Nghiên cứu điều chế cao định chuẩn từ lá cây lá đắng (vernonia amygdalina del asteraceae)

Đã xây dựng được tiêu chuẩn nguyên liệu lá cây Lá đắng theo quy định chung của DĐVN, định tính và định lượng dựa vào chất chỉ điểm cynarosid và luteolin.. Một số nghiên cứu chiết xuất, p

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN HÙNG ANH

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐỊNH CHUẨN

TỪ LÁ CÂY LÁ ĐẮNG

(Vernonia amygdalina Del Asteraceae)

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Thành phố Hồ Chí Minh – 2018

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN HÙNG ANH

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐỊNH CHUẨN

TỪ LÁ CÂY LÁ ĐẮNG

(Vernonia amygdalina Del Asteraceae)

Ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quảnêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trìnhnào khác

Người viết lời cam đoan

Nguyễn Hùng Anh

TÓM TẮT

Luận văn Thạc sĩ Dược học Khóa 2016 – 2018

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐỊNH CHUẨN TỪ

LÁ CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del Asteraceae)

Nguyễn Hùng Anh Thầy hướng dẫn: PGS.TS Trần Anh Vũ, PGS.TS Huỳnh Ngọc Thụy

Mở đầu

Những năm gần đây, Lá đắng được người dân sử dụng nhiều để hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường

và cho kết quả khả quan Có nhiều công trình khoa học nghiên cứu chứng minh Lá đắng có tác dụng

hạ glucose huyết Tuy nhiên ở Việt Nam vẫn chưa có chế phẩm thuốc từ dược liệu này Xuất phát từ

thực tế nói trên, đề tài “Nghiên cứu điều chế cao định chuẩn từ lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina

Del Asteraceae)” được thực hiện với mục tiêu điều chế và xây dựng tiêu chuẩn cao toàn phần từ lá cây Lá đắng, làm nguồn nguyên liệu để sản xuất ra các dược phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng: Lá cây Lá đắng thu hái tại tỉnh Tây Ninh, Đắk Lắk và An Giang vào tháng 03/2017 Phương pháp nghiên cứu:

Bột Lá đắng được chiết ngấm kiệt với ethanol 96% thu được cao toàn phần Từ cao toàn phần tiến hành phân lập cynarosid bằng kỹ thuật lắc phân bố, kết tinh phân đoạn, tinh chế bằng HPLC điều chế; sử dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng chất cynarosid Xây dựng quy trình định lượng đồng thời cynarosid và luteolin trong nguyên liệu và cao bằng HPLC Kiểm tra và xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu theo quy định chung của DĐVN.

Khảo sát tối ưu hóa quy trình điều chế cao Lá đắng có hàm lượng hoạt chất và khả năng ức chế glucosidase cao và kinh tế Xây tiêu chuẩn cao đặc Lá đắng theo quy định chung của DĐVN và một

ɑ-số chỉ tiêu an toàn về giới hạn kim loại nặng và giới hạn nhiễm khuẩn.

Nâng cỡ lô chiết cao Lá đắng 3 lô (25 kg dược liệu/ lô) Kiểm tra một số chỉ tiêu chất lượng để đánh giá tính ổn định quy trình.

Kết quả

Từ 10 kg Lá đắng chiết được 1,2 kg cao ethanol toàn phần Tiếp tục tiến hành phân lập và tinh chế thu được 85 mg cynarosid Xây dựng và thẩm quy trình định lượng cynarosid bằng HPLC để đánh giá chuẩn làm việc (hàm lượng đạt 96,17%).

Đã xây dựng và thẩm định được qui trình định lượng đồng thời cynarosid và luteolin trong nguyên liệu và cao bằng HPLC.

Đã xây dựng được tiêu chuẩn nguyên liệu lá cây Lá đắng theo quy định chung của DĐVN, định tính

và định lượng dựa vào chất chỉ điểm cynarosid và luteolin.

Đã tìm được điều kiện để điều chế cao đặc Lá đắng có hàm lượng hoạt chất và khả năng ức chế glucosidase cao và kinh tế Cao được điều chế bằng phương pháp chiết xuất ngấm kiệt với dung môi ethanol 70%, tỉ lệ dịch chiết: dược liệu là 6,5:1 và làm khô dịch chiết bằng tủ sấy ở nhiệt độ 55 o C đến khi cao đạt độ ẩm 12-15%.

ɑ-Đã xây dựng phương pháp điều chế 3 lô cao Lá đắng quy mô pilot (mỗi lô là 25 kg dược liệu) ɑ-Đã đánh giá 3 lô cao về các chỉ tiêu như cảm quan, mất khối lượng do làm khô, định tính và định lượng

và các chỉ tiêu đều đạt.

Đã xây dựng được một số chỉ tiêu để đánh giá chất lượng cho cao đặc Lá đắng về cảm quan, mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính và định lượng.

Kết luận: Qua quá trình thực hiện, đề tài đã đạt được các nội dung đặt ra Sản phẩm cao Lá đắng của

đề tài sau khi thử tác dụng dược lý sẽ được sử dụng làm nguyên liệu để bào chế một số dạng thuốc theo hướng hạ glucose huyết.

THE ABSTRACT

Master’s thesis of Pharmacy Academic course 2016-2018

STUDY ON PREPARATION OF STANDARDIZED CONCENTRATED EXTRACT FROM

Vernonia amygdalina Del Asteraceae

Nguyen Hung Anh Supervisor: Associate Professor Tran Anh Vu – Associate Professor Huynh Ngoc Thuy

Introduction

Recently, Vernonia amygdalina is a medical herb that is widely used in the supplementary treatment for patients with diabetes mellitus Some scientific studies show that Vernonia amygdalina has blood glucoselowering effect However, in Viet Nam, the number of products originated from Vernonia amygdalina

are still limited As the matter of fact, the topic of “Study on preparation of standardized concentrated extract

from Vernonia amygdalina Del Asteraceae” was conducted to prepare and establish standards for concentrated extract from the leaves of Vernonia amygdalina This concentrated extract could be used as material for

production medication that potentially supports the diabetes mellitus therapy.

Subject and Method

Subject: Dried leaf of Vernonia amygdalina bulb were harvested from Tay Ninh, An Giang and Dak Lak

province in 03/2017.

Method:

Vernonia amygdalina dried leaf powder was extracted with ethanol 96% using percolation method to make the

total concentrated extract Cynarosid was isolated from this concentrated extract using the distribution of liquid-liquid extraction technique, recrystallization of crystals in suitable solvents and preparative HPLC HPLC method was used to determine the quantification of cynarosid HPLC method was also used to establish the simultaneous quantification process of cynarosid and luteolin in dry material and extract The standards of the material were tested and established based on the Vietnamese Pharmacopoeia.

Optimization the preparation process of Vernonia amygdalina extract which economically yielded high content

of active ingredient and the inhibition of α-glucosidase

Determination of in-house standards of the Vernonia amygdalina concentrated extract was based on the

Vietnamese Pharmacopoeia in relation to the heavy metals and bacteria limit.

Scaling up three batches of Vernonia amygdalina concentrated extract (25 kg of material/batch) Testing some

specifications to evaluate the stability of process.

Result

From 10 kg of dry herba Vernonia amygdalina, 1.2 kg of ethanol concentrated extract was extracted This

extract was isolated and refined to obtain 85 mg of cynarosid This study successfully:

Established and validated quantification process of cynarosid using HPLC method (the content is 96.17%) Established and validated the simultaneous quantification process of cynarosid and luteolin in dry material and

extract using HPLC method The standards of the Vernonia amygdalina material was established based on the

Vietnamese Pharmacopoeia Identification and quantification of active ingredient were conducted based on the makers that were cynarosid and luteolin.

Identified the optimal condition of preparation process of Vernonia amygdalina extract which economically

yielded high content of active ingredient and the inhibition of α-glucosidase.

The preparation method was percolation extraction with 70% ethanol, the ratio liquid extract: dry herb was 6,5:1, the liquid extract was dried by universal oven at 55 o C until the moisture was about 12-15%.

The preparation method of the three pilot batches of Vernonia amygdalina concentrated extract (25 kg of

material/batch) was also established The three pilot batches were tested appearance, moisture, qualitative, quantitative and met the specification standards.

This study also established specifications of Vernonia amygdalina concentrated extract such as appearance,

moisture, total ash, heavy metals limit, bacteria limit, qualitative and quantitative.

Conclusion

This research successfully achieved objectives The Vernonia amygdalina concentrated extract after

pharmacological study will be used as material for preparation of some blood glucose-reducing medications.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG VIỆT ii

BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG ANH iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 DƯỢC LIỆU LÁ ĐẮNG 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.1.3 Thành phần hóa học cây Lá đắng 5

1.1.4 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý 7

1.2 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ ĐIỀU CHẾ CAO THUỐC 9

1.2.1 Một số phương pháp chung về chiết xuất dược liệu 9

1.2.2 Một số nghiên cứu chiết xuất, phân lập hợp chất cynarosid và một số chất trong dược liệu Lá đắng 9

1.2.3 Cao thuốc 10

1.3 PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC TÁC DỤNG SINH HỌC 11

1.3.1 Khảo sát tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase in vitro 11

1.3.2 Qui trình tiến hành phản ứng 13

1.3.3 Một số nghiên cứu về khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro 13

1.4 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU VÀ CAO THUỐC 14

1.4.1 Nội dung và cách thức xây dựng một tiêu chuẩn dược liệu 14

1.4.2 Nội dung tiêu chuẩn cơ sở cho cao thuốc 15

1.4.3 Một số nghiên cứu về xây dựng quy trình định lượng cynarosid trong một số loại dược liệu và cao thuốc 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, DUNG MÔI HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Dung môi, hóa chất và thiết bị 18

2.1.3 Nơi tiến hành 20

2.1.4 Xử lý số liệu 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu lá cây Lá đắng 21

2.2.2 Phương pháp điều chế cao lá cây Lá đắng 33

2.2.3 Nâng cấp cỡ lô cao lá cây Lá đắng 38

2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao lá cây Lá đắng 39

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42

3.1 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN NGUYÊN LIỆU LÁ CÂY LÁ ĐẮNG 42

3.1.1 Điều chế và đánh giá chuẩn làm việc cynarosid 42

3.1.2 Kiểm tra nguyên liệu Lá đắng 56

3.1.3 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu 76

3.2 PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ CAO LÁ ĐẮNG 77

3.2.1 Khảo sát điều kiện chiết xuất 77

3.2.2 Khảo sát điều kiện phù hợp điều chế dịch chiết lá cây Lá đắng 79

3.2.3 Điều chế dịch chiết 81

3.2.4 Khảo sát điều kiện điều chế cao đặc từ dịch chiết 81

3.3 NÂNG CẤP CỠ LÔ CAO LÁ CÂY LÁ ĐẮNG 82

3.3.1 Khảo sát một số thông số kỹ thuật 82

3.3.2 Tiến hành chiết xuất và điều chế cao đặc 82

3.4 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO LÁ CÂY LÁ ĐẮNG 85

3.4.1 Kiểm tra chất lượng cao lá cây Lá đắng 85

3.4.2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao lá cây Lá đắng 87

Chương 4 BÀN LUẬN 89

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

thí nghiệm

HPLC High-performance liquid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Chương trình pha động methanol và nước acid phosphoric 0,2% 16

Bảng 1.2 Chương trình pha động acetoniltril và nước acid acetic 0,4% 17

Bảng 1.3 Chương trình pha động acetonitril và nước acid formic 0,1% 17

Bảng 2.1 Danh sách các hóa chất 18

Bảng 2.2 Chất chuẩn và sản phẩm đối chiếu 19

Bảng 2.3 Danh sách các thiết bị 19

Bảng 2.4 Kế hoạch thử nghiệm 35

Bảng 2.5 Thành phần các chất trong các mẫu thử nghiệm trên đĩa 96 giếng 37

Bảng 3.1 Bảng so sánh phổ 13C-NMR và 1H-NMR của CYNA1 và cynarosid 49

Bảng 3.2 Kết quả thăm dò tỷ lệ pha động acetonitril - nước acid phosphoric 0,1% 50

Bảng 3.3 Kết quả thăm dò tốc độ dòng 51

Bảng 3.4 Kết quả thăm dò nhiệt độ cột 51

Bảng 3.5 Kết quả xác định tính tương thích hệ thống 52

Bảng 3.6 Số liệu đường tuyến tính của quy trình định lượng cynarosid 54

Bảng 3.7 Kết quả xác định độ lặp lại của mẫu thử 55

Bảng 3.8 Kết quả xác định độ đúng 55

Bảng 3.9 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 63

Bảng 3.10 Kết quả xác định độ ẩm 64

Bảng 3.11 Kết quả xác định độ tro của nguyên liệu 64

Bảng 3.12 Kết quả định tính flavonoid trong nguyên liệu 65

Bảng 3.13 Chương trình pha động 66

Bảng 3.14 Kết quả các thông số sắc ký của mẫu thử 67

Bảng 3.15 Chương trình pha động 67

Bảng 3.16 Diện tích đỉnh cynarosid và luteolin khi chiết bằng ethanol 70%, methanol 70% 68

Bảng 3.17 Diện tích đỉnh của cynarosid và luteolin trong Lá đắng qua 3 lần chiết 68

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn (n=6) 69

Bảng 3.19 Số liệu đường tuyến tính của quy trình định lượng cynarosid và luteolin 71

Bảng 3.20 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 72

Bảng 3.21 Kết quả xác định độ lặp lại của mẫu dược liệu 73

Bảng 3.22 Kết quả xác định độ lặp lại của mẫu cao 73

Bảng 3.23 Kết quả xác định độ đúng mẫu dược liệu 74

Bảng 3.24 Kết quả xác định độ đúng mẫu cao 74

Bảng 3.25 Kết quả định lượng cynarosid và luteolin trong nguyên liệu 75

Bảng 3.26 Tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu lá cây Lá đắng 76

Bảng 3.27 Kết quả khảo sát hàm lượng hoạt chất theo phương pháp chiết xuất 77

Bảng 3.28 Kết quả khảo sát hàm lượng hoạt chất theo nồng độ dung môi chiết 77

Bảng 3.29 Kết quả khảo sát hàm lượng cynarosid và luteolin theo kích thước dược liệu 78

Bảng 3.30 Kết quả khảo sát hàm lượng cynarosid và luteolin theo tỷ lệ dịch chiết: dược liệu 78

Bảng 3.31 Các yếu tố khảo sát và khoảng thay đổi 79

Bảng 3.32 Ma trận bố trí thử nghiệm và kết quả 79

Bảng 3.33 Các thí nghiệm ở mức cơ bản 80

Bảng 3.34 Kết quả tối ưu theo phương pháp Box-Wilson 80

Bảng 3.35 Kết quả thăm dò nhiệt độ làm khô bằng tủ sấy 81

Bảng 3.36 Kết quả thăm dò lượng dung môi làm ẩm 82

Bảng 3.37 Kết quả thăm dò thời gian làm ẩm 82

Bảng 3.38 Kết quả đánh giá 3 lô cao lá cây Lá đắng qui mô pilot 84

Bảng 3.39 Kết quả mất khối lượng do làm khô của cao 85

Bảng 3.40 Kết quả tro toàn phần của cao 85

Bảng 3.41 Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học 85

Bảng 3.42 Kết quả định lượng cao đặc Lá cây Lá đắng 87

Bảng 3.43 Tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc lá cây Lá đắng 87

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Các bộ phận của V amygdalina [62] 4

Hình 1.2 Đặc điểm hình thái V amygdalina 4

Hình 1.3 Công thức flavonoid thường gặp trong cây Lá đắng 5

Hình 1.4 Công thức một số sesquiterpen lacton trong cây Lá đắng 6

Hình 1.5 Công thức một số glucosid steroid trong cây Lá đắng 7

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất và tách phân đoạn 43

Hình 3.2 Sắc ký đồ điều chế CYNA1 44

Hình 3.3 Hình sắc ký lớp mỏng kiểm tra tinh khiết của CYNA1 45

Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính bằng HPLC hợp chất CYNA1 phân lập 46

Hình 3.5 Cấu tạo phần aglycon của CYNA1 48

Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của CYNA1 50

Hình 3.7 Sắc ký đồ tính đặc hiệu 53

Hình 3.8 Đường biểu diễn mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh của cynarosid 54

Hình 3.9 Đặc điểm hình thái cây Lá đắng 57

Hình 3.10 Vi phẫu thân cây Lá đắng 58

Hình 3.11 Vi phẫu cuống lá cây Lá đắng 59

Hình 3.12 Vi phẫu gân giữa lá cây Lá đắng 60

Hình 3.13 Vi phẫu phiến lá cây Lá đắng 61

Hình 3.14 Hình cấu tử soi bột lá cây Lá đắng 62

Hình 3.15 Kết quả định tính nguyên liệu bằng SKLM 65

Hình 3.16 SKĐ mẫu thử 66

Hình 3.17 SKĐ thăm dò dung môi chiết 68

Hình 3.18 Sắc ký đồ tính đặc hiệu 70

Hình 3.19 Đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa nồng độ và diện tích pic của cynarosid và luteolin 71

Hình 3.20 Kết quả định tính cynarosid và luteolin trong 3 lô cao bằng phương pháp SKLM 84

Hình 3.21 Kết quả định tính cynarosid và luteolin trong cao bằng phương pháp SKLM 86

Hình 3.22 SKĐ định tính cao lá cây Lá đắng 86

MỞ ĐẦU

Theo số liệu ước tính của Liên đoàn Đái tháo đường thế giới (IDF), tính đến năm

2015 trên toàn thế giới có khoảng 415 triệu người mắc bệnh đái tháo đường(ĐTĐ), con số này dự kiến sẽ tăng lên 642 triệu người vào năm 2040 Hiện nay,

cứ 11 người trưởng thành sẽ có một người bị đái tháo đường, và cứ mỗi 6 giây,trên thế giới sẽ có một người tử vong do căn bệnh này Tại Việt Nam, năm 2015,

tỷ lệ bệnh nhân đái tháo đường chiếm khoảng 5,6% dân số, và tới năm 2025 tỷ lệnày sẽ tăng lên gần gấp đôi [42]

Trong những năm gần đây, người dân có xu hướng sử dụng các thuốc dược liệu

để hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường Điều này đã góp phần trong việc giảm liềucác thuốc tân dược và phòng ngừa biến chứng của bệnh Trong số đó, cây Lá đắng

với tên khoa học là Vemonia amygdalina Del., thuộc họ Cúc (Asteraceae) hiện

nay được người dân và các thầy thuốc chú ý và sử dụng trong việc hỗ trợ điều trịbệnh đái tháo đường [21] Cây Lá đắng có nguồn gốc từ châu Phi được di thựcvào Việt Nam và trồng khá phổ biến ở nước ta [23] Có nhiều doanh nghiệp trongnước đã đầu tư trồng cây Lá đắng với số lượng lớn để cung cấp cho thị trường nhưCông ty Thảo dược Đức Thịnh, Công ty TNHH Tấn Phát HCM, Công ty BúpXanh,… Trên thị trường nước ngoài, viên "Diabetes 5" (Nigeria) chứa tỷ lệ 1:1

hỗn hợp lá V amygdalina và lá Anisopus manil được sử dụng để điều trị đái tháo

đường [32] Ở Việt Nam, người dân sử dụng Lá đắng như một loại trà uống hàngngày để chữa nhiều bệnh như cao huyết áp, đái tháo đường, rối loạn lipid máu Tuynhiên, thực tế ở Việt Nam chưa có chế phẩm thuốc được bào chế từ lá cây Lá đắng.Muốn có chế phẩm thuốc có chất lượng từ cây Lá đắng, thì cần có chế phẩm trunggian có hàm lượng hoạt chất cao, có tác dụng dược lý tốt nhưng không gây độctính ở liều điều trị

Xuất phát từ thực tế nói trên, trong khuôn khổ luận văn cao học, đề tài “Nghiên

cứu điều chế cao định chuẩn từ lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.

Asteraceae)” được thực hiện với mục tiêu điều chế và xây dựng tiêu chuẩn cho

cao toàn phần từ lá cây Lá đắng, làm nguồn nguyên liệu để sản xuất ra các dượcphẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường

Để thực hiện mục tiêu trên, cần thực hiện các nội dung sau:

- Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu lá cây Lá đắng

- Phương pháp điều chế cao lá cây Lá đắng

- Nâng cấp cỡ lô cao lá cây Lá đắng

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao lá cây Lá đắng

Chương 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 DƯỢC LIỆU LÁ ĐẮNG

1.1.1 Giới thiệu chung

Trong hệ thống phân loại thực vật, cây Lá đắng được xếp vào lớp 2 lá mầm(Dicotyledonee), phân lớp Cúc (Asteridae), bộ Cúc (Asterales), họ Cúc

(Asteraceae), chi Vernonia [70].

Lá đắng có tên khoa học Vernonia amygdalina Del.

Đồng danh: Gymnanthemum amygdalinum Del.

Tên tiếng Anh: Bitter leaf

Tên Việt Nam: Cây Lá đắng

Tên Việt Nam khác: Cây Mật gấu miền Nam

Vernonia amygdalina phân bố chủ yếu ở các vùng Tây Phi, Nam Phi, Ấn Độ,

Congo, Cây Lá đắng có nguồn gốc từ châu Phi được di thực vào Việt Nam vàtrồng khá phổ biến ở nước ta [23] Cây được trồng nhiều tại các tỉnh như Đắk Lắk,Gia Lai, Lâm Đồng, Tây Ninh, Đà Nẵng, An Giang,…

Vernonia amygdalina được trồng bằng cách giâm cành, nước là yếu tố quan trọng

để lá phát triển và cho năng suất cao vào mùa mưa

Bộ phận thường dùng làm thuốc là lá và rễ Lá sau khi thu hoạch thường được sấykhô ở nhiệt độ dưới 45 °C

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây bụi cao 1,5-10 m, vỏ màu xám hoặc nâu Lá hình mũi mác thuôn dài khoảng

3-17 cm, rộng khoảng 1-4 cm, hai mặt lá nhẵn Cuống lá màu xanh, dài 1-4 cm Hoanhỏ, màu trắng kem, cánh dài khoảng 10 mm Quả bế màu nâu, hình trụ dài khoảng

2 mm, mặt ngoài có nhiều lông ngắn, đỉnh quả có mào lông của đài tồn tại [23], [33]

Hình 1.1 Các bộ phận của V amygdalina [62]

(1): Lá; (2): Cành hoa, (3): Cụm hoa; (4): Quả.

Hình 1.2 Đặc điểm hình thái V amygdalina

(l): Thân bụi; (2), (3): Cụm hoa; (4): Lá.

1.1.3 Thành phần hóa học cây Lá đắng

Thành phần hóa học chủ yếu của cây Lá đắng là các flavonoid, saponin, terpenoid,steroid và một số hợp chất khác như alkaloid, coumarin, acid phenolic, ligan,xanthon, anthraquinon, edotid [51]

1.1.3.1 Flavonoid

Năm 1994, Godwin O.Igile cùng cộng sự [40] đã nghiên cứu xác định được 3flavonoid là luteolin, luteolin 7-O-β- glucuronosid và cynarosid trong cây Lá đắng.Năm 2016, Nguyễn An Kim Thịnh và cộng sự [11] đã phân lập được vitexin từcao cồn lá cây Lá đắng

Luteolin 7-O-β-glucuronosid Cynarosid

Hình 1.3 Công thức flavonoid thường gặp trong cây Lá đắng

1.1.3.2 Sesquiterpen lacton

Năm 1969, Kupchan SM cùng cộng sự đã xác định được 2 hợp chất là vernodalin

và vernomygdin từ dịch chiết cloroform cây Lá đắng [47].

Năm 1983, Iiraj Ganjian tiến hành nghiên cứu trên dịch chiết EtOH từ lá cây Láđắng và đã tìm ra được 1 hợp chất mới đó là 11,13-dihydrovernodalin

Năm 2006, P Erasto đã phân lập và xác định thêm 1 sesquiterpen mới là vernolid[36].

Năm 2011, Xuan Luo cùng cộng sự đã xác định được 1 sesquiterpen lacton mới

là vernodalinol từ cao butanol của cây Lá đắng [51]

Ngoài ra một số sesquiterpen lacton được phân lập từ cây Lá đắng là vernolepin,vernomenin, vernolic, hydroxylvernolid, 11,13-dihydrovernorodelin, 4,15-dihydrovernodalin

Năm 1992, Mitsuo Jisaka từ phân đoạn ethyl acetat của dịch chiết MeOH lá cây

Lá đắng đã phân lập được 5 loại stigmastan-glucosid steroid là vernoniosid Al, A3,

A4, vernoniosid B2 và B3 [45]

Năm 1995, Godwin O.lgile phân lập được 2 hợp chất glucosid steroid mới làvernoniosid D và vernoniosid E [39]

Lá đắng có vị đắng là do thành phần có các vernoniosid Al, A2, A3 và A4 Trongkhi đó, các vernoniosid B1, B2 và B3 không mang vị đắng.

9-1 hợp chất steroidal alcohol được phân lập từ cây Lá đắng là: stigmastadien-3p-ol [34]

7,24(28)-1.1.4 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý

1.1.4.1 Tác dụng hạ glucose huyết

Michael và cộng sự khảo sát hoạt tính hạ đường huyết của metformin và dịch chiếtnước lá cây Lá đắng [59] Kết quả cho thấy việc sử dụng riêng dịch chiết nước Lá

đắng (80mg/kg) và metformin (40mg/kg) cho tác dụng hạ đường huyết trên chuộttương đương nhau Ngoài ra việc kết hợp giữa dịch chiết Lá đắng và metformincho tác dụng hạ đường huyết mạnh hơn khi sử dụng đơn trị liệu Sự kết hợp đótrên bệnh nhân đái tháo đường được khuyến khích bởi vì đảm bảo tác dụng hạđường huyết và giảm được tác dụng phụ từ thuốc.

Thành phần lá Lá đắng có chất cynarosid và luteolin được đánh giá có tác dụng

ức chế α – glucosidase in vitro và in vivo [57], [58].

Hlilal và cộng sự tiến hành thử hoạt tính ức chế α-glucosidase in vitro của

cynarosid và luteolin Kết quả cho thấy cynarosid và luteolin có hiệu quả ức chếα-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 0,014 mg/ml và 0,0092 mg/dl khi so vớiacarbose (IC50 = 0,28 mg/ml) [56]

Ngoài ra, cynarosid và luteolin có nhiều tác dụng nổi bật như: Chống oxy hóa,điều trị bệnh tim mạch, kháng viêm, kháng ung thư và kháng dị ứng [46], [50],[55], [56], [73]

1.1.4.2 Tác dụng bảo vệ gan

Adesanoye và cộng sự nghiên cứu thử tác dụng in vivo của cao methanol lá cây

Lá đắng với liều 250 - 750 mg/kg đường uống trên 2 lô chuột: Nhóm chuột khỏemạnh và nhóm chuột gây bệnh bằng carbon tetraclorid (CCl4) Nhóm chuột bệnhsau 5 tuần được uống cao methanol Lá đắng thì các chỉ số men gan AST, ALT vàserum alkaline phosphatase (SALP) đều giảm Kết quả cho thấy cao methanol của

lá cây Lá đắng có tác dụng bảo vệ gan khỏi tác hại gây độc của CCl4 [31] Dịchchiết methanol của Lá đắng được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan khỏi tác hạicủa phản ứng oxy hóa bởi các gốc tự do chứa oxy (ROS) [29]

LDL-cholesterol trong máu Từ đó cho thấy hiệu quả của việc sử dụng Lá đắng đối vớitác dụng hạ lipid huyết.

1.1.4.4 Tác dụng chống oxy hóa

Một nghiên cứu so sánh khả năng loại gốc tự do DPPH của các dịch chiết khácnhau từ Lá đắng, dịch chiết ethanol ức chế tốt nhất ở mức 77%, trong khi dịchchiết nóng ức chế 63% và dịch chiết lạnh ức chế 49% Ngoài ra, tất cả các chấtchiết xuất đều có khả năng ức chế phân hủy β-caroten, quá trình oxy hóa của acidlinoleic và lipid peroxid gây ra bởi Fe2+ascorbat [48], [64] Một nghiên cứu kháccho thấy dịch chiết methanol có khả năng chống oxy hóa cao nhất, tiếp theo làdịch chiết aceton và dịch chiết nước [42]

1.2 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ ĐIỀU CHẾ CAO THUỐC

1.2.1 Một số phương pháp chung về chiết xuất dược liệu

Chiết xuất là một quá trình kỹ thuật dùng dung môi để chiết tách một hoặc mộtvài cấu tử từ một dung dịch hay từ một vật thể rắn hay là quá trình hòa tan cácchất dễ tan trong một dung môi thích hợp, để tách chúng ra khỏi một hỗn hợp chấtrắn hoặc lỏng không tan hoặc rất ít tan trong dung môi đã được lựa chọn

Nếu hỗn hợp không tan là chất rắn thì gọi là chiết xuất rắn-lỏng, nếu là chất lỏngthì gọi là chiết xuất lỏng-lỏng [2], [27]

Tùy mục đích sử dụng dịch chiết, căn cứ vào khả năng hòa tan của những chấttrong dược liệu vào dung môi và bản chất dược liệu mà tiến hành chiết xuất theomột số phương pháp như ngấm kiệt, đun hồi lưu, ngâm [2], [27]

1.2.2 Một số nghiên cứu chiết xuất, phân lập hợp chất cynarosid và một số chất trong dược liệu Lá đắng

Cynarosid là luteolin 7-O-glucosid, cynarosid và luteolin thuộc nhóm flavon(flavonoid) Các dẫn chất flavon là các chất kết tinh không màu đến màu vàngnhạt [10]

Năm 1994, Godwin O.Igile cùng cộng sự [40] đã chiết bột lá cây Lá đắng bằngphương pháp ngâm với dung môi methanol 30%, sau đó dịch chiết được bốc hơi

dưới áp suất giảm (nhiệt độ 40 oC) thu được cao, từ cao này tách được 3 flavonoid

là luteolin, luteolin 7-O-β- glucuronoside và cynarosid

Hồ Thị Thúy Linh và cộng sự [5] chiết lá Lá đắng bằng phương pháp chiết nóngvới cồn 96 % được cao cồn Từ cao cồn qua các kỹ thuật chiết như lắc phân bố,sắc ký cột và tinh chế thu được hợp chất cynarosid từ phân đoạn ethyl acetat.Năm 2011, Xuan Luo và cộng sự [51] chiết bột lá cây Lá đắng bằng phương phápngâm với cồn 85%, dịch chiết được cô dung môi tạo cao cồn Cao cồn được chiếtphân bố và thu được cao n-butanol, từ cao này tách ra được vernodalinol

1.2.3 Cao thuốc

1.2.3.1 Khái niệm chung

Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịchchiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp [2].Cao thuốc thường có những đặc điểm sau:

- Đã được loại bỏ một phần hoặc hoàn toàn các tạp chất: Chất nhày, gôm, chấtbéo, nhựa

- Cao thuốc ít khi được sử dụng trực tiếp, thường dùng để bào chế các dạng thuốckhác như siro, potio, viên tròn, thuốc mỡ, thuốc đạn, thuốc trứng, viên nén, thuốcbột

- Trong quá trình điều chế có thể hình thành một số chất là sản phẩm của quá trìnhoxy hóa, thủy phân, tác dụng của enzym [1]

Cao thuốc thường được phân loại theo thể chất cao (có ba loại: Cao lỏng, cao đặc

và cao khô)

Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng, trong

đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếukhông có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng

để điều chế cao thuốc

Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao khôngquá 20%

Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô khôngđược có độ ẩm lớn hơn 5% [2].

Điều chế cao thuốc thường gồm các giai đoạn điều chế dịch chiết, loại tạp chất(nếu cần), cô đặc hoặc làm khô để đưa dịch chiết đến thể chất nhất định [6], [27]

1.2.3.2 Một số nghiên cứu về cao thuốc

Mã Đức Nhật Quang và cộng sự [9] đã nghiên cứu điều chế cao đặc Sâm đại hànhnhư sau: Bột Sâm đại hành được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dungmôi cồn 70% thu được dịch chiết Dịch chiết được để lắng qua đêm rồi lọc loạitạp Dịch lọc đã được loại tạp chuyển qua thiết bị cô áp suất giảm cho đến khi thuđược cao sệt Sau đó, tiếp tục cô trên bếp cách thủy đến thể chất đặc hơn rồi tiếnhành sấy ở 55 oC, tiến hành sấy trong 6 giờ đến độ ẩm nhỏ hơn 15% Sau khi sấyxong, thu được cao đặc Sâm đại hành

Nguyễn Hương Thư và cộng sự [18] đã nghiên cứu điều chế cao đặc Thiên ma vớiquy trình như sau: Dược liệu xay nhỏ được chiết xuất bằng phương pháp ngâmlạnh với dung môi ethanol 70% Quá trình ngâm gồm 4 lần, mỗi lần ngâm trong

24 giờ Dịch chiết thu được, lọc và đun cách thủy ở nhiệt độ 60 oC đến khi thuđược cao đặc Thiên ma

Trần Thị Thu Vân và cộng sự [22] đã nghiên cứu điều chế cao khô Sâm Việt Nambằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 45% Sau 24 giờ rút lấy dịch chiết, thu hồidung môi bằng cách cô quay ở nhiệt độ 50 oC được dịch chiết đậm đặc, tiếp tụcsấy chân không để thu được cao khô toàn phần

1.3 PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC TÁC DỤNG SINH HỌC

1.3.1 Khảo sát tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase in vitro

Tiến hành theo phương pháp của Zhi-Wei Wang và cộng sự (2013)

Nguyên tắc chung của phương pháp:

Dưới tác dụng xúc tác của enzym α-glucosidase, glucopyranosid (PNPG) phân giải cho ra hai sản phẩm là α-D-glucose và p-nitrophenol p-nitrophenol là một chất màu vàng, có độ hấp thu ở bước sóng 400-

nitrophenyl-α-D-415 Khi mẫu thử nghiệm có sự ức chế enzym α-glucosidase thì hàm lượng nitrophenol tạo thành sẽ giảm So sánh hàm lượng p-nitrophenol sinh ra giữa cácmẫu thử nghiệm và mẫu chuẩn (α-glucosidase hoàn toàn không bị ức chế) để xácđịnh phần trăm ức chế α-glucosidase của mẫu cao chiết dược liệu [72].

p-Các chất có tác dụng ức chế α-glucosidase: Gồm aglucosidase, miglitol và

emiglitat Với cơ chế tác dụng làm giảm sự hấp thu qua ruột của tinh bột, dextrin

và các disaccharid, làm chậm sự hấp thu carbohydrat Do đó sự tăng đường huyếtsau khi ăn giảm ở cả người bình thường và người bệnh đái tháo đường.Aglucosidase có hiệu quả nhất khi dùng chế độ ăn tinh bột, có nhiều xơ và ítglucose, Saccharose Aglucosidase cũng ức chế cạnh tranh với glucomylase vàsucrase, nhưng có tác dụng yếu trên α-amylase của tụy

Cơ chế tác dụng của chất ức chế enzym α-glucosidase:

Sau khi ăn, thức ăn được đẩy qua thực quản vào dạ dày, sau đó tới ruột non Thức

ăn được nghiền nát, bị phân cắt thành các phân tử nhỏ đơn giản hơn nhờ các enzym

có trong ruột Dịch nhầy trong ruột động vật có vú tiết các disaccharidase nhưmaltase, lactase, sucrase [28]

Bình thường sẽ có một màng nằm trong biểu mô ruột non liên kết với enzym giúpcho sự hấp thu glucose vào ruột non nhờ thúc đẩy phản ứng thủy phân cắt các phân

tử oligosaccharid thành monosaccharid diễn ra dễ dàng hơn.

Men glucosidase phân bố trong cơ thể vi sinh vật, mô thực vật và động vật, glucosidase có trong ruột (maltase), nó xúc tác cho phản ứng thủy phân đườngmaltose thành các đơn phân glucose, làm tăng nồng độ đường huyết Glucose saukhi bị thủy giải sẽ ngấm qua thành ruột non và đi vào máu, cho cơ thể hấp thu Sự

α-ức chế enzym α-glucosidase, sẽ làm quá trình thủy giải glucose từ các carbohydratcủa thức ăn bị chậm lại Aglucosidase là một trong các chất ức chế α-glucosidase

Aglucosidase là một Oligosaccharid có nguồn gốc từ nấm sacharomyces.

Aglucosidase gây ức chế cạnh tranh cơ chất oligosaccharid tinh bột với enzym glucosidase, làm giảm quá trình thoái giáng của disaccharid, oligosaccharid và

α-polysaccharid thành monosaccharid là dạng có thể hấp thu được, do đó làm chậmquá trình giải phóng đường glucose cũng như làm chậm lại sự hấp thu glucose, kếtquả nồng độ đường huyết sau ăn sẽ bị giảm xuống giúp ngăn chặn sự tăng đườnghuyết sau ăn Ngoài ra aglucosidase không làm tăng insulin huyết, không gây đềkháng insulin, bảo vệ tế bào beta, giảm nồng độ triglycerid và giảm các biến chứngcủa đái tháo đường.

1.3.2 Qui trình tiến hành phản ứng

Khả năng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết thực vật được thực hiện theo

phương pháp của Zhi-Wei Wang và cộng sự (2013) như sau: 10 µl mẫu thử được

ủ với 10 µl enzym α-glucosidase nồng độ 0,1 U/ml được cho vào trong dĩa 96 giếng có sẵn 170 µl dung dịch đệm phosphat nồng độ 50 mM (pH 6,8) Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37 °C trong thời gian 60 phút, thêm 30 µl PNPG (p-

nitrophenyl- α-D-glucopyranosid; 0,1 mM) được cho vào hỗn hợp phản ứng và ủ

30 phút ở 37°C Sau đó hỗn hợp phản ứng được đo mật độ quang ở bước sóng 415

1.3.3 Một số nghiên cứu về khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro

Nguyễn An Kim Thịnh và cộng sự [11] nghiên cứu tác dụng ức chế enzym

α-glucosidase in vitro của cao toàn phần chiết bằng cồn 96% từ lá cây Lá đắng và

các phân đoạn cao cloroform, cao ethyl acetat được chiết phân bố lỏng – lỏng từcao toàn phần Kết quả cho thấy ở nồng độ cao 0,25 mg/ml, cao toàn phần có tác

dụng ức chế enzym α-glucosidase là 40,37%; cao cloroform và cao ethyl acetat cótác dụng ức chế enzym α-glucosidase lần lượt là 11,23% và 36,13%.

Lê Nữ Bảo Ngân và cộng sự [8] nghiên cứu tác dụng ức chế enzym ɑ-glucosidase

in vitro của cao cồn 96% trên một số bộ phận dâu tằm Kết quả cho thấy tác dụng

ức chế ɑ-glucosidase của mẫu cao rễ mạnh hơn mẫu cao thân (ở nồng độ 0,1mg/ml, cao rễ có tác dụng ức chế ɑ-glucosidase là 97,61%, cao thân có tác dụng

ức chế ɑ-glucosidase là 90,99%)

Quách Ngô Diễm Phương và cộng sự [19] nghiên cứu khả năng ức chế enzym

ɑ-glucosidase in vitro của rễ tơ ké hoa đào (Urena lobata L.) Kết quả cho thấy: Ở

nồng độ 7,813 µg/ml, cao chiết ethanol từ rễ tự nhiên và rễ tơ thủy canh có khả

năng ức chế ɑ-glucosidase đạt 78,65% và 75,44% Trong khi đó, cao chiết rễ tơ in

vitro chỉ có khả năng ức chế ɑ-glucosidase đạt 54,97%.

Nguyễn Linh Nhâm và cộng sự [16] nghiên cứu tác dụng ức chế enzym

ɑ-glucosidase in vitro của cao cồn 96% trên một số bộ phận của một số họ dâu tằm

(Moraceae) Kết quả cho thấy cao thân vả thu hái tại Bình Dương có tác dụng ứcchế enzym ɑ-glucosidase cao nhất, ở nồng độ 0,01 mg/ml có khả năng ức chế ɑ-glucosidase đạt 91,95%

1.4 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU VÀ CAO THUỐC

1.4.1 Nội dung và cách thức xây dựng một tiêu chuẩn dược liệu

Các chuyên luận về nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên gồm các nộidung chủ yếu sau:

Định nghĩa

Tên thông dụng của dược liệu, tên khoa học của dược liệu

Định nghĩa dược liệu, tên thông thường và tên khoa học của loài cây cung cấpdược liệu đó [1], [2]

Đặc điểm cảm quan

Mô tả các đặc điểm hình thái, thể chất, màu sắc, mùi vị của dược liệu

Việc xây dựng tiêu chuẩn một dược liệu thường qua các bước chính sau đây:

- Chuẩn bị mẫu thử

- Khảo sát các chỉ tiêu, lập bảng số liệu từng chỉ tiêu

- Xác định giới hạn cho phép cho từng chỉ tiêu, viết tiêu chuẩn [1], [2]

1.4.2 Nội dung tiêu chuẩn cơ sở cho cao thuốc

Cao thuốc phải đáp ứng các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng như

mô tả, tro toàn phần, định tính, định lượng và phải đạt các yêu cầu chung sau đây:

- Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô

tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng

- Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác):

Cao đặc không quá 20%

Cao khô không quá 5%

- Kim loại nặng: Đáp ứng yêu cầu qui định trong chuyên luận riêng.

- Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn

hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định trongPhụ lục 10.14 Xác định dung môi tồn dư

- Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ lục 13.6 Thử giới

hạn nhiễm khuẩn [2]

1.4.3 Một số nghiên cứu về xây dựng quy trình định lượng cynarosid trong một số loại dược liệu và cao thuốc

Li và cộng sự [52] đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời cynarosid và

luteolin cùng một số hợp chất trong lá Salix Matsudana Koidz như sau:

Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch hỗn hợp các chất chuẩn đối chiếu: quercetin;kaempferol; salicin; myricetin; apigenin-3’-oxyethyl-7-O-glucoside; rutin;apigenin; luteolin (597 ppm) và cynarosid (500 ppm)

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 5 g bột dược liệu, chiết siêu âm với 50 mlethanol 70% x 3 lần, mỗi lần 30 phút, sau đó gom dịch chiết và cô đến cắn Sau

đó hòa tan cắn trong 50 ml methanol rồi lọc qua màng lọc Millipore 0,45 µm.Điều kiện sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng phát hiện 246 nm,tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, nhiệt độ cột 30 oC, chương trình phađộng gradient gồm methanol và nước acid phosphoric 0,2%

Bảng 1.1 Chương trình pha động methanol và nước acid phosphoric 0,2%

Thời gian (phút) Methanol (%) Nước acid phosphoric 0,2%

(%)

Qian và cộng sự [66] đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời cynarosid và

một số hợp chất trong Lonicera japonica Thunb như sau:

Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch hỗn hợp các chất chuẩn đối chiếu: acid chlorogenic,acid caffeic, loganin, werosides, secoxyloganin, rutin và cynarosid (7,36 μg/ml).Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu, chiết siêu âm với 25 mlmethanol 70% trong 45 phút, làm lạnh ở nhiệt độ phòng, thêm vừa đủ lượng

methanol 70% bị bay hơi trong quá trình siêu âm Sau đó dịch chiết được lọc quamàng lọc Millipore 0,45 µm.

Điều kiện sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng phát hiện 245 nm,tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 15 µl, nhiệt độ cột 30 oC, chương trình phađộng gradient gồm acetoniltril và nước acid acetic 0,4%

Bảng 1.2 Chương trình pha động acetoniltril và nước acid acetic 0,4%

Thời gian (phút) Acetonitril (%) Nước acid acetic 0,4%

Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và cộng sự [17] đã đã xây dựng quy trình định lượng

cynarosid trong cao actisô như sau:

Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn đối chiếu cynarosid (3 ppm)

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 200 mg cao vào bình định mức 100 ml, thêmkhoảng 50 ml ethanol 70%, siêu âm ở nhiệt độ 40 oC, trong 15 phút, để nguội 15phút, thêm ethanol 70% vừa đủ tới vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.Điều kiện sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng phát hiện 348 nm,tốc độ dòng 0,7 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, nhiệt độ cột 30 oC, chương trìnhgradient gồm acetonitril và nước acid formic 0,1%

Bảng 1.3 Chương trình pha động acetonitril và nước acid formic 0,1%

Thời gian (phút) Acetonitril (%) Nước acid formic 0,1%

Chương 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, DUNG MÔI HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá cây Lá đắng (Folium Vernonia amygdalina) thu hái tại tỉnh Tây Ninh (do công

ty Đức Thành Food cung cấp), Đắk Lắk và An Giang vào tháng 03/2017 Nguyênliệu được định danh bằng cách so sánh các đặc điểm hình thái thực vật với cácthông tin trên tài liệu tham khảo [23] và nhờ sự giám định của TS Võ Văn Chi

Xử lý: Lá cây Lá đắng được phơi khô, xay bột, độ ẩm khoảng 12%, đóng bao nilon

2 lớp chống ẩm, đơn vị đóng gói là 1 kg và 5 kg, dùng để nghiên cứu hóa học,chiết xuất và điều chế cao

2.1.2 Dung môi, hóa chất và thiết bị

Dung môi hóa chất

Bảng 2.1 Danh sách các hóa chất

Thuốc thử

Muối KH2PO4,

K2HPO4

Bảng 2.2 Chất chuẩn và sản phẩm đối chiếu

Máy cô quay chân không 1 lít Buchi Rotavapor R210S Thụy SĩMáy cô quay chân không 20 lít Buchi Rotavapor R220S Thụy SĩMáy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimazu LC20 ADXR Nhật Bản

Việt Nam

Thiêt bị ngấm kiệt loại vừa (dung tích

20 lít): Hình nón cụt ngược cao 750 mm,đường kính đáy trên 250 mm, đườngkính đáy dưới 175 mm, chiều cao phầnđáy phễu 80 mm, đường kính ống thoát

phần đáy phễu 100 mm, đường kính ốngthoát 27 mm, có van điều chỉnh tốc độ.

Thiết bị ngấm kiệt dùng để điều chế caoquy mô pilot (dung tích 150 lít): Hìnhnón cụt ngược, cao 1530 mm, đườngkính đáy trên 1230 mm, đường kính đáydưới 620 mm, chiều cao phần đáy phễu

IFOOD ViệtNam

Máy thu hồi dung môi công nghiệp dung

2.1.3 Nơi tiến hành

Bộ môn Bào chế, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM

Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM

Khoa Dược lý, Viện kiểm nghiệm thuốc TP HCM

Xưởng sản xuất của công ty TNHH Novaglory, 59B, Nhuận Đức, Củ Chi, TP.HCM

2.1.4 Xử lý số liệu

Phần các nghiên cứu thăm dò tìm điều kiện chiết xuất dịch chiết và điều chế caođặc từ dịch chiết lá khô tiến hành 3 thí nghiệm, lấy kết quả trung bình

Phần định lượng tiến hành 6 thí nghiệm lấy kết quả trung bình

Sử dụng mô hình thực nghiệm kết hợp phương pháp Box – Wilson

Sử dụng phần mềm tính toán và xử lý số liệu Microsoft Excel 2010

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu lá cây Lá đắng

2.2.1.1 Điều chế và đánh giá chuẩn làm việc cynarosid

Chiết xuất, phân lập và tinh chế

Chiết xuất cao toàn phần

Tham khảo tài liệu [5], quy trình chiết xuất cao toàn phần tiến hành như sau:Bột khô lá cây Lá đắng (10 kg) được làm ẩm với ethanol 96% trong 4 giờ Chuẩn

bị bình chiết: Cho vào 1 lớp bông dày khoảng 5 cm, tiếp theo thêm 1 lớp giấy lọc,thấm ướt bông và giấy lọc bằng cồn 96% Cho dược liệu đã làm ẩm vào bình, làmbằng mặt không nén chặt Cho thêm 1 lớp giấy lọc trên bề mặt dược liệu, thêmdung môi từ từ ngập bề mặt dược liệu khoảng 10 - 15 cm, ngâm trong 48 giờ, rútdịch chiết với tốc độ 10 ml/phút, tỷ lệ dịch chiết với dược liệu là 7:1 đến khi thuđược 70,0 lít dịch chiết thì ngưng thêm dung môi Rút hết dung môi, ép bã và gộpvới dịch chiết trên Dịch chiết được cô quay thu hồi dung môi, sau đó cô thêm trênbếp cách thủy cho đến khi cao sệt, thu được cao chiết toàn phần (cao A)

Phân lập và tinh chế cynarosid

- Tham khảo quy trình phân lập cynarosid từ lá cây Lá đắng trong các nghiên cứutrong và ngoài nước [5], [40]

Quy trình phân lập được tiến hành như sau: Cao chiết toàn phần được phân tán vàonước, sau đó chiết phân bố với cloroform đến khi dịch chiết lần cuối nhạt màu vàkhông còn hoặc còn rất ít cắn trên mặt kính đồng hồ, rồi phân đoạn nước tiếp tụcchiết phân bố với ethyl acetat đến khi dịch chiết lần cuối nhạt màu và không cònhoặc còn rất ít cắn trên mặt kính đồng hồ Cô quay thu hồi dung môi các dịch chiếtcloroform và ethyl acetat thu được cao cloroform và cao ethyl acetat

Từ cao ethyl acetat, tiến hành phân lập cynarosid với các phương pháp tham khảo

từ tài liệu [1], [5]

Các phương pháp để tinh chế:

- Kết tinh phân đoạn, kết tinh trong nhiều dung môi

Kiểm tra độ tinh khiết

Cân chính xác khoảng 0,5 mg cynarosid phân lập vào bình định mức 10 ml hòatan trong methanol 70%, điền dung môi đến vạch, lọc qua màng lọc Millipore 0,45

µm Dùng các mẫu thử này cho các thí nghiệm kiểm tra độ tinh khiết:

- Phương pháp SKLM

Kiểm tra độ tinh khiết cynarosid phân lập bằng 3 hệ dung môi có độ phân cực khácnhau, phát hiện bằng thuốc thử phù hợp

Yêu cầu: Trên bản sắc ký chỉ xuất hiện 1 pic, không kéo vệt, cân đối

- Phương pháp HPLC bằng đầu dò PDA

Hợp chất cynarosid phân lập được đánh giá bằng HPLC với chương trình sắc kýphù hợp Ghi nhận sắc ký đồ, phổ UV, sắc ký đồ 3 chiều và kiểm tra độ tinh khiếtpic

Xác định cấu trúc chất phân lập

Cynarosid phân lập đạt độ tinh khiết được tiến hành xác định cấu trúc thông quacác phương pháp phổ nghiệm:

- Đo quang phổ hồng ngoại IR bằng máy quang phổ hồng ngoại iS50FT – IR

- Đo quang phổ tử ngoại khả kiến UV – Vis bằng máy Shimazu LC 20ADXR

- Đo khối phổ MS tại Viện Công nghệ hóa học TP HCM

- Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR bằng máy BRUKER-AV-500, tại ViệnHóa học thuộc Trung tâm Khoa học công nghệ Việt Nam – Hà Nội

Đánh giá chuẩn làm việc cynarosid

Xây dựng quy trình định lượng cynarosid bằng phương pháp HPLC

- Thăm dò điều kiện HPLC

Thăm dò nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng, 30 oC, 35 oC

Tiến hành sắc ký dung dịch mẫu thử với điều kiện HPLC khảo sát, ghi lại sắc ký

đồ, độ tinh khiết pic, thời gian lưu và các thông số sắc ký như độ phân giải (Rs ≥1,5); hệ số bất đối (0,8 ≤ As ≤ 1,5); hệ số dung lượng (1 ≤ k’ ≤10); số đĩa lý thuyết(N ≥ 5000) [54], [67] Từ đó chọn được điều kiện sắc ký phù hợp

Thẩm định quy trình xác định hàm lượng chất phân lập bằng phương pháp HPLC

- Chuẩn bị mẫu

+ Dung dịch chuẩn gốc cynarosid: Cân chính xác 5 mg cynarosid chuẩn chovào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 7 ml MeOH 70%, siêu âm cho tan,sau đó thêm dung môi vừa đủ 10 ml, lắc đều Thu được dung dịch chuẩn gốc

có nồng độ 500 ppm

+ Dung dịch chuẩn cynarosid nồng độ 50 ppm: Lấy chính xác 1 ml dung dịchchuẩn gốc cynarosid 500 ppm cho vào bình định mức 10 ml, thêm dung môivừa đủ, lắc đều Lọc qua màng lọc Millipore 0,45 µm.

+ Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác khoảng 5 mg cynarosid (CYNA1) chovào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml MeOH 70%, siêu âm cho tan, sau đóthêm vừa đủ dung môi, lắc đều Thu được dung dịch có nồng độ 500 ppm.Lấy chính xác 1 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 10 ml, thêm dungmôi vừa đủ, lắc đều Lọc qua màng lọc Millipore 0,45 µm

+ Dung dịch thử thêm chuẩn: Lấy chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc nồng

Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của thời gian lưu (tR), diện tích pic (S)không quá 2,0% Hệ số bất đối 0,8 ≤ As ≤ 1,5; độ phân giải Rs ≥ 1,5; hệ số dunglượng 1 ≤ k’ ≤10; số đĩa lý thuyết N ≥ 5000 [54], [67]

- Độ đặc hiệu

+ Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn Sosánh sắc ký đồ, thời gian lưu, phổ UV, độ tinh khiết của pic cynarosid.+ Yêu cầu:

Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gianlưu của pic cynarosid có trong mẫu chuẩn

Sắc ký đồ mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn cho pic có thời gian lưu tương ứng vớipic cynarosid trong sắc ký đồ mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử, mẫu thử thêmchuẩn pic cynarosid tách rời khỏi các pic khác (Rs>1,5).

Khi thêm 1 lượng chất cynarosid vào mẫu thử, diện tích đỉnh của hợp chất cầnđịnh lượng phải tăng lên

Phổ UV của pic cynarosid trong sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử tương đươngnhau Độ tinh khiết của pic cynarosid trong mẫu chuẩn và mẫu thử, mẫu thử thêmchuẩn đạt yêu cầu (peak purity index ≥ 0,999) [60]

- Tính tuyến tính:

Khảo sát sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của chất phân tích: Chuẩn

bị 6 dung dịch chuẩn có nồng độ 6,25 ppm; 12,5 ppm; 25 ppm; 50 ppm; 100 ppm;

200 ppm Tiến hành sắc ký các dung dịch này và xác định phương trình hồi quy,

hệ số tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ chất phân tích

Phương trình hồi qui thu được có dạng: y = ax + b và phải đạt R2 ≥ 0,995

Sử dụng “phân tích hồi quy” với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương

trình hồi quy Các “phân tích hồi quy” được tính toán bằng phần mềm MS-Excel2010

- Độ lặp lại

Tiến hành xác định hàm lượng 6 mẫu thử độc lập, dựa vào diện tích pic cynarosidcủa các dung dịch thử để suy ra hàm lượng Xử lý thống kê, xác định độ lệch chuẩntương đối

Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng chất phân tích có trongcác mẫu không quá 2,0% [54]

- Độ đúng

Độ đúng được biểu thị bằng tỷ lệ phục hồi % của các giá trị tìm thấy so với giá trịthực của chất chuẩn thêm vào mẫu thử với cùng điều kiện phân tích

Tiến hành: Thêm vào mẫu thử đã được xác định hàm lượng, lượng chất chuẩntương ứng 80%, 100%, 120% Mỗi mức nồng độ chuẩn bị 3 dung dịch Tiến hành

đo theo cùng điều kiện phân tích Mỗi dung dịch tiêm 1 lần

Tỉ lệ phục hồi phải đạt từ 98 - 102% và RSD% ≤ 2% [54]

Đánh giá hàm lượng hợp chất phân lập

Áp dụng quy trình đã được thẩm định, xác định hàm lượng cynarosid phân lậpđược

2.2.1.2 Kiểm tra nguyên liệu Lá đắng

Soi bột dược liệu: Quan sát bột dược liệu bằng kinh hiển vi quang học, chụp hình

và ghi nhận các cấu tử [2]

Thành phần hóa học

Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Quy trình thường qui để xác định nhanh một số hợp chất thường gặp trong dượcliệu bằng phản ứng hóa học dựa trên nguyên tắc: Phân tách hỗn hợp các chất trongnguyên liệu thành các phân đoạn đơn giản, dùng các phản ứng hóa học đặc trưng

để phát hiện [1] Tiến hành theo qui trình cải tiến và sửa đổi của Khoa Dược, Đạihọc Y Dược TP.HCM từ qui trình phân tích của Ciuley (Trường đại học Dượckhoa Bucarest, Rumani) [1].

Kiểm tra độ tinh khiết nguyên liệu

Ống 1: Tạo phức với FeCl3 1% (thêm 2-3 giọt), phản ứng xảy ra nếu tạo phức màuxanh đen

Ống 2: Tăng màu với NaOH 1% (thêm 2-3 giọt), phản ứng xảy ra nếu dịch đậmmàu hơn ống chứng

Ống 3: Phản ứng Cyanidin (thêm một ít bột Mg kim loại, cho 1 ml dịch chiết vào,thêm từ từ 1-2 ml HCl đậm đặc theo thành ống nghiệm), phản ứng xảy ra nếu dungdịch có màu từ hồng đến đỏ

- Phương pháp SKLM

Mẫu chuẩn: Dung dịch cynarosid và luteolin chuẩn 100 ppm trong methanol.Mẫu thử: Lấy 5 g dược liệu khô, cắt nhỏ cho vào 20 ml methanol, siêu âm trong

10 phút, để nguội và lọc

Pha tĩnh: Silicagel F254 bản nhôm tráng sẵn 0,25 mm

Pha động: Thăm dò một số hệ dung môi sau đó chọn hệ dung môi tách vết rõ nhất

Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 µl mỗi dịch thử và dung dungdịch chuẩn.

Phát hiện: Sau khi triển khai bản mỏng quan sát dưới ánh sáng thường, kiểm tradưới đèn UV bước sóng 254 nm và 365 nm

Yêu cầu: Quan sát mẫu của mẫu thử và chuẩn phải có các vết có cùng Rf và màusắc tương ứng nhau

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời cynarosid và luteolin trong dược liệu và cao lá cây Lá đắng bằng HPLC

- Chương trình rửa giải: Tham khảo tài liệu [17], [66]

Khảo sát pha động: Các dung môi được khảo sát là acetonitril phối hợp với đệm ởcác tỷ lệ khác nhau, để tách được pic cynarosid và luteolin tốt với thời gian lưuphù hợp, đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.Ghi nhận sắc ký đồ, các thông số thời gian lưu tR, diện tích pic S, hệ số bất đối As,

số đĩa lý thuyết, phổ UV và độ tinh khiết pic

- Từ các kết quả khảo sát, xây dựng quy trình định lượng cynarosid và luteolintrong dược liệu và cao bằng phương pháp HPLC

Thăm dò phương pháp chiết xuất để định lượng từ dược liệu

- Tham khảo tài liệu [17], [66] chọn phương pháp chiết siêu âm ở 40 oC trong

30 phút

- Thăm dò dung môi chiết xuất.

Tiến hành: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu cho vào 2 bình nón nút mài

100 ml khác nhau, thêm chính xác 25 ml dung môi ethanol 70%, methanol 70%vào từng bình, đậy nút lại, siêu âm ở nhiệt độ 40 oC, trong 30 phút, lắc, để nguội

15 phút, lọc qua bông, cho dịch chiết vào bình định mức 50 ml, bổ sung vừa đủbằng dung môi chiết, sau đó lọc qua màng lọc Millipore 0,45 µm trước khi khaitriển trên HPLC theo điều kiện đã khảo sát So sánh sắc ký đồ, diện tích đỉnh củacynarosid và luteolin trong các dung môi khảo sát

- Thăm dò số lần chiết

Tiến hành: Cân chính xác 1 g dược liệu cho vào bình nón nút mài 100 ml, thêmchính xác 25 ml dung môi đã khảo sát, đậy nút, siêu âm ở nhiệt độ 40 oC, trong 30phút, lắc, để nguội 15 phút, lọc qua bông, cho dịch chiết vào bình định mức 25 ml,

bổ sung bằng dung môi chiết Bột dược liệu được rửa với dung môi và chiết tiếp

2 lần nữa ở điều kiện tương tự với 25 ml dung môi thu được dịch chiết 2 và dịchchiết 3 Các dịch được lọc qua màng lọc Millipore 0,45 µm Khai triển trên HPLCtheo điều kiện đã khảo sát So sánh diện tích đỉnh của cynarosid và luteolin củacác dịch chiết

Thẩm định quy trình định lượng

- Chuẩn bị các dung dịch

+ Dung dịch gốc cynarosid: Cân chính xác 10 mg cynarosid cho vào bình địnhmức 10 ml, thêm khoảng 7 ml MeOH 70%, siêu âm cho tan, sau đó thêmdung môi vừa đủ, lắc đều Thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000ppm

+ Dung dịch gốc luteolin: Cân chính xác 10 mg luteolin cho vào bình định mức

10 ml, thêm khoảng 7ml MeOH 70%, siêu âm cho tan, sau đó thêm dung môivừa đủ, lắc đều Thu được dung dịch có nồng độ 1000 ppm

+ Dung dịch hỗn hợp chuẩn: Hút chính xác 1,5 ml dung dịch gốc cynarosid, 1

ml dung dịch gốc luteolin cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung vừa đủ