) XÁC ĐỊNH MƠI TRƯỜNG LÊN MEN TỐI ƯU CHO Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER SỬ DỤNG CƠ CHẤT BÃ TÁO TA VÀ VỎ CAM SÀNH

Điểm mới của đề tài chính là việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin sẵn có của địa phương bã táo ta khô, vỏ cam tươi và vỏ bưởi khô làm cơ chất lên men sinh tổng hợp enz

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG

(Nghiên cứu sinh thực hiện)

XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG LÊN MEN TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PECTIN

METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER

SỬ DỤNG CƠ CHẤT BÃ TÁO TA VÀ VỎ CAM SÀNH

Mã số: NCST 2010 - 03

Chủ nhiệm đề tài

Ths Trần Thanh Trúc

Cần Thơ, tháng 12/2010

TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG LÊN MEN TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH

SINH TỔNG HỢP PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER

SỬ DỤNG CƠ CHẤT BÃ TÁO TA VÀ VỎ CAM SÀNH

Cán bộ phối hợp nghiên cứu

Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân Vương Tố Trinh

Ngày ……tháng…… năm 2010 Ngày……tháng…… năm 2010

Ngày……tháng…… năm 2010

Cơ quan chủ trì

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi

TÓM TẮT vii

ABSTRACT viii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Pectin methylesterase 2

2.1.1 Khái quát chung 2

2.1.2 Một số đặc tính cơ bản của PME 3

2.1.3 Một số ứng dụng của PME trong công nghệ thực phẩm 4

2.2 Thu nhận enzyme PME 5

2.2.1 Nguồn thu nhận PME 5

2.2.2 Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh enzyme PME 7

2.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu quả sinh tổng hợp PME9 2.3 Các kết quả nghiên cứu có liên quan 13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 15

3.1 Phương tiện nghiên cứu 15

3.1.1 Địa điểm, thời gian 15

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 15

3.1.3 Thiết bị, hoá chất 15

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 16

3.2 Phương pháp thí nghiệm 17

3.2.1 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu 17

3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 17

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 23

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 24

4.1 Ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung riêng lẻ đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger So2 24

4.2 Ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung kết hợp đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger So2 28

4.3 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen bổ sung đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger So2 29

4.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung vỏ bưởi khô đến quá trình sinh tổng hợp PME từ A.niger So2 32

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Kiến nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ix

(i) Phương pháp phân tích pectin ix

(ii) Phương pháp trích ly PME x

(iii) Phương pháp xác định hoạt tính của PME (theo Crelier et al, 1995; trích dẫn bởi Duvetter, 2007) x

(iv) Cách chuẩn bị dung dịch đệm citrate - phosphate (pH 2,2 - 8,0) xi

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ xii

1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung riêng lẻ đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger xii

2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung kết hợp đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger xv

3 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen bổ sung đến khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger xvi

4 Ảnh hưởng của việc bổ sung vỏ bưởi khô đến quá trình sinh tổng hợp PME từ A.niger xx

CHƯƠNG 1 DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Hiệu quả xử lý nước táo và nước vải bằng chế phẩm enzyme pectinase 5Bảng 2 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu trong nghiên cứu 17Bảng 3: Ảnh hưởng của việc bổ sung ZnCl2 và NaCl đến sự thay đổi hoạt tính

PME từ A.niger So2 24

Bảng 4: Tác động của thành phần khoáng MgCl2, CaCl2 và KCl đến sự thay đổi

hoạt tính PME từ A.niger So2 26

Bảng 5: Ảnh hưởng của việc bổ sung kết hợp các loại khoáng đến hoạt tính PME 28Bảng 6: Ảnh hưởng của nguồn nitrogen bổ sung ở các tỷ lệ sử dụng khác nhau đến

hoạt tính PME từ quá trình lên men A.niger So2 30

Bảng 7: Ảnh hưởng của việc bổ sung vỏ bưởi đến hoạt tính PME từ quá trình sinh

tổng hợp A.niger So2 33

Bảng 8: Kết quả tổng hợp thành phần môi trường lên men tối ưu cho sự sinh tổng

hợp PME của A.niger 33

Bảng PL1: Cách chuẩn bị dung dịch đệm citrate - phosphate (pH 2,2 - 8,0) xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Sơ đồ thủy phân pectin của PME 2Hình 2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 18Hình 3: Đồ thị biểu diễn mức độ thay đổi hoạt tính enzyme PME dưới tác dụng của thành phần khoáng bổ sung NaCl và ZnCl2 25

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

A.awamori Aspergillus awamori

A.niger Aspergillus niger

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện với mục tiêu xác định điều kiện môi trường tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) từ Aspergillus niger trên cơ chất bã táo ta và vỏ cam sành đạt hiệu quả cao Thông qua nghiên cứu, tác động của các thành phần khoáng và nitrogen bổ sung đến quá trình sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger So2 cũng được xác định Đồng thời, ảnh hưởng của việc bổ sung vỏ bưởi đến hiệu quả sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger So2 cũng được khảo sát.

Kết quả nghiên cứu cho thấy khi lên men Aspergillus niger sinh enzyme pectin methylesterase trên môi trường bã táo ta và vỏ cam với tỉ lệ 70:30 (%, w/w), hàm lượng khoáng bổ sung thích hợp là 0,5% MgCl 2 và 1,5% CaCl 2 , kết hợp với 0,1% urea từ nguồn dinh dưỡng bổ sung cho hiệu quả cải thiện đáng kể hoạt tính PME Đồng thời, việc bổ sung 5% vỏ bưởi khô làm gia tăng lượng pectin trong môi trường lên men, điều chỉnh độ DE của cơ chất và tạo điều kiện thích hợp cho sự sinh tổng hợp PME đạt hiệu quả cao nhất với hoạt tính PME thu được là 40,0 ± 1,0 U/mL, tăng gấp 2 lần so với giá trị PME thu nhận ban đầu

Điểm mới của đề tài chính là việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin sẵn

có của địa phương (bã táo ta khô, vỏ cam tươi và vỏ bưởi khô) làm cơ chất lên men sinh tổng hợp enzyme cho hiệu quả kinh tế và đáp ứng yêu cầu về môi trường Đồng thời, việc kết hợp vỏ cam, bã táo và vỏ bưởi với một tỉ lệ nhất định, thay vì

sử dụng riêng lẻ đã cho thấy hiệu quả cải thiện hoạt tính enzyme PME rõ rệt Quá trình nuôi cấy sử dụng nấm mốc Aspergillus niger đã từ phân lập và tuyển chọn từ cam soàn (Citrus sinensis) trong điều kiện phòng thí nghiệm.

In production of fungal pectin esterase in solid state fermentation, control of medium composition is an important key for improved the activity of enzyme The objective of this investigation was to determine optimized parameters of medium composition for PME biosynthesis in solid state fermentation by Aspergillus niger So2 Based on this objective, effects of different nutrition source with various concentrations in fermentation medium to production PME were studied In this study, a mixture of 70: 30 (%, w/w) of apple pomace and orange peels were used

as a main substrate for SSF The substrate was diluted by phosphate/citrate buffer (pH 3.5) to obtained 60% moisturea content of medium The result showed that, the addition of 1,5% CaCl 2 , 0.5% MgCl 2 combined with 0.1% urea from nutritional supplements were improved efficiency PME activity Also, the addition

of 5% dried grapefruit peel to increase the amount of pectin in the fermentation environment, adjust the DE of the substrate were a suitable condition for the biosynthesis of PME After the incubation period of 96 h, activity of PME from Aspergillus niger can be obtained the value of 40.0 ± 1.0 U/mL Overall, the addition of essential nutrition source can get 2 times higher PME activity than the control.

Using agro waste as substrate for fermentation processing is the important information of this study In addition, the combination of apple pomace, orange peels and grapefruit peels with suitable ratio can obtained the higher maximum yield The experiment were also affirmed that, Aspergillus niger So2 from sweet orange (Citrus sinensis) was found as a best strain for PME productivity.

CHƯƠNG 2 ĐẶT VẤN ĐỀ

2.1 Tính cấp thiết của đề tài

Việc ly trích và ứng dụng PME vào trong quá trình chế biến thực phẩm đã đượcphát triển khá rộng rãi ở nhiều quốc gia (Duvetter, 2006), tuy nhiên khả năng sửdụng của enzyme này vẫn chưa được quan tâm ở Việt Nam Hiện không có PMEthương mại được sản xuất ở nước ta, việc nhập khẩu PME được ly trích và tinh chế

ở nước ngoài thường có giá quá cao Điều này làm ảnh hưởng không nhỏ đến việcphát triển khả năng ứng dụng của enzyme PME vào quá trình chế biến thực phẩm.Chính vì thế, nghiên cứu ly trích PME trong điều kiện hiện tại ở Việt Nam là mộttrong những việc cần thiết, cần được quan tâm

Nghiên cứu trước đó của nhóm tác giả đề tài đã cho thấy hiệu quả của việc sử dụng

bã táo ta khô và vỏ cam làm cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp PME từ A.niger.

Tuy nhiên, hiệu quả lên men vẫn còn khá thấp khi so sánh với một số khảo sát đã

được thực hiện trên thế giới (Joshi et al., 2006) Chính vì thế, cần có biện pháp

thích hợp để gia tăng hiệu quả của quá trình sinh tổng hợp enzyme PME Bên cạnhviệc sử dụng cơ chất cảm ứng thích hợp (phụ phẩm giàu pectin có độ ester hóacao) và điều khiển nguồn nấm mốc sử dụng, hiệu quả của quá trình sinh tổng hợpenzyme PME có thể gia tăng bằng cách cải thiện môi trường lên men – bổ sungcác nguồn khoáng và vi chất dinh dưỡng (Nguyễn Đức Lượng, 2004; Rao, 2005;

Joshi et al., 2006) Đây chính là cơ sở cho việc nghiên cứu cải thiện hoạt tính PME

từ Aspergillus niger được thực hiện

2.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với mục tiêu xác định điều kiện môi trường tối ưu cho quá

trình sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger trên cơ chất bã táo ta và vỏ cam sành

đạt hiệu quả cao

CHƯƠNG 3 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

3.1 Pectin methylesterase

Khái quát chung

Pectin methylesterase (PME, E.C.3.1.1.11) là enzyme thuộc nhóm enzymepectinase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin, giải phóngmethanol và hình thành pectin có độ methoxyl thấp (là các acid pectinic hoặc acidpectic) (hình 1) Hiệu suất thủy phân có thể đạt đến 98% Vị trí thủy phân củaPME là liên kết methyl ester ở C6 của 1 gốc GalA trong HG (homogalacturonan)của pectin trong môi trường nước (các nhóm estermethyl của đơn vị galacturonatenằm kề đơn vị không bị ester hóa)

Hình 1: Sơ đồ thủy phân pectin của PME

(Nguồn: Sila et al., 2003)

Khi enzyme hoạt động không phải toàn bộ cấu trúc enzyme tham gia hoạt độngxúc tác mà chỉ có trung tâm hoạt động của enzyme tham gia phản ứng Trung tâmhoạt động của enzyme do cấu trúc của enzyme tạo ra

Dựa trên cấu trúc của PME carrot, Johansson et al (2002) đề nghị cơ chế hoạt

động như sau: trung tâm hoạt động của PME carrot bao gồm Asp157, Arg225,Gln113, Gln115 vaf Asp136 Trong đó, Asp157 có liên kết hydro gắn với cả oxy vàArg225 Arg225 được xem là một phần tử ái điện tử tấn công chủ yếu vào nhómcarbon từ carboxymethyl và carbonyl của pectin Asp136 liên kết với Phe160, có

tính acid trong giai đoạn đầu phản ứng và methanol được tách ra Tiếp theo,Asp136 có khả năng phản ứng như một bazơ tách hydro của một phân tử nước đểcắt liên kết hóa trị giữa cơ chất và Asp157 và phục hồi lại trung tâm hoạt động cho

enzyme (Johansson et al., 2002).

3.1.1 Một số đặc tính cơ bản của PME

PME là những enzyme có kích thước trung bình và phân tử khối (MM) vào

khoảng 25 ÷ 54 kDa (Benen et al., 2003) PME thu nhận từ những nguồn khác

nhau có điểm đẳng điện không giống nhau Điểm đẳng điện của PME thay đổi từ3,1 đối với enzyme từ nấm mốc đến pI = 11 đối với PME cà chua Hầu hết PMEchiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài trường hợp có PME cótính acid (Bordenave, 1996)

Nhiều loại PME khác nhau về phân tử khối, pI và hoạt tính sinh hóa được tìm thấy

ở các thực vật 2 lá mầm (Bordenave et al., 1996; Bordenave and Goldberg, 1994; Giovane et al., 1994; Pressey và Woods, 1992) Hầu hết các PME nguồn gốc thực

vật thủy phân liên ester của pectin từ đầu khử hoặc đầu không khử, hoặc gần vớinhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn (Nguyễn ĐứcLượng, 2004) Phản ứng khử ester bắt đầu ở gần nhóm carboxyl tự do hay từ đầukhử của mạch polygalacturonic (chỉ tác dụng tại một vị trí trên mạch), kết quả tạothành các gốc galacturonic bị khử nhóm ester (Solms và Deuel, 1955; Rexova,

Benkova và Markovic, 1976; Markovic và Kohn, 1984; Willats et al., 2001) Do

hoạt động cần có nhóm carboxyl tự do trên mạch galacturonic nên PME từ thựcvật ít hoạt động trên các pectin có độ ester hóa cao hơn là các pectin có độ esterhóa từ 20  30% (Evans và MacHale, 1978; Seymour et al., 1991)

Ngược lại, PME từ nấm mốc (Aspergillus spp) có thể phân cắt cơ chất một cách ngẫu nhiên (Ishi et al., 1979; Kohn et al., 1982; Limberg et al., 2000), ngoại trừ PME từ nấm mốc Trichoderma reesei khử ester hóa theo từng block (Markovic và Kohn, 1984), và phản ứng khử nhóm ester của PME từ nấm Erwinia chrysanthemi cũng tương tự như ở PME từ thực vật (Christensen et al., 2001)

Phản ứng tiếp theo của quá trình khử ester rất khác nhau Sự thủy phân theo vị trí

cố định (blockwise), các pectin đã bị khử ester hóa sẽ tạo gel khi có sự hiện diệncủa ion Calcium (Micheli, 2001) làm thành tế bào trở nên cứng chắc Trong khi đó,polygalacturonase và pectate lyase sẽ hoạt động và thủy phân ngẫu nhiên mạchpolymer của pectin

3.1.2 Một số ứng dụng của PME trong công nghệ thực phẩm

Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoahọc lớn Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự thành lập các chất gâyđục không mong muốn trong nước trái cây và rượu vang là do sự hiện diện cáchợp chất pectic đặc biệt là pectin hòa tan, các chất này nằm ở thành tế bào đượcphóng thích khi trái cây bị nghiền nhão Các chế phẩm enzyme sử dụng trong sảnxuất nước quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là đối với những quả cónhiều pectin, độ nhớt cao) tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô đặc dịch quả,làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật

Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép Nếupectin còn nhiều sẽ theo vào nước quả gây ra hiện tượng nước quả bị đục, có độkeo cao và rất khó lọc trong

Trong các sản phẩm đòi hỏi tính giòn, độ cứng chắc của sản phẩm (như trong sảnphẩm rau muối chua, táo cắt lát, rau quả đóng hộp…) Trong quá trình chầnnguyên liệu ở nhiệt độ thấp, thời gian dài sẽ làm kích hoạt PME phân cắt nhómester của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca2+ tạo cấu trúc theomong muốn Ảnh hưởng của sự tách loại nhóm methoxyl trong phân tử pectin đốivới độ cứng mô thực vật bao gồm hai hiện tượng: ở mô chưa xử lý, sự hiện diệncác nhóm carboxyl tự do làm tăng khả năng tạo thành và độ bền của phức calciumgiữa hai mạch pectin, và ở mô đã xử lý nhiệt sẽ có sự gia tăng liên kết với Ca2+ vàlàm giảm nguy cơ bị tự phân cắt hay còn gọi là β – elimination (Sajjaanatukal vàPitifer, 1991)

Tuy nhiên, một vài loại trái cây chỉ chứa một lượng rất nhỏ PME nội bào Do đónhiều phương pháp khác nhau được đề nghị để bổ sung enzyme vào mô thực vậtnguyên vẹn và cách đơn giản nhất là phương pháp ngâm – thấm thụ động Tuy

nhiên đây là một quá trình xảy ra chậm và sự thấm enzyme vào mô chỉ giới hạn ởbề mặt Vì thế cần có sự hiện diện của các chất phụ gia Nếu trong mô có khoảngkhông chứa khí đáng kể thì phải tiến hành dưới áp lực trực tiếp hoặc là chânkhông Kỹ thuật ngâm chân không (vacuum infusion – VI) được sử dụng trongnhiều quá trình chế biến khác nhau để cải thiện chất lượng về cấu trúc của sảnphẩm hoặc tạo sự đồng nhất của các thành phần chức năng trong sản phẩm

Ngâm bằng kỹ thuật chân không áp dụng cho trái đào cắt nửa với PME của bưởivà CaCl2 đã làm tăng đáng kể độ cứng của trái đào đóng hộp Theo Baker vàWicker (1996), có mối tương quan giữa mức độ ester hóa của pectin với khả năngcải thiện độ cứng Kỹ thuật ngâm chân không của PME nấm mốc với CaCl2 đượckhảo sát thấy có hiệu quả cải thiện độ cứng cho dâu tây cắt nửa lạnh đông

Bảng 1: Hiệu quả xử lý nước táo và nước vải bằng chế phẩm enzyme pectinase

Loại nước quả

Hiệu suất nước quả(%)

Hàm lượng chất khô (%)

Độ acid chuẩn (%)

Đường (%)

Pectin (%)

Điểm đánh giá cảm quan

Nước quả từ táo

a- Không có chế phẩm enzyme

b- Có chế phẩm enzyme

71,278,8

10,211,5

0,530,62

6,78,0

0,330,15

4,54,8

Nước quả vải

a- Không có chế phẩm enzyme

b- Có chế phẩm enzyme

49,272,4

8,510,2

0,911,16

5,627,4

0,260,12

3,84,3

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

3.2 Thu nhận enzyme PME

3.2.1 Nguồn thu nhận PME

Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sống Việc điều chếchúng bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn là việc làm rất khó khăn và đầytốn kém nên người ta thường thu nhận chúng từ các nguồn sinh học (Nguyễn ĐứcLượng, 2004) Mặc dù enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật thực

mặt kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzymecũng như cho phép thu được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế chúng.Việc phân bố của enzyme trong tế bào cũng không đồng đều, trong một loại tế bàocũng có thể có nhiều enzyme này song không có enzyme khác Lượng enzyme lạithay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển của sinh vật và tùy theo loài.Chính vì thế, việc chọn lựa nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc chiết rút và tinh

chế enzyme cần được quan tâm (Favelar – Torres et al., 2006).

Enzyme pectin methylesterase có thể được thu nhận từ hai nguồn là thực vật và visinh vật Trong hầu hết các loại cây ăn trái, đều có sự hiện diện của PME với hàmlượng khác nhau Việc ly trích PME thực vật cũng được tiến hành trên nhiều loại

quả như cà chua (Pressey và Woods, 1992; Giovane et al., 1994), carrot (Alonso et

al., 2003) hay bơ (Awad và Young, 1980) PME từ vỏ cam hiện đã được tinh sạch

và sản xuất thương mại (P5400, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) Mặc dù vậy,việc thu nhận PME từ thực vật vẫn gặp nhiều hạn chế, rất khó sử dụng để sản xuấtcác chế phẩm enzyme với quy mô lớn bởi các nhược điểm như:

- Chu kỳ sinh trưởng của thực vật khá dài,

- Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được,

- Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm, không có tính kinh tế khi sử dụnglàm nguồn ly trích enzyme thương mại

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Việc sử dụng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme là giải phápkhả thi do chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật rất ngắn (16 – 100 giờ), tốc độ sinhsản nhanh Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú Vi sinh vật có khả năngtổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động, thựcvật không tổng hợp được Phần lớn các thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ tìm và giá

rẻ Nhiều vi sinh vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên các môitrường đơn giản, dễ tìm như các phế liệu của các ngành sản xuất Hơn nữa, có thểdùng những nguyên liệu không phải thực phẩm, những dung dịch muối vô cơ đểnuôi vi sinh vật Chính vì thế, sử dụng vi sinh vật làm nguồn thu nhận enzyme sẽ

mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh và hiệu quả kinh tế cao (Nguyễn Đức

Lượng, 2004; Favelar – Torres et al., 2006).

Mặc dù có rất nhiều giống nấm mốc và vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme

PME … (Reignault et al., 1994 ; Joshi et al., 2006), tuy nhiên Aspergillus spp là nguồn chủ yếu (Patil và Dayanand, 2006 ; Arotupin et al., 2008 ; Joshi et al., 2006) Đặc biệt, Aspergillus niger được ưu tiên chọn lựa nhờ vào đặc tính an toàn

(GRAS) và khả năng dễ phát triển, dễ phân lập và thu nhận enzyme pectinase nói

chung cũng như PME nói riêng có hoạt tính cao (Deraeve et al., 2003) Chính vì thế, quá trình sinh tổng hợp enzyme PME từ nguồn nấm mốc Aspergillus niger

được quan tâm

Hiệu quả của quá trình lên men sinh PME cũng như các enzyme khác phụ thuộcvào rất nhiều thông số như chủng vi sinh vật, thành phần cơ chất, các vi chất dinhdưỡng, khoáng chất và điều kiện lên men Khi quá trình tuyển chọn chủng vi sinhvật có hoạt tính PME cao, số lượng nhiều đã được tiến hành thì thành phần cơchất, mức độ bổ sung khoáng, chất dinh dưỡng và điều kiện lên men là những nhân

tố thiết yếu, có ảnh hưởng sâu sắc đến hiệu quả của quá trình nuôi cấy, sinh tổnghợp enzyme mong muốn (Rao, 2005)

Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh enzyme PME

Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũngnhư các enzyme khác từ vi sinh vật Trong thành phần môi trường phải có đủ cácchất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợpenzyme Tuy nhiên, để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiệntượng cảm ứng Ở điều kiện bình thường, vi sinh vật chỉ tổng hợp ra một lượngenzyme vừa đủ cho hoạt động sinh lý của chúng (tổng hợp enzyme “bản thể”) Đểthu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần phải tiến hành quá trình nuôicấy thích hợp với sự tham gia của cơ chất cảm ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004;

Favelar – Torres et al., 2006) Sự hiện diện của chất cảm ứng thích hợp trong môi

trường nuôi cấy sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm, nhờ

đó thúc đẩy hiệu quả sinh tổng hợp enzyme

Trong trường hợp sinh tổng hợp pectin methylesterase cũng như các pectinasekhác, cơ chất cảm ứng tương thích được biết đến là pectin, acid pectic, D-galacturonate và một số nguồn carbohydrate khác (Sajjaanantakul và Pitifer,1991) Tuy nhiên, việc sử dụng cơ chất pectin từ nguồn phụ phẩm nông nghiệpđược ưa chuộng nhất (Patil, 2006) Hàm lượng pectin cao (15  25%) trong các

phụ phẩm nông nghiệp như cám mì (Taragano et al., 1997), bã mía, bã củ cải đường (Solis-Pereyra et al., 1993, 1996), xác đậu cove (Boccas et al., 1994), vỏ chanh (Larios et al., 1989) và bã táo (Hours et al., 1988) được biến đến như nguồn

cơ chất thích hợp cho việc sản xuất pectinase nguồn gốc vi sinh Ngoài ra, độmethoxyl hóa cao (60 ÷ 75% DE) của pectin trong phụ phẩm nông nghiệp chính là

điều kiện thuận lợi cho hoạt động của PME (Jayani et al., 2005) Một ưu điểm

khác của việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp làm cơ chất cho quá trình nuôi cấysinh enzyme PME là sự hiện diện trong nguyên liệu của một số thành phần nitơ,

chất xơ và khoáng cần thiết cho quá trình lên men (Martin et al., 2004; Favelar – Torres et al., 2006).

Đối với từng loại enzyme chuyên biệt, tỉ lệ tối ưu cho hoạt động cảm ứng của cơchất thay đổi khác nhau Tỉ lệ pectin dao động trong khoảng 2% thường được lựa

chọn cho quá trình lên men sinh enzyme pectin esterase (Grebechova et al., 2007).

Tuy nhiên, việc gia tăng nồng độ cơ chất pectin có hiệu quả rất tích cực trong việcđẩy nhanh tốc độ lên men và gia tăng hoạt tính enzyme pectin esterase (Maldonadand Callieri, 2005) Ở cùng một tỉ lệ pectin sử dụng, nguồn gốc nguyên liệu khác

nhau cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính PME thu nhận được (Grebechova et al.,

2007) Chính vì thế, việc khảo sát tỉ lệ pectin thích hợp cho quá trình lên men sinhenzyme cần phải được tiến hành cho từng cơ chất chuyên biệt và điều kiện nuôicấy cụ thể

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu quả sinh tổng hợp PME

Những yếu tố chính có ảnh hưởng đến sự tổng hợp vi sinh vật của enzyme trong hệthống lên men bao gồm: sự chọn lọc của cơ chất thích hợp và chủng vi sinh vật,quá trình tiền xử lý cơ chất, nhiệt độ ủ và thời gian lên men cũng như hàm lượngkhoáng dinh và dưỡng chất bổ sung Đặc biệt, trong quá trình nuôi cấy trong môi

trường rắn, kích cỡ của cơ chất (khoảng trống giữa các hạt và diện tích bề mặt tiếpxúc), hàm lượng nước và aw của cơ chất, độ ẩm của môi trường nuôi cấy, tốc độtiêu thụ oxygen là những yếu tố có chi phối mạnh đến quá trình sinh tổng hợpenzyme nói chung và enzyme PME nói riêng Việc đo lường hoạt tính đã chỉ ra sựkhác biệt giữa các loại PME lấy từ các điều kiện nuôi cấy khác nhau hoặc tronggiai đoạn phát triển khác nhau của PME (Bordenave và Goldberg, 1993).

(i) Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường lên men

Trong quá trình lên bề mặt ở trạng thái rắn, vi sinh vật phát triển và sản sinh ra sảnphẩm tại gần bề mặt cơ chất rắn có hàm lượng ẩm thấp Do đó, cần thiết cung cấpmột lượng nước tối ưu và kiểm tra độ hoạt động của nước (aw) của cơ chất lênmen Sự hiện diện của một lượng ẩm cao hơn hoặc thấp hơn đều ảnh hưởng bất lợicho hoạt động của vi sinh vật Hơn nữa, nước có ảnh hưởng sâu sắc đến các tínhchất hóa lý của chất rắn và do đó ảnh hưởng đến hiệu suất của toàn bộ tiến trình

nuôi cấy (Ashok Pandey et al., 2000).

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58 ÷ 60% vàphải giữ cho độ ẩm của môi trường ổn định trong quá trình nuôi Độ ẩm tăng quá70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hơn 50  55% thì sẽ kiềm hãm sự

sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như tạo enzyme (Ashok Pandey et

al., 2000).

(ii) Ảnh hưởng của pH môi trường lên men

Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, do môi trường có dung dịch đệm cao vàhàm ẩm thấp nên pH môi trường thường ít thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy.Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ đến sự pháttriển của nấm mốc và sự tạo thành enzyme Khi pH môi trường dịch về phía acidhoặc phía kiềm, sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thànhenzyme pectinase bị kiềm hãm pH tối thích của enzyme có nguồn gốc vi sinh vậttrong khoảng 4,5 ÷ 5,5 (Trần Xuân Ngạch, 2007) Mặc dù vậy, tùy thuộc vào đặcđiểm từng enzyme, loại cơ chất và chủng nấm mốc, giá trị pH tối thích cho hoạt

động của Chính vì thế, cần thiết phải xác định điều kiện pH ban đầu của môitrường nuôi cấy đến hiệu quả thu nhận enzyme mong muốn.

(iii) Nhiệt độ và thời gian lên men

Ở mức nhiệt độ nuôi cấy dao động trong khoảng 25 ÷ 40C hầu như không có tácđộng đến sự hình thành sinh khối của hệ enzyme pectinase hay polygalacturones.Nhiều khảo sát cho thấy, nhiệt độ dao động trong khoảng 28 ÷ 30C là giá trị tối

thích cho việc sản sinh pectinesterase (Maldonad và Callieri, 2005; Joshi et al.,

2006) ở điều kiện ôn đới Đồng thời, tốc độ lên men cũng phụ thuộc rất lớn vàođặc điểm môi trường nuôi cấy

Thời gian lên men cũng ảnh hưởng đáng kể đến việc sản sinh enzyme cũng nhưhoạt tính của enzyme Vi sinh vật cần thời gian đủ dài để phát triển và sản sinhenzyme Tuy nhiên, khi thời gian ủ quá dài, môi trường cạn dần chất dinh dưỡng,

vi sinh vật phát triển kém và do đó hoạt tính enzyme sẽ giảm

Thời gian nuôi cấy để thu được lượng enzyme lớn thường được xác định bằng thựcnghiệm Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt

tính enzyme Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo enzyme cực đại thường kết

thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử đính (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Nấm mốc

Aspergillus niger thường được nuôi cấy trong thời gian 48 đến 96 giờ cho quá

trình sinh tổng hợp PME (Schmitz, 2002; Joshi et al., 2006).

(iv) Nguồn dinh dưỡng và khoáng chất bổ sung

Nguồn Nitrogen

Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ trong các quá trình sống

để xây dựng tế bào Tất cả các thành phần quan trọng của tế bào đều có chứa nitơ(protein, acid nucleic, enzyme, …)

Trong tất cả các môi trường nuôi cấy cần thiết phải có các loại hợp chất nitơ mà visinh vật có thể đồng hóa được Việc chọn nguồn nitơ là rất cần để đảm bảo đượchiệu suất cao và có lợi về mặt kinh tế trong sản xuất vi sinh vật Các nguồn nitơdùng trong công nghiệp lên men thường là các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ(Lương Đức Phẩm, 1998)

Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4 Trong đó, urea lànguồn thức ăn nitơ trung tính về mặt sinh lý Khi bị phân giải bởi enzyme urease,urea sẽ giải phóng thành NH3 và CO2 Phần NH3 được vi sinh vật sử dụng màkhông làm chua môi trường như đối với các muối amon :

NH2 - CO - NH2 + H2O → 2NH3 + CO2

Vi sinh vật còn có khả năng đồng hoá rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ.Các thức ăn này sẽ vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn nitơ cung cấp cho vi sinhvật Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton loạichế phẩm thuỷ phân không triệt để của một nguồn protein nào đấy Chúng khácnhau về lượng chứa các loại polipeptit và lượng chứa axit amin tự do

Muối khoáng

Muối khoáng chiếm khoảng 2 ÷ 5% khối lượng khô của tế bào Chúng thường tồntại dưới dạng các muối sunphat, photphat, cacbonat, clorua Trong tế bào chúngthường ở dạng các ion Dạng cation chẳng hạn như Mg2+, Ca2+, K+, Na+, dạnganion chẳng hạn như HPO42−, SO42−, HCO3−, Cl- Các ion trong tế bào vi sinh vậtluôn tồn tại ở những tỷ lệ nhất định nhằm duy trì độ pH và lực thẩm thấu thích hợpcho từng loại vi sinh vật

Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp enzymecủa vi sinh vật Trong vòng đời phát triển của vi sinh vật nhu cầu sử dụng Mg khácao (10,3 ÷ 10,4M) Magie mang tính chất một cofactor, chúng tham gia vào nhiềuphản ứng enzyme có liên quan đến các quá trình phosphoryl hoá (chuyển H3PO4 từmột hợp chất hữu cơ này sang một hợp chất hữu cơ khác) Mg2+ có thể làm hoạthoá các hexokinase, ATP-ase, pirophosphatase, phosphopherase, transacetylase,phosphoglucomutase, cacboxylase, enolase, các men trao đổi protein, các men oxihoá khử của chu trình Krebs (tất cả khoảng trên 80 enzyme khác nhau) Ion Mg2+

còn có vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần riboxom với nhau.Bên cạnh đó, Mg2+ cũng có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme

Lưu huỳnh kích thích tạo enzyme (Lưu huỳnh có trong thành phần các acid aminquan trọng như methionine, cystein) Ngoài ra, calcium, mangan, coban, … cũngảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Calcium mặc dầu là nguyên tố ít tham gia vào việc xây dựng nên các hợp chất hữu

cơ nhưng nó có vai trò đáng kể trong việc xây dựng các cấu trúc tinh vi của tế bào.Calcium đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng của tếbào sống (như giữa ADN và protein trong nhân, giữa các nucleotit với nhau, giữaARN và protein trong riboxom) Calcium rất cần thiết đối với việc hình thành cáccấu trúc không gian ổn định của nhiều bào quan như riboxom, ti thể, nhân

Kali là nguyên tố chiếm một tỷ lệ khá cao trong thành phần khoáng của tế bào visinh vật, nhưng cho đến nay người ta chưa thấy Kali tham gia vào bất kỳ thànhphần nào của nguyên sinh chất, cũng chưa tìm thấy bất kỳ enzyme nào có chứaKali Người ta nhận thấy Kali thường tồn tại trong dạng ion K+ ở mặt ngoài cấutrúc tế bào Kali làm tăng độ ngậm nước của các hệ thống keo do đó ảnh hưởngđến các quá trình trao đổi chất, nhất là các quá trình tổng hợp Kali có thể còntham gia vào quá trình tổng hợp một số vitamin (như thiamin ) và có những ảnhhưởng đáng kể đến quá trình hô hấp của tế bào vi sinh vật

(Lê Xuân Phương, 2009)

Theo nhiều tác giả, các ion K+, Na+, Ca2+ có ảnh hưởng tích cực trong việc gia tănghoạt tính của PME Kretovits (1982) thừa nhận rằng muối Ca2+ và Mg2+ nâng caohoạt độ của enzyme, còn các ion Zn2+, Mn2+ và Cu2+ là nhân tố ức chế hoạt độ củaenzyme PME Tuy nhiên, KCl, HCl, HgCl2, H2O2 không có tác dụng tới hoạt độPME trong cam trong khi acid ascorbic, NaHSO3 với nồng độ thấp có khả năngnâng cao hoạt độ của enzyme này Nghiên cứu của Hossam (2005) đã đưa ra kếtluận EDTA, PbCl2, HgCl2 và IAA là nhân tố ức chế khả năng lên men của

Aspergillus repens, làm giảm hoạt tính PME

3.3 Các kết quả nghiên cứu có liên quan

PME đã được phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991;Solís-Pereira, 1993), đặc biệt là A.niger đã được khảo sát khá chi tiết với cả hai

phương thức lên men nổi và lên men chìm (Joshi et al., 2006) trên nhiều loại cơ chất khác nhau (Schmitz, 2002; Joshi et al., 2006) Nhìn chung, đặc điểm thành

phần cơ chất giàu pectin – cơ chất cảm ứng cho hoạt động của PME và điều kiệnmôi trường, tác động của thành phần khoáng bổ sung, đặc biệt là tính cân bằng củamôi trường dinh dưỡng về cacbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợpsinh khối của vi sinh vật và sự tạo thành enzyme Nitơ tham gia vào quá trình tạoprotein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật.Môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết sẽ tích lũy lượng enzyme lớnnhất Sự thiếu hụt cấu tử này không được bù đắp bằng sự dư thừa của cấu tử kia

Theo nghiên cứu của Joshi et al., (2006) về việc sinh pectin methylesterase (PME)

từ Aspergillus niger trên cơ chất bã táo đã cho thấy, nhiệt độ ủ 25oC, điều kiện pHphản ứng 4,0 và thời gian ủ là 96 giờ là điều kiện tối ưu cho việc lên men sinhPME ở cả môi trường rắn (SSF) và môi trường lỏng (SmF) Ngoài ra, vai trò củacác nguồn nitơ bổ sung như (NH4)2SO4, thành phần khoáng cũng như tỷ lệ phaloãng của cơ chất : nước nhằm tạo độ ẩm cho quá trình lên men sinh PME thích

hợp cũng được xác định (Joshi et al., 2006).

Theo Trần Xuân Ngạch (2007), PME nấm mốc có nhiệt độ hoạt động tối thíchtrong khoảng từ 30 – 45oC và bị vô hoạt ở 55  62oC và được hoạt hóa bởi Ca2+ và

Mg2+ Phương pháp trích ly PME cũng được nghiên cứu (Contreras – Esquivel,1999), kết quả cho thấy dung dịch NaCl 0,5% và 0,1% được sử dụng trích ly PME

từ vỏ quả chanh (Mexico lime) và vỏ quả lê (prickly pear) cho hiệu quả trích lycao nhất

Sarvamangala et al (2006) đã nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger với cơ chất là

hạt của hoa hướng dương và kết quả cho thấy rằng, với 4% glucose bổ sung trongquá trình lên men ở trạng thái rắn, 6% succrose quá trình lên men chìm và 0,3%amonium sulphate cho cả 2 quá trình lên men thì kết quả cho thấy hoạt tính củapectinase thu được trên môi trường rắn cao hơn gần gấp 2 lần so với pectinase thuđược trên môi trường lỏng (45,9 U/g và 18,9 U/g)

Vỏ cam cũng được sử dụng làm cơ chất cho quá trình lên men sản xuất pectin

nhiệt độ đạt 50oC và pH = 7,5 với sự có mặt của các chất khoáng như Ca2+, Mg2+,

Na+ và K+) (Hossam, 2005) Kết quả thu được pectin lyase với hoạt tính là 297U/mL Đồng thời, nghiên cứu này cũng cho thấy ion Zn2+, Co2+, Mn2+, Hg2+ là nhân

tố ức chế khả năng sinh pectin lyase của Rhizopus oryzea.

Thêm vào đó, việc sử dụng kết hợp các nguồn phụ phẩm nông nghiệp đã chứng tỏhiệu quả trong việc sinh tổng hợp enzyme Díaz (2004) khi nghiên cứu sản xuất

các loại enzyme thủy phân từ A.awamori sử dụng cơ chất lên men là hỗn hợp tỉ lệ

1:1 (w/v) của bã nho và vỏ cam cho hiệu quả vượt trội

Tóm lại, quá trình lên men sinh enzyme PME phụ thuộc rất nhiều yếu tố khácnhau, vì vậy cần phải được khảo sát một cách cẩn thận cho từng chủng nấm mốc

sử dụng, từng loại cơ chất cũng như các điều kiện của môi trường lên men

Ở Việt Nam, nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến hiệu quả sinhtổng hợp enzyme cũng được tiến hành trên một số enzyme khác cùng nhóm (Pham

et al., 2007; Ngo et al., 2008; Huỳnh Ngọc Oanh và Trần Ngọc Hùng, 2008), tuy

nhiên chưa được thực hiện đối với đối tượng là enzyme PME Mặc dù vậy, đâycũng chính là thông tin hữu ích cho việc nghiên cứu bổ sung các thành phần vichất dinh dưỡng, tạo điều kiện môi trường lên men tối ưu cho quá trình sinh tổng

hợp PME từ Aspergillus niger.

Dựa trên các nghiên cứu có liên quan đã được khảo sát và điều kiện thực tế, việcđánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung các thành phần khoáng chất, nguồn nitrogenvà vỏ bưởi khô (dạng bột) vào môi trường lên men đến hiệu quả sinh enzyme

pectin methylesterase khi lên men bề mặt Aspergillus niger trên môi trường rắn, sử dụng hai phụ phẩm nông nghiệp (bã táo và vỏ cam sành) được tiến hành.

CHƯƠNG 4 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU4.1 Phương tiện nghiên cứu

Địa điểm, thời gian

Địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệThực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.Thời gian: từ tháng 04/2010 đến tháng 12/2010

Đối tượng nghiên cứu

Nấm sợi Aspergillus niger đã được phân lập từ cam soàn (So2) và tuyển chọn phù hợp cho quá trình nuôi cấy sinh pectin methylesterase (Tran et al., 2010)

Môi trường lên men sinh PME: bã táo ta (Ziziphus nummularia) và vỏ cam sành (Citrus nobilis var typica Hassk)

Thiết bị, hoá chất

(i) Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp (Rotana 46 R, Đức)

Máy đo pH (HANA pH 212, Trung Quốc)

Máy khuấy từ

Tủ ủ Sanyo

Tủ cấy

Máy ép trái cây

Tủ sấy mẫu

Thiết bị gia nhiệt, thanh trùng

Ống nghiệm có nắp, đũa và que cấy, đĩa petri, bình tam giác 250 mL

Một số dụng cụ và thiết bị khác

 Acid citric (Merck)

 Pectin táo DE = 75% (Sigma)

Môi trường nuôi cấy

Cơ chất

Bã táo: bã táo ta (Ziziphus nummularia) được tách loại nước bằng cơ học và được

sấy ở nhiệt độ (60  1)C đến khi độ ẩm còn (4  1)% Bã táo khô được nghiền

thành bột và đóng trong các bao PE nhỏ (Joshi et al., 2006) hay để trong keo thủy

tinh cách ẩm

Vỏ cam sành: lấy phần vỏ trắng bên trong, rửa sạch, cắt nhỏ khoảng 1mm (chú ýluôn duy trì độ ẩm vỏ cam 75%)

Vỏ bưởi giống Năm roi (tên khoa học Citrus maxima) cũng được xử lý loại phần

vỏ xanh, sau khi cắt nhỏ sẽ mang đi sấy ở nhiệt độ khoảng 60C đến độ ẩm bằngvới độ ẩm bã táo

Chủng vi sinh vật

Nấm mốc A.niger So2 được chọn lựa ra từ nhiều chủng khác nhau, đã phân lập và

được nuôi cấy trên môi trường rắn, chọn chủng sinh PME có hoạt tính cao nhất

(Tran et al., 2010) Cho 5 mL dung dịch NaCl 0,025 M vào ống nghiệm A.niger đã được nuôi cấy sau 4 ngày để thu nhận dung dịch có chứa bào tử nấm A.niger Đo

độ truyền quang %T của Aspergillus niger ở bước sóng 530 nm để xác định mật số

trước khi pha loãng với nước cất đến mật số mong muốn (105 bào tử/mL) Lấy

2 mL huyền phù nấm mốc cho vào các bình tam giác có sẵn cơ chất

4.2 Phương pháp thí nghiệm

Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

Các chỉ tiêu cơ bản được phân tích và đo đạc theo phương pháp được tổng hợp ởbảng 2

Bảng 2 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu trong nghiên cứu

Chỉ tiêu Phương pháp

Hoạt tính của PME (U/mL) Phương pháp chuẩn độ điện thế acid – baz ở pH 4,5 và

nhiệt độ 300C ±1 (Crelier et al., 1995, trích dẫn bởi

Duvetter, 2007)

pH - Điều chỉnh pH môi trường lên men bằng dung dịch đệm

citrate phosphate ở các pH khác nhau

- Đo đạc pH bằng cách sử dụng pH kế theo tiêu chuẩn ISO 2917:1999(E)

Độ ẩm Sấy ở 105C đến nhiệt độ không đổi

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành theo phương pháp lên men bề mặt trênmôi trường rắn Sơ đồ thí nghiệm tổng quát cho toàn bộ khảo sát được trình bày ởhình 2 Một số thông số cơ bản của quá trình lên men được sử dụng dựa trên các

(5 g/bình lên men 250 mL, với tỉ lệ 3,5 g táo và 1,5 g vỏ cam), mật số nấm mốc

được cho vào môi trường lên men (2 mL huyền phù A.niger So2, 105 bào tử/mL),được nuôi cấy 96 giờ ở nhiệt độ 37C trong môi trường 60% ẩm (pH của môitrường là 3,5) và tỉ lệ dung dịch đệm sử dụng để trích ly PME (20 mL dung dịchđệm citrate - phosphate pH 4,5 trên 5 g cơ chất)

Hình 2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

(Nguồn: Trần Thanh Trúc, 2010)

(i) Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung riêng

lẻ đến khả năng sinh PME từ A.niger So2

Loại, tỉ lệ khoáng bổ sung (TN1)

Bổ sung khoáng kết hợp (TN2) Nguồn nitrogen bổ sung (TN3)

Tỉ lệ carbohydrate bổ sung(vỏ bưởi khô)

(TN4)

Môi trường nuôi cấy

Mục đích: Tìm ra loại khoáng và tỉ lệ bổ sung khoáng thích hợp cho quá trình sinh

tổng hợp PME từ A.niger đạt kết quả cao nhất.

Số nghiệm thức thí nghiệm:

5 x 4 + 1 mẫu đối chứng (không bổ sung khoáng) = 21 nghiệm thức

Số mẫu thí nghiệm = 21 x 3 = 63 mẫu thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm:

Cân 5 g hỗn hợp bã táo và vỏ cam với tỉ lê bã táo : vỏ cam là 70 : 30 cho vào bìnhtam giác 250 mL Tiến hành bổ sung riêng lẻ các khoáng NaCl, KCl, ZnCl2, CaCl2

và MgCl2 ứng với các nồng độ khảo sát vào các bình cơ chất trên Cơ chất sau đóđược làm ẩm đến độ ẩm khoảng 60% bằng dung dịch đệm citrate – phosphate pH3,5 Thanh trùng các bình tam giác chứa cơ chất ở 121C trong 15 phút Làm mátcác bình sau khi thanh trùng, cho 2 mL huyền phù bào tử nấm mốc vào mỗi bìnhcấy (105 bào tử/mL) và ủ trong tử ủ có nhiệt độ 37C trong thời gian 96 giờ

Sau khi ủ, trích lấy dịch chứa enzyme PME thô bằng dung dịch đệmcitrate/phosphate pH 4,5 (khuấy gián đoạn trong 1 giờ) (Joshi, 2006)

Xác định hoạt tính của PME tương ứng với từng nghiệm thức khảo sát

Kết quả thu nhận

Hoạt tính của PME (U/ mL) trong dịch trích tương ứng với từng nghiệm thức thínghiệm

Chọn lựa 3 loại khoáng (dự kiến) và tỷ lệ bổ sung cho hoạt tính của PME caođược chọn làm điều kiện cố định để tiến hành các thí nghiệm khảo sát sau đó

(ii) Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung kết

hợp đến khả năng sinh PME từ A.niger So2

Mục đích: Xác định thành phần khoáng bổ sung kết hợp thích hợp cho sự sinh tổng

hợp PME từ A.niger là tốt nhất.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại.Nhân tố F: Thành phần khoáng bổ sung kết hợp trong môi trường lên men sinhtổng hợp PME

F1: Đối chứng

F2: Khoáng 1 – Khoáng 2

F3: Khoáng 1 – Khoáng 3

F4: Khoáng 2 – Khoáng 3

F5: Khoáng 1 – Khoáng 2 – Khoáng 3

Số nghiệm thức thí nghiệm: 5 nghiệm thức

Tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành tương tự như thí nghiệm 1 Thành phần và tỉ lệ khoángkết hợp sử dụng cho thí nghiệm này dựa trên kết quả tối ưu của thí nghiệm 1 Saukhi cơ chất lên men được điều chỉnh ẩm và pH sẽ được thanh trùng, làm nguội và

cấy 2 mL huyền phù bảo tử A.niger.Thời gian nuôi cấy được cố định ở 96 giờ ứng

với nhiệt độ ủ là 37C

Kết quả thu nhận

Hoạt tính của PME (U/mL) tương ứng với từng nghiệm thức thí nghiệm

Thành phần và tỷ lệ khoáng bổ sung kết hợp cho hoạt tính của PME cao nhất

(iii) Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung nguồn nitrogen khác

nhau đến khả năng sinh PME từ A.niger So2

Mục đích: Xác định thành phần dinh dưỡng từ Nitrogen bổ sung thích hợp nhất

cho sự tổng hợp PME của A.niger

Số nghiệm thức thí nghiệm = 4 x 4 + 1 nghiệm thức đối chứng = 17 nghiệm thức

Số mẫu thí nghiệm = 17 x 3 = 51 mẫu thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được chuẩn bị tương tự như thí nghiệm 1 Thành phần và tỉ lệ bổ sungkhoáng vào cơ chất lên men dựa trên kết quả tối ưu đã khảo sát từ thí nghiệm 2.Bên cạnh đó, 4 nguồn nitrogen khác nhau sẽ được bổ sung vào cơ chất ứng với cáctỉ lệ khảo sát Sau khi cấy nấm mốc, mẫu khảo sát được tiến hành lên men ở tủ ủ