Nghiên cứu phương pháp chiết tách một số hoạt chất từ cây chút chít (rumex crispus l ) và thử nghiệm sản phẩm tách chiết theo hướng bảo vệ thực vật

Nghiên cứu chiết tách dịch chiết tổng cây Chút Chít nhăn. Thử hoạt tính sinh học dịch chiết etyl axetat, nhexan và metanol. Chiết tách và xác định cấu trúc các chất từ dịch chiết etyl axetat của cây Chút Chít nhăn. Chiết tách và xác định cấu trúc các chất từ dịch chiết nhexan của cây Chút Chít nhăn.

Trang 1

Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HỌC VIÊN: VŨ THỊ LAN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH MỘT SỐ HOẠT CHẤT

TỪ CÂY CHÚT CHÍT (RUMEX CRISPUS L.) VÀ THỬ NGHIỆM SẢN

PHẨM TÁCH CHIẾT THEO HƯỚNG BẢO VỆ THỰC VẬT”

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LƯU HOÀNG NGỌC PGS.TS KHUẤT HỮU THANH

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này

Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác Các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Học viên

Vũ Thị Lan Phương

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Nhờ có sự hướng dẫn của thầy giáo, PGS TS Khuất Hữu Thanh, sự tạo điều

kiện của TS Lưu Hoàng Ngọc, PGS.TS.Nguyễn Văn Hùng, sự giúp đỡ về mặt thiết

bị, dụng cụ của Trung tâm Nghiên cứu và phát triển thuốc,Viện Hóa Sinh Biển ,Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, bản luận văn tốt nghiệp này đã được hoàn

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS.Nguyễn Văn Hùng, em Trần Hữu Giáp,

và toàn thể các cô, các chú, anh chị em thuộc Trung tâm Nghiên cứu và phát triển thuốc, Viện Hóa Sinh Biển ,Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn chị Phan Bích Thu, Viện Bảo Vệ Thực Vật, Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn đã giúp tôi tiến hành thử hoạt tính trên các đối tượng sâu bệnh

Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Hà Nội, tháng 3 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Vũ Thị Lan Phương

Trang 4

MỤC LỤC

L ỜI MỞ ĐẦU 1

CH ƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.1 Vài nét về họ rau Răm (Polygonaceae) 3

1.1.2 Vị trí phân loại chi Rumex trong hệ thống phân loại thực vật 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Rumex 3

1.1.4 Sự phân bố của chi Rumex 4

1.1.5 Đặc điểm thực vật loài Rumex crispus 4

1.2 Nh ững nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Rumex crispus 5

1.3 Nghiên c ứu hoá học chi Rumex 8

1.4 Nghiên c ứu hóa học cây Rumex crispus 11

1.5 Đặc điểm sinh học và sinh thái của bệnh gây bởi vi khuẩn, nấm mốc 14

1.5.1 Bệnh héo vàng cà chua do nấm Fusarium oxyporium 14

1.5.2 Bệnh thối hạch bắp cải do nấm Sclerotinia Sclerotinium (Lib.) De Bary 15

1.5.3 Bệnh thối nhũn trên hành ta do vi khuẩn Ervinia carotovora 16

1.5.4 Bệnh trên cây đậu côve do nấm Botrytis cineratis 17

1.6 Tình hình nghiên c ứu và sử dụng dịch chiết từ cây Rumex crispus làm thu ốc bảo vệ thực vật 18

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 18

1.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 23

CH ƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên v ật liệu, thiết bị 26

2.1.1 Mẫu thực vật 26

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 26

2.1.3 Dung môi và hóa chất 26

2.2 N ội dung nghiên cứu 27

Trang 5

2.3 Ph ương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp chiết 27

2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính 28

2.3.3 Phân lập và xác định cấu trúc một số chất từ cao tổng cây Rumex crispus 30

2.3.4 Phổ hồng ngoại (IR) 31

2.3.5 Phổ khối lượng (MS) 31

2.3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 32

CH ƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Th ực nghiệm 33

3.1.1 Xử lý mẫu thực vật và ngâm chiết 33

3.1.2 Phân lập một số hợp chất trong dịch chiết 35

3.1.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất phân lập được 37

3.2 Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập được 41

3.2.1 Chrysophanol (RP1.1) 41

3.2.2 Emodin (RP4.5) 45

3.2.3 Physcion (RP1.4) 47

3.2.4 Quercetin (RP10.5.2) 49

3.2.5 Kaempferol (RC8.4.2) 51

3.3 K ết quả thử hoạt tính sinh học 53

K ẾT LUẬN 55

KI ẾN NGHỊ ĐỀ XUẤT 56

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 57

Trang 6

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng1.1: Chỉ số DPPH của các dịch chiết từ cây Rumex crispusa [18] 6

Bảng 1.2: Các chỉ số FRAP, DPPH, LP của các chất BHT, Quercetin, Rutin, acid Ascobic và dịch chiết Metanol từ quả Rumex crispus [32] 7

Bảng1.3: Hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết từ loài Rumex crispus [18] 7

Bảng 1.4 Tổng hàm lượng anthracene trong các phần của chi Rumex L [30] 11

Bảng 1.5 Hoạt tính của dịch chiết metanol chiết từ cây Rumex crispus trên sáu loại

Bảng 1.9 Hoạt tính của chrysophanol, nepodin, parietin trên 5 loại nấm bệnha 21

Bảng 1.10 Hoạt tính kháng nấm Blumeria graminis f sp Hordeia 22

Bảng 1.11 Khả năng kiểm soát nấm mốc gây bệnh trên dưa chuột của chrysophanol, nepodin và parietin chiết từ rễ Rumex crispusa 22

Bảng 1.12 Ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến khả năng kháng nấm Fusarium 24

Bảng 3.1 Kết quả thử hoạt tính các dịch chiết của cây Rumex crispus trên 4 loại

bệnh hại cây trồng 53

Trang 7

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

HÌNH

Hình 1.1 Cây Rumex crispus L 4

Hình 1.2 Lá và hoa cây Rumex crispus L 5

Hình 1.3: Chế phẩm dạng viên chiết từ Rumex crispus dùng chữa các bệnh đường hô hấp ở người 5

Hình 3.1 Bản mỏng TLC của hợp chất RP1.1 (hệ dung môi n-hexan/EtOAc 8:2, hiện màu bằng TT CeSO4) 41

Hình 3.2 Bản mỏng TLC của hợp chất RP1.1 (hệ dung môi n-hexan/ axeton 9:1, hiện màu bằng TT CeSO4) 41

Hình 3.3 Phổ 1H-1H COSY giãn rộng của hợp chất 1 42

Hình 3.4: Phổ HMBC của chất RP1.1 44

Hình 3.5 : Một số tương tác chính trên phổ HMBC của chất RP1.1 44

Hình 3.6 Bản mỏng TLC của hợp chất 2 (hệ dung môi n-hexan/ EtOAc 8:2, hiện màu bằng TT CeSO4) 45

Hình 3.7 Phổ 13C-NMR của chất RP4.5 46

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR giãn rộng của chất 2 47

Hình 3.9 Bản mỏng TLC của hợp chất 3 (hệ dung môi n-hexan: EtOAc= 8:2, hiện màu bằng TT CeSO4) 48

Hình 3.10 Bản mỏng TLC của hợp chất 3 (hệ dung môi n-hexan: axeton = 9:1, hiện màu bằng TT CeSO4) 48

Hình 3.11 Phổ 1H-NMR của chất RP1.4 49

Hình 3.12 Bản mỏng TLC của hợp chất RP10.5.2 (Dung môi CH2Cl2/MeOH 95:5 hiện màu bằng TT CeSO4) 50

Hình 3.13 Bản mỏng TLC của hợp chất RC8.4.2 51

(n-Hexan/Axeton 7:3, hiện màu bằng TT CeSO4) 51

S Ơ ĐỒ Sơ đồ 1 Quy trình ngâm chiết mẫu thực vật 34

Sơ đồ 2 Quá trình phân lập các chất từ cặn n-hexan 35

Sơ đồ 3: Quá trình phân lập các chất từ cặn chiết EtOAC 36

Trang 8

EI-MS Electronic Impact Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng)

IR Infared Spectrometry(Phổ hồng ngoại)

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonace Spectroscopy (Phổ cộng hưởng

từ hạt nhân proton)

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonace Spectroscopy (Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân carbon 13) DEPT Distortioless Enhancement by Polarisation Transfer (phổ DEPT) COSY Correlation Spectroscopy (Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation (phổ tương tác hai chiều

dị hạt nhân) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ tương tác đa liên kết

hai chiều dị hạt nhân)

 Các chữ viết tắt khác

EtOAc Ethyl acetat

s: singlet d:doublet t:triplet

m: multiplet dd:double doublet br:broad

Trang 9

Vũ Thị Lan Phương 1 Đại học Bách khoa Hà Nội

LỜI MỞ ĐẦU

Sâu bệnh, côn trùng hại cây trồng là một trong những nguyên nhân làm giảm năng suất, từ đó làm ảnh hưởng tới an ninh lương thực trên thế giới Việc sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật đã trở thành một nhu cầu không thể thiếu trong sản xuất nông nghiệp trên thế giới Tuy nhiên việc sử dụng rộng rãi các hóa chất bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học đang làm gia tăng ô nhiễm môi trường, cũng như làm ảnh hưởng tới sức khỏe con người Do đó hiện nay con người đang hướng tới tìm kiếm sử dụng các sản phẩm thân thiện hơn với môi trường, ít độc với người sử dụng, phân hủy nhanh để thay thế các sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật tổng hợp hóa học Các sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc thảo mộc là một thay thế đang được quan tâm Thực vật với một số lượng lớn các loài, trong đó nhiều loài có hoạt tính, chính là nguồn nguyên liệu đồi dào cho việc nghiên cứu, chiết tách để tạo

ra các chế phẩm có hoạt tính phòng trừ sâu bệnh, côn trùng hại cây trồng

Các nghiên cứu gần đây trên thế giới cho thấy dịch chiết của loài Chút chít

nhăn (Rumex crispus L.) có hiệu quả diệt nấm tốt, đặc hiệu với loại nấm mốc gây

bệnh mốc sương trên cây lúa, cây đậu Hà Lan và cây dưa chuột Ngoài ra, chế phẩm

này cũng có tác dụng với các loại nấm mốc như Magnaporthe grisea, Phytophthora

infestans, Botrytis cinerea, Puccinia recondite, Blumeria graminis f.sp.hordei gây

bệnh ở lúa và khoai tây Ở Việt Nam, năm 2008, nhóm nghiên cứu của TS Lưu Hoàng Ngọc, Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam chủ trì, đã bước đầu nghiên cứu

cao dịch chiết từ rễ cây Chút chít nhăn (R crispus) với định hướng làm thuốc trừ

nấm thảo mộc thân thiện môi trường

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu về cây Chút chít nhăn (R Crispus) đã kể

trên, em quyết định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu phương pháp chiết tách một số hoạt chất từ cây Chút chít (Rumex crispus L.) và thử nghiệm sản phẩm tách chi ết theo hướng bảo vệ thực vật” làm đối tượng nghiên cứu của đồ án này Mục

tiêu của đồ án là tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện tài liệu để sớm có thể đưa ra chế

phẩm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ cây Chút chít nhăn (R crispus) phục

vụ bà con nông dân

Trang 10

Nội dung cụ thể của đồ án như sau:

- Chiết tách dịch chiết tổng cây Chút chít nhăn (Rumex crispus)

- Thử hoạt tính sinh học dịch chiết etyl axetat, n-hexan và metanol trên:

 nấm Fusarium oxyporium gây bệnh héo vàng cây cà chua

 nấm Sclerotinia sclerotinium gây bệnh cây cải bắp

 nấm Botrytis cineratis gây bệnh cây đậu côve

 vi khuẩn Ervinia carotovora gây bệnh thối nhũn hành ta

- Chiết tách và xác định cấu trúc các chất từ dịch chiết etyl axetat của cây

Chút chít nhăn (R crispus)

- Chiết tách và xác định cấu trúc các chất từ dịch chiết n- hexan của cây Chút

chít nhăn (R crispus)

Trang 11

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật

1.1.1 Vài nét về họ rau Răm (Polygonaceae)

Trên thế giới họ rau răm (Polygonaceae) có 49 chi với khoảng 1000 loài, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc bán cầu Ở Việt Nam có 10 chi: Antenoron,

Antigonon, Coccoloba, Fagopyrum, Fallopia, Homalocladium, Polygonum, Reynoutria, Rheum, Rumex [1]

1.1.2 Vị trí phân loại chi Rumex trong hệ thống phân loại thực vật

Chi Rumex thuộc:

Nghành Angiosperms

Lớp Eudicots

Phân lớp Core eudicots

Bộ Caryophyllales

Họ rau Răm (Polygonaceae)

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Rumex

Dạng cỏ sống hàng năm hay sống dai, thường nạc, không mùi vị hoặc hơi đắng, có khi chua Rễ thường có thớ, ít khi có củ Các lá đều mọc từ gốc hoặc xếp dọc thân, có hình dạng thay đổi thường hơi nạc, bẹ chìa dạng màng có khi chóng tàn Cụm hoa thành xim đơn hay vòng giả, thường kèm theo lá hay không và thường tạo thành các chùm hay chùm ở ngọn Hoa thường lưỡng tính hay đa tính khác gốc do thui biến, nhỏ, màu lục hay vàng vàng, tập hợp dọc các trục hoa, cuống hoa dạng sợi tóc, bao gồm 2 vòng, vòng ngoài 3 mảnh không đồng trưởng thường gập ra ngoài sau khi nở, vòng trong 3 mảnh áp sát bầu héo quắt hoặc có đồng trưởng dạng màng hoặc tạo thành 3 van đai Nhị 6, đính ở gốc của bao hoa và xếp từng đôi đối diện với 3 mảnh hoa ngoài, bao phấn đính gốc Bầu có 3 góc, vòi nhụy

3 dạng sợi rất nhỏ, đầu nhụy nhiều dạng bút vẽ Quả có vỏ quả ngoài dai nằm trong

3 mảnh trong của bao hoa bong nhẵn và màu vàng nhung nhiều hay ít [1]

Trang 12

1.1.4 Sự phân bố của chi Rumex

Chi Rumex gồm 200 loài phân bố ở các vùng ôn đới chủ yếu ở Bắc bán cầu

Ở Việt Nam có 7 loài [1]

1.1.5 Đặc điểm thực vật loài Rumex crispus

Tên Việt Nam: Chút chít nhăn, Dương đề nhăn [1]

Rumex crispus L là loại cây sinh trưởng tốt tại vùng đất chua, chủ yếu tại khu vực bắc bán cầu nhưng đã được du nhập gần như khắp mọi nơi Cây sinh trưởng tốt vào mùa thu đông, ở những nơi ẩm thấp[4,8]

Rumex crispus L dạng

thân cỏ, rễ cái dài có màu hơi

nâu ở bên ngoài và màu vàng ở

Hình 1.1 Cây Rumex crispus L

Hoa nhỏ màu hơi xanh hoặc hơi đỏ Hoa mọc thành cụm sít nhau Đài hoa có kích thước 3 - 4mm, có lông tơ, tràng hoa hơi trắng dài 4 - 5mm Hoa Chút chít mọc trên các lá và mọc thành cụm giống như một vòng xoắn, khó quan sát, chủ yếu là hoa lưỡng tính Quả bế ba cạnh, dưới có đài dài 8 - 12mm [4]

Trang 13

Rễ cây có thể đào quanh năm,

nhưng tốt nhất vào mùa thu đông, từ

tháng 8 tới tháng 10 Sau khi thu

hoạch, rễ được rửa sạch, cắt bỏ rễ con

và phơi khô, cắt thành từng đoạn 10 -

20cm, đường kính 1-1,5cm, mặt ngoài

màu nâu có vết nhăn dọc, mặt cắt

ngang màu vàng nâu, vùng sinh tầng

trông rất rõ, mùi nhẹ, đặc biệt, vị lúc

đầu hơi ngọt sau đắng [4,8] Hình 1.2 Lá và hoa cây Rumex crispus L

Phân bố: Ấn Độ, Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Lào, Indonesia Ở nước

ta có gặp từ Hà Nội, Ninh Bình và Lâm Đồng, Cần Thơ Mọc tự nhiên nơi đất ẩm ướt và chua, ven rừng, ven đường, ven suối, thung lũng, khe đá, có khi gặp ở cồn cát [1]

1.2 Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Rumex crispus

Trong các bộ phận của chi Rumex, rễ là

phần có giá trị sử dụng cao nhất Trong y học

dân tộc, nó được dùng như một loại thuốc bổ

giúp thanh lọc máu, chữa bệnh thấp khớp, táo

bón, sưng viêm đường hô hấp cấp và mãn

tính, chứng bệnh scorbut (bệnh của máu do

thiếu vitamin C) Rumex crispus còn được

dùng như thuốc nhuận tràng do có tác dụng

tẩy nhẹ, êm dịu trên ruột và dùng trong điều

trị bệnh trĩ; dùng để chữa các bệnh ngoài da

như : vẩy nến, eczêma, chứng mày đay,

chứng bệnh vàng da, mẩn ngứa [1,8]

Hình 1.3: Chế phẩm dạng viên

chiết từ Rumex crispus dùng chữa

các bệnh đường hô hấp ở người

Trang 14

Những nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học đã chỉ ra rằng Rumex

crispus có hoạt tính chống oxy hóa, kháng lại sự hoạt động của một số loại vi khuẩn

và nấm mốc

Năm 2006, Gwi-Taek Jeong và cộng sự đã tiến hành xác định khả năng

chống oxy hóa của loài Rumex crispus theo phương pháp DPPH sử dụng BHA,

BHT, acid Ascorbic là các chất so sánh Kết quả cho thấy trong các dịch chiết hexan, etyl axetat, butanol, nước (bảng 1.1) thì dịch chiết ethyl acetat có hoạt tính

n-tương đương so với BHA và acid Ascorbic [18]

Bảng1.1: Chỉ số DPPH của các dịch chiết từ cây Rumex crispus a [18]

Trong một nghiên cứu khác của Zoran Maksimovic´và cộng sự, nghiên cứu

khả năng chống oxy hóa của dịch chiết Metanol từ quả Rumex crispus L bằng các

phép thử FRAP, DPPH và LP so sánh với các chất chống oxy hóa BTH, Rutin, Quercetin, acid Ascorbic Kết quả dịch chiết metanol của quả Rumex crispus L thể

hiện hoạt tính tương đương BHT, nhưng thấp hơn so với Rutin, Quercetin và acid Ascorbic (bảng 1.2) [32]

Trang 15

Bảng 1.2: Các chỉ số FRAP, DPPH, LP của các chất BHT, Quercetin, Rutin,

acid Ascobic và dịch chiết Metanol từ quả Rumex crispus [32]

sự phát triển các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,

Escherichia coli , Candida albicans, Bacillussubtilis [11, 23, 31] Gwi-Taek Jeong

và cộng sự, đã tiến hành thử hoạt tính của các dịch chiết n-hexan, butanol, etyl axetat và nước kết quả cho thấy các phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn trên các

đối được quan sát (chỉ trừ vi khuẩn Pseudomonas areuginosa), đặc biệt hoạt tính thể hiện rõ nhất đối với Vibrio vulificus và Saccharomyces cerevisiae [18]

Bảng1.3: Hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết từ loài Rumex crispus [18]

Dịch chiết (phần trên mặt đất/phần dưới mặt đất) Chủng vi sinh vật Nước n-Hexan Butanol Etyl axetat

Trang 16

- Không có tăng trưởng; +: ít hơn 8 ~ 9 mm; + +: ít hơn 9 ~ 10 mm; + + +: 10

~ 11 mm

Trong công tác phòng trừ bệnh hại cây trồng, đã có khá nhiều nghiên cứu và

ứng dụng khả năng kháng nấm của các hoạt chất có trong Rumex crispus Các kết quả thử nghiệm cho thấy dịch chiết của Rumex crispus cho hiệu quả diệt nấm tốt,

đặc hiệu với loại nấm mốc gây bệnh trên đậu Hà Lan và dưa chuột [20, 21]

1.3 Nghiên cứu hoá học chi Rumex

Trong 200 loài của chi Rumex đã có nhiều loài được nghiên cứu về thành

phần hóa học Các hợp chất đã được phân lập chủ yếu là anthraquinones/dẫn xuất antracene (aglycones của chrysophanol, emodin, aloe-emodin, rhein), các dẫn xuất của naphthalen (bao gồm neopodin, lapodin), tannin (catechol), một số axit hữu cơ,

rumicin, các chất dầu và clorophyl

Năm 2001, Demirezerr và đồng nghiệp đã phân lập được 5 hợp chất

napththalene glycoside từ dịch chiết MeOH của rễ cây Rumex patientia là 3-methyl-6-carboxy-1,8-dihydroxynaphthalene-8-O-β-D-glucopyranoside (1); 2-

2-acetyl-acetyl-3-methyl-1,8-dihydroxynaphthalene-8-O-glucopyranosyl (1→3)

β-D-glucopryranoside (2), 4,4’’-binaphthalene-8,8”-O,O-di-β-D-glucopryranoside (3);

nepodin-8-O- β-D-glucopyranoside (4); torachrysone- 8-O-β-D-glucopyranoside (5)

HOOC

O HO

Trang 17

O HO

HOOC

O HO

(3)

Tiếp tục nghiên cứu thành phầm hóa học rễ cây Rumex patientia, Demirezerr

và đồng nghiệp đã phân lập được thêm 9 hợp chất: chrysophanol (6), physion (7),

emodin (8), chrysophanol-8-O- β-D-glucopyranoside (9), glucopyranoside (10), emodin-6-O-β-D-glucopyranoside (11), flavan-3-ol,6- chlorocatechin (12), catechin (13), orcinol (14 ); trong đó có 2 hợp chất mới là 11 và

emodin-8-O-β-D-12 Chín hợp chất này được thử hoạt tính chống oxy hoá và chống ung thư đối với

dòng tế bào ung thư vú MCF7, ung thư gan HepG2, kết quả cho thấy 12 và 13 có

hoạt tính chống oxy hoá [16]

OH

HO

OH H

H

O

OH OH

OH

HO

OH H

H Cl

CH3

OH HO

2

= glu (10):R1 = OH,R

2

= glu

(11) (12)

(13) (14)

Trang 18

Từ dịch chiết diclometan của cây Rumex japonicus, các nhà khoa học Trung

quốc đã phân lập được 3 hợp chất anthraquinone là : chrysophanol (6), physion (7), emodin (8) [29]

Vào năm 2006, Kerem và đồng nghiệp đã phân lập được 3 hợp chất

trans-stibene là 3,5,4’-trihydroxystilbene (15); 5,4’-dihydroxystilbene-3-O-

β-D-glucopyranoside (16); 5,4’-dihydroxystilbene-3-O-β-α-glucopyranoside (17) từ rễ

cây Rumex bucephalophrorus của Israel [25]

OH HO

HO

O O HO

HO HO

CH2OH

(15)

(16)

O OH

HO

OH O

OH HO

(17)

Năm 2007, Wegiera và cộng sự đã tiến hành xác định hàm lượng dẫn xuất

anthracene trong một số loài thuộc chi Rumex L., kết quả cho thấy tỷ lệ anthracene

toàn phần trung bình là 3% - 3,4% trong đó có chừng 0,47% ở dạng tự do và 2,54%

ở dạng kết hợp [30]

Trang 19

Bảng 1.4 Tổng hàm lượng anthracene trong các phần của chi Rumex L [30]

1.4 Nghiên cứu hóa học cây Rumex crispus

Từ cây Rumex crispus các nhà khoa học đã phân lập được hợp chất

1,8-dihydroxy-3-methyl-9-anthrone (20) vào năm 1963 [12] Sau đó, đã có nhiều hợp

chất được phân lập từ cây Rumex crispus như chrysophanol (6), physcion (7),

emodin (8), rhein (18); 1,5-dihydroxyanthraquinone (19) [19, 26, 30] Đến năm

2007, Selda Başkan và cộng sự đã phân lập được thêm 3 hợp chất nữa từ cây này là

1,5-dihydroxy-3-methylanthraquinone (21); hydroxymethylanthraquinone (22); 1,5-dihydroxy-3-methoxy-7- methylanthraquinone (23) [12]

Trang 20

Năm 2009, các nhà khoa học ở Khoa Dược, Bệnh viện No.421 PLA, Quảng

Châu, Quảng Đông - Trung Quốc đã phân lập được 15 hợp chất là β-sitosterol (24), acid hexadecanoic (25), hexadecanoic-2,3-dihydroxy propyl este (26), chrysophanol (6), physcion (7), emodin (8), chrysophanol-8-O- β-D-glucopyranoside (27),

physcion-8-O-β-D-glucopyranoside (28), emodin-8-O-β-D-glucopyranoside (29), gallic acid (30); (+)- catechin (13), kaempferol (31), quercetin (32), kaempferol-3-

O- α-L-rhamnopyranoside (33), quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (34) từ phân đoạn ete dầu hoả và etyl axetat của loài Rumex crispus, trong đó hợp chất 26, 29,

31, 33, 34 lần đầu tiên thu được từ loài R crispus [17]

Trang 21

HO

H HO

H

H OH H HO

H

HO H HO

H

H OH H OH

HO

OH

OH O

HO

OH O OH

HO O

OH

(28)

OH O OH

HO O

OH OH

OH

(34)

OH

Trang 22

1.5 Đặc điểm sinh học và sinh thái của bệnh gây bởi vi khuẩn, nấm mốc

1.5.1 Bệnh héo vàng cà chua do nấm Fusarium oxyporium

Bệnh héo vàng cà chua được mô tả lần đầu tiên bởi Masse G.E ở Anh vào năm 1895 Bệnh có khắp nơi trên thể giới nhưng chủ yếu ở vùng nhiệt đới

Cây con bị bệnh còi cọc, kém phát triển, sau chết Cây trưởng thành bị bệnh các lá phía dưới gốc thường biến vàng, không bị rụng Vết bệnh ở trên thân sát mắt đất hoặc cổ rễ màu nâu, vết bệnh lớn dần làm khô tóp cả đoạn thân sát mặt đất, bộ

rễ kém phát triển, rễ bị thối dần Khi trời ẩm, trên mắt vết bệnh có lớp nấm màu hồng nhạt, chẻ dọc thân thấy bó mạch libe màu nâu Cây bị bệnh ban ngày héo, ban đêm hồi phục cây sinh trưởng kém Sau một tuần đến một tháng cây chết hoàn toàn

Bệnh do nấm Fusarium oxysporium f.sp licopersici( Sacc) W.C.Snyder and H.N Hans gây ra Nấm thuộc họ Tuberculariaceae, bộ Moniliales, lớp nấm bất toàn Trên môi trường PDA, tản nấm xốp, màu hồng nhạt, sau cấy 4-5 ngày hình thành sắc tố màu đỏ tím, sau cấy 3-5 tuần nấm hình thành bào tử hậu Trên môi trường CLA, bào tử hình thành rất nhiều Bào tử lớn hơi cong hình lưỡi liềm, có 3-5 vách ngăn, kích thước 27- 46 x 3-5 µm, không màu hoặc vàng nhạt bào tử nhỏ hình ôvan hoặc elip, kích thước 5-12x 2,2- 3,5 µm, không có vách ngăn, bào tử được hình thành trong bọc giả Trên bề mặt vết bệnh, bào tử hình thành rất nhiều Đây là nguồn lây lan và gây bệnh cho cây cà chua khác

Bệnh phát triển ở nơi thời tiết ấm, trên đất cát và chua Nấm tồn tại trong đất vài năm, nhiệt độ thích hợp 28oC Bệnh phát triển mạnh vào tháng 4, 5 hại cà chua

vụ đông xuân và xuân hè Bênh xuất hiện ở tháng 9,10 gây hại cà chua vụ đông sớm [ 9] Nấm lây truyền qua hạt giống, cây con bị nhiễm trước khi trồng hoặc do gió, nước, công cụ làm đất… Nấm có thể tồn tại trong đất nhiều năm( Dhesi N.S và ctv, 1968)

Trang 23

1.5.2 Bệnh thối hạch bắp cải do nấm Sclerotinia Sclerotinium (Lib.) De Bary

Bệnh thối hạch phá hoại rất phổ biến trên 160 loài cây thuộc 32 họ khác nhau nhưng chủ yếu là cải bắp, cà rốt, đậu trắng Cây cải bắp có thể bị bệnh từ giai đoạn còn non, nhưng bệnh phá hoại chủ yếu vào thời kỳ cuốn bắp trở đi làm cây chết, bắp cải thối khô

Cây con bị bệnh, gốc thân sát mặt đất bị thối nhũn làm cây chết gục đổ trên ruộng Trên cây lớn, vết bệnh thường bắt đầu từ các lá già sát mặt đất và gốc thân

Ở trên thân vết bệnh lúc đầu có màu vàng nâu, nếu trời ẩm ướt chỗ bị bệnh dễ bị thối nhũn nhưng không có mùi thối, nếu trời khô hanh chỗ bị bệnh khô teo có màu nâu nhạt

Bệnh thối hạch cải bắp do nấm Sclerotinia Sclerotinium (Lib.) De Bary gây

ra Nấm thuộc họ Scloerotiniaceae, bộ Helotiales, lớp Nấm Túi Hạch nấm là một giai đoạn bắt buộc trong chu kỳ phát triển của nấm Khi gặp điều kiện thuận lợi hạch nấm nảy mầm hình thành quả thể đĩa

Quả thể đĩa hình hoa loa kèn hoặc hình phễu dẹt, đường kính 2-8 mm, có cuống dài hay ngắn tùy thuộc vị trí hạch nấm nằm trong đất sâu hay nông Quả thể màu nâu hồng hay hồng nhạt, cuống có mầu nâu sẫm hoặc nâu đen Túi hình trụ dài, không màu, kích thước 111,4-128 × 5,2-6,5 µm bên trong có chứa 8 bào tử túi hình bầu dục, đơn bào không màu, kích thước 11,7-16,9 × 3,9-5,2 µm

Để nảy mầm hạch nấm phải hút một lượng nước nhất định cũng như đòi hỏi nhiệt độ tương đối thấp Bào tử túi hình thành thuận lợi trong điều kiện độ ẩm cao

và nhiệt độ 18-240C Bào tử túi có thể nảy nầm trong phạm vi nhiệt độ khá rộng từ 2-330C Sợi nấm sinh trưởng thuận lợi ở nhiệt độ 15-250C, độ ẩm không khí thích hợp trên 85% và độ pH 5-8

Quá trình xâm nhập của nấm vào cây tiến hành thuận lợi ở nhiệt độ 19-240C

Vì vậy, bệnh thường phá hại cải bắp từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau Nguồn bệnh chủ yếu bảo tồn ở dạng hạch nấm rơi rụng trong đất sau thu hoạch Bào tử túi nhờ gió

Trang 24

lan truyền, khi gặp điều kiện thuận lợi nảy mầm xâm nhập vào các lá già, xuyên qua tế bào biểu bì hình thành sợi nấm, tiết ra enzym pectinaza phân giải mô tế bào [9]

1.5.3 B ệnh thối nhũn trên hành ta do vi khuẩn Ervinia carotovora

Vi khuẩn Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn trên nhiều loài cây trồng

khác nhau Vi khuẩn là loại đa thực phá hoại trên nhiều loại cây trồng: hành tây, tỏi tây, cà rốt, cải bắp, súp lơ, cải canh Theo Nguyễn Thị Nghiêm, Vũ Triệu Mân và

Lê Lương Tề (1999) chúng có khả năng tấn công nhiều loại cây rau màu như gừng, dưa leo, cải bắp, cần tàu, ớt, cà chua, cà rốt, khoai tây Vết bệnh nhũn nước xuất hiện trên mô cây bệnh rồi phát triển nhanh chóng Mô bệnh trở nên mềm nhũn, nhày

nhụa, thường sậm màu, bốc mùi hôi thối

Biểu hiện bệnh trên cây hành ngoài sản xuất: ban đầu, trên thân hành xuất hiện các vết úng nước, các vết úng này lan rộng dần và một thời gian sau thì có biểu hiện triệu chứng thối nhũn Phần thân bị bệnh thối ướt, các lá phía trên bộ phận bị thối không thẳng đứng nữa mà bị đổ gục xuống sát mặt đất và bị phân hủy dưới tác động của các yếu tố vô sinh cũng như các sinh vật phân hủy có trong đất

Biểu hiện trên củ hành trong bảo quản, bệnh thối nhũn gây hại từ trong ra ngoài Nhìn bề ngoài, rất khó để phân biệt củ hành bị bệnh ở giai đoạn đầu với củ

hành khỏe vì lớp vỏ hành vẫn được giữ nguyên cả màu sắc cũng như hình dạng củ

Sau khi bị nhiễm vi khuẩn Erwinia carotovora, củ hành bị bệnh sẽ có biểu hiện

thối nhũn, chảy nước và có mùi hôi khó chịu Sau đó củ hành sẽ bị thối hoàn toàn, không giữ được hình dạng ban đầu nữa mà bị móp lại do không còn phần lõi bên trong, lúc này vỏ củ cũng chuyển sang màu nâu cánh gián, bên trong củ có thể có giòi

Bệnh thối nhũn trên hành ta do vi khuẩn Ervinia carotovora gây ra thuộc chi

Erwinia, họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria

Vi khuẩn gây bệnh là loại đa thực, ký sinh trên nhiều loại cây trồng khác

Trang 25

nhau Vi khuẩn hình gậy, hai đầu hơi tròn có 2 - 6 lông roi bao quanh mình Nuôi cấy trên môi trường pepton saccarose, khoai tây - agar khuẩn lạc có màu trắng xám hình tròn hoặc hình bầu dục không đều, bề mặt khuẩn lạc hơi ướt Vi khuẩn không

có vỏ nhờn, nhuộm gram âm, háo khí, dịch hóa gelatin, tạo H2S, thủy phân tinh bột, không tạo NH3 Trên môi trường TZC khuẩn lạc của vi khuẩn có màu đỏ ở giữa, dìa

có màu trắng đó là đặc trưng để nhận biết loài Erwinia sp Vi khuẩn phát triển thuận

lợi trong phạm vi nhiệt độ khá rộng nhiệt độ thích hợp nhất là 27 - 320C, nhiệt độ tới hạn là 500C, phạm vi pH cũng khá rộng từ 5,3 - 9,2, thích hợp nhất là pH 7,2 Vi khuẩn có thể bị chết trong điều kiện khô và dưới ánh sáng

1.5.4 B ệnh trên cây đậu côve do nấm Botrytis cineratis

Nấm Botrytis cinerea còn có tên khoa học khác là Botrytis fuckeliana N.F Buchw (giai đoạn vô tính) và Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel (giai đoạn

hữu tính)

Nấm Botrytis cinerea Pers gây bệnh trên các cây trồng cạn như rau, đậu

,lạc, Cây bị bệnh ở tất các giai đoạn nhưng nặng nhất vào thời kỳ cây con Cành bào tử mọc đơn lẻ, thẳng, đa bào, cành phân nhánh ngắn Cành không màu, hoặc mầu nâu nhạt, quanh vết bệnh có màu nâu xám, nấm phát triển ở nhiệt độ 20- 25oC Nhiệt độ tối ưu cho sự hình thành bào tử được tìm thấy là 15 ° C trong khi nó là 20

° C cho tăng trưởng sợi nấm (Jarvis, 1962a) Ở nhiệt độ dưới 15 ° C, tỷ lệ hình thành bào tử giảm mạnh và ở mức 10 ° C là chỉ có 10% của sự hình thành bào tử ở

15 ° C (Jarvis, 1962a) hoặc thậm chí ít hơn

Nấm xâm hại giai đoạn ra hoa, đậu quả, giai đoạn sau thu hoạch, trước khi xuất hiện, giai đoạn cây con, sau tăng trưởng thực vật Trên vết bệnh xuất hiện đốm màu nâu xám, lấy mẫu bệnh là bào tử của nấm Nấm phất triển tốt trên môi trường malt agar (MEA) và dextrose agar khoai tây (PDA) MEA hỗ trợ mạnh mẽ sự phát triển sợi nấm ở 20-25 ° C và thích hợp cho việc phát triển của hạch nấm (ở 15 ° C,

Trang 26

trong bóng tối) Môi trường PDA là tốt hơn cho các chế phẩm thương mại và thích hợp cho việc thu thập hình thành bào tử

1.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng dịch chiết từ cây Rumex crispus làm

thuốc bảo vệ thực vật

Trên thế giới, cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp, tình hình sâu, bệnh phá hoại mùa màng và các côn trùng gây bệnh cho người, gia súc ngày càng trở lên trầm trọng, gây tổn thất lớn về người và vật chất Sử dụng các hóa chất phòng trừ dịch hại (thuốc bảo vệ thực vật - BVTV) nhằm hạn chế các tổn thất trên

là biện pháp không thể thiếu, đặc biệt vào những thời điểm dịch hại xảy ra Vì vậy, nhu cầu các thuốc BVTV trên thế giới hàng năm không ngừng tăng lên Nếu như chỉ số tiêu thụ các sản phẩm này năm 2004 là 36929 triệu USD thì năm 2009 đã tăng lên 45045 triệu USD (tăng khoảng 21,9%) Tuy nhiên, cùng với việc gia tăng

sử dụng các hóa chất BVTV, nguy cơ ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới sức khỏe con người cũng tăng theo [3]

Để giảm thiểu tác động xấu của thuốc BVTV tới môi trường và con người, một trong những xu hướng hiện nay là tìm kiếm và sử dụng các sản phẩm chọn lọc,

ít độc đối với người sử dụng, phân hủy nhanh, ít để lại dư lượng trong nông phẩm

và môi trường - những sản phẩm thân thiện với môi trường, thay thế các sản phẩm độc hại trước đây Các hóa chất BVTV có nguồn gốc thảo mộc là sự lựa chọn đúng đắn trong công tác phòng trừ dịch hại, bảo vệ mùa màng

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hoạt tính trừ sâu của một số loài thực vật đã được người Trung Quốc và Ai Cập khám phá từ những năm trước Công nguyên Đến thế kỷ XVII, người ta đã biết

sử dụng nicotin trong cây thuốc lá để trừ sâu Thế kỷ XIX, các chất rotenon chiết từ

rễ cây Derris eliptica và pyrethum từ hoa cúc Crysanthemum đã được sử dụng như

thuốc trừ sâu Hiện nay trên thế giới có khoảng trên 2.000 loài cây có khả năng diệt được sâu hại, chưa kể các loài có khả năng diệt nấm, bệnh hay các tác dụng phòng trừ khác [ 32]

Trang 27

Năm 2004, Jin- Cheol Kim cùng các cộng sự tại viện công nghệ hoá học Krict của Hàn Quốc đã công bố kết quả nghiên cứu thử hoạt tính kháng nấm của

dịch chiết từ rễ Rumex crispus Kết quả cho thấy Rumex crispus có hiệu quả diệt

nấm tốt, đặc hiệu với loại nấm mốc gây bệnh trên đậu Hà Lan, lúa mạch và dưa chuột Ngoài ra cũng tác dụng tới các loại nấm mốc gây bệnh khác như

Magnaporthe grisea, Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, Puccinia recondite

ở lúa và khoai tây [20, 21]

Bảng 1.5 Hoạt tính của dịch chiết metanol chiết từ cây Rumex crispus trên sáu

loại bệnh hại cây [21]

Khả năng kiểm soát bệnh (%) 13 0 25 6 90 100

RCB: bạc lá lúa (Magnaporthe grisea)

RSB: đốm vằn, lép hạt cây lúa (Corticium sasaki)

TGM: mốc xám trên cây cà chua (Botrytis cinerea)

TLB: bệnh mốc sương trên cây cà chua (Phytophthora infestans)

WLR: gỉ sắt trên lá lúa mì (Puccinia recondita)

BPM: nấm mốc sương trên lúa mạch (Erysiphe graminis f sp hordei)

Bảng 1.6 Tính kháng nấm Erysiphe graminis hordei trên lúa mạcha của dịch

chiết metanol từ rễ Rumex crispus b [20]

Lượng đem cô lấy dịch (g) 300 100 33 11 3,7 1,2 Khả năng kiểm soát bệnhc (%) 100a 100a 98a 87b 33d 0e

a - Giống cây đã bị tiêm nhiễm nấm E graminis hordei một ngày sau khi được

phun dịch chiết trên lá;

b - Từ 300g vật liệu tươi cho 1,6g dịch chiết Rumex

c - Sau khi tiêm mầm bệnh 7 ngày thì đã có khoảng 100% diện tích cây trồng bị

ảnh hưởng

Trang 28

Bảng 1.7 Hoạt tính kháng nấm Sphaerotheca fuliginea trên dưa chuộta của

dịch chiết metanol từ rễ Rumex crispus b [21]

a Dịch chiết hay hoá chất được phun lên lá dưa chuột hai lần trong 7 ngày ngay sau khi bắt đầu xuất hiện những triệu chứng đầu tiên của nấm mốc sương (dưa chuột được trồng và theo dõi trong điều kiện nhà kính)

b Từ 300g nguyên liệu tươi cho 1,6g dịch chiết Rumex crispus

c Đánh giá bệnh sau bảy ngày điều trị

Các phép thử trên dịch chiết n-hexan, etyl axetat, butanol, nước của Rumex

crispus cho thấy chúng đều có tác dụng trên một số nấm gây bệnh, tuy nhiên ở các mức độ khác nhau điều này là do sự phân bố các hoạt chất chính trong dung môi

khác nhau Kết quả thử hoạt tính cho thấy dịch chiết n-hexan mang hoạt tính cao

nhất, tiếp theo là dịch chiết etyl axetat (bảng 1.8) [20]

Bảng 1.8 Khả năng kháng nấm của dịch chiết rễ Rumex crispus được chiết

bằng dung môi khác nhau a [20]

a Cây đã bị truyền mầm bệnh một ngày sau khi đem phun dịch chiết lên lá;

b Mỗi giá trị đại diện đã được đánh giá sự sai khác với độ tin cậy 95%;

c RCBc bệnh đạo ôn (Magnaporthe grisea); RSB bệnh khô vằn (Corticium

sasaki ); TGM bệnh mốc xám trên cà chua (Botrytis cinerea); TLB bệnh mốc sương trên cây cà chua (phytophthora infestans ); WLR bệnh rỉ sắt trên lá lúa mì (Puccinia

Trang 29

recondite ); BPM nấm mốc sương trên lúa mạch (Blumeria graminis f.sp.hordei)

Bên cạnh việc thử hoạt tính dịch chiết, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phân lập được một số chất và tiến hành thử hoạt tính sinh học của chúng bao gồm chrysophanol, nepodin, parietin Các chất này có khả năng kiểm soát hoạt động sống trong cây chống lại sự phát triển của sáu loại nấm, giảm sự phát sinh của nấm mốc Kết quả cũng cho thấy những chất này có tính diệt nấm với liều EC50như sau: 4,7µg/ml chrysophanol, 0,48µg/ml parietin, 20µg/ml nepodin Chrysophanol

(100µg/ml), nepodin (400µg/ml) có hiệu quả trị nấm gây bởi Podosphaera xanthii

cao hơn chất kháng nấm fenarimol (30µg/ml) và polyoxin (100µg/ml) trong cùng điều kiện thí nghiệm trên cây dưa chuột nuôi trồng trong nhà kính Parietin (30 và 10µg/ml) giảm sự phát triển nấm mốc sương trên dưa chuột hiệu quả như fenarimol (30µg/ml) và hiệu quả hơn polyoxinB (100µg/ml) Các kết quả được thể hiện trong

50 65±8,9b 21±24a 25±8,9a 0 98±2,4ab

100 75±11a 21±13a 16±5,7ab 20±6,1b 98ab

200 80±6,1a 14±19ab 25±13a 7±13c 100a

Trang 30

Bảng 1.10 Hoạt tính kháng nấm Blumeria graminis f sp Hordei a

Chất Nồng độ

(µg/ml)

Khả năng kiểm soát bệnhb

Trước khi truyền mầm bệnh

a Sau khi tiêm mầm bệnh 7 ngày thì khoảng 100% diện tích cây trồng bị ảnh hưởng;

b Mỗi giá trị đại diện đã được đánh giá sự sai khác với độ tin cậy 95%

Bảng 1.11 Khả năng kiểm soát nấm mốc gây bệnh trên dưa chuột của chrysophanol, nepodin và parietin chiết từ rễ Rumex crispusa

Chất Nồng độ (µg/ml) Khả năng kiểm soátb (%)

a.Cây dưa ở giai đoạn 7 lá mầm;

b Mỗi giá trị được đánh giá sự sai khác với độ tin cậy 95%;

Trang 31

1.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, Việt Nam là nước có hệ thực vật rất đa dạng, phát triển quanh năm, trong đó có nhiều loài cây chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, có thể ứng dụng làm nguyên liệu cho ngành sản xuất hóa dược và thuốc BVTV Trong lĩnh vực phòng trừ các côn trùng gây hại, từ lâu ở Việt Nam, người ta đã biết sử dụng một số cây, cỏ phục vụ mục đích này Cụ thể, các cây ruốc

cá, củ đậu, hạt thàm mát đã được dùng làm bả diệt chuột trong nhà, đánh bắt cá ngoài ruộng nuôi tôm, hoặc dùng khói của một số cây như cây chổi xể để xua muỗi, hương xả để đuổi rắn, gỗ thông để nhử mối…

Những công trình nghiên cứu thuốc BVTV có nguồn gốc thảo mộc được ứng dụng vào thực tế đầu tiên được Phòng Nông dược - Viện Hóa học CN (nay là Viện Hóa học công nghiệp VN) nghiên cứu từ những năm 80 của thế kỷ trước Những năm sau này, nhóm nghiên cứu do Giáo sư Nguyễn Công Hào thuộc Viện Hóa học (Phân Viện phía Nam) - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu chiết tách và sử dụng các hợp chất tự nhiên từ thực vật Việt Nam

để tổng hợp một số chất dẫn dụ sinh dục (pheromone) đối với côn trùng gây hại Năm 2001, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam (VIPESCO) đã nghiên cứu thành công và đăng ký thuốc trừ sâu thảo mộc VINEEM 0,15 ND, chứa 0,15 % hoạt chất Azadirachtin chiết từ cây xoan trồng ở Ninh Thuận Sản phẩm có thể diệt được nhiều đối tượng chính như sâu, bướm, rầy, nhện, mọt, tuyến trùng và các côn trùng

y tế [5,6,7]

Bắt đầu từ những năm 2000, trong Danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng ở Việt Nam đã xuất hiện những sản phẩm có nguồn gốc thảo mộc Năm 2001, Viện BVTV, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã đăng ký thuốc khử trùng kho Gu chung jing 25 DP, trong thành phần chứa thảo mộc 25 % Một số công ty nước ngoài đã đăng ký sản phẩm thuốc trừ sâu chứa 0,1 - 0,3 % hoạt chất là Azadirachtin, chiết từ cây Neem (xoan) Ấn Độ như : T Stanes & Co., Ltd, India, Magrow Pte Ltd Cũng trong năm 2001, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam

Trang 32

(VIPESCO) đã nghiên cứu thành công và đăng ký thuốc trừ sâu thảo mộc VINEEM 0,15 ND, chứa 0,15 % hoạt chất Azadirachtin chiết từ cây xoan trồng ở Ninh Thuận (Đào Văn Hoằng, 2001) Sản phẩm có thể diệt được nhiều đối tượng chính như sâu, bướm, rầy, nhện, mọt, tuyến trùng và các côn trùng y tế Các sản phẩm có nguồn gốc thảo mộc này còn được khuyến cáo sử dụng trong công tác phòng trừ dịch hại tổng hợp (IPM) ở hầu hết các nước phát triển và cả ở Việt Nam

Bên cạnh đó, Dương Anh Tuấn và cộng sự Viện Hóa học - Viện KH&CN đã bước đầu nghiên cứu và ứng dụng một số chế phẩm thuốc BVTV từ cây NEEM, bã thanh hao hoa vàng, cây ruốc cá

Năm 2008, nhóm nghiên cứu do TS Lưu Hoàng Ngọc, Viện Hóa học công nghiệp VN chủ trì đã bước đầu nghiên cứu cao dịch chiết từ rễ cây Chút chít

Rumex crispus, định hướng làm thuốc trừ nấm thảo mộc thân thiện môi trường Nghiên cứu đã tiến hành xác định ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng

kháng nấm Fusarium oxysporium schlech gây bệnh héo vàng cây khoai tây (bệnh 1)

và nấm Fusarium gây bệnh héo rũ cây chuối (bệnh 2) Kết quả thu được cụ thể

a Quá trình chiết được thực hiện ở nhiệt độ sôi của các dung môi

b Hiệu quả chiết tính theo % nguyên liệu khô

c Hiệu quả kháng bệnh ở nồng độ 0,45%

Trang 33

Kết quả thí nghiệm cho thấy, ở cùng một nồng độ 0,45%, sau khi phun chế

phẩm, khả năng kiểm soát bệnh của cao dịch chiết n-hexan là lớn nhất, sau đó đến

etyl axetat Tuy nhiên, khi sử dụng toàn bộ cao dịch chiết thu được từ các dung môi khác nhau để phun lên các mẫu nấm có đường kính tản nấm giống nhau thì hiệu quả

là tương đương nhau, đạt 61 - 65% [2]

Thời gian gần đây, cùng với các loại khác, thuốc BVTV có nguồn gốc thảo mộc đã được sử dụng nhiều ở Việt Nam do những tính chất ưu việt thân thiện với môi trường của nó Năm 2008, đã có tổng cộng gần 40 loại thuốc thảo mộc được đăng ký sử dụng, trong đó có 11 loại thuốc trừ sâu, 12 loại thuốc trừ nấm bệnh, 7 loại thuốc trừ ốc, 4 loại thuốc dẫn dụ, 3 loại chất hỗ trợ, 1 loại thuốc khử trùng (Danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng ở VN năm 2008) Những hoạt chất chủ yếu được sử dụng là saponin (trong cây sở và một số cây khác), matrin (cây hòe), eugenol (hương nhu), carvacrol (cỏ xạ hương), oligo - alginate (rong biển), rotenone (ruốc cá), một số tinh dầu như dầu chanh, cam, dầu hạt bông, dầu đinh hương, dầu tỏi

Mặc dù nhu cầu và thực tế sử dụng các thuốc BVTV có nguồn gốc thảo mộc

ở Việt Nam tương đối đa dạng nhưng các công trình nghiên cứu trong lĩnh vực này còn rất ít Phần lớn các sản phẩm sử dụng ở Việt Nam đều do các công ty nước ngoài hoặc công ty liên doanh đăng ký Một trong những lý do là sự quan tâm chưa đúng mức của các nhà khoa học Việt Nam trong lĩnh vực này Ngoài ra, như đã đề cập ở trên, việc nghiên cứu và áp dụng vào sản xuất các thuốc BVTV có nguồn gốc thảo mộc phức tạp và cần những thiết bị hiện đại (cả khâu chiết tách, xác định cấu trúc lẫn giai đoạn thử hiệu lực sinh học, độc tính), sản lượng nhỏ nên giá thành sản phẩm cao, người nông dân khó chấp nhận Nếu khắc phục được những yếu tố này thì khả năng ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tế là cao

Trang 34

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Mẫu thực vật

Rumex crispus (cây chút chít nhăn) được thu hái ở Hoài Đức - Hà Nội vào tháng 2 năm 2011 Nguyên liệu sau khi thu hái được sơ chế bằng cách cắt nhỏ và đem sấy khô ở 500C đến độ ẩm W = 10%, bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát

Mẫu thực vật được định tên bởi TS Trần Thế Bách, Viện Sinh thái Tài nguyên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Mẫu thực vật được bảo quản tại

Trung tâm Hóa thực vật, Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

Các phép đo được tiến hành tại Viện Hoá sinh biển và Viện Hóa học -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Điểm nóng chảy được đo trên máy đo điểm nóng chảy hiệu Boetius HMK 70/3159

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy đo hồng ngoại biến đổi Fourier hiệu FTIR Impact-410 bằng phương pháp nén viên KBr

- Phổ khối va chạm điện tử (EI-MS) được đo trên máy ghi phổ khối Waters

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz với TMS là chất chuẩn nội

2.1.3 Dung môi và hóa chất

- Các dung môi được sử dụng là n-hexan, diclometan, etyl axetat, axeton, metanol

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 Merck F254 có độ dày 0,25 mm Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng λ =254 nm và λ = 366 nm

Trang 35

- Sắc ký cột (CC) sử dụng silica gel Merck cỡ hạt 40-63 µm, và sephadex LH- 20

- Thuốc hiện trong phân tích sắc ký lớp mỏng: Ceri sulfat, Vanilin/H2SO4

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Chiết tách dịch chiết tổng cây Chút chít nhăn (Rumex crispus)

- Thử hoạt tính sinh học dịch chiết etyl acxtat, n-hexan và metanol trên:

 nấm Fusarium oxyporium gây bệnh héo vàng cây cà chua

 nấm Sclerotinia sclerotinium gây bệnh cây cải bắp

 nấm Botrytis cinera tis gây bệnh cây đậu côve

 vi khuẩn Ervinia carotovora gây bệnh thối nhũn hành ta

- Chiết tách và xác định cấu trúc các chất từ dịch chiết etyl axetat của cây

Trang 36

2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính

Quá trình thử hoạt tính sinh học được thực hiện tại phòng thí nghiệm Viện Bảo vệ thực vật, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, Đông Ngạc, Từ Liêm,

Hà Nội

- Thí nghiệm đánh giá hiệu lực của chế phẩm dịch chiết rễ cây chút chít 5%

với các vi khuẩn và nấm gây bệnh: Nấm gây hại cây trồng gồm có: Sclerotinia

scleorotinium g ây bệnh thối hạch trên cây cải bắp; Botrytis cinerea gây hại trên cây đậu ăn quả; Fusarium oxysporium gây hại cây cà chua Vi khuẩn: Erwinia

carotovora gây bệnh thối nhũn trên củ hành

Các nấm bệnh được phân lập và nuôi cấy thuần trên môi trường PCA, PDA, hoặc Chapeks Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường PDA hoặc Wakimoto

Môi trường PCA (Potato Carrot Agar)

Trang 37

10 ngày

Với tác nhân gây bệnh là vi khuẩn dùng phương pháp giấy thấm đã khử trùng nhúng vào dịch vi khuẩn thuần rồi đem cấy trên môi trường có chế phẩm và môi trường không chế phẩm để làm đối chứng

Điều tra theo dõi tiến hành đo đường kính tản nấm ỏ các công thức có sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thực vật và đối chứng sau 3,4,5 … 10 ngày

Điều tra theo dõi tiến hành đo vòng tròn vi khuẩn ở các công thức có sở dụng các chế phẩm có nguồn gốc thực vật và đối chứng sau 1,2…7 ngày

Trang 38

Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất dựa vào

độ phân cực của chúng hoặc tùy theo kích thước phân tử Trong nghiên cứu này, việc phân lập các chất được thực hiện bằng sắc ký cột với chất mang là silica gel (hệ dung môi rửa giải với độ phân cực tăng dần),hoặc gel sephadex( gel dextran)

- Sắc ký cột (CC) sử dụng silica gel Merck cỡ hạt 40-63 µm, hoặc sephadex LH- 20

a/ Sắc ký cột thô:

Kích thước cột: chiều dài 70cm, đường kính 4cm

Sử dụng chất mang là silicagel Merck cỡ hạt 40-63 µm( pha tĩnh)

Cột được nhồi 120 g silicagel theo phương pháp nhồi ướt

- Nạp cặn dịch chiết etyl axetat lên cột để chiết tách các chất trong dịch chiết etyl axetat

- Nạp cặn dịch chiết hexan lên cột để chiết tách các chất trong dịch chiết hexan

n-Hệ dung môi chạy cột: n- hexan/axeton gradient( 0-100%)

Trang 39

Chế độ chạy gradient nồng độ

b/ Sắc ký cột phân đoạn:

Sau khi phân tách cặn dịch chiết thành các phân đoạn khác nhau, tiến hành chạy sắc ký cột phân đoạn để phân tách các chất tinh khiết từ các phân đoạn khác nhau của dịch tổng Tùy theo khối lượng mẫu của từng phân đoạn mà ta sử dụng kích thước cột khác nhau

Tiến hành tách phân đoạn sử dụng chất mang silicagel Merck cỡ hạt 40-63 µm( pha tĩnh) sử dụng các hệ dung môi rửa giải là n-hexan/etyl axetat gradient( 0-10%), n-hexan/axetat gradient (0-10%)

Tiến hành tách phân đoạn sử dụng chất mang sephadex G LH- 20 (pha tĩnh) sử dụng các hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH (2:8), CH2Cl2/ MeOH ( 3:7) hoặc MeOH 100%

2.3.3.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng là phương pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và xác định

số lượng các nhóm chất khác nhau có trong thành phần các dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn tách ra từ đó Dựa trên nguyên tắc các chất khác nhau có độ phân cực khác nhau nên được tách ra ở những vị trí khác nhau Đây là phương pháp vi lượng, hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn

Sắc ký lớp mỏng (TLC) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 Merck F254 có độ dày 0,25 mm Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng λ =254 nm và λ = 366 nm

2.3.4 Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại cho phép nhận biết sự có mặt của các nhóm chức có trong phân

tử hợp chất nghiên cứu, dựa vào cực đại hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức đó

2.3.5 Phổ khối lượng (MS)

Khối phổ là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]+, …từ đó giúp xây dựng công thức phân tử

Trang 40

2.3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tương tác

spin – spin J Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo

 Phổ H-NMR: trong phổ H-NMR độ chuyển dịch hóa học của các proton được xác định bằng thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy chúng biểu diễn bằng một độ dịch chuyển khác nhau Dựa vào độ dịch chuyển, diện tích pic cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân với nhau mà có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất

 Phổ 13C-NMR: phổ này cho tín hiệu phổ vạch của cacbon Mỗi nguyên tử cacbon ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton

 Phổ DEPT: phổ này cho tín hiệu phổ phân loại các bậc cacbon khác nhau Trên phổ DEPT 90 chỉ cho tín hiệu phổ của CH Trên phổ DEPT135 không cho tín hiệu của cacbon bậc 4, tín hiệu của CH và CH3nằm về một phía còn CH2nằm về phía đối diện

 Phổ HSQC: biểu diễn tương tác trực tiếp giữa nguyên tử C và nguyên tử H; trên phổ này một trục biểu diễn tín hiệu phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR

 Phổ HMBC : biểu diễn các tương tác xa của nguyên tử C và nguyên tử H trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn

bộ phân tử được xác định về cấu trúc

Tiêu đề	Nghiên cứu phương pháp chiết tách một số hoạt chất từ cây chút chít (Rumex Crispus L.) và thử nghiệm sản phẩm tách chiết theo hướng bảo vệ thực vật
Tác giả	Vũ Thị Lan Phương
Người hướng dẫn	TS. Lưu Hoàng Ngọc, PGS. TS. Khuất Hữu Thanh
Trường học	Đại học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành	Công nghệ sinh học
Thể loại	Luận văn thạc sỹ
Năm xuất bản	2013
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	104
Dung lượng	2,13 MB