ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA CÓ KHA NĂNG CHỊU HẠN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

Chính vì vậy, trong nghiên cứu nàychúng tôi đã phân tích đa dạng di truyền tập đoàn 39 giống lúa địa phương ViệtNam có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử SSR, với mục

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA CÓ KHẢ

NĂNG CHỊU HẠN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Nhài, Nguyễn Thị Thanh Thuỷ

Viện Di truyền Nông nghiệp

MỞ ĐẦU

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực có khả năng

chịu hạn kém và khá nhạy cảm với môi trường bên ngoài Tính trạng chịu hạn làmột tính trạng đa gen phức tạp, những nghiên cứu về sinh lý học đã chỉ ra rằngtính chịu hạn của lúa phụ thuộc vào các yếu tố sau: thứ nhất, khả năng đâm xuyêncủa rễ tìm nước dưới tầng đất sâu phục vụ nhu cầu nước của cây khi lớp nướctrên bề mặt bị bốc hơi; thứ hai, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bàolá giúp cây duy trì được sức căng bề mặt bảo vệ cho mô phân sinh khỏi bị mấtnước; thứ ba, cơ chế điều khiển thoát hơi nước ở khí khổng (Nguyen & cs.,2000) Hiện nay, các nhà khoa học cho rằng có khoảng 200 gen tham gia vào cơchế kháng hạn ở cây nhưng các gen này không quy tụ vào một giống cố định.Kết quả nghiên cứu sơ bộ trên một số giống lúa cho thấy nước ta có nguồngen chịu hạn phong phú từ các giống lúa địa phương Tuy nhiên, chưa có nhiềunhững phân tích, đánh giá đặc tính chịu hạn của các giống lúa bản địa theo hướngnghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học Chính vì vậy, trong nghiên cứu nàychúng tôi đã phân tích đa dạng di truyền tập đoàn 39 giống lúa địa phương ViệtNam có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử SSR, với mục đích đưa ra nguồnthông tin hữu ích cho những nghiên cứu về tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn genbản địa Việt Nam

I TỔNG QUAN VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY LÚA

1.1 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học nôngnghiệp Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thểquy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗtrợ xác định gen mục tiêu hoặc quá trình lai - chọn tạo giống thông qua lựa chọncác cặp bố mẹ trong phép lai Trên nhiều đối tượng thực vật, nghiên cứu đa dạng

di truyền đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau,mỗi phương pháp cung cấp cho người sử dụng các loại thông tin khác nhau Việclựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của người nghiên cứu

1.1.1 Chỉ thị hình thái

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị hình thái là phương pháp đánhgiá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộphận) Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền cũngnhư quy trình phức tạp Hiện nay phương pháp này vẫn được sử dụng phổ biếntrên cây trồng để giúp các nhà nghiên cứu phân biệt các giống khác nhau bằngmắt thường Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng ditruyền có những hạn chế: Thứ nhất, số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, chỉ thịhình thái chịu tác động của môi trường và phụ thuộc vào giai đoạn nhất định củaquá trình phát triển; hạn chế thứ hai, việc đánh giá mang tính chất thông kê nêncần thực hiện với số lượng lớn để đảm bảo tính chính xác; thứ ba, có nhiều tínhtrạng do đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hìnhmà có thể đánh giá được Vì thế, các nhà chọn giống thường kết hợp sử dụng cácchỉ tiêu hình thái với việc xác định bằng chỉ thị sinh hoá và chỉ thị phân tử ADN

để đạt được kết quả chính xác nhất

1.1.2 Chỉ thị sinh hóa

Các protein khác nhau có khối lượng phân tử và điểm đẳng điện khác nhau,

vì vậy chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong quá trình điện di tạothành những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và có thể hiện thị bằng phươngpháp nhuộm Cơ chế này được điều khiển bởi vật chất di truyền là ADN, thôngqua dòng thông tin di truyền từ ADN  ARN  Protein

Chỉ thị protein và chỉ thị enzyme thuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao đồngthời có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của protein Tuy nhiên, do sốlượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng vàphát triển của cá thể, nên các chỉ thị protein và isozyme được ứng dụng tương đốihạn chế

1.1.3 Chỉ thị phân tử ADN

Các chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình ADN.Nó được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loàihoặc giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài, dùng đểlựa chọn tổ hợp lai

Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu, cótính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô với độ chính xác caomà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường Chỉ thị phân tử được chialàm hai nhóm chính:

• Chỉ thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP

• Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD,AFLP, SSR, )

2.1.3.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn)

RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic, nguyên lýcủa phương pháp: chiều dài ADN của bộ gen sau khi cắt bằng enzyme giới hạn sẽthành những đoạn có kích thước khác nhau Khi điện di những đoạn này sẽ phân

bố ở những vị trí khác nhau trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành sợi đơnvà được chuyển lên màng celulose hoặc nylon Trong quá trình lai ADN tiếp

theo, nếu chúng bổ sung với mẫu dò (là một đoạn ADN đã được đánh dấu phóngxạ hoặc hoá học) thì sẽ cho phản ứng lai Kết quả của phản ứng lai là chúng ta cóthể xác định được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau

Kỹ thuật RFLP đã được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trongnghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người (Botstein và cs 1980)Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội được sử dụng phổ biến trong tạo giống cây trồngvới nhiều mục đích khác nhau: lập bản đồ di truyền, chọn lọc sớm tính trạng đơngen, phân tích đa hình di truyền Tuy nhiên, hạn chế của kỹ thuật này là tốn nhiềuthời gian, công sức, kỹ thuật phức tạp, độc hại do sử dụng chất phóng xạ và đòihỏi ADN chất lượng cao

2.1.3.2 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)

Chỉ thị AFLP được phát hiện bởi Zabeau Vos(1993) và được mô tả chi tiếtbởi Vos và cs (1995) Ưu điểm của kỹ thuật này là có độ nhạy cao, dễ phát hiện

đa hình trong toàn bộ hệ gen Kỹ thuật AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định,đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen (Thomas và cs 1995)và chọn giống (Vos và cs 1995) Nhược điểm của kỹ thuật AFLP là chỉ thị ditruyền trội do đó không có khả năng phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thểdị hợp tử, kỹ thuật phức tạp, đòi hỏi phải có các phương pháp xử lý số liệu tựđộng trong quá trình phân tích, giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao

2.1.3.3 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - ADN đa hình được nhân bội ngẫu nhiên)

Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn ADN được nhân bảnngẫu nhiên bằng việc sử dùng một mồi đơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên.Vào đầu thập kỷ 90, William và cs.(1990) những người đầu tiên đã thông báo vềviệc sử dụng các đoạn mồi đơn dài 10 nucleotide và có trình tự tuỳ ý để phân tích

Ưu điểm của kỹ thuật này là nhanh, giá thành cho mỗi mẫu phân tích thấp,không cần biết những thông tin ban đầu về trình tự, dễ dàng phân tích cho sốlượng mẫu lớn Nhược điểm của kỹ thuật là nhạy cảm, phụ thuộc và điều kiện thínghiệm, các thiết bị nghiên cứu và giai đoạn nghiên cứu Mặt khác, RAPD là chỉthị trội nên không thể nhận biết được cá thể dị hợp tử, khó nhận biết những đoạncùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau thực sự có được tạo ra từ cùng 1 vị trítrên hệ gen.

2.3.1.3 Chỉ thị Microsatellite (SSR - Simple Sequence Repeats - sự lặp lại của một trật tự đơn giản).

Trong cơ thể thực vật, hiện tượng lặp lại của một trật nucleotide đơn giảnlà khá phổ biến Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơnvị lặp lại có thể ít hay nhiều và số lần lặp có thể biến động từ 2 đến hàng trămngàn lần Phương thức lặp lại rất phong phú, được chia ra làm 3 kiểu lặp lại sau:

• Lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau)

• Lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một sốnucleotide khác)

• Lặp lại phức tạp (có sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau).Chỉ thị SSR có ưu điểm so với các chỉ thị ADN khác:

- Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tựsườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen củaphản ứng SSR - PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị ADN ngẫu nhiên

- Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biếnđổi di truyền, số lần lặp lại các motip SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạnSSR có chiều dài khác nhau Do đó phản ứng SSR - PCR có thể phát hiện cácallene khác nhau trong cùng một locus SSR, qua đó phát hiện được các cá thểđồng hợp tử/dị hợp tử của locus đó

Nhược điểm cơ bản của việc sử dụng chỉ thị này là: tốn công sức, giá thànhcao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình bao gồm

việc tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN trong hệ gen chứaSSR, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài.

2.1.3.4.Một số loại chỉ thị ADN khác

Phân tử ADN không chỉ khác nhau về trình tự mà còn khác nhau về hìnhdạng không gian khi ADN ở trạng thái sợi xoắn kép Hai trình tự ADN chỉ cần cómột vị trí nucleotide khác nhau cũng có thể mang hình dạng khác nhau Bằngphương pháp điện di có thể phát hiện được sự đa hình (về hình dạng) giữa cácđoạn ADN này (chỉ thị CS.GE- Conformation Sensitive Gel Electrophoresis) Cùng với những thành tựu của công nghệ sinh học, nhiều loại chỉ thị mới đãđược phát triển và ứng dụng, làm phong phú hơn những công cụ sử dụng trongnghiên cứu đa dạng di truyền Với mục tiêu làm sáng tỏ hơn bản chất phân tửtrong các nghiên cứu, các chỉ thị mới đi sâu vào phân tích trình tự ADN của cácgen cụ thể (chỉ thị STS, EST và ADN microarray…) giúp nghiên cứu đa dạng ditruyền chính xác và chi tiết hơn Tuy nhiên, những chỉ thị này yêu cầu kỹ thuật vàchi phí cao hơn so với các loại chỉ thị ADN “thế hệ cũ” (RAPD, SSR, …) Đâyđược xem là điểm cơ bản hạn chế sự phổ biến của những chỉ thị này trong nghiêncứu đa dạng di truyền

1.2 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa

1.2.1 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa trên thế giới

Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của nhiềuloại chỉ thị chỉ thị cũng như số lượng của mỗi loại chỉ thị đã làm tăng hiệu quảtrong quá trình đánh giá, bảo tồn, khai thác và sử dụng trong với mục đích khácnhau Chỉ thị ADN được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vậtmà phân tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểm soát các tính trạng, haychọn giống phân tử là các lĩnh vực được triển khai hiệu quả

Tác giả Virk và cs.(1995) tiến hành nghiên cứu 12 giống lúa trồng ở châu Á

Tác giả Xu (2004) sử dụng 113 chỉ thị RFLP và 60 chỉ thị SSR để địnhlượng đa dạng allene của 125 giống lúa thu được từ các bang miền Tây và miềnNam nước Mỹ và 111 giống từ tập đoàn lúa Quốc tế IRRI Các tác giả nhận thấy

cơ sở di truyền các giống lúa hiện nay có ở Mỹ hẹp hơn nhiều so với các giống từtập đoàn lúa Quốc tế (56% SSR allele so với 96% và 92 RFLP so với 99%) Với

31 trong số 236 giống lúa có số lượng các allele cao (chiếm 95% số allele củaRFLP và 74% số allele của SSR) có thể sử dụng làm tập đoàn hạt nhân Kết quảcho thấy, chỉ thị SSR sử dụng hữu hiệu hơn RFLP cả về khả năng phát hiện cácallele lẫn chi phí và kỹ thuật

Tác giả Victoria và cs (2007) tiến hành nghiên cứu đa dạng trên 24 giống lúa

ở Philippin có chất lượng tốt bằng 164 chỉ thị SSR Trong số 164 chỉ thị SSR có

151 chỉ thị cho đa hình với tổng số allele thu được là 890, trung bình 5,89allele/locus Trong đó, có 89 chỉ thị cho 147 allele hiếm Hệ số đa dạng di truyềnPIC từ 0,18 - 0,91, đạt trung bình 0,68/chỉ thị Theo kết quả phân tích UPGMA, ởđộ tương đồng 40%, tổng số 24 giống lúa được chia thành ba nhóm: Nhóm 1 gồm

8 giống Japonica, nhóm 2 và 3 là các giống lúa Indica Nghiên cứu này cho ta

thấy việc sử dụng chỉ thị SSR là rất hiệu quả trong phân nhóm các loài phụ củalúa, những giống lúa có chất lượng tốt thì thường có khoảng cách di truyền caohơn và vì thế chúng là nguồn vật liệu cho công tác chọn giống

1.2.2 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa tại Việt Nam

Việt Nam được xem là trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài nguyên ditruyền lúa của nước ta phong phú cả về số lượng và chất lượng Những nghiêncứu về đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Namcòn hạn chế Tuy nhiên, trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầuquan tâm ứng dụng các kỹ thuật chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng tài nguyênlúa nước ta

Tác giả Bùi Chí Bửu (1999) đã sử dụng 20 mồi RAPD để đánh giá đa dạng

di truyền của 72 giống lúa địa phương Trong 20 mồi thử nghiệm thuộc nhómOPA kit, có 10 mồi cho kết quả tốt với 59 băng Kết quả có hai nhóm chính bao

gồm các giống lúa mùa, lúa chiêm ở đồng bằng sông Hồng, lúa nước sâu củađồng bằng sông Cửu Long, lúa nếp của Tây Nguyên và lúa nước trời của DuyênHải Trung bộ.

Tác giả Nguyễn Đức Thành và cs (2001) đã sử dụng 10 mồi RAPD, 50 cặpmồi SSR, 15 cặp mồi AFLP để nghiên cứu 72 giống lúa nương Kết quả cho thấy,các giống lúa nương có đa dạng di truyền cao và là nguồn vật liệu tốt phục vụcông tác chọn giống

Tác giả Trần Danh Sửu và cs (2006) sử dụng 48 chỉ thị SSR để đánh giá đadạng di truyền của 17 giống lúa Tám Hệ số đa dạng gen thu được từ các giốnglúa là 0,35 Số allele thu được trung bình 3,37 allele/mồi 17 giống lúa này còn

được phân loại Indica và Japonica dựa trên sự khác biệt của ADN lục lạp Kết quả 17 giống lúa Tám đều thuộc nhóm Japonica.

Tác giả Phạm Thị Bé Tư và cs (2008) đã đánh giá đa dạng của 90 giống lúamùa địa phương bằng chỉ thị SSR Hệ số đa dạng từ 0,68 - 9,95, trung bình là0,88 Kết quả thu được từ 90 giống lúa mùa địa phương được phân thành 6 nhómgiống khác nhau

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu:

- Tổng số có 40 giống lúa (Bảng 1), trong đó:

 Có 39 giống lúa địa phương Việt Nam có khả năng chịu hạn tốt đượccung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật và Viện Lúa đồng bằngsông Cửu Long

 Có 01 giống lúa (IR64) là giống mẫn cảm với khô hạn

- Có 50 mồi SSR cung cấp bởi hãng IDT, Mỹ, bao phủ trên 12 nhiễm sắc thểcủa hệ gen lúa (Bảng 2)

Bảng 1 : Danh sách các giống lúa địa phương sử dụng trong nghiên cứu

1 412 Nếp bồ hóng Hải Dương H1 Hải Dương

13 7099 Kháu căm pị H13

14 3429 Chiêm đỏ H14 Quảng Trị

15 3483 Lúa muối H15 Quảng Ngãi

16 3525 Ba chơ K'tê H16 Bình Định

38 5020 Khẩu đó đón H38

39 Nàng quớt biển H39

TT SĐK Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc

40 Nàng quớt vàng H40

Bảng 2 : Danh sách mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

(bp)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tách chiết ADN: ADN tổng số được tách chiết theo phương

pháp "NaOH extraction" của Wang (1992) Quy trình tách chiết ADN bao gồm các bước:

 Mẫu lá non được cắt nhỏ vào ống eppendorf 2ml Thêm 200µl NaOH0.25N Nghiền mịn mẫu lá bằng máy nghiền RETSCH Mixer Mill MM

200

 Thêm 800µl dung dịch Tris 100mM pH7.5, trộn đều

 Ly tâm 12.000vòng/phút trong 20 phút

 Chuyển 200µl dung dịch vào ống eppendorf 1.5ml Lưu giữ ở -200C để làmdung dịch ADN gốc

 Pha loãng dung dịch gốc 10 lần, sử dụng 5µl dung dịch ADN pha loãngcho mỗi phản ứng PCR

- Kỹ thuật PCR:

Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96well Thermal cycler Tổng dung dịch phản ứng là 15 µl bao gồm 5µl ADN, 0.15µM mồi, 0.2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2.5mM MgCl2 và 0.25 đơn vị Taq TaKaRa

Điều kiện phản ứng PCR như sau: 950C - 7 phút; 35 chu kỳ của: 940C - 15 giây, 550C - 30 giây, 720C - 1 phút; 720C - 5 phút; giữ mẫu ở 40C Sản phẩm PCR được phân giải trên gel agarose 3%

- Phương pháp điện di trên gel agarose

Theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, Trường Đại học công nghệ Texas, Mỹ (2002) có cải tiến

Chuẩn bị gel agarose:

- Bột Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TBE 0.5X với nồng độ 3,0%

- Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng

- Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C

- Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) với nồng độ 0.5µg/ml

- Chuẩn bị khay gel và lược.

- Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược Thời gian chờ gel đông là 45 - 60 phút

- Tra sản phẩm PCR

- Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di

- Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ

- Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh

- Phân tích số liệu:

Những số liệu thống kê bao gồm số allen trên locus, tần số allele phổ biếnnhất, số allele độc nhất, chỉ số PIC (Polymorphism Information Content) được tínhtoán sử dụng phần mềm Excel, trong đó:

- Chỉ số Tần số allele phổ biến nhất được tính bằng tỷ lệ % của số cá thể

xuất hiện allele phổ biến nhất trên tổng số allele xuất hiện ở từng locus nghiên cứu

- Allele độc nhất của từng chỉ thị SSR được xác định là allele xuất hiện duynhất ở 1 giống trong toàn bộ các giống lúa nghiên cứu

- Đa dạng di truyền allele của các chỉ thị SSR được đánh giá thông qua hệ sốPIC (Botstein,1980) và được tính theo phương trình:

Trong đó: Pij : là tần số xuất hiện của alelel thứ j tương ứng với mồi i.

Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại

càng lớn, tức là càng nhiều allen được sinh ra

Sự có mặt hay vắng mặt của các allele của từng chỉ thị SSR được ghi nhậncho tất cả các giống lúa nghiên cứu, trong đó 0 là không có băng ADN và 1 là cóbăng ADN ở cùng một vị trí Số liệu được nhập vào chương trình NTSYS-pc v 2.1(Rohlf, 1997) để xây dựng ma trận tương đồng di truyền sử dụng hệ số Dice (Dice,