BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÍNH CHẤT PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER

Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin với xúc tác của enzyme PME Nguồn: Rexova–Benkova et al., 1976 Hầu hết các PME nguồn gốc thực vật thủy phân liên kết ester cu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Xác nhận của trường Đại học Cần Thơ Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)

Cần Thơ, tháng 12/2011

1 NCS Trần Thanh Trúc, Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp

& Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

2 PGs Ts Nguyễn Văn Mười, Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

3 Ts Nguyễn Văn Thành, Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

4 Nguyễn Tấn Đạt, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Khóa

15, Trường Đại học Cần Thơ

5 Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Khóa 17, Trường Đại học Cần Thơ

6 Vương Tố Trinh, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Khóa

17, Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC

MỤC LỤC

i

DANH SÁCH HÌNH iv

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

THUẬT NGỮ vi

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1

1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

1.5 ĐỐI TƯỢNG & PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 2

PHẦN 2 3

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 GIỚI THIỆU VỀ PECTIN METHYLESTERASE 3

2.1.1 Khái quát chung 3

2.1.2 Đặc tính sinh lý của enzyme PME 3

2.1.3 Các nguồn enzyme PME tự nhiên 4

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme PME 6

2.1.5 Ứng dụng của enzyme PME trong chế biến thực phẩm 8

2.2 CƠ SỞ CỦA VIỆC THU NHẬN ENZYME TỪ ASPERGILLUS NIGER 10

2.3 CÁC BIỆN PHÁP TINH SẠCH PECTIN METHYLESTERASE 11

2.3.1 Tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A niger bằng phương pháp kết tủa 11

2.3.2 Ứng dụng kỹ thuật lọc màng trong tinh sạch enzyme 13

2.4 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TINH SẠCH ENZYME BẰNG KỸ THUẬT ĐIỆN DI 13

2.5 ĐỘNG HỌC ENZYME 14

2.5.1 Khái niệm enzyme và cấu tạo hóa học 14

2.5.2 Động học phản ứng enzyme 15

2.5.3 Phân tích động học quá trình xử lý nhiệt enzyme 17

2.6 CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 20

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 23

3.1.1 Địa điểm, thời gian 23

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 23

3.1.3 Thiết bị, hoá chất 23

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 24

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 24

3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả 24

3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 25

3.3.1 Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến khả năng kết tủa enzyme PME từ A niger 25

3.3.2 Thí nghiệm 2 Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme PME từ A niger bằng phương pháp lọc màng 26

3.3.3 Thí nghiệm 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 27

3.3.4 Thí nghiệm 4 Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A niger theo nhiệt độ28 3.3.5 Thí nghiệm 5 Động học sự vô hoạt nhiệt của enzyme PME từ A niger 28

3.3.6 Thí nghiệm 6 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 29

3.3.7 Thí nghiệm 7 Nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl và CaCl 2 đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 30

3.4 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 31

Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 32

4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI HÓA CHẤT VÀ TỶ LỆ SỬ DỤNG ĐẾN KHẢ NĂNG KẾT TỦA ENZYME PME TỪ ASPERGILLUS NIGER 32

4.1.1 Đánh giá khả năng kết tủa enzyme PME từ Aspergillus niger bằng (NH 4 ) 2 SO 4

32 4.1.2 Đánh giá khả năng kết tủa enzyme PME từ Aspergillus niger bằng NaCl 34

4.1.3 Ảnh hưởng của việc sử dụng dung môi hữu cơ đến khả năng kết tủa enzyme PME từ A niger 35

4.1.4 Tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ Aspergillus niger bằng phương pháp lọc màng

37

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA NỐNG ĐỘ PECTIN ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME PME TỪ ASPERGILLUS NIGER 39

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER 41

4.4 ĐỘNG HỌC SỰ VÔ HOẠT NHIỆT CỦA PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER 42

4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA Ph ĐẾN SỰ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER 44

4.6 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NACL VÀ CACL 2 ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER 45

4.6.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính của enzyme PME từ A niger 45

4.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl 2 đến hoạt tính của enzyme PME từ A niger 46

PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

KẾT LUẬN 48

ĐỀ NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC xii

CHƯƠNG 1 DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin với xúc tác của enzyme PME 2

Hình 2: Phức hợp pectate calcium 7

Hình 3: Tác dụng của enzyme PME trong quá trình làm trong nước quả 8

Hình 4: Nấm mốc A niger 9

Hình 5: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein 11

Hình 6: Hình minh họa động học theo phản ứng bậc một 16

Hình 7: Hình minh họa động học theo phản ứng chuyển đổi một phần 17

Hình 8: Hình minh họa ảnh hưởng của nhiệt đến hằng số tốc độ phản ứng 18

Hình 9: Thiết bị lọc màng 26

Hình 10: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE các mẫu enzyme PME từ A niger 37

Hình 11: Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 39

Hình 12: Phương trình biểu thị sự vô hoạt nhiệt của enzyme PME từ A niger 42

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Đặc tính sinh hóa của một số enzyme PME sau tinh sạch từ thực vật 4

Bảng 2: Thông số động học Km của một số enzyme 15

Bảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu 23

Bảng 4: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với (NH4)2SO4 31

Bảng 5: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với NaCl 33

Bảng 6: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với ethanol 34

Bảng 7: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với aceton 34

Bảng 8: So sánh hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng các loại hóa chất khác nhau 35

Bảng 9: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME từ A niger sau quá trình lọc màng 36

Bảng 10: Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 39

Bảng 11: Sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A niger do ảnh hưởng của nhiệt độ 40

Bảng 12: Các thông số động học của quá trình bất hoạt nhiệt enzyme PME từ A niger 42

Bảng 13: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme PME từ A niger 43

Bảng 14: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 45

Bảng 15: Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A niger 45

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Cfu Colony forming unit (số khuẩn lạc)

DE Degree of esterification (độ ester hóa)

PE Pectin esterase

PG Polygalacturonase

PL Pectat lyase

PME Pectin methylesterase

SSF Solid state fermentation (lên men rắn)

U Đơn vị hoạt tính enzyme

THUẬT NGỮ

Pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger: enzyme PME được thu nhận từ

quá trình trích ly sinh khối nấm mốc sau Aspergillus niger quá trình lên men rắn hay lỏng, Aspergillus niger ở các điều kiện lên men thích hợp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Đơn vị: Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thông tin chung

Tên đề tài: Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất pectin methylesterase từ

Aspergillus niger

Mã số: NCST 2011 - 05

Chủ nhiệm đề tài: Ths Trần Thanh Trúc Tel.: 0710.3831530 (8309)

E-mail: tttruc@ctu.edu.vn

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện: 8 tháng (từ tháng 01 5 2011 đến tháng 31 12 2011)

2 Mục tiêu

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, thời gian gia nhiệt, pH, nồng độNaCl, nồng độ CaCl2 đến hoạt tính của enzyme PME từ A.niger.

3 Tính mới và sáng tạo

Pectin methylesterase (PME) là enzyme có ứng dụng quan trọng trong lãnh vực chếbiến rau, củ, quả; đặc biệt trong cải thiện cấu trúc nguyên liệu Tuy nhiên, nghiên cứuứng dụng của enzyme này tại Việt Nam vẫn còn là một khái niệm mới mẻ, đồng thờigiá nhập ngoại của enzyme này rất cao Việc xác định tính chất cơ bản của enzyme

này sau tiến trình sinh tổng hợp PME từ A niger có ý nghĩa ứng dụng cao

4 Kết quả nghiên cứu

Kết quả thí nghiệm cho thấy, kết tủa enzyme PME thô từ A niger bằng ethanol với tỷ

lệ 3:1 (v/v) là tốt nhất, thể hiện ở hoạt tính riêng là 10,02 U/mgprotein, hiệu suất thu hồi91,48% và độ tinh sạch tăng gấp 7,98 lần so với mẫu enzyme thô Sau khi kết tủa vớiethanol, tiến hành lọc màng ở khoảng phân đoạn 50 kDa thu được enzyme PME cóhoạt tính riêng đạt 15,63 U/mgprotein, độ tinh sạch tăng 12,40 ± 0,89 lần khi so sánh với

mẫu enzyme thô Enzyme PME từ A niger có khối lượng phân tử khoảng 43 kDa,

hằng số Michealis–Menten (Km) của enzyme PME đạt được là 0,6668 ± 0,0379 g/L

Hoạt tính của enzyme PME từ A niger thể hiện cao nhất ở 40 oC, pH môi trường 5,0.CaCl2 và NaCl đều có tác dụng hoạt hóa, làm tăng hoạt tính của enzyme PME từ

A niger Đồng thời, sự bất hoạt nhiệt của enzyme PME tuân theo phương trình bậc 1

chuyển đổi một phần với hệ số góc k tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 50 đến 70 oC

5 Sản phẩm

- Các thông số cơ bản về tính chất của PME thu nhận từ A niger.

- Các kết quả về đào tạo đã được thực hiện thông qua nghiên cứu:

+ Có 1 bài báo được đăng

Nguyễn Văn Mười, Nguyễn Tấn Đạt, Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Vương Tố Trinh và Trần Thanh Trúc (2010) Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính pectin

methylesterase từ Aspergillus niger Kỷ yếu hội nghị khoa học: Phát triển nông

nghiệp bền vững thích ứng với sự biến đổi khí hậu, 26/11/2010, phần II, NXB Nông Nghiệp, trang 92-101

+ 1 luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ ngành Công nghệ thực phẩm và Đồ uống

6 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:

Hỗ trợ cho việc đào tạo Nghiên cứu sinh ngành Vi sinh vật học

Tài liệu giảng dạy ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Công nghệ thực phẩm

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

To find out factors effect to activity of pectin methylesterase from Aspergillus niger:

temperature, time, pH and role of NaCl and CaCl2

3 Creativeness and innovativeness

Pectin methylesterase (PME) has important applications in the field of processedvegetables and fruits, especially in improving the structure of materials However,research and application of this enzyme in Vietnam has been still a new concept,while imported prices of this enzyme is very high Determination the basic fators of

this enzyme from biosynthesis A niger PME has great significance of appliccation

4 Results obtained

The result showed that, ethanol was the suitable precipitant for PME purification.Firstly, cold ethanol was added to the crude enzyme solution with the ratio of 3: 1(v/v) for PME precipitation In this case, specific activity of PME was 10.02U/mgprotein,the purification factor achieved 7.98 fold and the PME recovery yieldobtained 91.48% Combined with the cross flow membrane step, the specific activity

of PME reached to 15.63 U/mgprotein and the purification factor achieved 12.40 ± 0.89fold in comparison to the crude enzyme solution The molecular weight of the enzyme

was found to be 43 kDa and Michealis–Menten constant Km was 0.6668 ± 0.0379 g/L.

In addition, temperature and pH optimum of A niger PME were 40 oC and 5.0,respectively The activity of the enzyme was stimulated by NaCl or CaCl2 Isothermal

inactivation of partial purified A niger PME could be described by a fractional–

conversion model and the inactivation rate constants increase with increasingtemperatures from 50 to 70 oC

The studied resutls can be applied in teaching and researching in the field ofbiotechnology Based on experimental data, the optimal fermentation condition can bedetermined.

5 Products

Some parameters of characteristic A.niger PME

Papers were submitted:

Nguyen Van Muoi, Nguyen Tan Dat, Nguyen Ngoc Huynh Tran, Vuong To Trinh andTran Thanh Truc, 2010 Factors effect to activity of pectin methylesterase from

Aspergillus niger Proceedings of Conference: Development of sustainable

agricultural techniques for adapting to climate change, part II, The AgriculturalPublishing House, 92-101pp

One master students of Food technology and Drinking

6 Effects, technology transfer means and applicability

This supplied to the PhD Thesis in the filed of Microbiology

The studied resutls can be applied in teaching and researching in the field ofbiotechnology, microbiology and food technology & drinking

CHƯƠNG 2 PHẦN 1 MỞ ĐẦU

2.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong vài thập kỷ trở lại đây,các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trongcác lĩnh vực kinh tế Trong lĩnh vực chế biến thực phẩm, điều khiển hoạt động PME

đóng vai trò hết sức quan trọng, cụ thể là trong sản xuất nước quả citrus đục (Nath & Ranganna, 1977), giúp tăng độ nhớt trong sản xuất nước quả và puree cà (Nath et al.,

1983), hoặc góp phần cải thiện cấu trúc và độ cứng chắc trong quá trình chế biến một

số loại rau quả (Pilnik & Voragen, 1993).

Hiện nay vi sinh vật là nguồn cung cấp enzyme chủ yếu do những ưu điểm như tốc độsinh sản nhanh, nguồn vật liệu rẻ tiền, dễ thu hồi, cùng lúc thu được nhiều loại

enzyme (Favelar - Torres et al., 2006) Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy sinh enzyme PME từ A niger cũng như các loại vi sinh vật khác, sản phẩm thu được là một hỗn

hợp protein gồm rất nhiều enzyme Hầu hết các enzyme pectinase thương mại được sửdụng trong quá trình chế biến hiện nay đều là hỗn hợp pectin methylesterase, pectinacetylesterase và rhamnogalacturonan acetylesterase; polygalacturonase,rhamnogalacturonan hydrolase, và pectate lyase; pectin lyase và rhamnogalacturonan

lyase (Benen et al., 2003) Mặt khác, PME là enzyme khởi đầu cho quá trình thủy

phân pectin, tạo điều kiện cho các enzyme còn lại của hệ enzyme pectinase hoạt động.Điều này gây khó khăn cho việc ứng dụng PME độc lập vào từng loại sản phẩm cụ thểnhằm mang lại hiệu quả như mong muốn

Do vậy, quá trình tinh sạch enzyme thô cần được tiến hành nhằm thu được enzymePME thuần nhất, có hoạt tính cao Bên cạnh đó, đặc tính của enzyme và động học sự

vô hoạt enzyme cũng có vai trò đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụngenzyme

2.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu đánh giá khả năng tinh sạch sơ bộ pectin

methylesterase từ A niger, đồng thời xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của

enzyme thu được

- Đánh giá khả năng tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A niger bằng phương pháp kết

tủa và lọc màng trước khi xác định các tính chất cơ bản

- Xác định hằng số Michaelis-Menten của enzyme PME từ A niger.

- Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A niger theo nhiệt độ và pH môi

trường

- Nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl và CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A niger.

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại từ 3 lần Kết quả của các thí nghiệm sosánh, chọn nghiệm thức tối ưu được thống kê và phân tích theo chương trìnhStagraphic 4.0 Các biến đổi động học được phân tích theo chương trình Prism 5.0.Các kết quả được phân tích, đo đạc bằng các thiết bị hiện đại: điện di, máy quang phổ,

sử dụng phương pháp phân tích tin cậy

2.5 ĐỐI TƯỢNG & PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài sẽ được tiến hành với enzyme pectin methylesterase (PME) đã được lên men

rắn từ Aspergillus niger, sử dụng bã táo ta Enzyme PME sau khi trích ly từ nấm mốc

A niger sẽ được kết tủa với dung dịch ethanol theo tỉ lệ 1 : 3 và ly tâm sau 2 giờ để

thu lấy phần kết tủa Làm khô kết tủa trong tủ lạnh khoảng 1 ngày trước khi hòa tantrong dung dịch đệm citrate/phosphate ở pH 4,5 để hòa tan kết tủa Dựa trên nghiêncứu đã thực hiện của nhóm tác giả và các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cóliên quan đến đề tài, tiến hành thí nghiệm khảo sát đặc điểm enzyme

PHẦN 2

3.1 GIỚI THIỆU VỀ PECTIN METHYLESTERASE

3.1.1 Khái quát chung

Enzyme pectin methylesterase (PME) còn được gọi là pectin esterase (PE), được đánh

số trong hệ thống phân loại là (EC 3.1.1.11) Enzyme PME thuộc nhóm enzymepectinase, nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân pectin Enzyme PME chủ yếu thủyphân trên các nhóm methylester nằm kề đơn vị không bị este hóa của D–galacturonan

tạo thành acid pectinic và methanol (Willats et al., 2001) Tuy nhiên, PME không thể

phản ứng trên các pectin ester hóa bởi nhóm ethyl, propyl hoặc methyl aginate

Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin với xúc tác của enzyme PME

Nguồn: Rexova–Benkova et al., 1976

Hầu hết các PME nguồn gốc thực vật thủy phân liên kết ester của pectin từ đầu khửhoặc đầu không khử, hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng

cơ chế chuỗi đơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Bởi vì hoạt động cần có nhóm carboxyl

tự do trên mạch galacturonic nên PME từ thực vật hoạt động kém trên các cơ chất

pectin có độ ester hóa cao hơn 20 30% (Willats et al., 2006) Ngược lại, PME từ nấm mốc Aspergillus có thể thuỷ phân ngẫu nhiên các nhóm methylester trên chuỗi D–galacturonan (Ishii et al., 1979; Limberg et al., 2000) Các pectin đã bị khử ester

hóa sẽ tạo gel khi có sự hiện diện của ion canxi giúp cho thành tế bào trở nên cứngchắc hơn (Micheli, 2001)

3.1.2 Đặc tính sinh lý của enzyme PME

Enzyme PME có phân tử khối trung bình vào khoảng 25 ÷ 54 kDa và điểm đẳng điện

pI khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc sản xuất ra chúng (Benen et al., 2003) Hầu hết

PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài trường hợp có PME

có tính acid Điểm đẳng điện của PME từ nấm mốc và từ cà chua lần lượt là 3,1 và 11(Bordenave, 1996)

Việc xác định các tính chất đã cho thấy có sự khác biệt giữa PME từ thực vật và visinh vật, thậm chí PME trích ly từ các bộ phận khác nhau, ở các giai đoạn phát triển

khác nhau của cây cũng khác nhau (Bordenave et al., 1993)

Nhìn chung, hoạt động của PME rất nhạy cảm đối với các yếu tố của môi trường nhưnhiệt độ, pH, cation, anion, Enzyme PME thường được hoạt hóa bởi các cation như

Na+, Ca2+ và Mg2+ Hầu hết PME thực vật có pH tối ưu từ 6 ÷ 8, trong khi giá trị pHtối ưu của PME vi sinh vật nằm trong khoảng từ 4 ÷ 9 (Bordenave, 1996) Giá trị pHtối thích cho hoạt động của enzyme PME cà chua là 8,0 trong khi đó giá trị 4,5 là pH

tối ưu cho hoạt động của PME từ Aspergillus (Duvetter, 2007).

3.1.3 Các nguồn enzyme PME tự nhiên

Enzyme PME được sinh tổng hợp từ hai nguồn chủ yếu là thực vật và vi sinh vật Đối

với vi khuẩn thì không có sự đa dạng về PME ngoại trừ Erwinia chrysanthemi, một PME duy nhất được tìm thấy trong tất cả các nghiên cứu trên vi khuẩn (Benen et al.,

2003)

PME hiện diện trong hầu hết cây ăn trái với hàm lượng khác nhau Chúng thường nằmtrong vách tế bào và hàm lượng gia tăng khi trái bắt đầu chín Các loại trái chứa PMEnhiều nhất là cà chua, cam, chuối, kiwi, táo… PME nội bào của thực vật có liên quanđến sự thoái hóa của pectin trong suốt quá trình phát triển của cây (Bordenave, 1996).Phối hợp với các enzyme pectinase khác, PME có tác dụng điều khiển sự thoái hóacủa pectin và sự mềm đi của mô thực vật trong quá trình chín PME có ảnh hưởng đếncác quá trình sinh lý như tăng kích thước và năng suất của củ, sự phát triển của rễ và

sự mềm đi của trái (Smout et al., 2004).

Enzyme PME từ thực vật có khối lượng phân tử trong khoảng 21  57 kDa và pIkhoảng 9,0 Hầu hết PME từ thực vật hoạt động trong khoảng pH trung tính và nhiệt

độ tối ưu trong khoảng 55  60 oC (Ly Nguyen B., 2004)

Đặc tính sinh hóa của PME sau tinh sạch từ thực vật được tóm tắt trong bảng 1

PME thực vật thường tồn tại các dạng đồng phân Thông thường, các dạng đồng phâncủa chúng khác nhau ở điểm đẳng điện pI và khối lượng phân tử (Bordenave., 1996).Mối quan hệ giữa tỷ lệ của các dạng đồng phân này có thể thay đổi tùy theo mức độ

tăng trưởng của trái và nguồn gốc PME (Bordenave et al., 1993) Cà chua có hai loại

đồng phân là PME1 và PME2, hàm lượng cả hai PME này đều tăng trong giai đoạntrái bắt đầu chín nhưng ở giữa giai đoạn chín thì PME1 giảm xuống, PME2 tiếp tụctăng đến cuối quá trình chín Bên cạnh đó, hai dạng đồng phân của PME trong cam cótính chất rất khác nhau, PME1 có pI là 10,05 và PME2 có pI >11 Các đồng phân

trong kiwi thì có cùng khối lượng phân tử, cùng pI nhưng lại khác nhau về tính bềnnhiệt (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Bảng 1: Đặc tính sinh hóa của một số enzyme PME sau tinh sạch từ thực vật

Cà chua 23 – Tucker et al., 1982

Cà chua 23,8

24,2

9,38,9

Pressey & Woods, 1992

Cà chua 35 > 9,3 Giovane et al., 1994

Carrot 34,2 9,8 Markovic et al., 2002

Carrot 25 > 8,6 Alonso et al., 2003

Cherry 27,2

55,955,955,9

> 8,67,056,365,24

So với thực vật, vi sinh vật được sử dụng phổ biến hơn trong sản xuất các chế phẩmpectinase thương mại Các loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp PME gồm nấm mốcvà vi khuẩn

Enzyme PME từ nấm mốc

Cũng như các enzyme pectinase khác, enzyme PME có thể được sản xuất từ nhiều loại

nấm mốc khác nhau như Aspergillus awamori, A foetidus, A niger, A terrus, A saitoi, Penicillium glaucum, P ehrlichii, P chrysogenum, P expanam, P cilrimim, Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizoctonia solani, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp., Neurospora crassa, etc., nhưng Aspergillus là nguồn chủ yếu (Joshi

et al., 2006 ).

PME từ nấm mốc thường là các enzyme ngoại bào, hoạt động tối ưu trong khoảng

nhiệt độ 30 ÷ 45 ºC và bị vô hoạt ở nhiệt độ trên 55 ºC PME từ các loài Aspergillus

có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong vùng acid Hoạt động của PME từ A niger đạt

tối ưu ở pH 4,5 và nhiệt độ 40 ºC (Fawole, 2003) Trong khi pH tối ưu của enzyme

PME từ A species là 3,7 ÷ 4,2 và enzyme PME từ A sojae là 5,5 Riêng với enzyme

PME từ A repens có nhiệt độ tối thích là 30 ºC và pH tối ưu là 6,5 (Nguyễn Đức

Lượng, 2004)

Enzyme PME từ vi khuẩn

Enzyme PME cũng có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi khuẩn khác nhau như

Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes

Khác với enzyme PME từ nấm mốc, enzyme PME từ vi khuẩn không có tính acid mà

có tính hơi kiềm, pH tối ưu của chúng nằm trong khoảng 7  8 và hầu hết bị vô hoạt ở

85 oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004) PME từ vi khuẩn Erwinia chrysanthemi có pI là 9,64 (Đặng Thị Thu et al., 2004).

3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme PME

Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH của môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạtđộng mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích Thông thường, ở pH tốithích, enzyme có điện tích tổng cực tiểu nên pH tối thích khá gần với điểm đẳng điện

pI của enzyme (Đặng Thị Thu et al., 2004) Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH

môi trường vì pH có ảnh hưởng đến trạng thái ion hoá các gốc R của các acid amintrong phân tử enzyme, ion hoá các nhóm chức trong trung tâm hoạt động và ion hoá

cơ chất Do đó, pH ảnh hưởng đến cả hai tham số động học Km và Vmax của enzyme

(Phạm Thị Trân Châu & Phan Tuấn Nghĩa, 2007)

Enzyme PME từ các nguồn gốc khác nhau có pH tối thích khác nhau Hầu hết cácPME thực vật có pH tối thích trong khoảng 6,0  8,0 (Ly Nguyen B., 2004) nhưngPME từ vi sinh vật có pH tối thích từ 4,0 đến 9,0 (Bordenave, 1996) Enzyme PME từ

cà chua có pH tối thích là 8,0 Trong khi đó, pH tối thích của PME từ Aspergillus là

4,5 (Duvetter, 2007)

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Cũng như các phản ứng hoá họcthông thường, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng Tuy nhiên, do enzyme

có bản chất là protein nên dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao Do đó, tốc độ phản ứng chỉtăng đến một giới hạn cao nhất gọi là nhiệt độ tối thích Vượt quá nhiệt độ này, tốc độphản ứng enzyme sẽ giảm dần đến mức triệt tiêu Phần lớn enzyme hoạt động mạnhnhất ở nhiệt độ 40 ÷ 50 °C và bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70 °C (Lê Ngọc Tú,2004) Tuy nhiên, nhiệt độ tối thích của enzyme còn phụ thuộc nhiều vào sự có mặtcủa cơ chất, các ion kim loại, pH (Lê Ngọc Tú, 2004)

Giống như các phản ứng của enzyme khác, tốc độ của phản ứng phân giải pectin doenzyme PME sẽ gia tăng cùng với sự gia tăng nhiệt độ đến nhiệt độ tối thích Nhiệt độ

tối thích cho hoạt động của enzyme PME dao động trong khoảng từ 45 ÷ 55 oC và bị

vô hoạt ở 55 ÷ 62 °C, phụ thuộc vào nguồn enzyme (Sila et al., 2003).

Enzyme thường được hoạt hóa bởi các cation Na+, K+, Ca2+

, Mg2+ và Zn2+ (Arotupin et al., 2008) Theo Nari et al., (1991), hoạt động của PME tăng cùng với sự tăng nồng độ

ion kim loại và đạt đến nồng độ tối thích, ở trên nồng độ này hoạt động của PMEthường giảm Trong phản ứng khử ester hóa xúc tác bởi PME thực vật, ion kim loạithúc đẩy cho phản ứng thủy phân xảy ra nhanh hơn Ion kim loại phản ứng với nhómmang điện tích âm (nhóm carboxyl) cho phép enzyme phản ứng trên liên kết ester vàcắt đứt liên kết này Ở nồng độ cao, ion kim loại ức chế hoạt động của enzyme Điềunày được giải thích dựa trên nhóm carboxyl kế cận liên kết ester được giải phóng chophép phản ứng tiếp diễn nhưng những nhóm này có thể bị khóa bởi ion kim loại làm

cho enzyme không thể tiếp tục xúc tác (Nari et al., 1991)

Với NaCl, nồng độ tối ưu cho hoạt động PME là 0,2M Theo Leiting & Wicker,

(1997) ở cùng mức độ ion hóa, khả năng hoạt hóa PME của những cation hóa trị II làkhác nhau Hiệu ứng của cation hóa trị II trên hoạt động của PME xuất hiện phức tạphơn so với ion hóa trị I Trong số những ion hoá trị II, calcium là một trong những ionquan trọng nhất Ở nồng độ thấp (5  25 nM), calcium tăng khả năng hoạt động củaPME Tuy nhiên, ở nồng độ cao, calcium làm giảm tốc độ phản ứng của PME do có

sự hình thành gel calcium–pectate (Leiting & Wicker, 1997) Đối với nấm mốc Vigra radiata, magnesium là chất hoạt hóa mạnh hơn calcium Magnesium có khả năng cân

bằng hoạt tính PME tự do và PME cố định, trong khi calcium chỉ kích hoạt enzyme cố

định (Bordenave et al., 1993) Bên cạnh đó, anion cũng có khả năng kích hoạt enzyme dựa vào tác dụng hạ pH tối thích của enzyme xuống giá trị acid (Moustacas et al.,

1991)

Chất ức chế glycoprotein của PME (PMEI) có thể được trích ly từ trái kiwi PMEI cóthể phản ứng cạnh tranh và ngăn cản hoạt động của PME thực vật Nhờ khả năng ứcchế của PMEI đối với PME thực vật, việc tinh sạch và cô đặc PME thực vật có thể

được tiến hành theo phương pháp sắc ký ái lực (Laratta et al., 1995; Ly Nguyen B.,

2004) Trong khi đó, việc tinh sạch PME vi sinh vật cần phải sử dụng một quy trìnhhoàn toàn khác biệt và phức tạp hơn PMEI được xác định không ảnh hưởng đến hoạt

tính của PME từ vi sinh vật (Laratta et al., 1995, Ly Nguyen B., 2004) Tuy nhiên,

catechin từ trà xanh cũng được chứng tỏ là chất có khả năng ức chế hoạt động củaPME (Lewis, 2008) Đây cũng là một thông tin hữu ích trợ giúp cho việc tìm raphương thức phù hợp cho việc tinh sạch enzyme PME đạt hiệu quả cao nhất

3.1.5 Ứng dụng của enzyme PME trong chế biến thực phẩm

Enzyme PME có vai trò quan trọng trong việc cải thiện cấu trúc cho các sản phẩm raucải muối chua, trái cây đóng hộp Enzyme PME xúc tác thuỷ phân các liên kết estercủa pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca2+ tạo cấu trúc theo mong muốn(Duvetter, 2007)

Hình 2: Phức hợp pectate calcium

Nguồn: Liners et al., 1992

Việc ứng dụng enzyme PME vào chế biến thực phẩm có thể thực hiện bằng cách kíchhoạt enzyme nội bào hoặc bổ sung enzyme ngoại bào Enzyme PME của carrot có thểđược kích hoạt ở 60 ºC trong 40 phút hay 70 ºC trong 30 phút Do đó, độ cứng củacarrot được duy trì khi tiền xử lý nhiệt kết hợp với ngâm trong dung dịch CaCl2 nồng

độ 0,5% (Smout et al., 2004) Độ cứng của bí đỏ cũng được cải thiện khi chần một

phút trong dung dịch CaCl2 nồng độ 2,5% ở 40ºC (Luna et al., 1999) Tuy nhiên, một

số loại rau quả chứa rất ít PME nội bào, đồng thời việc tiền xử lý ở nhiệt độ(50 ÷ 70ºC) có thể làm hoạt hóa một số loại enzyme không muốn Vì vậy, nhiềuphương pháp khác nhau được đề nghị bổ sung enzyme vào mô thực vật ở trạng tháinguyên vẹn (Baker & Wicker, 1996) Phương thức bổ sung đơn giản nhất là phươngpháp ngâm thông thường Quá trình này thường xảy ra chậm và sự thấm enzyme vào

mô chỉ giới hạn ở bề mặt Ngâm dưới áp lực trực tiếp hoặc trong chân không đã được

áp dụng thành công đối với việc bổ sung PME ngoại bào vào mô tế bào quả dâu tây vàmột số loại trái cây khác (Duvetter, 2007)

Pectin là thành phần quan trọng trong cấu tạo vách tế bào Quá trình trích ly dịch quả

có thể gặp khó khăn do pectin tạo độ nhớt cao, thành tế bào vững chắc ngăn cản dịchbào thoát ra ngoài Vì vậy, hiệu quả trích ly có thể được cải thiện khi sử dụng hệenzyme pectinase Trong đó, enzyme PME xúc tác thuỷ phân các liên kết ester tạo

điều kiện cho enzyme PG và PL phân cắt pectin Quá trình này thường kết hợp với

việc sử dụng enzyme cellulase để cho hiệu quả tối ưu (Tucker et al., 1993).

(iii) Làm trong nước quả

Một trong những vấn đề quan trọng trong việc sản xuất nước quả là tránh được sự vẩnđục của sản phẩm Khi ép dịch quả, một lượng lớn protopectin sẽ theo dịch quả, gâyđục và tăng độ nhớt sản phẩm Phức hệ protopectin gồm protein mang điện dương vàlớp vỏ pectin mang điện âm Do lớp vỏ ngoài tích điện cùng dấu nên chúng đẩy nhauvà ở trạng thái lơ lửng, gây vẩn đục Khi xử lý với hệ enzyme pectinase, lớp vỏ pectin

sẽ bị phân cắt làm cho các protein lộ ra Khi đó, các phân tử protopectin sẽ hút nhau

và kết tủa (Bali, 2003) Ishii et al., (1972, trích dẫn bởi Ishii et al., 1979) đã thử

nghiệm và cho thấy hiệu quả tương tự khi ứng dụng xử lý làm trong nước táo bằngcách kết hợp PME với PG (polygalacturonase) hoặc sử dụng PL (pectat lyase) độc lập

Tuy nhiên, đến năm 1973, Ishii et al lại cho thấy việc sử dụng PL độc lập không hiệu quả bằng việc kết hợp PME và PG (Ishii et al., 1979)

Hình 3: Tác dụng của enzyme PME trong quá trình làm trong nước quả

Nguồn: Ishii et al., 1979

Ngoài lĩnh vực chế biến nước quả, pectinase từ vi sinh vật còn có nhiều triển vọngtrong công nghiệp chế biến ca cao và cà phê Khi xử lý bằng hệ enzyme pectinasetrong quá trình lên men ca cao và cà phê, lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bịphân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khô

Ngoài ra, hệ enzyme pectinase còn được ứng dụng trong việc tạo hương vị đặc trưngcho sản phẩm rượu do sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc trongnguyên liệu (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

3.2 CƠ SỞ CỦA VIỆC THU NHẬN ENZYME TỪ ASPERGILLUS NIGER

Aspergillus niger được biết đến như loại nấm mốc có màu đen (Abarca et al., 2004),

thuộc nhóm sinh sản vô tính Loại nấm mốc này thường thấy trong quá trình thu hoạchvà bảo quản các loại thực phẩm như đậu phộng, bắp, táo, lê, đào, nho, dâu tây, cà chua

và dưa (Pitt & Hocking, 1997).

Hình 4: Nấm mốc A niger

Nguồn: http://www.moldbacteria.com/newsletters/2005/dec2005.html

Aspergillus niger được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme (như

–galactosidases, lipases, proteases, hemicellulases, cellulases và pectinases) và acid

hữu cơ Trong công nghiệp thực phẩm, A niger đã được ứng dụng hơn mười thập kỷ qua mà không có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người (Schuster et al., 2002) Thêm vào đó, sản phẩm từ A niger cũng được Viện nghiên cứu thực phẩm và dược phẩm của Mỹ (FDA) chứng nhận là sản phẩm an toàn (GRAS) (Abarca et al., 2004) PME từ A niger đã được sản xuất thương mại ở Công ty DSM Food Specialties, Seclin, Pháp (Degraeve et al., 2003)

Sản xuất enzyme từ A niger có thể được thực hiện trên rất nhiều cơ chất khác nhau

theo phương pháp lên men trạng thái rắn hay lỏng Cơ chất thường được sử dụng choquá trình lên men sinh enzyme là các nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật như ngũcốc, gạo, bắp, thực vật thân củ, cây họ đậu, các nguồn nguyên liệu giàu protein, lipidhoặc các phụ phẩm nông nghiệp (Ashok P. et al., 2002) Tuy nhiên, một số các nghiên

cứu gần đây cho thấy, có thể ly trích PME hay các pectinase khác từ nấm mốc trên các

cơ chất giàu pectin như bã táo (Joshi et al., 2006), vỏ cam (Hamdy, 2005)

A niger sản xuất nhiều loại enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân tử

pectin như pectin methylesterase (EC 3.1.1.11), pectin acetylesterase (EC 3.1.1.6),endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15), exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67), pectatelyase (EC 4.2.2.2) và pectin lyase (EC 4.2.2.10) Hoạt động của pectin methylesterasecần thiết để tạo ra pectin có độ methyl ester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho

polygalacturonases và pectate lyase Trong khi đó pectin lyase có thể sử dụng cơ chất

có độ methyl ester bất kỳ Hệ enzyme pectinase từ A niger có nhiều ứng dụng trong

công nghiệp thực phẩm và thức uống Tuy nhiên, các enzyme này thường ở dạng hỗn

hợp sau khi trích ly, gây khó khăn trong việc ứng dụng Chính vì thế, quá trình tinh

sạch nhằm loại bỏ các hệ enzyme khác, thu được enzyme PME thuần nhất đóng vaitrò rất quan trọng

3.3 CÁC BIỆN PHÁP TINH SẠCH PECTIN METHYLESTERASE

Việc tinh sạch enzyme PME có thể thực hiện theo nhiều phương pháp khác nhau Phổbiến nhất là phương pháp kết tủa, sắc ký lỏng (sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực, sắc ký

lọc gel) (Ishii et al., 1979) hay ức chế chọn lọc pectin polymerase (sốc nhiệt, thay đổi

pH hay sử dụng chất hóa học) (Schmitz, 2002)

3.3.1 Tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A niger bằng phương pháp kết tủa

Phương pháp kết tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinhhọc, đặc biệt là các phân tử có bản chất protein như enzyme Cấu tạo phân tử enzymerất phức tạp, chúng có cả những nhóm kỵ nước và ưa nước nên tính tan phụ thuộc vào

sự phân bố của các nhóm này trên bề mặt

Có thể dùng nhiều cách khác nhau để tủa enzyme như tủa bằng muối, bằng các dungmôi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa enzyme Các dung môi hoặc cáchóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn enzyme nên có thể lôi kéo nước ra khỏiphân tử enzyme, làm cho chúng mất lớp áo nước và tủa xuống

Hỗn hợp enzyme thô thu được sau khi nuôi cấy nấm mốc A niger được loại bỏ một

phần tạp chất bằng phương pháp tủa Kết tủa được xem như là bước đầu tiên trong quitrình tinh sạch enzyme thô Sau khi tủa, tiến hành ly tâm hoặc lọc hỗn hợp lỏng–rắnthu được phần rắn Tiếp theo là hoà tan phần rắn bằng nước hoặc dung dịch đệm Sau

đó là khử muối nếu cần thiết (Harris, 1995)

Kết tủa bằng muối ammonium sulfate

Ammonium sulfate thường được sử dụng để tủa enzyme ở bước đầu trong quy trìnhtách chiết và tinh sạch Ở trạng thái bình thường, các nhóm mang điện tích trên bề mặtenzyme sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh qua liên kết hydro tạo lớp áo nướcquanh phân tử Khi thêm muối ammonium sulfate vào với nồng độ cao, các phân tửmuối sẽ phân ly thành các ion, các ion này liên kết với các phân tử nước làm choenzyme mất lớp áo nước, liên kết lại với nhau và tủa xuống (Banerjee, 2006)

Các loại muối thường được dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 Nhiều nghiên cứucho thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì có khả năng ổn định hầu hết các loại enzyme

Có thể dùng muối (NH4)2SO4 dạng rắn hoặc dạng dung dịch bão hòa

Phương pháp này cũng được sử dụng để kết tủa và thu phân đoạn các enzyme tronghỗn hợp dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ởmột nồng độ muối khác nhau.

Enzyme được kết tủa bằng muối ít bị biến tính nhưng cần phải tiến hành thêm bướcthẩm tích để loại muối ra khỏi dung dịch trước khi tiến hành sắc ký

Túi thẩm tích là một màng bán thấm, có những lỗ nhỏ cho phép các phân tử nhỏ điqua trong khi các phân tử lớn như enzyme được giữ lại (hình 5) Khi đặt trong môitrường có nồng độ muối thấp hay không có muối, muối từ trong túi sẽ khuếch tán rabên ngoài để cân bằng nồng độ, lặp lại nhiều lần muối sẽ được loại khỏi enzyme Thờigian thẩm tích thường là 24 đến 28 giờ (Đỗ Quý Hai, 2005)

Hình 5: Thẩm tích để loại muối (NH 4 ) 2 SO 4 trong kết tủa protein

Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2005

Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở độ hòa tan của protein phụ thuộc vào

sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử enzyme với các phân tử nước.Khả năng hydrate hóa của enzyme sẽ bị giảm khi thêm vào dung dịch các dung môihữu cơ, các phân tử enzyme liên kết lại với nhau và kết tủa xuống Dung môi hữu cơthường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu

Ở phương pháp này cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5 oC trở xuống) nhằmtránh gây biến tính enzyme Có thể dùng các dung môi hữu cơ này để tách phân đoạnenzyme dưới 0 oC, như vậy sẽ có tác dụng tốt đến độ ổn định của enzyme

Khi đã có kết tủa, phải tách nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng máy li tâm Phươngpháp này có ưu điểm là không cần loại muối, các dung môi hữu cơ có nhiệt độ bay hơithấp nên dễ dàng tách khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ nhưng nhược điểm là hay cómàu (Lương Đức Phẩm, 2004)

3.3.2 Ứng dụng kỹ thuật lọc màng trong tinh sạch enzyme

Enzyme cũng là một protein cao phân tử, do vậy các phương pháp phân tách protein

sử dụng màng lọc phân tử khá hữu hiệu (Đặng Thị Thu et al., 2009) Các kỹ thuật

phân tách protein hay enzyme theo kích thước phân tử của chúng nhờ một màng bánthấm hoặc màng lọc phân tử Dung dịch enzyme khi đó được phân thành hai pha: pha(1) không đi qua màng lọc chứa các cao phân tử, trong đó có protein hay enzymemuốn thu nhận và pha (2) đi qua màng lọc chỉ chứa các phân tử có kích thước nhỏ hơnkích thước màng lọc (peptid, glucid đơn giản, muối…) với nồng độ cân bằng vớichúng trong pha (1) Trong một số trường hợp, quá trình lọc được áp dụng với mụcđích thu nhận thành phần enzyme trong pha (2) – pha chứa phân tử có kích thước nhỏ

hơn Enzyme có thể được tách ra khỏi các protein/enzyme khác nhờ vào kích thước

phân tử của chúng, theo kỹ thuật sàng phân tử hay “siêu lọc” với khoảng phân đoạnphù hợp (Đặng Thị Thu & Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009a)

Nghiên cứu ứng dụng lọc màng theo siêu lọc, lọc chéo nano đã được ứng dụng kháthành công trên một số enzyme như pectinase (Huỳnh Ngọc Oanh & Trần Ngọc

Hùng, 2008) Nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Oanh & Trần Ngọc Hùng (2008) cho thấy,

sau khi kết tủa bằng ethanol, mức độ tinh sạch của pectinase tăng 3,1 lần khi enzymeđược đưa qua hệ thống lọc màng có khoảng phân đoạn 50 kDa, tốc độ bơm mẫu 150rpm và áp suất lọc nhỏ hơn 5 Psi Việc gia tăng tốc độ bơm mẫu lên đến 200 rpm là

nguyên nhân làm tăng áp lực lọc và làm giảm hiệu quả tinh sạch enzyme.

Mặc dù phương pháp tinh sạch bằng lọc màng không thể loại bỏ hoàn toàn các hợpchất cao phân tử có cùng khoảng khối lượng phân tử với enzyme muốn tinh sạch, tuynhiên đây vẫn là giải pháp hữu hiệu do tính tiện dụng, đơn giản, kinh phí thấp(Dubbin, 2005)

3.4 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TINH SẠCH ENZYME BẰNG KỸ THUẬT ĐIỆN DI

Điện di là quá trình dịch chuyển của các phân tử tích điện trong điện trường Các phân

tử protein enzyme được tách riêng dựa vào sự tích điện và khối lượng phân tử Khảnăng tách riêng các protein theo phương pháp này khá cao nhưng khó phát triển ở quy

mô lớn

Điện di được thực hiện trên một khuôn đỡ như giấy, celluloseacetate, gel tinh bột, gelagarose hoặc gel polyacrylamide Chúng có vai trò giống như một cái rây phân tử sẽlàm tăng sự phân tách Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel có thể di chuyểnxuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không dichuyển Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốckhác nhau

Điện di là một cách lọc qua gel mà theo đó tất cả các phân tử, không xét về kíchthước, sẽ bị tác động một lực để di chuyển trong cùng một cơ chất Các protein có thểđược phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bịbiến tính Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate(SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị củaprotein ban đầu

Mercaptoethanol (2–thioethanol) hay dithiothreitol được thêm vào để khử các cầudisulfide (–S–S–) và sodium dodexyl sulfate (SDS), tạo sự biến tính protein Chuỗi

polypeptide đã bị dãn ra sẽ được phủ kín bằng phân tử SDS để tạo ra polyanion có mật

độ điện tích trên một đơn vị chiều dài gần như không đổi và không phụ thuộc vàotrình tự của chuỗi peptide

Dưới tác dụng của một điện trường, các protein đã được SDS phủ kín sẽ di chuyểntrên gel arylamit về phía anot (cực +) Do các mắt lưới của gel, những protein nhỏ dichuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu.Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới những điều kiện như thế tỉ lệvới khối lượng của chúng

Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băngbằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue hay Amiden.Những đánh dấu phóng xạ có thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp Xquang lên miếng gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi

SDS–PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide) có độ phân tách cao, cho kếtquả nhanh và độ nhạy cao Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0,1 ug (~2 pmol) protein đã chovạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm chí ít hơn (~0,02 ug) vẫn có thểđược phát hiện khi nhuộm bằng bạc Những protein chênh lệch về khối lượng khoảng2% vẫn có thể phân biệt được bằng SDS–PAGE Vì vậy, SDS–PAGE giúp đánh giáđược hiệu quả của quá trình tinh sạch Với những phân đoạn đầu tiên, kết quả là dãygồm rất nhiều protein, nhưng qua mỗi bước tinh sạch, số lượng protein sẽ giảm và sẽ

có một băng ngày càng đậm, tương ứng với protein mục tiêu (Đặng Thị Thu &Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009a, b)

3.5.1 Khái niệm enzyme và cấu tạo hóa học

Enzyme được sản xuất ra bởi các tế bào sống (động vật, thực vật, vi sinh vật) và có vaitrò như là chất xúc tác bắt buộc cho các phản ứng sinh học (Nguyễn Đức Lượng,2004)

Dựa vào thành phần hóa học, có thể chia enzyme thành hai loại:

Enzyme đơn giản (enzyme một cấu tử): trong thành phần cấu tạo của nó chỉ gồmcác gốc acid amin.

Enzyme phức tạp (enzyme hai hoạc nhiều cấu tử): trong thành phần của nó ngoàiacid amin (protein) còn có các nhóm phụ khác có phân tử lượng thấp gọi là phần phiprotein hoặc là những yếu tố kết hợp gọi tắt là cofactor (các ion kim loại, vitamin,nucleotid, nhân pocfirin…) Phần protein của enzyme 2 cấu tử gọi là apoenzyme Phầnphi protein (cofactor) quyết định kiểu phản ứng và tham gia trực tiếp vào cơ thể xúctác của enzyme, thực hiện cầu nối của enzyme và cơ chất, giúp ổn định bền vững cấu

trúc của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004 ; Lê Ngọc Tú et al., 2004)

Theo Michealis – Menten, cơ chế xúc tác tổng quát của phản ứng có enzyme đượctrình bày theo sơ đồ:

Trong đó: k1, k–1, k2, k–2 là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng

Sự hình thành phức hợp ES thường xảy ra nhanh, nhưng ngược lại sự chuyển hóathành sản phẩm thì chậm hơn Phản ứng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm là quantrọng nhất

Trong đó, k2 tỉ lệ với nồng độ ES

v = k2.[ES] (v: vận tốc phản ứng) Khi nồng độ ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Theo thuyết Mischaelis và Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác của enzyme xảy ra qua

ba giai đoạn:

Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm hoạt độngcủa enzyme bằng các liên kết hóa học, tạo thành phức hệ enzyme cơ chất (E–S) Ởgiai đoạn này, các liên kết được hình thành thường là những liên kết yếu nên phức hệ

E – S thường không bền Phản ứng tạo phức hệ này thường xảy ra rất nhanh và cần cómột ít năng lượng Giữa E và S có năm loại liên kết tham gia, mỗi loại có đặc tínhriêng và năng lượng liên kết khác nhau, gồm liên kết phối trí, liên kết hydro, liên kết

ion, liên kết kỵ nước lực Vander–Waals và liên kết do dịch chuyển điện tử.

Giai đoạn hai: khi tạo thành phức hệ E – S, dưới tác dụng của enzyme, cơ chất sẽ

bị thay đổi về cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên kết bên trongphân tử, dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.Sau đó xảy ra sự thay đổi mật độ điện tích của phức hợp E – S làm biến dạng các liênkết giữa chúng, kết quả là cơ chất được hoạt hóa, dễ dàng tham gia phản ứng

Giai đoạn ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm của quá trình phản ứng đượctạo thành, enzyme tách ra và trở về trạng tháng ban đầu, chuẩn bị kết hợp với phân tử

cơ chất khác

(Mathewson, 1998)

Tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme sẽ có bản chất khác nhau, thông số động học Km đặctrưng cho mỗi enzyme (Bảng 2)

Bảng 2: Thông số động học K m của một số enzyme

a–Amylase 3.2.1.1 Dịch tụy heo Tinh bột 1,0

–Amylase 3.2.1.2 Khoai lang Amylose 0,07Bromelin 4.3.1.1 Trái khóm Benzoyl–L–arginine

ethyl ester

170

Glucose–isomerase 5.3.1.5 Lactobacillus brevis D–Glucose 920Lipoxygennase 1.13.11.12 Đậu nành Linoleate 1,0Papain 3.4.22.2 Nước đu đủ Benzoyl–L–arginine

ethyl ester

1,89

Urease 3.5.1.5 Đậu Urea 10,5

Nguồn: Phạm Thị Trân Châu & Phan Tuấn Nghĩa, 2002

3.5.3 Phân tích động học quá trình xử lý nhiệt enzyme

Sự vô hoạt enzyme ở một điều kiện nhiệt độ nhất định có thể được mô tả bởi mô hình

phương trình bậc một (Ludikhuyze et al., 2001; Eagerman & Rouse, 1976).

) exp(

A



 ) ln(

Trong đó:

A: hoạt tính của enzyme ở thời điểm t

A0: hoạt tính ban đầu của enzyme t = 0

k: hằng số tốc độ vô hoạt (phút –1)

t: thời gian xử lý nhiệt (phút)

Hằng số tốc độ phản ứng (k) có thể được xác định bằng cách lập một đồ thị của ln(A/

A0) theo thời gian gia nhiệt Hằng số tốc độ phản ứng (k) có thể suy ra trực tiếp từ hệ

số gốc của đường hồi quy

Hình 6: Hình minh họa động học theo phản ứng bậc một

Nguồn : Ly Nguyen,, 2004

Phương trình chuyển đổi một phần là một trường hợp đặc biệt của phản ứng bậc một,được ứng dụng trong trường hợp hàm lượng của chất nghiên cứu không giảm đến giátrị không và hàm lượng của chất này sau khi giảm đến một mức nào đó sẽ không đổi

khi kéo dài thời gian xử lý nhiệt (A) và có thể được biểu diễn như:

A A f

0

0

Với:

f: hệ số chuyển đổi một phần

A : hàm lượng của một chất còn lại sau quá trình xử lý nhiệt kéo dài

ln(A/A 0 )

Thời gian xử lý

Đồ thị logarithm của (1–f) theo thời gian là một đường thẳng với hằng số tốc độ phản

ứng được biểu thị bằng giá trị âm của hệ số góc

Vậy phương trình (5) giống phương trình (1) khi A gần bằng 0

Để tính toán hàm lượng còn lại sau quá trình xử lý nhiệt kéo dài, mô hình chuyển đổimột phần sau nên được sử dụng:

A A

A A

ln 1

(iii) Sự phụ thuộc của hằng số tốc độ phản ứng (k) vào nhiệt độ (T)

Dựa vào quan điểm động học (phương trình đẳng áp, đẳng tích của phản ứng hóahọc), sự phụ thuộc của hằng số tốc độ phản ứng vào nhiệt độ có thể biểu diễn bằngphương trình:

2

ln

RT

E dT

E k

dT RT

E k

1 1 ln

ln

T T R

E k

E k k

ref

a ref

1 1 ln

E a: năng lượng hoạt hóa (kJ/mol)

Hình 8: Hình minh họa ảnh hưởng của nhiệt đến hằng số tốc độ phản ứng

Nguồn : Ly Nguyen, 2004

Năng lượng hoạt hóa (E a) thường được sử dụng để chỉ sự phụ thuộc vào nhiệt độ củahằng số tốc độ phản ứng Hơn nữa, năng lượng hoạt hóa có thể được xác định theophương pháp đồ thị bằng cách biểu diễn logarithm của hằng số tốc độ phản ứng theonhiệt độ tuyệt đối Hệ số nhiệt độ có thể được tính toán từ hệ số góc (hình 8)(Duvetter, 2007)

Chất lượng của các mô hình toán được đánh giá thông qua tính toán hệ số “corrected

R 2 ” và “standard deviation” (SD) theo công thức sau:

) (

1 ) 1 ( 1 2

j m SSQ

SSQ m

) (m j

m: số lượng các thí nghiệm (observation)

j: là số tham số của phương trình

SSQ: các tổng bình phương (sum of squares)

Nguồn: SAS Institute Inc (2003)

3.6 CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

Trích ly và tinh sạch PME từ các nguồn thực vật và nấm mốc, vi khuẩn đã đượcthực hiện và đưa vào áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới

Schmitz (2002) đã công bố bản quyền nuôi cấy, thu nhận PME từ A niger theo

phương pháp nuôi cấy rắn với môi trường bột mì, cám mì, peptone và một sốkhoáng chất, sau đó tinh sạch bằng phương pháp lọc màng và bảo quản ở dạng bộtsấy phun

Arotupin et al (2008) đã nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất của PME từ Aspergillus repens Theo đó, độ tinh sạch PME từ Aspergillus repens gấp 7,93 lần

ban đầu, hoạt tính riêng của PME gia tăng từ 0,82 U/mgprotein đến 6,5 U/mgprotein saucác bước kết tủa bằng (NH4)2SO4, lọc gel kết hợp khử bỏ muối bằng Sephadex G–

100 và áp dụng sắc ký trao đổi ion với SP Sephadex C–50

Duvetter (2007) cũng đã khẳng định hiệu quả của việc tinh sạch PME từ A aculeatus thông qua sắc ký lọc gel với đoạn mồi Alka (Alka prime, GE Helthcare),

sử dụng cột Superdex 75 Kết quả cho thấy, hoạt tính riêng của A aculeatus PME

gia tăng từ 120 U/mgprotein PME thô, Novozyme) đến giá trị 180 U/mgprotein sau khitinh sạch

Bên cạnh việc kết tủa sơ bộ hỗn hợp protein chứa enzyme sau quá trình lên menbằng (NH4)2SO4, dung môi acetone lạnh cũng được sử dụng làm tác nhân kết tủa

enzyme trước khi tinh sạch bằng sắc ký PME từ Botrytis cinerea có thể được tinh

sạch bằng acetone lạnh với tỷ lệ dung môi: dung dịch chứa protein là 4 : 1 ở nhiệt

độ 3 ÷ 4 °C Sau khi kết tủa, kết tủa chứa enzyme PME được phân tách bằng ly tâm

ở tốc độ 27000 g trong thời gian 10 phút, sau đó hòa tan lại trong dung dịch đệmsodium acetate ở pH 4,5 Mức độ tinh sạch PME (so với enzyme thô) tăng 1,6 lầnsau khi kết tủa bằng acetone nhưng gia tăng đến 37,5 lần sau quá trình tinh sạchbằng sắc ký trao đổi ion CM–Sepharose (CL–6B, Pharmaci) Hoạt tính riêng đạt

được là 1,69 U/mg (so với giá trị 0,04 U/mg ở enzyme thô) (Reignault et al.,

1994)

Nhìn chung, các nghiên cứu tinh sạch PME từ vi sinh vật, chủ yếu là nấm mốc

Aspergillus spp cho thấy, hoạt tính của PME và mức độ tinh sạch gia tăng đáng kểkhi enzyme thô thu được sau quá trình lên men được kết tủa với (NH4)2SO4 haydung môi hữu cơ, tiếp theo đó là quá trình tinh sạch bằng sắc ký cột thích hợp Đây

cũng chính là cơ sở cho việc nghiên cứu tinh sạch PME thu nhận từ A niger.

Cũng như các loại enzyme khác, hoạt tính PME rất dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tốmôi trường Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính xúc tác của enzyme Phầnlớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 ÷ 50 °C Tùy thuộc vào nguồn gốc,nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau thì hoàn toàn khác nhau Enzymepectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30 ÷ 45 °C và bị vô hoạt ở 55 ÷ 62

°C (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điềukhiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thựcphẩm Bên cạnh yếu tố nhiệt độ, enzyme cũng rất nhạy cảm với sự thay đổi pH củamôi trường pH thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, đặc biệt là ảnh

hưởng đến độ bền của enzyme PME từ các loài Aspergillus spp là điển hình cho

các PME có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong vùng acid Tuy nhiên, cùng họ

Aspergillus spp nhưng pH tối thích của các loài Aspergillus cũng rất khác nhau Chẳng hạn pH tối ưu của enzyme PME từ A species là 3,7 ÷ 4,2 và trong khi pH tối ưu của enzyme PME từ A sojae là 5,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Riêng với enzyme PME từ A repens thì có hoạt tính mạnh nhất ở pH 6,5 Theo Nari et al.

(1991), hoạt động của PME tăng cùng với sự tăng nồng độ ion kim loại và đạt đếncực đại, ở trên giá trị này hoạt tính enzyme giảm dần Ion kim loại phản ứng vớinhóm mang điện tích âm (nhóm carboxyl) cho phép enzyme phản ứng trên liên kếtester và giải phóng nó Ở nồng độ cao, ion kim loại ức chế hoạt động của enzyme.Điều này được hiểu dựa trên nhóm carboxyl kế cận liên kết ester được giải phóngcho phép phản ứng tiếp diễn Nếu những nhóm này được khóa bởi ion kim loại,

phản ứng enzyme không xảy ra (Nari et al., 1991) Theo Leiting & Wicker (1997)

ở cùng mức độ ion hóa, những ion hóa trị 2 kích hoạt PME khác nhau Với NaCl,nồng độ tối ưu cho hoạt động PME là 0,2M Trong số những ion hoá trị 2, calciumlà một trong những ion quan trọng nhất Tại nồng độ thấp (5  25 nM), calciumtăng khả năng hoạt động của PME, trong khi đó ở nồng độ cao, có lẽ vì sự hìnhthành gel pectate mà tốc độ phản ứng của PME giảm (Leiting & Wicker, 1997)

Trong nghiên cứu này, các điều kiện môi trường có tác động đến hoạt động củaPME sau quá trình tinh sạch sơ bộ, chẳng hạn như điều kiện pH môi trường, nhiệt

độ, độ bền nhiệt, nồng độ ion CaCl2 và NaCl, nồng độ cơ chất sử dụng (pectin)được đề nghị khảo sát

CHƯƠNG 4 PHƯƠNG TIỆN VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

4.1.1 Địa điểm, thời gian

Địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thựcphẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng và Phòng thí nghiệm Sinh hóa, ViệnNghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: từ tháng 05 năm 2011 đến tháng 12 năm 2011

4.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Enzyme thô thu được từ quá trình lên men rắn A niger trên môi trường bã táo và cam

sành

4.1.3 Thiết bị, hoá chất

(i) Thiết bị

Thiết bị thanh trùng

Thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp (Rotana 46 R, Germany)

Hệ thống sắc ký gel SP– Streamline SP

Hệ thống điện di Miniprotein II (BioRad)

Máy đo pH (TOA pH meter HM – 12P)

Bộ điều nhiệt (water bath Memmert)

Bộ hệ thống lọc màng QuixStand Benchtop Systems (hãng AmershamBiosciences) với bộ lọc màng (membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa

Tủ cấy, tủ ủ

Các dụng cụ phổ biến trong phân tích vi sinh và enzyme

Bovine serum albumin (Merck)

Bộ protein chuẩn của GenScript bao gồm 6 protein tái tổ hợp thay đổi từ 15 kDađến 100 kDa

Một số hóa chất khác sử dụng trong phân tích

4.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

4.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm mốc gồm 5 gam bã táo có bổ sung thêm 0,075 gamCaCl2, 0,025 gam MgCl2, 0,01 gam urea, hỗn hợp được trộn đều với 15 mL đệm citrat(sử dụng bình tam giác 250 mL) Môi trường nuôi cấy được tiệt trùng ở 121 oC trong

15 phút Sau khi để nguội, cho 2 mL bào tử nấm mốc A niger vào (khoảng 105 bào tử/mL), ủ ở nhiệt độ phòng trong 96 giờ Hỗn hợp enzyme thô được trích ly bằng dungdịch đệm citrat/phosphate ở pH 4,5 Lọc qua hệ thống vi lọc có đường kính 0,2 m

trước khi tiến hành tinh sạch (Tran et al., 2010).

4.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả

Các chỉ tiêu cơ bản được phân tích, đo đạc theo phương pháp được tổng hợp ở bảng 3

Bảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

Hoạt tính của PME (U/mL) Phương pháp chuẩn độ điện thế (Crelier el al., 1995; trích

dẫn bởi Duvetter, 2007)Hàm lượng protein tổng

(mg/mL)

Phương pháp Bradford (1976), sử dụng bovine serum albumin (BSA) làm đường chuẩn, với chỉ thị màu Coomassie Brillant Blue và đo ở bước sóng 595 nm

Hiệu suất thu hồi PME, Y

TA0: tổng hoạt tính PME có trong mẫu thô (U)

TA1: tổng hoạt tính PME có trong mẫu sau trích ly (U)Hoạt tính riêng S (U/mg)

protein

A S

C



A: hoạt tính PME (U/mL)

Cprotein: nồng độ protein trong mẫu tương ứng (mg/mL)

S1: hoạt tính riêng của PME sau tinh sạch (U/mg)

S0: hoạt tính riêng của PME trong mẫu thô (U/mg)Nhận diện PME và kiểm

tra độ tinh khiết của protein

Điện di trên gel SDS–PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

4.3 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Thí nghiệm được chia làm hai phần chính

Phần 1 Khảo sát khả năng tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A niger bằng

phương pháp kết tủa

4.3.1 Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng

đến khả năng kết tủa enzyme PME từ A niger

Mục đích

Tìm ra loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng phù hợp nhằm đạt hiệu quả kết tủa enzyme PME

từ A niger tốt nhất mà không làm biến tính PME A niger

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành theo phương thức kết hợp 2 nhân tố với 3 lần lặp lại

Nhân tố A: Hóa chất dùng để kết tủa enzyme PME từ A niger, có 4 loại hóa chất

A1: Ammonium sulfate A2: Sodium chloride

Số nghiệm thức thí nghiệm: 21 nghiệm thức

Số mẫu thí nghiệm: 21 x 3 = 63 mẫu

Tiến hành thí nghiệm

Dung dịch enzyme thô được làm lạnh đến 4 oC trước khi tiến hành thí nghiệm này.Đối với trường hợp kết tủa bằng muối, dịch enzyme thô được tiến hành kết tủa phânđoạn bằng muối ammonium sulfate bão hòa bắt đầu từ 15% đến 85% hoặc sodiumchloride bão hòa từ 15% đến 35% Đầu tiên, cho một thể tích xác định của dịchenzyme thô đã làm lạnh vào trong ống ly tâm Từ bảng tra nồng độ bão hòa muối(NH4)2SO4, NaCl, tính toán được khối lượng muối cần thiết phải cho vào dung dịch đểđạt được nồng độ bão hòa tương ứng

Cho muối từ từ vào dung dịch enzyme và lắc đều cho đến khi muối tan hoàn toàn Quátrình kết tủa được thực hiện trong vòng 2 giờ ở 4 °C, tiếp theo kết tủa được tách rabằng máy ly tâm 10000 g trong 20 phút ở 4 ºC Sau quá trình ly tâm, kết tủa được tách

ra và phần dung dịch còn lại được đem đi xác định thể tích và tiến hành tính toán xácđịnh lượng muối cần thiết cho vào để đạt được nồng độ bão hòa kế tiếp Các bước tiếptheo cũng được thực hiện như lúc đầu và cho đến nồng độ bão hòa cuối cùng

Sau đó, kết tủa thu được ở các phân đoạn muối bão hòa khác nhau sẽ được hòa tan trởlại bằng dung dịch đệm citrate-phosphate (pH 4,5) với thể tích vừa đủ Tiếp theo, phầnkết tủa được hòa tan sẽ đem đi thẩm tích trong dung dịch đệm citrate-phosphate (pH4,5) bằng màng cellophane trong vòng 12 giờ Sau cùng, ứng với từng phân đoạnmuối bão hòa xác định hoạt tính, hàm lượng protein của PME và tính toán hiệu quảtinh sạch enzyme

Đối với kết tủa bằng dung môi hữu cơ, dung môi hữu cơ được làm lạnh trước đếnnhiệt độ –5 ± 0,5 oC, cho chầm chậm vào các ống nghiệm chứa enzyme thô theo các tỷlệ như đã bố trí, lắc nhẹ và để ổn định 2 giờ ở 4 oC Sau khi kết tủa, hỗn hợp được lytâm ở 4 oC, 10000 vòng/phút (khoảng 11173 g) trong 15 phút thu được phần kết tủa.Phần kết tủa được hòa tan bằng dung dịch đệm citrat/phosphate pH 4,5 Xác định hoạttính PME, đo hàm lượng protein và tính toán hiệu quả tinh sạch enzyme

Kết quả thu nhận

Chọn ra loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng phù hợp cho quá trình kết tủa PME từ A niger

dựa trên hoạt tính riêng, độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi Kết quả tối ưu của thínghiệm này sẽ làm cơ sở thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

4.3.2 Thí nghiệm 2 Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme PME từ A niger bằng

phương pháp lọc màng

Mục đích: Đánh giá khả năng tách loại, thu nhận PME bằng cách sử dụng hệ thống

màng có khoảng phân đoạn 50 kDa

Tiến hành thí nghiệm

Dựa trên kết quả kết tủa protein bằng muối và dung môi

hữu cơ khác nhau, chọn mẫu protein sau kết tủa có hoạt

tính riêng và độ tinh sạch cao nhất để tiến hành khảo sát

lọc màng Tiến hành bơm 50 mL kết tủa đã hòa tan trong

dung dịch đệm citrate/phosphate có pH 4,5 với tốc độ

150 rpm qua hệ thống lọc màng QuixStand Benchtop

Systems (hãng Amersham Biosciences) với bộ lọc

màng (membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa Điều

chỉnh sao cho áp suất trên bề mặt màng không quá 5

Psi (hình 9) Thu dịch qua lọc, xác định hiệu suất thu

hồi enzyme và hoạt độ tương ứng Nhiệt độ trong quá

trình lọc duy trì trong khoảng 4 oC

Hình 9: Thiết bị lọc màng QuixStand Benchtop System

Kết quả thu nhận

Hiệu suất thu hồi, độ tinh sạch và hoạt tính riêng của PME sau quá trình lọc

Phần 2 Xác định tính chất của enzyme PME từ A niger sau khi được tinh sạch

sơ bộ bằng phương pháp kết tủa

4.3.3 Thí nghiệm 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất pectin đến hoạt

tính enzyme PME từ A niger

Mục đích

Xác định hằng số Km, Vmax của enzyme PME từ A niger đối với cơ chất pectin.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành với 1 nhân tố

Nhân tố C: Nồng độ dung dịch pectin (g/L), thay đổi ở 9 mức độ và 3 lần lặp lại

Tiến hành thí nghiệm

Dung dịch cơ chất có chứa NaCl 0,12 M và pectin ở các nồng độ khác nhau từ

0 ÷ 10 g/L được điều chỉnh đến pH 4,5 bằng dung dịch NaOH 0,01 N Hỗn hợp cơ chất này được sử dụng để đo hoạt tính enzyme PME từ A niger sau khi tinh sạch sơ

bộ theo kết quả tối ưu của thí nghiệm 1 và 2

Kết quả thu nhận

Xác định hằng số Km và Vmax của enzyme PME từ A niger dựa vào sự thay đổi hoạt

tính của enzyme này theo nồng độ cơ chất pectin

4.3.4 Thí nghiệm 4 Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A niger

theo nhiệt độ

Mục đích

Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme PME từ A niger nhằm tìm ra

nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme này

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố, 3 lần lặp lại

Nhân tố D: Nhiệt độ xử lý (oC), thay đổi ở 7 mức độ

đá và xác định hoạt tính còn lại của PME ứng với từng mức nhiệt độ khác nhau

Kết quả thu nhận

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của enzyme PME từ A niger

4.3.5 Thí nghiệm 5 Động học sự vô hoạt nhiệt của enzyme PME từ A niger

Mục đích

Xác định tính ổn định của enzyme PME do tác động của nhiệt