THỰC PHẨM CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH –XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATRI FLUOROACETAT –PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG- HAI LẦN KHỐI PHỔ

3 Thuốc thửTất cả các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, nước được sử dụng là nước cấthai lần đã loại ion hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định

DT TCVN … : 2019

Xuất bản lần 1

THỰC PHẨM CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATRI FLUOROACETAT – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG- HAI LẦN KHỐI PHỔ

Infant formula – Determination of sodium fluoroacetate Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

HÀ NỘI – 2019

Lời nói đầu

TCVN … : 2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2015.03

Sodium Fluoroacetate in Infant Formula – Liquid chromatography–

Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS).

TCVN … : 2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc

gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất

lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN … : 2019

Thực phẩm công thức dành cho trẻ sơ sinh –

Xác định hàm lượng natri fluoroacetat –

Phương pháp sắc ký lỏng-hai lần khối phổ

Infant formula – Determination of sodium fluoroacetate –

Liquid chromatography tandem mass spectrometry

CẢNH BÁO  Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

Natri fluoroacetat rất độc với con người, thực hiện tất cả những bảo hộ cần thiết, đặc biệt là khi thao tác với dung dịch chuẩn gốc.

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng natri fluoroacetat trong thực phẩm côngthức dành cho trẻ sơ sinh ở dạng lỏng và dạng bột từ sữa và từ đậu nành bằng phương pháp sắc kýlỏng- hai lần khối phổ (LC-MS/MS)

Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp này là 1 µg/kg

2 Nguyên tắc

Mẫu sữa bột được hoàn nguyên trong nước (mẫu sữa dạng lỏng thì sử dụng luôn) Bổ sung axetonitrilvào mẫu để kết tủa protein, sau đó ly tâm, phần dịch nổi phía trên được rửa bằng n-hexan và axit hóabằng axit sulfuric đặc Bổ sung muối QuERChERS (MgSO4 và NaCl) để tách lớp, hỗn hợp sau đó được

ly tâm Phần dịch nổi phía trên được cho bay hơi đến khi còn 0,5 ml, ly tâm và phân tích trên hệ thốngLC-MS/MS với chế độ ion hóa ESI (-) và chế độ theo dõi phản ứng chọn lọc (SRM) Hợp chất phân tíchđược là anion fluoroacetat

Việc định lượng được thực hiện sử dụng chất nội chuẩn natri fluoroacetat dán nhãn đồng vị 13C

3 Thuốc thử

Tất cả các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, nước được sử dụng là nước cấthai lần đã loại ion hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác

3.1 n-Hexan (C6H14)

3.2 Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho LC-MS

3.3 Magie sulfat (MgSO4)

3.4 Natri clorua (NaCl).

3.5 Amoni focmat (HCOONH4)

3.6 Axit sulfuric (H2SO4), 95 % đến 97 %

3.7 Axit formic (HCOOH), đặc.

3.8 Natri fluoroacetat (FCH2COONa), CAS No 62-74-8, w = 99 %, 10 µg/ml trong nước

3.9 Chất chuẩn nội 13 C 2 -Natri fluoroacetat, w = 99 %, độ tinh khiết về đồng vị > 99,5 %.

3.10 Dung dịch chuẩn gốc natri fluoroacetat (10 µg/ml) trong nước

Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong thời gian như trên giấy chứng nhận dungdịch chuẩn

3.11 Dung dịch chuẩn làm việc natri fluoroacetat (1,0 µg/ml) trong axetonitril:nước (9:1)

Lấy 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc 10 µg/ml cho vào bình định mức 10 ml và thêm axetonitril đến vạch.Khi được bảo quản ở -20 ºC dung dịch này có thể bền trong 6 tháng

Dung dịch được đưa về về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

3.12 Dung dịch chuẩn làm việc natri fluoroacetat (0,2 µg/ml) trong axetonitril

Lấy 2,0 ml dung dịch chuẩn làm việc 1 µg/ml cho vào bình định mức 10 ml và thêm axetonitril đếnvạch Khi được bảo quản ở -20 ºC dung dịch này có thể bền trong 6 tháng

Dung dịch được đưa về về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

3.13 Dung dịch chuẩn làm việc natri fluoroacetat (0,05 µg/ml) trong axetonitril

Lấy 2,5 ml dung dịch chuẩn 0,2 µg/ml cho vào bình định mức 10 ml và thêm axetonitril đến vạch Khiđược bảo quản ở -20 ºC dung dịch này có thể bền trong 6 tháng

Dung dịch được đưa về về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

3.14 Dung dịch nội chuẩn gốc 13 C 2 Natri fluoroacetat (1000 µg/ml) trong nước

Cân 10 mg ± 0,1 mg chất chuẩn nội Hoà tan trong nước đựng trong bình định mức 10 ml và thêmnước đến vạch

Để giảm thiểu sự tiếp xúc với chất phân tích, có thể cân lọ đựng dung dịch chuẩn (w1, mg), tiếp tụcchuyển toàn bộ chất phân tích vào bình định mức 10 ml Hoà tan hoàn toàn và thêm nước đến vạch.Cân lại lọ đựng dung dịch chuẩn đã làm khô (w2, mg) Nồng độ của dung dịch (µg/ml) được tính theocông thức 1000 x (w1-w2)/10 Khi được bảo quản ở -20 ºC dung dịch này có thể bền trong 6 tháng Dung dịch được đưa về về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

3.15 Dung dịch nội chuẩn làm việc 13 C 2 natri fluoroacetat (0,2 µg/ml) trong axetonitril

Lấy 100 µl dung dịch chất chuẩn nội gốc 1000 µg/ml (3.14) cho vào bình định mức 10 ml và thêmaxetonitril đến vạch Khi được bảo quản ở -20 ºC dung dịch này có thể bền trong 6 tháng

Dung dịch được đưa về về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

3.16 Chuẩn bị dãy dung dịch để dựng đường chuẩn, tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn theo

Cân chính xác 315 mg ± 5 mg amoni focmat cho vào bình định mức 1 000 ml Thêm khoảng 300 mlnước (3.1), lắc đều cho tan hết, thêm 100 µl axit formic đậm đặc Thêm nước (3.1) đến vạch và trộn.Khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng, dung dịch này có thể bền trong 1 tháng.

3.18 Dung dịch dùng để rửa kim bơm mẫu tự động axetonitril/nước (1:1)

Dùng ống đong lấy 500 ml axetonitril cho vào bình định mức 1000 ml Thêm nước (3.1) đến vạch, chovào lọ HPLC Khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng, dung dịch này có thể bền trong 1 tháng

CHÚ THÍCH: Nồng độ của các dung dịch chuẩn được hiệu chỉnh dựa vào độ tinh khiết và lượng cân thực tế

3.19 Gói muối chiết QuERChERS, mỗi gói chứa 4 g MgSO4 (3.3) 1 g NaCl (3.4) (Agilent hoặc tươngđương)

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Ống ly tâm Falcon bằng polypropylen, dung tích 50 ml

4.2 Ống ly tâm Falcon bằng polypropylen, dung tích 15 ml

4.3 Máy ly tâm, các rotor phù hợp với ống 15 ml và 50 ml: có thể ly tâm ở 4 000 x g và có thể kiểm

soát được nhiệt độ

4.4 Máy lắc Vortex.

4.5 Máy ly tâm, để ly tâm ống 2 ml, có thể ly tâm ở 17 000 x g.

4.6 Ống ly tâm bằng popypropylen, dung tích 2 ml.

4.7 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

4.8 Máy lắc.

4.9 Bộ làm bay hơi.

4.10 Cột HPLC, kích thước 2,1 mm x 100 mm x 1,7 µm (ví dụ: Waters hoặc tương đương)

4.10 Hệ thống HPLC-MS/MS, ví dụ: Agilent 1200 SL kết hợp với máy quang phổ khối lượng tứ cực

Sciex 5500 có trang bị nguồn ion hóa TurboIonSpray hoặc tương đương

4.11 Dụng cụ thủy tinh, bình định mức và ống đong có dung tích thích hợp.

5 Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổichất lượng trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển

6 Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị mẫu

Trước khi tiến hành phân tích, mẫu được trộn đều hoặc đồng nhất kỹ bằng máy đồng nhất mẫu

Các mẫu kiểm soát chất lượng (QC) phải được thường xuyên phân tích lặp lại và phân tích cùng vớimẫu thử Nếu cần thiết, sử dụng các bình định mức khác nhau trong quá trình xử lý mẫu để duy trì tỉ lệpha loãng

Chuyển 5,0 g ± 0,1 g hỗn hợp trên cho vào ống Falcon 15 ml (4.2), ghi lại khối lượng chính xác đến0,1 g Thêm 50 µl dung dịch nội chuẩn làm việc 0,2 µg/ml (3.15), lắc đều Lượng nội chuẩn thêm vàotương đương với hàm lượng trong mẫu là 10 µg/kg

6.2.2 Mẫu dạng lỏng

Lắc kỹ vật chứa mẫu

Cân 5,0 g ± 0,1 g mẫu cho vào ống falcon 15 ml (4.2) Thêm 250 µl dung dịch nội chuẩn làm việc0,2 µg/ml (3.15), lắc đều đảm bảo chất chuẩn nội phân tán đều trong mẫu Lượng nội chuẩn thêm vàotương đương với hàm lượng trong mẫu là 10 µg/kg

6.3 Chiết mẫu

Thêm 8 ml axetonitril (3.2) vào các phần mẫu trong 6.2.1 hoặc 6.2.2, trộn kỹ rồi lắc bằng máy lắc trong1,5 min với tốc độ 1500 r/min Ly tâm trong 5 min ở nhiệt độ phòng ở 4000 x g, sau đó chuyển phầndịch nổi phía trên (khoảng 9 ml đến 10 ml) sang ống Falcon 50 ml

Thêm 10 ml hexan, lắc đều bằng máy lắc trong 1,5 min với tốc độ 1500 r/min

Ly tâm 5 min ở nhiệt độ phòng ở 4000 x g Hút bỏ lớp hexan phía trên

Thêm 100 µl axit sulfuric đặc (3.6) vào dung dịch chứa chất phân tích, lắc đều pH của hỗn hợp nàyphải ≤ 1 để chất phân tích ở dạng axit (pKa của axit fluoroaxetic là 2,39)

Thêm tiếp gói muối QuERChERS (3.19) có chứa 4,0 g ± 0,4 g MgSO4 và 1,0 g ± 0,1 g NaCl vào hỗnhợp Lắc nhanh để tránh vón cục, lắc tiếp trên máy lắc trong 1,5 min với tốc độ 1500 r/min

Ly tâm trong 5 min ở nhiệt độ phòng ở 4000 x g Chuyển phần dịch phía trên (khoảng 5 ml) vào ốngFalcon 15 ml

Cho bay hơi phần dịch thu được dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ 40 ºC ± 20 ºC cho đến khi còn 0,5 ml(vạch chỉ mức 0,5 ml có thể nhìn thấy trên thân ống Falcon) Không làm bay hơi đến thể tích nhỏ hơn0,5 ml để tránh bị mất mẫu

Chuyển 0,5 ml dịch thu được sang ống 2 ml, ly tâm trong 5 min ở nhiệt độ phòng ở 17 000 x g Chuyểnphần dịch trong vào lọ HPLC và phân tích trên hệ thống LC-MS/MS

6.4 Mẫu trắng thuốc thử

Để kiểm soát việc nhiễm chéo trong quá trình phân tích mẫu, mẫu trắng thuốc thử cần được phân tíchđồng thời cũng với mẫu thử, trong đó phần mẫu sữa sẽ được thay thế bằng nước với các giai đoạnchuẩn bị mẫu tương tự như trên

6.4 Phân tích sắc ký

6.4.1 Điều kiện phân tích bằng LC-MS/MS thích hợp được nêu trong Phụ lục A.

6.4.2 Thứ tự bơm mẫu trên hệ thống LC-MS/MS như sau:

- axetonitril (dung môi trắng) ít nhất 03 lần;

- lặp lại thứ tự như trên

Sau 03 hoặc 04 mẫu thử cần bơm axetonitril để kiểm tra nhiễm chéo giữa các lần bơm

6.4.3 Dựng đường chuẩn

Dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan tuyến tính giữa tỉ lệ diện tích pic chất phân tích với chấtnội chuẩn (trục y) và tỉ lệ nồng độ chất phân tích tương ứng với nội chuẩn (trục x) Lập phương trìnhđường chuẩn tuyến tính y = ax + b Kiểm tra độ tuyến tính của đường chuẩn (hệ số hồi quy R2 > 0,98

và độ lệch chuẩn tương đối của trung bình các hệ số đáp ứng (= y/x) < 15 %)

6.4.4 Xác định và khẳng định

Chất phân tích phải có đầy đủ các thông số sau:

- Trên sắc đồ các dung dịch, tỉ lệ thời gian lưu của chất phân tích với nội chuẩn (thời gian lưu tươngđối) tương ứng với tỉ lệ trung bình của thời gian lưu tương đối của dãy dung dịc chuẩn với ± 2,5 %dung sai cho phép

- Tỉ lệ diện tích pic của các mảnh ion chuẩn cũng như nội chuẩn phù hợp với Bảng 2

Bảng 2 – Thông tin về các mảnh ion và tỉ lệ diện tích pic

a m/z 57 tương ứng với việc thất thoát axit hydrofluoric [M-HF]- và m/z 33 tương ứng với việc thát thoát

cacbon dioxit

[M-CO2] Thời gian phân tích: trong 24 h có thể phân tích được 20 mẫu

7 Tính và biểu thị kết quả

7.1 Tính kết quả

Hàm lượng natri fluoroacetat (µg/kg) trong mẫu được tính theo công thức sau:

W = [(Aa/AIS) – 1]/S x (mIS/ma)Trong đó:

Aa là diện tích pic của chất phân tích (tính theo mảnh định lượng);

AIS là diện tích pic của nội chuẩn (tính theo mảnh định lượng);

1 là hệ số b của phương trình đường chuẩn;

S là hệ số a của phương trình đường chuẩn;

mIS là lượng chất chuẩn nội được bổ sung vào phần mẫu thử (10 ng với mẫu dạng bột và

50 ng với mẫu dạng lỏng);

ma là khối lượng phần mẫu thử (1 g với mẫu dạng bột và 5 g với mẫu dạng lỏng)

7.2 Biểu thị kết quả

Báo cáo kết quả chất phân tích theo số µg/kg đến 1 số thập phân

Các mẫu không phát hiện phải được biểu thị là < 1 µg/kg

8 Đảm bảo chất lượng thử nghiệm

Mẫu đảm bảo chất lượng (QC) (được chứng nhận, P-test, mẫu chuẩn nội bộ hoặc mẫu thêm chuẩn) phải được thường xuyên được phân tích cùng với mẫu và phân tích lặp lại

Thí nghiệm thêm chuẩn thêm vào mẫu 20 µl (cho mẫu dạng bột) hoặc 100 µl cho mẫu dạng lỏng của dung dịch chuẩn làm việc 0,05 µg/ml Đồng thời thêm nội chuẩn tương ứng Mức thêm chuẩn tương ứng với 10 µg/kg Tính toán kết quả tỉ lệ thu hồi (Rec) của mẫu thêm chuẩn theo công thức sau :

PSpiked là tổng nồng độ natri fluoroaxetat tính được trong mẫu tính bằng microgam trên kilogam

9 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng vớimọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được

f) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Các điều kiện phân tích thích hợp

Với các thiết bị cụ thể nêu trên, có thể sử dụng thay thế bằng loại tương đương hoặc tốt hơn Khi thaythế cột pha tĩnh HPLC, cần đảm bảo thời gian lưu của chất phân tích phải gấp ít nhất 02 lần thời gianlưu tương đương với thể tích của cột sắc ký

Điều kiện HPLC:

Bảng A.1 – Các điều kiện HPLC để phân tích natri fluoroacetat

Với các điều kiện trên thì thời gian lưu của chất phân tích khoảng 1,7 min

Bảng A.2 – Chương trình gradient để phân tích natri fluoroacetat

Các thông số này thu được khi phân tích các dung dịch chuẩn của mỗi chất chưa biết hoặc đã biết(khoảng 1µg/ml) được truyền trực tiếp từ syringe (tốc độ khoảng 10µl/min) vào detector kết hợp vớidòng dung môi từ phần HPLC (với tốc độ 0,45 ml/min) thông qua bộ phận kết nối Dòng HPLC duy trìvới 10 % kênh A, 90 % kênh B.

Bảng A.3 – Các thông số MS để phân tích natri fluoroacetat

Vị trí nguồn Dọc: 5,0; ngang 5,0; điện cực thò ra 1,0 mm

Với các điều kiện trên thì thời gian lưu của chất phân tích khoảng 1,7 min

Kiểm tra thiết bị: Trước khi phân tích mẫu, phải đảm bảo rằng các bộ phận của hệ thống LC-MS/MSđang hoạt động theo các điều kiện của phương pháp phù hợp với các mục đích sử dụng Nếu cần thiết

có thể bơm dung dịch chuẩn có nồng độ thấp (dung dịch chuẩn 2) để kiểm tra thiết bị đủ độ nhạy

Hình B.1 – Sắc kí đồ của mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn ở mức 1 µg/kg

(IS 10 µg/kg) thực phẩm công thức nền sữa dạng bột

Hình B.2 – Sắc ký đồ của mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn ở mức 1 µg/kg

(IS 10 µg/kg) thực phẩm công thức nền sữa dạng lỏng (uống liền)

Hình B.4 – Sắc kí đồ của mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn ở mức 1 µg/kg

(IS 10 µg/kg) thực phẩm công thức nền sữa

Phụ lục C

(Tham khảo)

Hiệu năng của phương pháp

Phương pháp này đã được thẩm định sử dụng mẫu cung cấp bởi AOAC Stake Holder Panel on InfantFormula and Adult Nutritionals (SPIFAN) Sản phẩm công thức dành cho trẻ sơ sinh được mô tả ởBảng C.1 Sản phẩm công thức dành cho trẻ sơ sinh sử dụng để thẩm định phương pháp

Bảng C.1 – Sản phẩm công thức dành cho trẻ sơ sinh sử dụng để thẩm định phương pháp

Sản phẩm công thức dành cho trẻ

sơ sinh

Thực phẩm dinh dưỡng nhiều chất

béo

Thẩm định phương pháp được tiến hành theo SANCO/12571/2013 (2) Dữ liệu độ chính xác thu được

từ giá trị của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 1 và 10 µg/kg (tương ứng với hai mức 1 x LOQ và 10 x LOQ)

Ít nhất hai kiểm nghiệm viên tham gia vào thí nghiệm này, mỗi kiểm nghiệm viên phân tích 5 lần lặp lại

ở mỗi mức thêm chuẩn trong hai ngày khác nhau (khoảng 10 thí nghiệm riêng biệt cho mỗi mức thêmchuẩn) Mẫu không thêm chuẩn được phân tích để khẳng định không có mặt chất phân tích trước khithêm chuẩn

Độ tuyến tính: Độ tuyến tính được xác định qua 0-2 tỉ lệ diện tích, tương ứng với 0-0,8 ng natrifluoroacetat (0,4 ng IS) được bơm vào cột Đường chuẩn được dựng theo mô hình tuyến tính với R2 >0,99 và độ lệch chuẩn tương đối của giá trị trung bình của độ đáp ứng < 15%

Giới hạn định lượng (LOQ): LOQ của phương pháp là 1 µg/kg cho sản phẩm công thức cho trẻ sơsinh Nồng độ này tương ứng với mức thêm chuẩn thấp nhất trong quá trình thẩm định

Độ thu hồi, độ lặp lại và độ tái lặp trung gian được nêu trong Bảng C.2

Bảng C.2 – Giá trị độ thu hồi, độ tái lặp và độ tái lặp trung gian ở các nền mẫu khác nhau