao của polyphenol cho thấy tiềm năng to lớn của chiết xuất lá xoài trong mỹ phẩm, dược phẩm và các ứng dụng thực phẩm Chính vì vậy, nếu có thể tận dụng nguồn lá xoài này để ly trích các hợp chất có khả năng điều trị bệnh như mangiferin thì không những giảm thiểu tác động của rác thải lên môi trường mà còn góp phần gia tăng hiệu quả kinh tế của cây xoài mang lại Cho đến nay, sự tổng hợp hóa học của mangiferin đã được báo cáo khan hiếm và các phương pháp khả thi khác cung cấp năng suất cực thấp [5] Theo nghiên cứu của Tang – Bin Zou, En – Qin Xia và cộng sự cho thấy hàm lượng mangiferin trong lá xoài khá cao 58,46 ± 1,27 mg/g [6] Do đó, nguồn mangiferin chính là cây xoài và các nguồn tự nhiên khác [5] Mangiferin có thể được chiết từ lá xoài bằng các phương pháp khác nhau nhưng trong dịch chiết thu được còn lẫn rất nhiều tạp chất Vì vậy,

việc tinh sạch và nghiên cứu hoạt tính sinh học của mangiferin từ dịch chiết lá xoài là cần thiết để thu được mangiferin có độ tinh khiết cao và ứng dụng vào các sản phẩm dược phẩm

Từ những thực tế nêu trên, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Trúc Loan,

đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tinh sạch dịch chiết mangiferin từ lá xoài bằng

phương pháp chiết phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin sau tinh sạch” được đề xuất thực hiện nhằm tìm ra quy trình phù hợp để tinh sạch

mangiferin và khảo sát hoạt tính sinh học của nó

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu tổng quan về nguyên liệu lá xoài và tính chất của mangiferin

- Nghiên cứu tổng quan về quá trình chiết phân đoạn lỏng – lỏng

- Nghiên cứu tổng quan về kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

- Nghiên cứu tinh sạch cao chiết thô bằng phương pháp chiết phân đoạn lỏng –lỏng kết hợp với tinh sạch bằng sắc ký cột hở silica gel pha thường

- So sánh hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa của cao thô, các cao phân đo ạn, mangiferin chuẩn và mangiferin tinh sạch

- Tính toán hiệu suất thu cao thô, hiệu suất thu mangiferin và độ tinh khiết của mangiferin tinh sạch được

3 Mục đích nghiên cứu

- Đề xuất quy trình tinh sạch mangiferin từ cao chiết mangiferin thô trong ethanol

từ lá xoài sao cho thu được mangiferin tinh sạch với hiệu suất cao nhất và hoạt tính sinh học tốt nhất

4 Đối tượng nghiên cứu

Lá xoài (Mangifera indica L.) thu hái ở cây xoài nhà trồng, Hương An, Hương

Trà, Thừa Thiên Huế

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp vật lý, hóa học, phương pháp xử lý số liệu như excel, minitab,…

6 Bố cục đồ án tốt nghiệp

Bố cục đồ án tốt nghiệp gồm các phần sau:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Kết luận và kiến nghị

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây xoài và mangiferin

1.1.1 Tổng quan về cây xoài

Xoài có tên khoa học là Mangifera indica L., thuộc chi Mangifera, họ

Anacardiaceae, là loại trái cây phổ biến nhất của vùng nhiệt đới, được gọi là “The King of Asiatic Fruits” Xoài có nguồn gốc ở Đông Nam Á, nơi nó đã được trồng cách đây hơn 4000 năm Ngày nay có hơn 1000 giống xoài khác nhau trên khắp thế giới [7] Xoài hiện được trồng đại trà ở hơn 87 quốc gia với diện tích khoảng 3,7 triệu ha trên toàn thế giới [5] Xoài là một nguồn tiềm năng của flavonoid và carotenoids, khiến chúng trở thành một loại thực phẩm có tiềm năng hoạt tính sinh học tốt Các hợp chất hoạt tính sinh học chính được tìm thấy trong xoài là polyphenol mangiferin, catechin, quercetin, kaempferol, axit gallic và axit benzoic, là nh ững hợp chất liên quan đến việc ngăn ngừa các bệnh thoái hóa, bao gồm ung thư, bệnh tim mạch và tiểu đường [8]

Mỗi phần của cây xoài, bao gồm lá, vỏ cây, quả, hạt và nhân đã được sử dụng trong các loại thuốc truyền thống trong nhiều thế kỷ [5] Các bộ phận khác nhau của cây xoài có một loạt các chất dinh dưỡng như chất xơ, khoáng chất, tinh bột, lipit, chất chống oxy hóa, [9]

Thịt quả rất giàu axit hữu cơ như axit oxalic, malic, succinic, pyruvic, glucuronic, galacturonic, axit citric, axit ascorbic, carotenoids, polyphenol, mangiferin, axit coumaric, axit gallic và nhiều loại khác Sự hiện diện của các chất chống oxy hóa giúp xoài được đưa vào chế độ ăn uống hàng ngày vì một số lợi ích sức khỏe, có các hoạt động, đặc tính chống ung thư và virus, ngoài việc cải thiện sức khỏe tim mạch và giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch [10]

Sản phẩm phụ của xoài, đặc biệt là lá và vỏ cây, có hàm lượng cao các hợp chất phenolic bao gồm axit phenolic, flavonoid, xanthones, benzophenones và gallotannin Polyphenol có trong xoài chứa nhiều hoạt tính sinh học như chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, trị đái tháo đường, hạ sốt, điều hòa miễn dịch và giảm đau [11] Lá xoài có các hợp chất phenolic chống oxy hóa mạnh như mangiferin, flavonol, benzophenones và gallotannis được đánh giá cao trong các ứng dụng thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm [12] Vỏ xoài rất giàu pectin, cellulose, hemixellulose, lipid, protein, polyphenol và carotenoids, với đặc tính chống oxy hóa tuyệt vời Bột v ỏ xoài có tiềm năng to lớn như là một thành phần chức năng trong việc phát triển các sản

phẩm thực phẩm tốt cho sức khỏe như mì, bánh mì, bánh xốp, bánh quy và các sản phẩm bánh khác, bên cạnh việc sử dụng nó trong thực phẩm trẻ em Nhân xoài là một nguồn phong phú của axit gallic, ellagic, ferulic, cinnamic, tannin, vanillin, coumarin

và mangiferin, tất cả đều có khả năng hoạt động như một nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên [13]

Lá xoài, vỏ cây và quả xoài (thịt quả, vỏ, hạt) là một nguồn phong phú chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học như protein, vitamin A, vitamin C, carotenoids, h ợp chất phenolic (mangiferin), chất xơ, carbohydrate, và khoáng chất, cung cấp nhiều lợi ích về dược phẩm, dinh dưỡng và công nghiệp Những hợp chất chống oxy hóa này giúp bảo vệ chống lại các bệnh liên quan đến stress oxy hóa Nhiều nghiên cứu đã đề nghị sử dụng tất cả các bộ phận của cây xoài trong thực phẩm chức năng để cải thiện dinh dưỡng và sức khỏe Garrido và cộng sự (2008) cho rằng mangiferin (một hợp chất phenolic) có thể đảm nhiệm cho hoạt động chống oxy hóa của chiết xuất cây xoài Mangiferin hiện diện với số lượng cao nhất trong lá, vỏ cây, sau đó là vỏ và thịt quả, cũng đã được báo cáo là hợp chất hoạt tính sinh học chính trong xoài [14]

Bảng 1.1 Phân loại thực vật học của xoài [15]

Phylum (ngành) Mangoliophyta

Class (lớp) Mangoliopsida

Order (bộ) Sapindales

Family (họ) Anacardiaceae

Genus (chi) Mangifera

Species (loài) Indica

1.1.2 Cấu trúc và thành phần hóa học của mangiferin

Mangiferin, một C – glycosyl xanthonoid, ban đầu được phân lập như một chất

màu từ cây xoài (Mangifera indica L.) bởi Wiechowski và đồng nghiệp vào năm 1908

Cho đến những năm 1960 cấu trúc của nó, cụ thể là [2 – C – β – D – glucopyranosyl –1,3,6,7 – tetrahydroxyxanthone] được xác định một cách thuyết phục bằng các nghiên cứu toàn diện [16], [17], [18] Cấu trúc được thừa nhận hiện nay là một glycoside có phần aglycon có bộ khung xanthon với 4 nhóm hydroxyl và một phân tử glucose đính vào C số 2 [19] Mangiferin, có công thức phân tử C19H18O11, trọng lượng phân tử là 422,35 đvC, là một C – glucoside xanthone được tìm thấy trong lá, vỏ cây, quả và rễ

của Mangifera indica và các cây khác như Salacia chinensis, Swertia chirata và

Hypericum aucheri [7], [20]

Mangiferin là một flavonoid có hoạt tính sinh học chính trong lá xoài, có hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa, trị đái tháo đường, điều hòa miễn dịch và chống ung thư,…[21] Theo Aritomi M., Kawasaki T (1970) trong lá xoài ngoài mangiferin chiếm ưu thế thì còn hiện diện của các đồng phân là isomangiferin và homomangiferin cùng tồn tại với mangiferin [15], [17] Homomangiferin là mangiferin monomethyl

ether (1,6,7 – trihydroxy – 3 – methoxy – 2 – C – β – D – glucopyranosyl‐xanthone)

[16] Cấu trúc hóa học của mangiferin và các đồng phân được thể hiện ở hình 1.1 và 1.2

R = OH, mangiferin; R = OCH3, homomangiferin Hình 1.1 Cấu trúc của mangiferin và homomangiferin [22]

R = H, mangiferin; R = CH3, homomangiferin isomangiferin

Hình 1.2 Cấu trúc của mangiferin, homomangiferin và isomangiferin [16]

+ Điểm nóng chảy ở dạng khan là 2710C [15]

+ Bước sóng hấp thu cực đại λmax = 205,6; 238,4; 256,8; 315,2; 367,2 nm [24]

+ Có thể định tính bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – butanol : acid acetic : H2O (4 : 1 : 2,2) cho Rf = 0,77 [24]

+ Tính chất khi tác dụng với các chất khác: tăng màu vàng với dung dịch kiềm loãng; cho màu vàng xanh với dung dịch FeCl3/HCl đậm đặc; cho màu xanh đen với dung dịch FeCl3 [25]

1.1.4 Tác dụng dược lý của mangiferin

1.1.4.1 Tác dụng chống oxy hóa

Mangiferin được chứng minh có thể ngăn ngừa tổn thương ti thể qua trung gian sắt bằng phương pháp oxi hóa giảm kim loại chuyển tiếp cần thiết để sản xuất ra các gốc superoxide, hydroxyl và hoạt động thải gốc tự do Mangiferin tạo thành phức ch ất với Fe2 +,đẩy nhanh quá trình oxy hóa Fe2 + và hình thành các phức Fe3+ – polyphenol

ổn định hơn Như vậy, mangiferin có khả năng tạo phức sắt như là một cơ chế chính

để bảo vệ ty thể của gan chuột chống lại Fe2 + – citrate gây ra peroxid hóa lipid Nó cũng cho thấy tác dụng ức chế đáng kể đối với quá trình peroxy hóa phospholipid não chuột và ngăn ngừa tổn thương DNA do hệ thống bleomycin gây ra [15]

Các cơ chế chống oxy hóa có thể có của mangiferin được chuyên biệt với khả năng phức hợp sắt trong ty thể Các nhóm hydroxyl tự do và nhóm catechol là rất cần thiết cho hoạt động chống oxy hóa của nó Bên trong xơ vỡ động mạch với thụ thể LDL cholesterol, nó ngăn ngừa quá trình oxy hóa tự phát NADPH và ức chế các hoạt động oxy hóa trong ty thể mitochondria gan và lympho bào lách Trong một mô hình

sự suy giảm trí nhớ cholinergic do scopolamine gây ra ở chuột, mangiferin ức chế acetylcholinesterase cải thiện sự thiếu hụt trí nhớ [26]

Đặc tính chống oxy hóa của của mangiferin cho phép nó bảo vệ các tế bào của con người khỏi bị hư hại do stress oxy hóa dẫn đến peroxid hóa lipid, tổn thương DNA

và nhiều bệnh thoái hóa [27] Sử dụng mangiferin có thể làm giảm tác dụng độc hại do phóng xạ ở bệnh nhân trải qua xạ trị [28]

1.1.4.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Bằng kỹ thuật khuếch tán agar, mangiferin cho thấy hoạt động chống lại các loài

vi khuẩn (Bacillus pumilus, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus

citreus, Escherichia coli, Salmonella agona), nấm men (Saccharomyces cerevisiae) và

bốn loại nấm (Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei, Aspergillus flavus,

Aspergillus fumigatus) [15]

1.1.4.3 Tác dụng chống ký sinh trùng

Cryptosporidium parvum là một ký sinh đơn bào, có thể gây ra bệnh về đường hô

hấp và tiêu hóa Hoạt tính ức chế của mangiferin trên Cryptosporidium parvum được

đánh giá trong một mô hình chuột sơ sinh và so sánh với kháng sinh Paromomycin Kết quả thu được cho thấy mangiferin (100 mg/kg) có khả năng kháng

Cryptosporidium parvum, có tác dụng tương tự như Paromomycin ở cùng một liều

lượng [15]

Clostridium tetani là vi khuẩn gây ra bệnh uốn ván Dịch chiết lá xoài từ ete và

ethanol được chứng minh có khả năng chống Clostridium tetani với nồng độ ức chế tối

thiểu lần lượt là 6,25 mg/mL và 12,5 mg/mL [29]

1.1.4.4 Tác dụng chống dị ứng

Vimang là tên thương hiệu của các công thức có chứa chiết xuất Mangifera

indica L., được sử dụng theo phương pháp dân tộc học ở Cuba để điều trị một số rối

loạn miễn dịch, bao gồm hen phế quản, viêm da dị ứng và các bệnh dị ứng khác Trong nghiên cứu của Salvatore Cuzzocrea và cộng sự (2005) đã chứng minh rằng mangiferin góp phần vào đặc tính chống dị ứng của Vimang Kết quả cho thấy Vimang

có đặc tính chống dị ứng, được chứng minh bằng sự ức chế sản xuất IgE và sốc phản

vệ, ức chế tính thấm của mạch máu do histamine, giải phóng histamine từ tế bào chủ

và giảm đáp ứng tế bào lympho tăng sinh Ngoài ra, Vimang làm giảm mô hình in vivo

về dị ứng viêm qua trung gian tế bào chủ [30]

1.1.4.5 Tác dụng kháng viêm

Chứng viêm là hiện tượng xảy ra ở tổ chức tế bào, là phản ứng phòng vệ của cơ thể khi sinh vật bị tấn công từ bên ngoài lên cơ thể thông qua phản xạ của hệ thần kinh Mangiferin được chứng minh giảm chứng phù tai do arachidonic acid (AA) và phorbol myristate acetate (PMA) ở chuột Đối với PMA, dịch chiết lá xoài làm giảm hoạt động của enzyme myeloperoxidase và ức chế các yếu tố hoại tử khối u trong cả hai mô hình viêm AA và PMA [31]

1.1.4.6 Tác dụng bảo vệ dạ dày

Helicobacter pylori là vi khuẩn thường được tìm thấy ở đường tiêu hóa, đặc biệt

có trong dạ dày H pylori có thể truyền từ người này sang người khác khi tiếp xúc với

chất dịch cơ thể của người bị nhiễm bệnh (chẳng hạn như nước bọt) hoặc ăn uống

chung Mangiferin chứng minh giảm khả năng bị ung thư dạ dày do vi khuẩn H pylori gây ra Khi nuôi cấy đồng thời tế bào AGS bị nhiễm H pylori với mangiferin (100 g)

kết quả cho thấy tăng đáng kể vùng ức chế cũng như giảm đáng kể nồng độ ức chế tối

thiểu Do đó chứng minh hoạt động chống H pyloric của mangiferin gần như tương đương với kháng sinh amoxicillin Ngoài ra, mangiferin còn có tác dụng bảo vệ dạ dày

chống lại tổn thương do ethanol và indomethacin gây ra thông qua các cơ ch ế hoạt động chống oxy hóa [32]

1.1.4.7 Tác dụng điều hòa miễn dịch

Hoạt động điều hòa miễn dịch của chiết xuất từ vỏ thân của cây xoài đã được nghiên cứu ở chuột Người ta kết luận rằng chiết xuất thử nghiệm là một loại thuốc đầy hứa hẹn với các đặc tính kích thích miễn dịch Mangiferin đóng vai trò là chất trung gian điều hòa sự giảm của NF – κB, ức chế hoạt hóa NF – κB gây ra bởi các tác nhân gây viêm, bao gồm yếu tố hạt nhân khối u, làm tăng nồng độ glutathione nội bào

và làm chết tế bào qua trung gian hóa trị; điều này cho thấy vai trò có thể có trong liệu pháp phối hợp điều trị ung thư [15] Người ta đã chứng minh rằng mangiferin bảo vệ các tế bào lympho của người bị tổn thương DNA khi tiếp xúc với bức xạ gamma, điều này làm tăng khả năng sử dụng của nó ở những bệnh nhân trải qua xạ trị hoặc những người tiếp xúc với bức xạ [28]

1.1.4.8 Tác dụng chống ung thư

Năm 2017, Aunyachulee Ganogpichayagrai, Chanida Palanuvej và Nijsiri Ruangrungsi đã tiến hành nghiên cứu trên chiết xuất lá xoài trong ethanol và mangiferin về khả năng ức chế in vitro của các enzym α – amylase và α – glucosidase

và để chứng minh hoạt động ức chế chống lại các dòng tế bào ung thư được chọn Hoạt tính chống ung thư được đánh giá dựa trên năm dòng tế bào ung thư ở người so với hai dòng tế bào bình thường của con người sử dụng xét nghiệm Kết quả cho thấy chiết xuất lá xoài ở mức ≥ 200 g/mL cho thấy tiềm năng gây độc tế bào chống lại tất

cả các dòng tế bào ung thư đã được thử nghiệm [33]

1.1.4.9 Tác dụng chống đái tháo đường

Ảnh hưởng của dịch chiết từ lá xoài đã được nghiên cứu và kết quả cho thấy bột

lá xoài có thể giúp cho việc điều trị bệnh tiểu đường Chiết xuất của lá xoài có thể làm

hạ đường huyết ở động vật bị tiểu đường thông thường và do streptozotocin (chất kháng sinh có tác dụng phá huỷ tế bào của tuyến tụy gây mô hình đái tháo đường loại

1 do thiếu insulin) gây ra với liều lượng 250 mg/kg [34]

A Sudha Madhuri và Rajalakshmi Mohanvelu đã nghiên cứu tác dụng chống tiểu đường của chiết xuất từ lá xoài và kết hợp với thuốc hạ đường huyết gliclazide trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxan gây ra Kết quả cho thấy, sự kết hợp của chiết xuất từ lá xoài với gliclazide đã làm giảm đáng kể mức glucose trong máu so với việc chỉ dùng gliclazide đơn thuần Vì vậy, thay vì tăng liều thuốc hạ đường huyết thông thường, mà sẽ dẫn đến nhiều tác dụng phụ hơn, sự kết hợp của mức thấp liều thuốc hạ đường huyết uống với liều thấp hoặc thậm chí liều cao hơn của chiết xuất từ

lá xoài không chỉ phục vụ để kiểm soát lượng đường trong máu mà còn có thể dùng trong điều trị đái tháo đường [33]

Kết luận: Mangiferin là một polyphenol với nhiều hoạt tính dược lý quan trọng

như kháng oxy hóa, kháng khuẩn, điều hòa miễn dịch và đặc biệt trong điều trị đái tháo đường loại 2 Vì vậy mangiferin đã và đang trở thành tâm điểm của nhiều nhà nghiên cứu về tác dụng dược lý của nó cũng như tìm cách để thu được mangiferin tinh khiết với hiệu suất cao để ứng dụng vào các sản phẩm thực phẩm, dược phẩm

1.2 Tổng quan về các phương pháp chiết tách và tinh sạch hợp chất thiên nhiên

từ thực vật

Các hợp chất tự nhiên trong thực vật rất đa dạng, trong đó chứa nhiều hợp chất

có hoạt tính sinh học cao như polyphenol, carotenoids, alcaloid, anthocyanin,… đang trở thành tâm điểm của nhiều nhà khoa học [25] Những hợp chất này có độ phân cực khác nhau, từ không phân cực đến rất phân cực nên thông thường có thể áp dụng các phương pháp sau để chiết và tinh sạch

1.2.1 Phương pháp chiết rắn – lỏng

a Chiết ngâm dầm

* Mục đích: dùng để lấy các hợp chất tự nhiên ra khỏi thực vật thô ban đầu

* Cách tiến hành: ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng

thép không gỉ có nắp đậy Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chiết bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ [25]

b Chiết ngấm kiệt

* Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình

là van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới

để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết

* Cách tiến hành: bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm Mẫu không

nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt, còn nếu quá mịn sẽ cản trở dòng chảy Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc

và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt Để yên một thời gian, thường là 12 – 24 giờ Mở van bình ngấm kiệt

cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này

Hình 1.3 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

So sánh với phương pháp ngâm dầm, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn nhưng hiệu quả lại cao hơn vì đây là quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi mới

➢ Trong nghiên cứu này bột lá xoài được chiết bằng kỹ thuật ngâm dầm kết hợp với phương pháp siêu ẩm bể để tăng hiệu quả trích ly các chất Đồng thời, quá trình chiết kết hợp với khuấy từ nhằm mục đích đảo trộn, tăng sự tiếp xúc giữa nguyên liệu

và dung môi, từ đó tăng hiệu quả của quá trình chiết Hơn nữa, phương pháp này thực hiện đơn giản, không đòi hỏi thiết bị phức tạp

1.2.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

* Nguyên tắc: Sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau để tách các hợp

chất có độ phân cực khác nhau ra khỏi hỗn hợp Dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi phân cực trung bình hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh Phương pháp này dựa trên sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau

* Yêu cầu của dung môi:

- Chọn dung môi phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát

- Rẻ tiền, dễ kiếm, đơn giản

- Cần tránh các dung môi độc như benzene hoặc dễ cháy do có nhiệt độ sôi thấp như dietyl eter, cacbon tetraclorua,…

- Sau khi chiết tách xong, dung môi đó có thể được loại bỏ dễ dàng

* Phương pháp chiết lỏng – lỏng thường được áp dụng để:

+ Chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu

+ Phân chia cao alcol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau Mục đích chính của sự chiết lỏng – lỏng là để tinh chế sơ bộ một hợp chất nào đó Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với nó có hằng số phân bố lớn, còn các tạp bẩn cũng như các chất khác có cấu trúc hóa học không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ hơn thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó, sau đó sẽ tìm cách tách riêng chúng ra

➢ Trong nghiên cứu này, cao chiết mangiferin thô thu được còn rất nhiều tạp chất khác và nếu sử dụng cao thô này để tách trực tiếp trên sắc ký cột thì rất khó để thu được mangiferin có độ tinh khiết cao Vì vậy, sử dụng kỹ thuật chiết phân đoạn lỏng –lỏng bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để phân chia cao thô ban đầu thành các cao phân đoạn có độ phân cực khác nhau Lúc này, trong các cao phân đoạn sẽ chứa ít hợp chất hơn, giúp cho quá trình tinh sạch tiếp theo hiệu quả hơn

1.3 Tổng quan về sắc ký

1.3.1 Phương pháp sắc ký

Sắc ký là một phương pháp để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống gồm pha tĩnh và pha động [35]

- Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc lỏng Pha tĩnh tách riêng các hợp chất trong một hỗn hợp nào đó nhờ vào tính chất hấp thu của nó [25]

+ Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumin hoặc silica gel (SKLM, sắc ký cột) + Pha tĩnh là chất lỏng: một chất lỏng được tẩm lên một bề mặt chất mang rắn (sắc ký giấy, sắc ký khí)

- Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí

+ Pha động là chất khí: áp dụng trong kỹ thuật sắc ký khí

+ Pha động là chất lỏng: được dùng trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và được gọi là dung môi rửa giải

Người ta phân biệt nhiều loại kỹ thuật sắc ký khác nhau dựa vào bản chất của hai pha sử dụng (bảng 1.2) hoặc dựa vào bản chất của các hiện tượng xảy ra trong quá trình tách chất

Bảng 1.2 Các loại pha tĩnh và pha động sử dụng trong kỹ thuật sắc ký

Pha động Pha tĩnh Tên gọi của kỹ thuật sắc ký

➢ Trong nghiên cứu này, sử dụng sắc ký cột hở để phân đoạn cao ethyl acetate ban đầu thành những phân đoạn cao nhỏ hơn có độ phân cực khác nhau, để từ đó cô lập được mangiferin tinh khiết từ một phân đoạn cao nhỏ Sắc ký cột được tiến hành ở

áp suất khí quyển với pha tĩnh là silica gel 60 (0,040 – 0,063 mm) được nhồi trong cột thủy tinh Cao ethyl acetate được nạp lên đầu cột, phía trên pha tĩnh Pha động là hỗn hợp chloroform : ethanol với độ phân cực tăng dần di chuyển qua lớp chất hấp phụ dưới tác động của trọng lực, tùy theo ái lực với pha tĩnh và pha động mà mỗi chất sẽ giải ly ra khỏi cột trước hoặc sau

1.3.3 Sắc ký lớp mỏng

1.3.3.1 Định nghĩa

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography) là kỹ thuật sắc ký dựa vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh

là một chất hấp thu trơ như silica gel, alumina, Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

1.3.3.2 Đặc điểm sắc ký lớp mỏng

- Bình sắc ký: hũ, lọ,…bằng thủy tinh, có nắp đậy để bão hòa hơi dung môi

- Pha tĩnh với chất hấp thu là silica gel hoặc alumina: các hợp chất kém phân c ực

sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm Độ dày của pha tĩnh thường là 0,25 mm

- Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển chậm dọc theo tấm lớp mỏng nhờ vào lực mao quản và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc

di chuyển này tùy thuộc vào lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh níu giữ lại, ái lực với pha tĩnh, pha động và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi

Hình 1.4 Bình sắc ký lớp mỏng

- Mẫu chất cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau, dùng vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn nằm trên pha tĩnh, ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng (pha động) đang chứa trong bình sắc

ký Vị trí của mỗi thành phần cấu tử trên bản mỏng được đặc trưng bằng giá trị Rf, được tính bởi công thức bên dưới, với a là đoạn đường di chuyển của hợp chất, b là đoạn đường di chuyển của dung môi: R f a

b

=

Hình 1.5 Bản mỏng chưa khai triển và đã khai triển

Một hợp chất tinh khiết sẽ cho một vết tròn, gọn trên sắc ký lớp mỏng, với giá trị

Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhất định

* Sắc ký lớp mỏng pha đảo (reversed phase)

Chất hấp thu cho sắc ký lớp lỏng cũng có thể là silica gel pha đảo, thường là C –

2, C – 8, C – 12, C – 18 Khi pha tĩnh tráng silica gel C – 18, pha tĩnh này có tính chất không phân cực, hấp thu mạnh các hợp chất không phân cực Khi giải ly bản mỏng bởi loại dung môi phân cực, các chất phân cực của mẫu chất do không bị pha tĩnh níu giữ mạnh nên sẽ được giải ly đi lên trên cao, còn các chất không phân cực của mẫu chất sẽ

ở vị trí thấp; nghĩa là thứ tự các loại hợp chất phân cực và không phân cực hiện diện trên bản silica gel pha đảo có trật tự ngược lại với bản silica gel pha thường

So với sắc ký lớp mỏng pha thường, sắc ký lớp mỏng pha đảo có một số ưu điểm như: tính chọn lọc cao; tách tốt các hợp chất không phân cực nhưng có giá tiền đắt gấp

20 lần pha thường

1.3.3.3 Hiện hình các vết sau khi giải ly

Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên muốn nhìn thấy các vết, cần

sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý

a Phương pháp vật lý

Thường phát hiện bằng tia tử ngoại (UV), đèn chiếu UV với hai loại bước sóng:

+ Đèn chiếu tia UV 254 nm: ánh sáng này để phát hiện các hợp chất có thể hấp

thu tia UV, các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu sẫm tối

Nếu sử dụng bản mỏng thương mại như silica gel 60 F254, bản mỏng này là silica gel có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang (silicat kẽm có Mn hoạt hóa) hấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm như vậy dưới ánh sáng 254 nm, tấm bản mỏng sẽ có màu xanh lục sáng chói

+ Đèn chiếu tia UV 365 nm: ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất có

phát huỳnh quang Các vết của mẫu chất có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu

b Phương pháp hóa học

Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt lên bản mỏng hoặc dùng bông tẩm thuốc thử rồi quét nhẹ lên bản mỏng

1.3.3.4 Các công dụng của sắc ký lớp mỏng

- Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách cô lập

- Để kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau, có phải là một chất hay không?

- Để hỗ trợ cho việc chạy sắc ký cột: tìm hệ dung môi để bắt đầu cho sắc ký cột

và để theo dõi quá trình sắc ký cột

➢ Trong nghiên cứu này, sử dụng SKLM để định tính sự có mặt của mangiferin trong cao chiết thô từ lá xoài, trong các cao phân đoạn khi chiết lỏng lỏng với diclometan và ethyl acetate Đồng thời chạy SKLM song song với sắc ký cột để theo dõi quá trình giải ly cột, gộp những phân đoạn nhỏ có cùng Rf để thu các phân đoạn lớn Ngoài ra, SKLM còn được dùng trong quá trình rửa kết tinh để kiểm tra sơ bộ xem mangiferin tinh sạch được có giống với mangiferin chuẩn hay không

1.3.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được phát triển trong những năm 1960 là nhánh rẽ của sắc ký lỏng cột, trong đó công nghệ chế tạo cột và các thành phần cấu tạo của thiết bị (bơm, van nạp mẫu và detector) được cải tiến Ban đầu, HPLC được gọi tên là sắc ký lỏng cao áp, phản ánh cột được vận hành trong điều kiện áp suất cao Tuy nhiên đến những năm cuối 1970, tên gọi sắc ký lỏng hiệu năng cao được chuộng hơn, nhấn mạnh hiệu quả cao của quá trình tách đạt được

1.3.4.1 Cấu tạo thiết bị HPLC

Hình 1.6 Thiết bị HPLC Thiết bị HPLC gồm các bộ phận chính sau:

➢ Hệ thống phân phối pha động, với chức năng:

+ Tạo ra áp suất lớn, ổn định để đẩy pha động đi qua khỏi cột

+ Cung cấp một dòng chảy có lưu lượng ổn định và chính xác

+ Đảm bảo thành phần của pha động chính xác

+ Bộ phận chính của hệ thống phân phối pha động là bơm piston

➢ Cổng tiêm mẫu: đưa một lượng mẫu có thể tích chính xác vào trong pha động

➢ Buồng chứa cột: ổn định nhiệt độ cho cột phân tích

➢ Cột bảo vệ: bảo vệ cột phân tích trước ảnh hưởng của tạp bẩn và hóa chất ăn mòn

➢ Cột phân tích: có vai trò quan trọng nhất, có chức năng phân tách các cấu tử có trong mẫu, cột dài 5 – 30 cm, đường kính trong 4 – 10 mm, được nhồi bằng nhiều loại pha tĩnh khác nhau với kích thước 2 – 10 μm

➢ Detector: nhận biết các cấu tử có trong mẫu khi đi ra khỏi cột, phiên dịch nồng

độ của các cấu tử đó thành tín hiệu điện

➢ Hệ thống ghi/xử lý số liệu

1.3.4.2 Ứng dụng của HPLC

Với ưu điểm như áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc ký nhanh,…HPLC được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa dạng như phân tích dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polyme thiên nhiên hoặc tổng hợp, dư lượng thuốc trừ sâu trong rau quả, axit amin, protein, các loại nguyên tố hiện diện trong mẫu phân tích ở dạng vết đều có thể phân tích được HPLC [25] Ngoài ra, HPLC còn được sử dụng để định tính và định lượng mẫu chất phân tích khi có chất chuẩn

➢ Trong nghiên cứu này, sử dụng HPLC để định tính sự mặt của mangiferin trong cao chiết thô từ lá xoài, trong các cao phân đoạn khi chiết lỏng lỏng với diclometan và ethyl acetate, đồng thời để định lượng hàm lượng mangiferin trong các phân đoạn đó và xác định độ tinh khiết của mangiferin sau tinh sạch dựa vào sắc ký đồ của mangiferin chuẩn đã biết trước nồng độ

1.4 Tổng quan về kháng oxy hóa và kháng khuẩn

1.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp thử nghiệm sử dụng gốc tự do DPPH

1.4.1.1 Giới thiệu về gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử, phân tử hay ion có các điện tử độc thân ở lớp ngoài cùng, do đó chúng kém bền vững, thời gian tồn tại ngắn và hoạt tính cao Vì vậy

mà chúng dễ dàng tham gia phản ứng với các phân tử khác bằng cách lấy đi một điện

tử của phân tử đó nhằm bền vững hoá lớp vỏ điện tử của mình nhưng đồng thời sinh ra một gốc tự do mới, gốc tự do mới lại tiếp tục phản ứng với phân tử khác và tạo thành phản ứng dây chuyền Một số gốc tự do có vai trò quan trọng trong cơ thể, là những chất chuyển hóa trung gian có hoạt tính mạnh, tuy nhiên khi số lượng vượt quá sự kiểm soát của cơ thể thì chúng sẽ tấn công vào hệ thống các mô, cơ quan, các base trong nucleic acid, các amino acid trong chuỗi protein, các acid béo chưa bão hoà,…

và gây ra hàng loạt biến đổi có hại cho cơ thể

Các gốc tự do được tạo ra trong hệ thống sinh học và điều kiện ngoại sinh, nó được biết là gây ra các rối loạn thoái hóa khác nhau, như gây đột biến, gây ung thư, rối loạn tim mạch và lão hóa Chất chống oxy hóa là các hợp chất chống lại các gốc tự do bằng cách can thiệp vào bất kỳ một trong ba bước chính của quá trình oxy hóa qua trung gian gốc tự do: khởi đầu, lan truyền và chấm dứt Những chất chống oxy hóa này cũng được sản xuất bởi hệ thống sinh học và xuất hiện tự nhiên trong nhiều loại thực phẩm và sự cân bằng giữa chất oxy hóa và chất chống oxy hóa quyết định sức khỏe và sức sống Do đó, điều quan trọng là phải biết hàm lượng chất chống oxy hóa và hiệu quả của chúng trong thực phẩm, để bảo quản hoặc bảo vệ chống lại hư hỏng do quá trình oxy hóa để tránh những thay đổi nghiêm trọng và mất giá trị thương mại và dinh dưỡng Vì vậy đòi hỏi sự phát triển của một phương pháp nhanh chóng để xác định khả năng chống oxy hóa tiềm năng trong nhiều thực phẩm [36]

Mangiferin là một trong những chất lí tưởng có tác dụng kháng oxy hóa dựa trên

cơ sở kìm hãm quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động Khi đưa mangiferin vào cơ thể sẽ sinh ra gốc tự do bền hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lý (viêm nhiễm, ung thư, lão hóa), chúng có khả năng giải tỏa các điện tử trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động Các gốc tự do tạo ra bởi mangiferin phản ứng với các gốc tự do hoạt động và trung hòa chúng nên không tham gia vào ph ản ứng oxy hóa tiếp theo Kết quả là hạn chế bệnh lí do cắt đứt dây chuyền

1.4.1.2 Giới thiệu về phương pháp DPPH và nguyên tắc của thử nghiệm

Phương pháp DPPH được giới thiệu bởi Marsden Blois (1958), sử dụng cysteine làm chất chống oxy hóa mẫu DPPH là một gốc tự do ổn định nhờ vào sự định vị của điện tử tự do trên toàn bộ phân tử, có màu tím đậm trong dung dịch ethanol hoặc methanol [37] Gốc DPPH có bước sóng hấp thu cực đại ở 517 nm và độ hấp thu của

nó giảm tương ứng khi nguyên tử N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hoặc gốc hydro từ các chất chống oxy hóa để trở thành một phân tử ổn định [38] Do đó, DPPH được sử dụng rộng rãi và là thử nghiệm cơ bản để đánh giá hiệu quả hoạt động làm sạch gốc tự do của các chất chống oxy hóa dựa trên sự thay đổi độ hấp thu của dung dịch DPPH ở 517 nm [37]

Khi trộn dung dịch DPPH với một chất có thể cho nguyên tử hydro, nó sẽ tạo ra dạng khử với sự mất màu tím Phản ứng giữa gốc tự do DPPH• và chất chống oxy hóa (AH) xảy ra như sau:

DPPH• + AH → DPPH – H + A

Hình 1.7 Dạng oxy hóa và dạng khử của DPPH

1.4.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của phương pháp DPPH

Việc xác định hoạt tính chống oxy hóa của các loại thực phẩm sử dụng phương pháp DPPH được so sánh với các phương pháp khác Phân tích chất chống oxy hóa bằng các phương pháp khác có thể bị giới hạn ở những hợp chất hòa tan trong dung môi đã chọn Trong phương pháp DPPH, hiệu quả chống oxy hóa được đo ở nhiệt độ môi trường do đó loại bỏ được nguy cơ suy thoái nhiệt của các phân tử thử nghiệm

Ưu điểm của phương pháp này là DPPH có thể phản ứng với toàn bộ mẫu và thời gian đủ dài cho phép DPPH phản ứng chậm ngay cả với các chất chống oxy hóa yếu Phương pháp DPPH có thể được sử dụng trong dung môi hữu cơ chứa nước và không phân cực và có thể được sử dụng để kiểm tra cả chất chống oxy hóa hydrophilic

và lipophilic Đây là một phương pháp nhanh chóng, đơn giản, rẻ tiền và được sử dụng rộng rãi để đo lường khả năng bắt gốc tự do của các hợp chất, và để đánh giá hoạt động chống oxy hóa của thực phẩm Nó cũng có thể được sử dụng để định lượng chất chống oxy hóa trong các hệ thống sinh học phức tạp, cho các mẫu rắn hoặc lỏng Phương pháp này rất dễ dàng và áp dụng để đo khả năng chống oxy hóa tổng thể và hoạt động bắt gốc tự do của nước ép trái cây và rau quả Thử nghiệm này đã được sử dụng thành công để nghiên cứu các đặc tính chống oxy hóa của hạt lúa mì và cám, rau, axit linoleic liên hợp, thảo mộc, dầu hạt ăn được trong một số hệ thống dung môi khác nhau bao gồm ethanol, acetone, nước, methanol và benzen Đây là một phương pháp tiện lợi cho việc xác định khả năng oxy hóa của cysteine, glutathione, axit ascorbic, tocopherol và các hợp chất thơm polyhydroxy, dầu ô liu, trái cây, nước ép và rượu vang [38]

Tuy nhiên, cơ chế phản ứng giữa chất chống oxy hóa và DPPH• phụ thuộc vào cấu tạo cấu trúc của chất chống oxy hóa Phương pháp này bị hạn chế do gốc DPPH tương tác với các gốc khác và DPPH nhạy cảm với một số loại bazơ, dung môi cũng

như oxy DPPH chỉ có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ và sự can thiệp của độ hấp thụ từ các hợp chất mẫu có thể là một vấn đề đối với phân tích định lượng Độ hấp thụ của DPPH trong methanol và acetone được hình thành dưới ánh sáng Phương pháp DPPH có những hạn chế trong việc phản ánh phân vùng chất chống oxy hóa trong các

hệ thống nhũ tương và không hữu ích để đo hoạt tính chống oxy hóa của huyết tương,

vì protein bị kết tủa trong môi trường phản ứng chứa cồn [36]

1.4.2 Tổng quan về kháng khuẩn

Chất có hoạt tính kháng khuẩn là chất có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn hoặc tiêu diệt vi khuẩn bằng cách tác động chuyên biệt lên một giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi khuẩn Để đánh giá hoạt động kháng khuẩn và kháng n ấm của một chất, có thể sử dụng phương pháp khuếch tán thạch (khoanh giấy và giếng)

* Nguyên tắc kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn: Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn

của các cao chiết bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên môi trường thạch (the paper disc method) của Kirby – Bauer [39] Các khoanh giấy lọc (đường kính 6 mm) đã tẩm cao chiết được đặt lên trên mặt thạch đã trải vi khuẩn Cao chiết sẽ khuếch tán từ giấy lọc vào môi trường thạch Khả năng kháng khuẩn của cao chiết được xác định dựa vào sự hình thành vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy tẩm cao chiết Kháng sinh được sử dụng làm đối chứng dương và dung môi pha mẫu được sử dụng làm đối chứng âm [40]

* Kháng sinh: Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất

hóa học bán tổng hợp, tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát

triển của vi khuẩn

Trong nghiên cứu này khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cao chiết lá xoài, các cao phân đoạn, mangiferin chuẩn và mangiferin tinh sạch đối với vi

khuẩn Escherichia coli, Salmonella và nấm mốc Aspergillus flavus Những chủng vi

khuẩn được chọn là các dòng được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn, có khả năng gây bệnh nghiêm trọng về đường tiêu hóa trên người và các loài động vật

✓ Escherichia coli là vi khuẩn Gram âm, thường có mặt trong thực phẩm

và sống kí sinh trong ruột già người, chúng có thể gây ngộ độc thức ăn, gây các bệnh đường ruột

✓ Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, gây ra các

bệnh như thương hàn, nhiễm trùng máu và ngộ độc thực phẩm Các triệu chứng do

Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 – 36 giờ

sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella

✓ Aspergillus flavus là một loại nấm thường có mặt trong môi trường và có thể

gây bệnh trên các loại ngũ cốc tích trữ trong thời gian dài Chúng cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho người, liên quan đến bệnh aspergillosis của phổi và đôi khi gây bệnh trên kết mạc, nấm tai, nhiễm trùng mũi hầu Nhiều dòng nấm sinh ra một lượng lớn độc tố aflatoxin, một trong những chất gây ung thư và gây độc cấp tính

1.5 Tình hình nghiên cứu về tinh sạch và khảo sát hoạt tính của mangiferin ở Việt Nam và trên thế giới

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Mangiferin được phân lập lần đầu tiên vào năm 1908 dưới dạng chất màu từ cây

xoài (Mangifera indica L., Anacardiaceae) Cho đến những năm 1960, cấu trúc của nó,

cụ thể là [2 – C – β – D – glucopyranosyl – 1,3,6,7 – tetrahydroxyxanthone] được xác định một cách thuyết phục bằng các nghiên cứu toàn diện [16]

Năm 1970, Padma Herath, E Karunanayake, S S Selliab và G P Wannigama

đã tiến hành nghiên cứu tách mangiferin từ vỏ cây Mangifera Zeylanica 380 g vỏ cây khô được chiết bằng petroleum ete để loại bỏ chất béo, sau đó chiết bằng acetone lạnh

để loại bỏ tanin và cuối cùng chiết bằng ethanol 70% Sử dụng kĩ thuật sắc ký giấy,

UV, phổ NMR trong quá trình thí nghiệm và kết quả thu được 15,2 g tinh thể mangiferin hình kim màu vàng nhạt [41]

Năm 2005, Stoilova I, Gargova S , Stoyanova A , Ho I đã nghiên c ứu hoạt động kháng khuẩn và kháng oxy hóa của mangiferin Kết quả cho thấy mangiferin có

khả năng kháng các loài vi khuẩn: Bacillus pumilus, Bacillus cereus, Staphylococcus

aureus, Staphylococcus citreus, Escherichia coli, Salmonella agona, Klebsiella pneumoniae, nấm men Saccharomyces cerevisiae và các loại nấm sau: Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei, Aspergillus flavus và Aspergillus fumigatus Khả

năng kháng oxy hóa được thử nghiệm với gốc tự do DPPH (2, 2 – diphenyl – 1 – picrylhydrazyl) và nồng độ mangiferin tối thiểu gây ức chế 50% gốc tự do IC50 = 7,5 ± 0,0075 μg/mL [42]

Năm 2010, Aranya Jutiviboonsuk, Chanchai Sardsaengjun đã tiến hành phân lập mangiferin từ lá của ba giống xoài được trồng ở Thái Lan bao gồm: Nam Đốc Mai (N), Keow Savoey (K) và Gaew (G) Methanol, ethanol và 70% acetone được sử dụng làm dung môi chiết Phương pháp phân lập để điều chế mangiferin trong nghiên cứu này có thể loại bỏ các sắc tố và các tạp chất khác bằng các quy trình không phức tạp và

rẻ tiền bao gồm: ngâm chiết, thủy phân bằng axit, phân vùng bằng dung môi hữu cơ và

kết tinh lại Kết quả cho thấy chiết xuất bằng metanol mang lại lượng mangiferin cao nhất từ cả 3 giống, cụ thể hàm lượng mangiferin chiếm 2,8% w/w từ giống xoài N; 2,4% w/w từ giống xoài K và 1,3% w/w từ giống xoài G, tiếp theo là chiết xuất bằng ethanol và 70% acetone [43]

Năm 2010, mangiferin, isomangiferin và homomangiferin đã được Zhongtao

Wu, Guo Wei, Gaoyan Lian và Biao Yu tiến hành nghiên cứu tổng hợp bằng con đường hóa học Chìa khóa để tổng hợp mangiferin và các đồng phân là việc xây dựng liên kết C – glycosidic xanthone, phản ứng kiểu Friedel – Crafts giữa một hợp chất cho nhóm glycosyl và một hợp chất thơm giàu electron [16]

Năm 2012, Shashi Kant Singh, Rupali M Tiwari và cộng sự đã tiến hành nghiên

cứu phân lập mangiferin từ vỏ cây Mangifera indica (M indica) và đánh giá hoạt tính

kháng khuẩn của các chất tương tự khác nhau được tổng hợp từ mangiferin Vỏ cây

thô của M indica đã được loại chất béo bằng ete dầu mỏ (60 – 800C) trước khi chiết bằng ethanol 95% Dịch chiết được cô đặc và sau đó được hấp phụ trên sắc ký cột silica gel và rửa giải bằng chloform : metanol (1 : 1) để thu được mangiferin gốc dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt Mangiferin và các chất tương tự của nó được đặc trưng bởi điểm nóng chảy và xác định giá trị Rf và thông qua kỹ thuật quang phổ như phân tích quang phổ UV, IR và NMR Tác dụng kháng khuẩn của mangiferin và các dẫn xuất của nó được nghiên cứu theo phương pháp khuếch tán đĩa Kết quả là mangiferin và các dẫn xuất của nó cho thấy khả năng kháng khuẩn liên quan đến các

loài vi khuẩn như Bacillus pumilus, Bacillus cereus và Salmonella virchow và các loại nấm như Thermo Damascus aurantiacus và Aspergillus flavus [24]

Năm 2012, Fenglei Luo, Qiang Lv, Yuqin Zhao, Guibing Hu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu định lượng mangiferin có trong vỏ quả, thịt quả và hạt xoài Trung Quốc Kết quả cho thấy hàm lượng mangiferin cao nhất được tìm thấy trong vỏ quả xoài Lvpimang (7,49 mg/g) Sau đó lần đầu tiên tinh sạch hiệu quả mangiferin từ vỏ quả xoài bằng cách kết hợp sắc ký nhựa HPD100 với phương pháp sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) Mangiferin tinh khiết đã được xác định bởi cả HPLC và LC –

MS, và nó cho thấy khả năng bắt gốc tự do và khả năng khử sắt của huyết tương (FRAP) cao hơn so với axit L – ascorbic [44]

Năm 2013, Tangbin Zou, Hongfu Wu, Huawen Li, Qing Jia, Gang Song đã tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa quá trình chiết mangiferin từ lá xoài bằng dung môi ethanol có hỗ trợ lò vi sóng Một số thông số như nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi, công suất vi sóng và thời gian chiết được tối ưu hóa bằng các thí nghiệm đơn yếu tố và phương pháp phản ứng bề mặt Kết quả cho thấy điều kiện chiết tối ưu

là ethanol 45%, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1: 30 (g/mL) và thời gian chiết là 123 giây dưới chiếu xạ vi sóng là 474 W Trong điều kiện tối ưu, năng suất của mangiferin

là 36,10 ± 0,72 mg/g, cao hơn đáng kể so với chiết xuất thông thường [21]

Năm 2014, Tang – Bin Zou, En – Qin Xia, Tai – Ping He, Ming – Yuan Huang, Qing Jia và Hua – Wen Li tiếp tục nghiên cứu chiết xuất mangiferin từ lá xoài có hỗ trợ siêu âm Một số thông số như nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi, nhiệt

độ chiết và thời gian chiết được tối ưu hóa bằng thí nghiệm đơn yếu tố và phương pháp phản ứng bề mặt Kết quả cho thấy các điều kiện chiết tối ưu là ethanol 44%, tỷ

lệ nguyên liệu : dung môi là 1 : 38 và chiết trong 19,2 phút ở 600C khi chiếu xạ siêu

âm 200 W Trong điều kiện tối ưu đó hàm lượng mangiferin thu được là 58,46 ± 1,27 mg/g Kết quả thu được chỉ ra rằng chiết xuất có hỗ trợ siêu âm là một phương pháp rất hữu ích để chiết xuất xoài từ nguyên liệu thực vật [6]

Năm 2016, Sihui Nian, Ehu Liu, Yong Fan, Raphael N Alolga, Huijun Li, Ping

Li đã đưa ra phương pháp để tinh chế và làm sạch hiệu quả bốn chất: neomangiferin, mangiferin, timosaponin B – II và timosaponin A – III bằng cách sử dụng phương pháp hấp phụ nhựa macroporous HPD400 và polyamide Phương pháp được kết hợp giữa PRC (polyamide resins chromatography) và MRC (macroporous resins chromatography), chỉ sử dụng dung môi nước và ethanol nhằm hạn chế các dung môi nguy hiểm và độc hại Trong các điều kiện tối ưu hóa, từ 1 kg nguyên liệu thô điều chế được 2,31 g neomangiferin, 4,10 g mangiferin, 12,87 g timosaponin B – II và 2,78 g timosaponin A – III và độ tinh khiết của chúng lần lượt là 90%, 92,15%, 90,8% và 92,61% Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng sắc ký cột kết hợp với polyamide và nhựa hấp phụ vĩ mô có thể được sử dụng như là một thay thế xanh và hiệu quả để tinh chế quy mô lớn các thành phần hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thảo dược [23]

Cũng trong năm 2016, Xiong Wei, Danlin Liang, Qing Wang, Xiangbao Meng

và Zhongjun Li đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp mangiferin, homomangiferin và neomangiferin bằng con đường tổng hợp hóa học dựa trên nguyên tắc liên kết C – C giữa phân tử đường và phần aglycon có thể được tạo ra bằng cách glycosyl hóa sắp xếp lại liên kết O – C giữa phân tử 2,3,4,6 – tetrabenzylglucose và phân tử benzaldehyde [17]

Năm 2017, Aunyachulee Ganogpichayagrai, Chanida Palanuvej và Nijsiri Ruangrungsi đã tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá hoạt động chống đái tháo đường của chiết xuất lá xoài trong ethanol và mangiferin về ức chế in vitro của các enzym α – amylase and α – glucosidase và để chứng minh hoạt động ức chế chống lại các dòng tế bào ung thư được chọn Hoạt tính chống ung thư được đánh giá dựa trên năm dòng tế

bào ung thư ở người so với hai dòng tế bào bình thường của con người sử dụng xét nghiệm Chiết xuất từ lá xoài và mangiferin thể hiện sự ức chế phụ thuộc liều đối với nấm men α – glucosidase với IC50 lần lượt là 0,0503 mg/mL và 0,5813 mg/mL, so với chuột α – glucosidase với IC50 lần lượt là 1,4528 mg/mL và 0,4333 mg/mL, so với acarbose với IC50 tương ứng là 11,9285 mg/mL và 0,4493 mg/mL Đối với hoạt động chống ung thư, chiết xuất lá xoài, ở mức ≥ 200 g/mL cho thấy tiềm năng gây độc tế bào chống lại tất cả các dòng tế bào ung thư đã được thử nghiệm [33]

Cũng trong năm 2017, A Sudha Madhuri và Rajalakshmi Mohanvelu đã nghiên cứu tác dụng chống tiểu đường của chiết xuất từ lá xoài và kết hợp với thuốc hạ đường huyết gliclazide trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxan gây ra Kết quả cho thấy, sự kết hợp của chiết xuất từ lá xoài với gliclazide đã làm giảm đáng kể mức glucose trong máu so với việc chỉ dùng gliclazide đơn thuần Dịch chiết lá xoài sở hữu hoạt động hạ đường huyết đáng kể là do sự hiện diện của flavonoid, tannin, steroid và trepenoids và dịch chiết của lá chứa hàm lượng phenol và flavonoid cao hơn thể hiện hoạt động chống oxy hóa cao hơn bằng cách làm giảm biến chứng tiểu đường Vì vậy, thay vì tăng liều thuốc hạ đường huyết thông thường, mà sẽ dẫn đến nhiều tác dụng phụ hơn, sự kết hợp của mức thấp liều thuốc hạ đường huyết uống với liều thấp hoặc thậm chí liều cao hơn của chiết xuất từ lá xoài không chỉ phục vụ để kiểm soát lượng đường trong máu mà còn có thể dùng trong điều trị đái tháo đường [33]

Năm 2019, Ngampuk Tayana, Wichayasith Inthakusol, Nongnaphat Duangdee, Savita Chewchinda, Hataichanok Pandith, và Sumet Kongkiatpaiboon đã tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa việc chiết xuất mangiferin trong các bộ phận khác nhau của

cây xoài (Mangifera indica L.) được thu thập ở 10 địa điểm khác nhau ở Thái Lan bao

gồm: lá non, lá già, cành cây, quả xoài chín và chưa chín bằng các dung môi khác nhau Các mẫu được rửa sạch bằng nước, sấy khô ở 500C, cắt thành miếng nhỏ, và nghiền thành bột và được giữ trong các túi nhựa kín khí ở nhiệt độ phòng Trong nghiên cứu này, nước, methanol, hỗn hợp nước và methanol tỉ lệ khác nhau, ethanol và tetrahydrofuran được thử nghiệm để tối ưu hóa quá trình chiết mangiferin Định lượng mangiferin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với pha động là hỗn hợp axit axetic 0,5% trong nước và methanol (75 : 25, v/v), với bộ lấy mẫu tự động ALS 1260, bộ điều nhiệt cột TCC 1260 và detector mảng diode VL được đặt ở bước sóng 258 nm Kết quả cho thấy methanol 70% trong nước là dung môi tối ưu thu được hàm lượng mangiferin cao nhất 7,45 ± 0,12 (% w/w) Hàm lượng mangiferin trong bột khô của lá

non, già lá và cành cây M indica dao động từ 4,82% đến 8,85% (trung bình 6,78%),

3,32% đến 7,78% (trung bình 5,89%) và 0,69% đến 1,65% (trung bình 2,75%) w/w tương ứng [5]

Năm 2019, Sija, S L, Adithya V Anand, Arathy Sasankan và Arun Anil đã tiến hành nghiên cứu đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn của chiết

xuất ethyl acetate từ lá và hoa của các loài cây thuốc Anacardium occidentale L và xoài (Mangifera indica L.) Phương pháp bắt gốc tự do DPPH và phương pháp khuếch

tán giếng thạch được sử dụng để phát hiện hoạt tính chống oxy hóa và hoạt động kháng khuẩn tương ứng Kết quả cho thấy các chiết xuất thực vật khác nhau của cả hai loài cây được nghiên cứu có hoạt tính chống oxy hóa mạnh chống lại DPPH và hoạt

động kháng khuẩn chống lại năm mầm bệnh của con người như Pseudomonas

aeruginosa; Salmonella typhi; Bacillus subtilis; Escherichia coli và Staphylococcus aureus Do đó, chiết xuất ethyl acetate từ lá và hoa trưởng thành của cả A occidentale

và M indica có thể được coi là một nguồn tiềm năng mới của chất chống oxy hóa tự

nhiên và tác nhân kháng khuẩn cho ngành công nghiệp dược phẩm [45]

Cũng trong năm 2019, N Venkata Raju, Karuganti Sukumar, G Babul Reddy, P.K Pankaj, Muralitharan G, Shanti Annapareddy1, D Teja Sai và Anjani Devi Chintagunta đã tiến hành nghiên cứu hoạt động chống ung thư và kháng khuẩn của

chiết xuất hạt xoài trong methanol của Mangifera indica L Cultivar Banganapalli Khả

năng chống ung thư đã được kiểm tra bằng cách sử dụng xét nghiệm đĩa khoai tây ghi nhận tỷ lệ ức chế khối u 40,12% Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng phương

pháp khuếch tán agar bằng cách lấy 3 vi sinh vật thử nghiệm Bacillus subilis subsp

subtilis, Staphylococcus aureus và Escherichia coli Kết quả cho thấy đường kính

vòng kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus trong khoảng 8,5 ± 0,3 mm, tiếp theo là E coli (8,2 ± 0,3 mm) và Bacillus subtilis subsp subtilis (6,6 ± 0,5 mm) [46]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Năm 1991, Phạm Xuân Sinh, Phạm Gia Khôi đã tiến hành nghiên cứu chiết xuất

và xác định flavonoid mangiferin trong vỏ và lá cây xoài Định tính sơ bộ chứng tỏ chất chiết từ vỏ xoài thuộc hợp chất flavonoid, tiến hành sắc ký giấy, dung môi triển khai là acid acetic 15% xuất hiện vết có màu vàng xanh, Rf = 0,41 Xác định điểm chảy của hợp chất nằm trong khoảng 258 – 2610C Căn cứ vào kết quả phổ tử ngoại và phổ hồng ngoại, đối chiếu với những tài liệu tham khảo thì hợp chất flavonoid này có cấu trúc của mangiferin [47]

Năm 2011, Trần Kim Tuyến, Nguyễn Văn Hùng, khoa Sư phạm Hóa học, Đại học Cần Thơ đã tiến hành ly trích và tinh chế mangiferin từ lá xoài Trong nghiên cứu này sử dụng kĩ thuật chiết ngâm dầm với dung môi ethanol 70%, cô lập mangiferin từ

dịch chiết và tinh chế bằng phương pháp kết tinh trong ethanol được mangiferin thô, sau đó kết tinh lại trong hỗn hợp ethanol – nước, rồi nhận danh sản phẩm tinh chế được bằng phổ IR, phổ NMR, đo nhiệt độ nóng chảy, xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng HPLC Kết quả ly trích được mangiferin với hiệu suất tương đối cao và sản phẩm khá sạch [48]

Năm 2014, nhóm nghiên cứu Nguyễn Xuân Khu, bác sĩ chuyên khoa II và các cộng sự Bệnh viện y học cổ truyền Sơn La đã cùng PGS TS Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, tiến sĩ Phạm Thị Vân Anh, bác sĩ Nguyễn Thị Vân Hà – trường Đại học Y Hà Nội tiến hành nghiên cứu đề tài nghiên cứu khoa học cấp tỉnh: “Chiết xuất glycoside toàn phần, đánh giá tính an toàn và tác dụng hỗ trợ điều trị viêm phế quản mãn tính trên thực nghiệm của lá xoài tròn Yên Châu” Nhóm nghiên cứu đã xác định xoài tròn

Yên Châu thuộc loài Mangifera indica L., họ Anacardiaceae Hàm lượng hoạt chất

mangiferin trong lá xoài khi chiết xuất bằng dung môi ethanol 70% đạt 6,47% ở lá già , 6,78% ở lá non và 7,39% ở lá bánh tẻ [49]

Năm 2018, Nguyễn Thị Ái Lan và Đái Thị Xuân Trang đã tiến hành nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào MIN6 tụy tạng của dịch trích methanol lá

xoài non (Mangifera indica L.) Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng

phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH (2, 2 – diphenyl – 1 – picrylhydrazyl), khử sắt (RP) có giá trị IC50 lần lượt là 27,64 ± 0,88; 12,11 ± 1,15 µg/mL Kết quả cho thấy lá xoài non có tiềm năng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường theo cơ chế kháng oxy hóa

và bảo vệ tế bào β của tụy tạng khỏi sự chết bởi stress mạng nội chất [50]

Năm 2019, Ngô Đại Hùng, Ngô Đại Nghiệp, Võ Thị Thanh Nhàn và Võ Thanh Sang, khoa Khoa học tự nhiên, Đại học Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương đã tiến hành

nghiên cứu cơ chế hoạt động chống tiểu đường của lá xoài (Mangifera indica L.)

thông qua mô hình in vitro Kết quả cho thấy rằng, chiết xuất từ lá xoài sở hữu sự ức chế đáng kể đối với hoạt động của enzym α – amylase lên đến (51,4 ± 2,7)% ở nồng

độ 200 µg/mL Đáng chú ý, chiết xuất từ lá xoài có hiệu quả cao trong việc trung hòa (63,3 ± 2,1)% gốc tự do DPPH, (71,6 ± 4,3)% gốc tự do (ABTS)+ (2, 2 – azinobis – 3 – ethyl benzothiazoline – 6 – sulfonic acid) và ức chế (66 ± 4,9)% NO sản xuất từ tế bào RAW264.7 mà không có bất kỳ hiệu ứng độc tế bào nào Theo đó, lá xoài được đề xuất là nguyên liệu đầy hứa hẹn để phát triển các sản phẩm hạ đường huyết [51] Nhận thấy rằng ở Việt Nam hầu như chỉ mới tập trung vào việc thu chiết mangiferin thô từ lá xoài, rất ít các nghiên cứu về làm sạch mangiferin và mangiferin thu được có độ tinh khiết rất thấp Năm 2017, Nguyễn Thị Trúc Loan đã tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết mangiferin có hỗ trợ siêu âm từ lá xoài và kết

quả cho thấy các thông số của quá trình chiết để thu được hàm lượng mangiferin cao nhất là: tỉ lệ nguyên liệu : dung môi = 1 : 10 (w/v); nồng độ ethanol 60%; nhiệt độ siêu

âm 600C; thời gian siêu âm 5 phút [52] Năm 2018, Nguyễn Thị Mỹ Phương, Đại học Bách khoa Đà Nẵng, đã tiến hành tinh sạch mangiferin bằng phương pháp sắc ký hấp phụ nhựa macroporous D101 ngay trên cao chiết thô từ lá xoài Do trong cao thô còn chứa rất nhiều tạp chất từ không phân cực đến rất phân cực nên việc tinh sạch bằng D101 ngay trên cao thô rất khó để thu được mangiferin tinh khiết Kết quả nghiên cứu thu được mangiferin với độ tinh khiết còn thấp 68% so với mangiferin chuẩn, mangiferin thu được có hoạt tính kháng oxy chưa cao (IC50 = 38,5 µg/mL) thấp hơn khoảng 2,2 lần so với cao thô (IC50 = 17,67 µg/mL), thấp hơn 9,2 lần so với mangiferin chuẩn và thấp hơn 17 lần so với vitamin C (IC50 = 2,3 µg/mL) [53] Cũng trong năm

2018, Trần Thị Duyên đã tiến hành nghiên cứu tinh sạch mangiferin bằng phương pháp sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên mangiferin tinh sạch thu được vẫn còn lẫn các tạp chất khác, trên sắc ký đồ thu được vẫn còn nhiều peak, độ tinh sạch của mangiferin thu được là 72% so với mangiferin chuẩn [54] Sử dụng hai phương pháp riêng lẻ không thu được mangiferin có độ tinh sạch cao Do đó, đề tài

“Nghiên cứu tinh sạch dịch chiết mangiferin từ lá xoài bằng phương pháp chiết phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin sau tinh sạch” được đề xuất thực hiện để kết hợp cả hai phương pháp: chiết phân đoạn lỏng – lỏng với các

dung môi khác nhau để phân đoạn cao thô ban đầu thành các cao phân đoạn có độ phân cực khác nhau và chứa ít tạp chất hơn cao thô ban đầu, từ đó tiếp tục chạy sắc ký cột sẽ cho kết quả tốt hơn nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi mangiferin và thu được mangiferin có độ tinh khiết cao hơn để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, đáp ứng kịp nhu cầu hiện nay của người tiêu dùng về các sản phẩm

có nguồn gốc tự nhiên, đồng thời mở ra hướng nghiên cứu mới về tinh sạch mangiferin

ở quy mô công nghiệp phù hợp với tình hình ở Việt Nam

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

* Lá xoài: sau khi hái sẽ được rửa sạch, để ráo nước, sấy khô ở nhiệt độ 45 –

500C trong 24 giờ Sau đó nghiền mịn thành bột và bao gói trong các túi zip để tránh hút ẩm và bảo quản ở nhiệt độ phòng [5]

Địa điểm thu mẫu: cây xoài nhà trồng, Hương An, Hương Trà, Thừa Thiên Huế Thời gian thu mẫu: ngày 17 tháng 8 năm 2019

Hình 2.1 Bột lá xoài

❖ Phương pháp thu cao chiết mangiferin thô

✓ Chiết mangiferin thô bằng dung môi ethanol 60% kết hợp siêu âm bể

- Bột lá xoài được ngâm trong ethanol 60% (nguyên liệu/dung môi = 1 : 10 w/v) [23], được đựng trong các chai thủy tinh dung tích 1 lít rồi đem đi siêu âm Quá trình chiết có hỗ trợ siêu âm được thực hiện trong một thiết bị siêu âm bể (KJ1004B, Kejin Instrument Company, Guangzhou, China) với công suất siêu âm 200 W và tần số 40 kHz, được trang bị bộ điều khiển nhiệt độ và bộ hẹn giờ kỹ thuật số [6]

- Theo các nghiên cứu trước đây, các thông số của quá trình chiết bằng dung môi ethanol có hỗ trợ siêu âm để thu được hàm lượng mangiferin cao nhất là: tỉ lệ nguyên liệu : dung môi = 1 : 10 (w/v); nồng độ ethanol 60%; nhiệt độ siêu âm 600C; thời gian siêu âm 5 phút [52]

- Sau khi siêu âm xong, sử dụng máy khuấy từ nhằm mục đích đảo trộn, tăng hiệu quả tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi, nâng cao hiệu quả của quá trình chiết Phần dịch chiết tiến hành lọc để tách cặn bằng phễu lọc chân không buchner th u được dịch lọc trong Phần xác bột lá xoài tiếp tục cho dung môi vào để ngâm chiết tiếp lần

2, lần 3 nhằm trích ly kiệt các chất có trong bột lá xoài

✓ Cô đặc dịch chiết thu cao thô

- Phần dịch trong sau khi lọc được đem đi cô đặc ở thiết bị cô quay chân không

để làm bay hơi dung môi thu được cao thô Tùy vào mức độ cô quay, nhiệt độ, thời gian mà cao này có thể ở dạng lỏng, dạng sệt quánh hay dạng bột khô

- Bảo quản cao thô trong tủ lạnh 4 – 80C để sử dụng cho các lần nghiên cứu sau

* Mangiferin chuẩn: có độ tinh khiết 98,6% được mua tại Viện Kiểm nghiệm

thuốc Trung ương

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

- Dụng cụ sử dụng như: cốc thủy tinh; ống đong; bình tam giác; ống nghiệm; giấy lọc; giấy bạc; eppendorf; đĩa petri; que trang; que cấy; đầu côn; pipet; micropipet; đèn cồn; ống mao quản; bông thấm nước; bút chì; thước kẻ; kéo; giấy dán nhãn; keo

- Thiết bị sử dụng: tủ sấy; tủ ấm; tủ lắc; thiết bị siêu âm dạng bể; bộ cô quay chân không; máy khuấy từ; máy vortex; máy lọc chân không; cân phân tích; tủ cấy vi sinh; thiết bị ly tâm; máy đo quang; thiết bị đo HPLC; đèn chiếu UV 254 nm

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tinh sạch mangiferin từ cao chiết mangiferin thô

Cao chiết mangiferin thô trong ethanol từ lá xoài còn chứa nhiều tạp chất từ không phân cực đến rất phân cực [55] vì thế nếu muốn tinh sạch được mangiferin mà

áp dụng sắc ký cột ngay lên trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt kết quả mong muốn Vì thế chúng tôi tiến hành chiết phân đoạn lỏng – lỏng để phân đoạn cao thô ban đầu