NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Với mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu chứa hàm lượng Plumbagin cao thông qua nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà, trên cơ sở: chọn cơ quan thực vật phù hợp dùng chuyển gen; xác định hiệu quả chu

-

TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH

HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ

NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY

IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2016

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH

HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ

NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY

IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật

Mã số: 62.42.01.12

Người hướng dẫn khoa học:

1 Chức danh, tên GV1: TS NGUYỄN HỮU HỔ

2 Chức danh, tên GV2: PGS.TSKH NGÔ KẾ SƯƠNG

Hà Nội – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng

để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận án Nghiên cứu sinh

Bùi Đình Thạch

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành nghiên cứu này, tác giả xin chân thành cảm ơn:

- Các thầy giáo hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Hổ và PGS.TSKH Ngô Kế Sương luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu

- Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, Bộ phận đào tạo sau Đại học của Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi và quan tâm sâu sắc trong công việc và thực hiện nghiên cứu

- Các Thầy/Cô, Anh/Chị, Đồng nghiệp và Bạn bè đã hỗ trợ trong công tác chuyên môn, ủng hộ tinh thần và cho những ý kiến xác đáng trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Đặc biệt, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến Ba, Mẹ và Gia đình luôn hỗ trợ về vật chất và tinh thần

Nghiên cứu sinh

Bùi Đình Thạch

TÓM TẮT

Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) là một cây dược liệu quan trọng, rễ

cây chứa thành phần chính là Plumbagin, một naphthoquinone có nhiều đặc tính dược liệu được quan tâm, như: kháng tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm

và kháng côn trùng Với mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu chứa hàm lượng Plumbagin cao thông qua nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà, trên cơ sở: chọn cơ quan thực vật phù hợp dùng chuyển gen; xác định hiệu quả chuyển gen dưới tác động đồng thời của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone; xác định tác động đồng thời của một số yếu tố (điều kiện nuôi cấy, môi trường, dinh dưỡng và elicitor) lên khả năng sinh trưởng, tích lũy Plumbagin trong rễ tơ và đánh giá biểu hiện tác động kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin

Kết quả nghiên cứu đã xác định lá là cơ quan được chọn để chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà, có sự tác động đồng thời giữa thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone lên hiệu quả chuyển gen theo đó Acetosyringone 134,09

µM và 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC

11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,025%) Khả năng phát triển của rễ tơ cây Bạch hoa xà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, theo đó: môi trường MS,

rễ được nuôi ở điều kiện tối và môi trường ở dạng lỏng là điều kiện tối ưu cho sự phát triển sinh khối rễ tơ

Sử dụng ma trận Plackett-Burman (Plackett, Burman 1946) để đánh giá tác động đồng thời của nhiều yếu tố (dinh dưỡng và elicitor) lên khả năng sinh trưởng và tích lũy Plumbagin, qua đó đã chọn lọc và xác định được điều kiện môi trường nuôi cấy rễ tơ có bổ sung: nước dừa: 14,30%, chitosan 100 mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L và peptone 500 g/L thu được kết quả tối ưu với trọng

lượng tươi 5,268 g, trọng lượng khô: 0,46 g và hàm lượng Plumbagin: 13,135

mg

Ngoài ra, hoạt tính của Plumbagin cũng được kiểm chứng qua việc cảm ứng sự biểu hiện các đặc điểm hình thái cũng như thay đổi sự cân bằng trong biểu hiện một số gene liên quan tới quá trình chết của tế bào HepG2, thông qua mật độ trung bình của tế bào HepG2 giảm, sự phân mảnh của nhân và sự biểu

hiện của gene (bax và bcl-2) liên quan đến quá trình apoptosis

ABSTRACT

Plumbago zeylanica L is an important pharmaceutical plant Its roots

contain high quantity of Plumbagin, a naphthoquinone that has positive effects against cancer cells, bacteria, fungi as well as insects This research aims to

produce Plumbagin sources through culturing Plumbago zeylanica L hairy roots

on the selection of suitable plant segment for transgene The study also identifies the transgene efficiency under effects of incubation time and acetosyringone concentration; identifies other factors (culturing condition, media, nutrition and elicitor) on plant growth and plant capacity to accumulate Plumbagin in hairy roots and evaluates anticancer effect of Plumbagin on liver carcinoma

This study showed that the highest transgenic efficiency (0.025%) was achieved when leaf segment was used to generate transgenic hairy roots in 3.47

days of incubation with Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 at 134.09 µM acetosynringone P Zeylanica L hairy roots showed to be grow best in liquid

MS media and in dark condition

Using Plackett-Burman (Plackett Burman, 1946) matrix to analyse efficiency of co-factors, the optimum condition for hairy roots to grow and accumulate Plumabagin was media supplemented with 14.30 % coconut water,

100 mg/L chitosan, 19.40 mg/L salicyclic acid and 500 g/L peptone With the listed condition, the best result achieved were 5.268 g fresh weigh and 0.46 g dry weight of hairy roots, with plumbagin content was 13.135 mg

Besides, plumbagin had effects on physiology of liver cancer cells It also affects some apoptotic genes of HepG2 cells The results showed that there were

a reduction in number of HepG2 cells, fragmentation in nucleus and expression

of apoptotic bax and bcl-2 genes

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 4

TỔNG QUAN 4

1.1 Cây Bạch hoa xà 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Thành phần hóa học 5

1.1.4 Công dụng của dịch trích ly từ rễ cây BHX 6

1.2 Plumbagin 7

1.2.1 Cấu trúc và đặc tính hóa học 7

1.2.2 Sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật 7

1.2.3 Hoạt tính của Plumbagin 8

1.2.3.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 8

1.2.3.2 Hoạt tính kháng viêm 9

1.2.3.3 Hoạt tính kháng ung thư 10

1.2.3.4 Hoạt tính kháng khuẩn 12

1.2.3.5 Hoạt tính kháng nấm 13

1.2.4 Độc tính của plumbagin 13

1.2.5 Tình hình nghiên cứu thu nhận hoạt chất Plumbagin từ thực vật 16

1.3 Chuyển hóa thứ cấp từ thực vật 20

1.3.1 Hợp chất thứ cấp từ thực vật 20

1.3.2 Con đường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp 21

1.3.3 Dược tính của các hợp chất thứ cấp từ thực vật 24

1.4 Sự cần thiết nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp 25

1.4.1 Sự hình thành rễ tơ ở thực vật 27

1.4.2 Chuyển gen tạo rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes 28

1.4.2.1 Ri-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 28

1.4.2.2 Sự chuyển nạp gen từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế bào thực vật 29

1.4.2.3 Sự biểu hiện của các gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trong mô thực vật 32

1.4.2.4 Tạo rễ tơ ở thực vật bằng Agrobacterium rhizogenes 39

1.5 Nuôi cấy rễ tơ ở thực vật 40

1.5.1 Ảnh hưởng của dòng rễ tơ 41

1.5.2 Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy 41

1.5.3 Ảnh hưởng của elicitor 43

1.5.4 Nuôi cấy rễ tơ để thu nhận các hoạt chất thứ cấp 44

CHƯƠNG 2 48

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 48

2.1 Vật liệu 48

2.1.1 Nguyên vật liệu 48

2.1.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy 49

2.2 Phương pháp thực nghiệm 49

2.2.1 Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho chuyển gen 49

2.2.1.1 Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu 49

2.2.1.2 Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ 50

2.2.1.3 Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro 52

2.2.1.4 Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân cây Bạch hoa xà in vitro 52

2.2.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ 54

2.2.2.1 Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ 54

2.2.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của gen rol trong T-DNA của vi khuẩn hợp nhất được vào bộ gen tế bào rễ tơ bằng phương pháp PCR 56

2.2.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt chất plumbagin trong nuôi cây rễ tơ cây Bạch hoa xà 58

2.2.3.1 Ảnh hưởng trạng thái môi trường 58

2.2.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng sinh trưởng

của rễ tơ 59

2.2.3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ 59

2.2.3.4 Ảnh hưởng khối lượng ban đầu 60

2.2.3.5 Xác định đường cong tăng trưởng 60

2.2.3.6 Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng của rễ tơ 61

2.2.4 Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ 62

2.2.4.1 Ly trích và chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC 62

2.2.4.2 Định tính Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) 63

2.2.4.3 Định lượng Plumbagin bằng HPLC 63

2.2.5 Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin 64

2.2.6 Xử lý số liệu 67

CHƯƠNG 3 68

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68

3.1 Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro 68

3.1.1 Xác định điều kiện khử trùng mẫu 68

3.1.2 Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ 70

3.1.3 Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro 73

3.1.4 Khảo sát khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa xà in vitro 75

3.2 Chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà 79

3.2.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ 79

3.2.2 Xác định hoạt chất Plumbagin tích lũy trong rễ tơ 85

3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp Plumbagin 87

3.3.1 Trạng thái môi trường 87

3.3.2 Điều kiện chiếu sáng 88

3.3.3 Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ 89

3.3.4 Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy 91

3.3.5.Xác định đường cong tăng trưởng 92

3.3.6 Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy 94

3.4 Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin 101

CHƯƠNG 4 107

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 107

4.1 Kết luận 107

4.2 Đề nghị 108

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 109

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NSCLC Non-small cell lung cancer

B5 Gamborg's B-5

SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG

1.1 Một số kết quả ghi nhận trong nghiên cứu in vitro thu nhận

Plumbagin

16, 17,

18, 19

2.1 Điều kiện khử trùng đoạn thân cây Bạch hoa xà để tạo mẫu in

vitro

49

2.2 Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thử nghiệm

tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây Bạch hoa xà

51

2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng

thực vật đến khả năng hình thành và phát triển rễ bất định

mẫu in vitro

53

2.4 Ảnh hưởng của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone lên

tỉ lệ chuyển gen

55

2.7 Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự sinh

trưởng rễ tơ

62

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước Javel và thời

gian khử trùng tạo mẫu in vitro từ đoạn thân cây Bạch hoa xà

69

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh

trưởng thực vật đến khả năng tạo chồi từ chồi bên in vitro của

71

3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự phát triển cây

Bạch hoa xà từ chồi in vitro sau 2 tuần nuôi cấy

75

3.4 Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ

bất định từ lá và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy

76, 77

3.5 Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acetosyringone đến mô nuôi

và tỉ lệ mẫu chuyển gen

83

3.7 Ảnh hưởng trạng thái môi trường nuôi đến khả năng sinh

trưởng rễ tơ cây Bạch hoa xà

87

3.8 Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây

Bạch hoa xà

89

3.9 Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ BHX

nuôi cấy

90

3.10 Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả năng sinh trưởng rễ

tơ BHX nuôi cấy

92

3.11 Sự thay đổi trọng lượng rễ và hàm lượng Plumbagin theo thời

gian

94

3.12 Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự

sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy

95

3.13 Mức tác động của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự

sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy

96

cấy

3.15 Phân tích phương sai và phương trình hồi quy theo mô hình

D-Optimal

100

3.16 Tế bào HepG2 sau 3 ngày cảm ứng Plumbagin ở các nồng độ

khác nhau

102

3.17 Tỉ lệ đứt gãy DNA trong đuôi và tỉ lệ chiều dài đuôi

comet/chiều dài comet

104

DANH MỤC HÌNH

1.5 Sinh tổng hợp và trao đổi các chất thứ cấp ở các bào quan 23

1.8 Sơ đồ nuôi cấy rễ tơ bằng vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes

40

3.3 MS + 1,5 mg/L BA + 0,1 mg/L IBA sau 4 tuần nuối cấy 72 3.4 Các nghiệm thức E0, E1, E2, E3, E4, E5, E6 sau 2 tuần nuôi

cấy

74