KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (CND và BC) khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí để thu sinh khối dưới dạng bào tử của vi khuẩn bacillus clausii

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ... Khảo sát ảnh

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA

Bacillus clausii

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy

giáo DS Lê Ngọc Khánh, người đã luôn động viên, hướng dẫn tôi trong thời

gian làm khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Đàm Thanh Xuân cùng toàn thể các

thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công Nghiệp Dược đã nhiệttình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáotrường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, dìu dắt tôi trong suốtquá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đãluôn động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống và học tập

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 05 năm

Sinh viên

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 6

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 7

1.1.Vi khuẩn Bacillus……… 7

1.1.1 Giới thiệu về chi Bacillus ………7

1.1.2 Vị trí phân loại……….7

1.1.3 Đặc điểm vi khuản Bacillus………7

1.1.4 Bào tử và khả năng hình thành bào tử……… 8

1.1.5 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus……… 10

1.2 Giới thiệu về Bacillus clausii……….11

1.2.1 Đặc điểm sinh thái sinh lý của Bacillus clausii………11

1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii………14

1.3 Các phương pháp nuôi cấy………16

CHƯƠNG 2: : NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị……….…… ………17

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất……… 17

2.1.2 Máy móc, thiết bị………….………….……….… ……… 17

2.1.3 Môi trường sử dụng……… 17

2.2 Nội dung nghiên cứu……… …….18

2.2.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii………18

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí để thu sinh khối………….18

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 18

2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina………18

2.3.2 Giữ giống trên thạch nghiêng……… 18

2.3.3 Chuẩn bị dịch nhân giống……….19

2.3.4 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng xác định lượng sinh khối ướt trong dịch lên men của Bacillus clausii tại thời điểm khác nhau … … … …… … … …… … … …… … … …… … … 19

2.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên khả năng tăng sinh khối ………19

2.3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối ……….20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 21

3.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii………21

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis……….23

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis……… 23

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối của Bacillus clausii ……….28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… ……….32 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3.1 Lượng sinh khối thu được của Bacillus clausii tại các thời

điểm khác nhau

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của

Bacillus clausii ở nhiệt độ 370C

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của

Bacillus subtilis ở nhiệt độ 370C

Bảng 3.4 So sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis

Bảng 3.7 So sánh khả năng tăng sinh khối ở nhiệt độ 300C và 370C

của Bacillus clausii và Bacillus subtilis.

Trang171721242527293031

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bào tử Bacillus subtilis

Hình 1.2 Bào tử Bacillus anthracis.

Hình 1.3 Quá trình hình thành bào tử của Bacillus clausii

Hình 1.4 Cấu tạo bào tử

Hình 1.5 Bacillus clausii trên môi trường đặc.

Hình 1.6 Bào tử Bacillus clausii dưới kính hiển vi điện tử

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus

clausii theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 370C

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus

subtilis theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 370C

Hình 3.4 Đồ thị so sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus

subtilis ở các tốc độ lắc khác nhau tại 370C

Hình 3.5 Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus clausii ở

nhiệt độ 300C và 370C

Hình 3.6 Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus subtilis ở

nhiệt độ 300C và 370C

Trang88991313151515222426272930

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong đường ruột của con người có sự hiện diện rất lớn của hệ vi sinhvật với khoảng hơn 100 tỷ vi khuẩn, bao gồm cả vi sinh vật có lợi và vi sinhvật có hại Các vi sinh vật có lợi sẽ có tác động tốt cho sức khỏe như tổng hợpvitamin, giảm sự hình thành các chất gây hại trong ruột, hỗ trợ tiêu hóa, giúphấp thu tốt hơn và cải thiện sự rối loạn của đường ruột, cũng như tăng cườngsức khỏe, giúp phòng bệnh Ngược lại, các vi sinh vật gây hại sẽ gây ra nhữngtác động xấu cho cơ thể như hình thành các chất gây hoại tử ruột, các chất gâyung thư, tiêu chảy… Trong cuộc sống hàng ngày, hệ vi sinh vật đường ruột dễ

bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài như lão hóa, dùng kháng sinh, thức ănkhông vệ sinh… làm mất cân bằng về số lượng giữa vi khuẩn có lợi và vikhuẩn có hại, gây nên các bệnh đường ruột trong đó tiêu chảy là một điểnhình Vì vậy việc duy trì lượng vi sinh vật có lợi chiếm ưu thế nhằm hỗ trợcác chức năng về tiêu hóa và miễn dịch ở đường ruột là rất quan trọng

Sử dụng chế phẩm chứa vi sinh vật có lợi (Probiotic) nhằm mục đích

bổ sung, cân bằng lại vi sinh vật đường ruột là một trong các phương phápphòng và chữa bệnh tiêu chảy Trong các Probiotic thì chế phẩm

Enterogermina thực sự nổi bật, là chế phẩm duy nhất chứa bào tử Bacillus

clausii kháng đa kháng sinh, và do sử dụng dạng bào tử nên vi khuẩn qua

dược dạ dày với tỷ lệ sống sót cao và điều trị rối loạn tiêu hóa hiệu quả Tuy

nhiên việc nghiên cứu điều kiện nuôi cấy Bacillus clausii còn ít được quan

tâm Vì vậy, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí để thu sinh

khối dưới dạng bào tử của vi khuẩn Bacillus clausii” được thực hiện nhằm

giải quyết mục tiêu:

- Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii

- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối

dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

1.1 Vi khuẩn

Bacillus

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Giới thiệu về chi Bacillus

Từ Bacillus theo tiếng Latinh có nghĩa là hình que, do đó Bacillus còn được gọi là trực khuẩn Chi Bacillus gồm rất nhiều loài đã được biết đến như:

Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus globigii, Bacillus natto, Bacillus clausii [15].

Do sự đa dạng về loài trong chi Bacillus, trực khuẩn có thể sống và

được phân lập trong các môi trường khác nhau, từ đất, nước, không khí, côntrùng và con người

1.1.2 Vị trí phân loại

Theo như Bergey’s manual of Systematic of Bacteriology 2nd edition,

2004 thì chi Bacillus thuộc họ Bacillaceae là một trong 4 họ thuộc bộ

Bacillales, lớp Bacilli, ngành Firmicutes trong giới vi khuẩn.

Việc phân loại vi khuẩn theo hình thái và sinh lý được hoàn thiện bằngviệc giải trình tự gen 16S r.ARN Theo phương pháp này người ta thấy

Bacillus có mối quan hệ họ hàng với một số loại vi khuẩn không hình thành

nội bài tử như Enterococcus, Lactobacillus và Streptococcus ở cấp phân loại

bộ và có mối quan hệ với Literia và Staphylococcus ở cấp phân loại họ.

Chi Bacillus bao gồm trên 400 loài (476 loài).

1.1.3 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus có hình que, thường là Gram dương, có khả năng di

động, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalasedương tính, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron trong quá trình trao đổichất

Về dinh dưỡng và sinh trưởng, Bacillus có thể sử dụng các hợp chất

hữu cơ đơn giản như các loại đường, acid amin và các acid hữu cơ Trong một

số trường hợp chúng lên men cacbohydrat qua một loạt các chuỗi phản ứngphức tạp tạo ra glycerol và các glutadiol

Phần lớn Bacillus sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 30- 45ºC, pH khác

nhau, dao động từ 2-11

Khả năng hình thành bào tử là một trong những đặc điểm quan trọng

của chi Bacillus.

1.1.4 Bào tử và khả năng hình thành bào tử

Bào tử (nội bào tử) của chi Bacillus được miêu tả lần đầu năm 1872 bởi Ferdinand Cohn khi nghiên cứu Bacillus subtilis và sau này của Koch khi nghiên cứu mầm bệnh than do vi khuẩn Bacillus anthracis năm 1976 [12].

Hình 1.1 Bào tử Bacillus subtilis Hình 1.2 Bào tử Bacillus anthracis

Bào tử thường có dạng hình cầu hoặc elip, kích thước 0,8 - 1,4 µm chiềudài, là thể nghỉ của vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng khi điều kiện sốngkhông thuận lợi Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử lại nảy mầm phát triểnthành tế bào sinh dưỡng

Sự hình thành nội bào tử qua các bước:

- Trong tế bào sinh dưỡng ADN được phân chia thành nhiễm sắc thể(chromosom) riêng biệt và màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào

- Vỏ bào tử được hình thành đầy đủ bao quanh ADN.

- Bào tử chín và được giải phóng ra ngoài tế bào [1]

Bào tử tự do Tế bào sinh dưỡng

Áo bào tử

Tế bào mẹ

Sự phát triển của áo bào

Hình 1.3 Quá trình hình thành bào tử của Bacillus clausii

Quá trình hình thành bào tử rất phức tạp, mất khoảng 6-8 giờ, để có thể tạo ra bào tử có cấu trúc vững bền chịu được hoàn cảnh khắc nghiệt

Đặc điểm bào tử vi khuẩn:

Hình 1.4 Cấu tạo bào tử

- Cấu trúc bào tử là hệ thống nhiều lớp vỏ bền vững bao quanh vùng lõichứa ADN, các lớp bao bọc (gồm màng bào tử, thành bào tử, vỏ bào tử, áobào tử gồm 2 lớp áo trong và áo ngoài) chiếm tới 50% thể tích bào tử

Tính chất bào tử

Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suấtthẩm thấu [6]

1.1.5 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus

Trong số các loài thuộc chi Bacillus, có 2 loài gây bệnh nguy hiểm cho con người, đó là Bacillus anthracis gây bệnh than và Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm Nhưng mặt khác, vi khuẩn Bacillus có rất nhiều ứng dụng

trong đời sống

Trong nông, lâm, ngư nghiệp :

- Chế tạo chế phẩm diệt côn trùng (bọ cánh cứng, bướm, ruồi, muỗi …)

từ các loài như Bacillus thuringiensis, Bacillus popiliae do các loài này có

khả năng xâm chiếm cơ thể côn trùng và sinh ra nội độc tố diệt côn trùng Chếphẩm sinh học tạo ra có khả năng diệt trừ sâu hại cao và ít gây ô nhiễm môitrường

- Tạo ra các chế phẩm sinh học từ các loài Bacillus subtilis, Bacillus

megatherium, Bacillus lichenliformis (chế phẩm Biochie) ứng dụng trong xử

lý nước nuôi thủy sản, có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, cải thiện môitrường nước

- Sản phẩm từ Bacillus subtilis có tác dụng hỗ trợ cây trồng, bổ sung

dinh dưỡng cho đất qua chu kỳ cacbon và chu kỳ nitơ của vi sinh vật, đồngthời chống lại các vi sinh vật khác gây bệnh cho cây

Trong công nghiệp:

- Chất tẩy rửa: sử dụng enzym protease pH kiềm

- Công nghiệp thuộc da

Trong dược phẩm, thực phẩm chức năng:

- Tạo ra các chế phẩm probiotic chống loạn khuẩn đường ruột, nhất làsau khi sử dụng kháng sinh dài ngày

- Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng một chủng Bacillus đơn độc (Biosubtyl II chứa Bacillus subtilis của công ty vắc xin và sinh phẩm số 2), hoặc kết hợp Bacillus với loài vi khuẩn có lợi khác (Bio-acimin).

1.2 Giới thiệu về Bacillus clausii

1.2.1 Đặc điểm sinh thái sinh sinh lý của Bacillus clausii

- Đặc điểm phân loại: Bacillus clausii thuộc

Bacillus clausii chủ yếu phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất,

có thể là vườn (Bacillus clausii KSM-K16, Bacillus clausii DSM8716, ATCC31084…), hoặc đất sét (Bacillus clausii DSM 9784…) Ngoài ra có thể tìm thấy Bacillus clausii ở trong nước (Bacillus clasausii MB được phân lập

từ mẫu nước vùng biển phía đông Ấn Độ), trong bùn… [6]

- Đặc điểm hình thái

Bacillus clausii có hình que đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi, là vi

khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử có hình bầu dục

Bacillus clausii có kích thước chiều rộng 1-2µm, chiều dài 5µm [9].

- Cấu trúc bộ gen

Bacillus clausii có cấu trúc bộ gen là một vòng tròn nhiễm sắc thể,

nhiễm sắc thể này gồm 4.303.871 nucleotide, gen này chứa 4.204 gen, trong

đó 4096 là protein mã hóa và mã hóa cho 96 RNA

Các nucleotid loại GC trong ADN của Bacillus clausii chiếm tỷ lệ cao nhất so với các Bacillus khác: chiếm 44% với chủng KSM- K16 và chiếm tới

49% với chủng GMBAE 42 [8], [18]

- Điều kiện nuôi cấy

Nhu cầu oxy: Bacillus clausii là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình

nuôi cấy cần có sự cấp khí

Về nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15-50oC Mỗi chủng có

nhiệt độ tối ưu riêng như: Bacillus clausii DSM 8716 có nhiệt độ tối ưu là

30oC, chủng Bacillus clausii KSM-K16 có nhiệt độ tối ưu là 40oC, Bacillus

clausii ATCC 31084 có nhiệt độ tối ưu là 37oC…[6], [11]

Về pH: khoảng pH nuôi cấy thích hợp là từ 7-10,5 Chủng Bacillus

claussii KSM-K16 có pH tối ưu là 9,0 [11].

Về dinh dưỡng: Bacillus clausii có thể sử dụng nhiều nguồn carbohydrat

khác nhau như: glucose, galactose, mannose, sorbitol, 2-ketogluconat…;nguồn nitơ, phospho, các nguyên tố vi lượng…

Trong môi trường lỏng (canh thang): Bacillus clausii có thể kết thành

chuỗi hoặc dạng tế bào đơn độc Trong môi trường đặc (thạch thường): tạokhuẩn lạc màu trắng, viền hơi nhăn

Hình 1.5 Bacillus clausii trên môi trường đặc

- Đặc điểm sinh hóa

Vi khuẩn Bacillus clausii có khả năng thủy phân được casein, gelatin và

tinh bột, nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60 Vi

khuẩn Bacillus clausii cho phản ứng oxidase, catalase dương tính, khử nitrat

thành nitrit

- Bào tử và khả năng tạo bào tử

Trong điều kiện không thuận lợi, Bacillus clausii hình thành nội bào tử

(endospore) theo cơ chế và cấu trúc bào tử gồm nhiều lớp vỏ bọc bền vững

giống như các Bacillus khác Bào tử của Bacillus clausii có dạng hình cầu,

kích thước 1,01±0,13 x 0,57± 0,05 μmm [12]

Hình 1.6 Bào tử Bacillus clausii dưới kính hiển vi điện tử

1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii

Bacillus clausii có hai ứng dụng quan trọng đó là: sản xuất enzym và sản

xuất chế phẩm probiotic

- Sản xuất enzym từ Bacillus clausii

Bacillus clausii có khả năng sản xuất nhiều loại enzym như: xylanase,

cellulase, amylase, và protease… Trong các enzym này quan trọng nhất làprotease Đây là nhóm enzym quan trọng, chiếm gần 60% tổng doanh số cácenzym trên thế giới Protease có ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau nhưchất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, thực phẩm… Protease cũng có thể được

sử dụng với mục đích thủy phân protein dạng sợi như sừng, lông và tóc [7]

- Sản xuất chế phẩm probiotic từ bào tử Bacillus clausii

Bào tử Bacillus clausii được sử dụng trong sản phẩm Enterogermina

(Sanofi - Aventis) – một chế phẩm probiotic có tác dụng hữu hiệu trong điều

trị tiêu chảy ở trẻ em Enterogermina chứa bào tử vi khuẩn Bacillus clausii

dưới 2 dạng: dạng huyền dịch trong ống nhựa (2 tỷ bào tử trong 5ml) và dạngviên nang (2 tỷ bào tử trong 1 viên nang) Enterogermina được chỉ định trongcác trường hợp:

 Ðiều trị và phòng ngừa rối loạn khuẩn chí đường ruột và bệnh lý kémhấp thu vitamin nội sinh

 Ðiều trị hỗ trợ để phục hồi hệ khuẩn chí đường ruột bị ảnh hưởng khidùng thuốc kháng sinh hoặc hóa trị liệu

 Rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em do nhiễm độc hoặc rối loạnkhuẩn chí đường ruột và kém hấp thu vitamin

Bacillus clausii có khả năng kháng kháng sinh, do đó khi sử dụng kháng

sinh nên uống chế phẩm xen kẽ với khoảng thời gian dùng kháng sinh Chế

phẩm sử dụng dạng bào tử vi khuẩn nên có nhiều ưu điểm là vi khuẩn qua dược dạ dày với tỷ lệ sống sót cao và điều trị rối loạn tiêu hóa hiệu quả.

Hình 1.7 Chế phẩm Enterogermina

Chế phẩm Enterogermina chứa bốn loài Bacillus clausii, mỗi loài kháng

một số loại kháng sinh nhất định: O/C kháng chloramphenicol, N/R khángnovobiocin và rifampicin, T kháng tetracycline, SIN kháng streptomycin vàneomycin [17]

Ngoài Enterogermina chứa bào tử Bacillus clausii còn một số chế phẩm khác chứa Bacillus clausii như: Progemila, Erceflora, Bazivic, Probacin,

Enterum

Hình 1.8 Chế phẩm Erceflora Hình 1.9 Chế phẩm Bazivic

1.3 Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

Nuôi cấy bề mặt

Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khảnăng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm Khi nuôi nấm mốc pháttriển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triểnđâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm Đối với một số mụcđích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuấttương), hạt đậu tương (đậu tương lên men-misô) đã được nấu chín trộn hạtcốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương)

Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia

là trấu Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều,không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc Tỉ lệcác chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyênliệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ((NH4)2SO4, (NH4)2CO3), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinhtrưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu [2]

Nuôi cấy chìm

Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếutrong đa số trường hợp là tinh bột Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùngnguồn cơ chất cacbon là đường glucose, saccharose Thực tế, trong một sốtrường hợp đường hoá sơ bộ tinh bột trước khi thanh trùng Khi đó đườngmaltose được tạo thành là chất cảm ứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớtnên dễ dàng cho quá trình khuấy trộn và sục khí [2] Phương pháp nuôi cấychìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanhtrùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quátrình nuôi cấy [2]