Luận văn nghiên cứu bệnh virus trên đu đủ và bầu bí do papaya ringspot virus (PRSV)

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


 -

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUS TRÊN ðU ðỦ VÀ BẦU BÍ

DO PAPAYA RINGSPOT VIRUS (PRSV)

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : BẢO VỆ THỰC VẬT

Mã số : 60.62.10

Người hướng dẫn khoa học: TS HÀ VIẾT CƯỜNG

HÀ NỘI - 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Kết quả nghiên cứu trong luận văn là kết quả lao ñộng của chính tác giả Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hải Yến

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ ii

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành ựề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi ựã nhận ựược rất nhiều sự quan tâm giúp ựỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân

Trước tiên, tôi xin ựược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo

TS Hà Viết Cường - Giám ựốc Trung tâm Bệnh cây nhiệt ựới - Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã tận tình hướng dẫn, giúp ựỡ tôi trong quá trình thực hiện

ựề tài và hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin ựược gửi lời chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Nông học, Viện đào tạo Sau ựại học

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các bà con nông dân tại nhiều nơi ựã tạo ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện ựề tài

Tôi cũng xin ựược chân thành cảm ơn các cán bộ tại Trung tâm Bệnh cây nhiệt ựới, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã nhiệt tình giúp ựỡ và tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện ựề tài

Bên cạnh ựó tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn

bè những người luôn bên cạnh ựộng viên giúp ựỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện bản luận văn này

Hà Nội, ngày 06 tháng 01 năm 2012

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hải Yến

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ iv

4.2.1 Bệnh virus trên cây bắ xanh tại đông Anh năm 2011 394.2.2 Bệnh virus trên cây bắ ngô tại đông Anh năm 2011 434.2.3 Bệnh virus trên bắ ngồi tại đông Anh năm 2011 46

4.3 đánh giá ảnh hưởng của bẫy màu vàng và bẫy phản xạ tới tỷ lệ

4.3.1 Ảnh hưởng của bẫy màu vàng tới tỷ lệ bệnh ựốm hình nhẫn trên ựu ựủ 544.3.2 Ảnh hưởng của bẫy phản xạ tới tỷ lệ bệnh ựốm hình nhẫn trên ựu ựủ 554.3.3 Ảnh hưởng của dùng bẫy phản xạ kết hợp loại bỏ lá vàng tới tỷ lệ

4.4 đánh giá ảnh hưởng của dùng bẫy phản xạ kết hợp loại bỏ lá vàng

4.5 đánh giá khả năng tạo tắnh kháng tập nhiễm hệ thống chống PRSV

EPPO European and mediterranean plant protection organization

Viện KHNNVN Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam

ðHNN Hà Nội ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ vi

2.3 Diện tắch, năng suất và sản lượng một số loại rau chủ lực năm 2004 19

4.1 Kết quả ựiều tra bệnh ựốm hình nhẫn trên ựu ựủ tại đông Anh năm 2011 364.2 ELISA phát hiện PRSV trên các mẫu ựu ựủ bị bệnh năm 2011 384.3 Kết quả ựiều tra bệnh virus gây hại trên bắ xanh tại đông Anh năm 2011 414.4 ELISA phát hiện PRSV trên bắ xanh bệnh năm 2011 424.5 Kết quả ựiều tra bệnh virus trên bắ ngô tại đông Anh năm 2011 444.6 ELISA phát hiện PRSV trên bắ ngô bệnh năm 2011 454.7 Kết quả ựiều tra bệnh virus gây hại trên bắ ngồi tại đông Anh năm 2011 474.8 ELISA phát hiện PRSV trên bắ ngồi tại đông Anh năm 2011 484.9 Kết quả ựiều tra bệnh virus trên tập ựoàn dòng/giống dưa chuột tại

trường đH Nông nghiệp Hà Nội năm 2011 (giai ựoạn ra quả) 514.10 ELISA phát hiện PRSV trên cây dưa chuột bị bệnh virus năm 2011 524.10 Ảnh hưởng của bẫy màu vàng tới sự xuất hiện rệp muội và bệnh

4.11 Kết quả ựánh giá ảnh hưởng của bẫy phản xạ tới bệnh ựốm hình

4.12 Ảnh hưởng của bẫy phản xạ kết hợp loại bỏ lá vàng tới bệnh ựốm

4.13 Anh hưởng của bẫy phản xạ kết hợp loại bỏ lá vàng tới bệnh virus

4.14 Các mô hình dịch bệnh ựược dùng ựể ựánh giá sự phát triển của

bệnh virus trên cây bắ ngồi ở trong thắ nghiệm ựánh giá ảnh hưởng

4.15 Thắ nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên cây ựu ựủ ựược xử lý 3 hóa chất 634.16 Thắ nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên cây bắ ngồi (nguồn PRSV trên

4.17 Thắ nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên cây bắ ngồi (nguồn PRSV trên

4.18 Một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây bắ ngồi sau lây nhiễm nhân tạo

với PRSV 1 tuần trong thắ nghiệm kắch kháng với 3 hóa chất 704.19 đánh giá tắnh gây bệnh của PRSV trên cây ựu ựủ và bầu bắ 73

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

2.1 Triệu chứng trên lá bắ ngô (pumpkin) và lá bắ xanh (squash) 8

2.3 Triệu chứng trên lá và trên quả dưa chuột (cucumber) 12

4.3 Bốn dạng tr.iệu chứng bệnh virus trên bắ xanh tại đông Anh năm 2011 40

4.4 Triệu chứng bệnh virus trên bắ ngô tại đông Anh năm 2011 43

4.5 Triệu chứng bệnh virus trên bắ ngồi tại đông Anh năm 2011 46

4.6 Triệu chứng bệnh virus trên tập ựoàn giống dưa chuột thắ nghiệm

4.7 Triệu chứng bệnh virus trên dưa chuột bao tử tại Tân Yên Ờ Bắc

4.8 Lá già trên cây ựu ựủ nhanh chóng chuyển màu vàng 53

4.9 Bố trắ thắ nghiệm bẫy màu vàng (ảnh trái) và cây ựu ựủ thắ nghiệm

4.10 Bố trắ thắ nghiệm bẫy phản xạ (ảnh trái) và cây ựu ựủ thắ nghiệm

4.11 đường diễn biến bệnh và ựường hồi qui tuyến tắnh ở 2 công thức thắ

nghiệm ựánh giá ảnh hưởng của dùng bẫy phản xạ và loại bỏ lá

4.12 Bố trắ thắ nghiệm bẫy phản xạ (ảnh trái) và cây bắ ngồi nghiệm

4.13 Phân tích hồi qui tuyến tính dựa trên giá trị ñổi biến của tỷ lệ bệnh

ñốm hình nhẫn ở 2 công thức thí nghiệm ñánh giá ảnh hưởng của dùng bẫy phản xạ và loại bỏ lá vàng ñến bệnh ñốm hình nhẫn ñu ñủ 61

4.14 Thí nghiệm ñánh giá tính kháng SAR trên ñu ñủ và bí ngồi 62

4.15 Thí nghiệm ñánh giá tính kháng SAR trên ñu ñủ chống PRSV 64

4.16 Thí nghiệm ñánh giá tính kháng SAR trên ñu ñủ chống PRSV 64

4.17 Thí nghiệm ñánh giá tính kháng SAR trên ñu ñủ chống PRSV 65

4.18 Các cây bí ngồi ở các công thức thí nghiệm sau lây nhiễm PRSV 1 tuần 71

4.19 Triệu chứng nhiễm PRSV trên bí ngồi sau lây nhiễm 1 tuần 71

4.20 Triệu chứng lùn trên bí ngồi ở các cây thí nghiệm sau lây nhiễm 1 tuần 71

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 1

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Sản xuất nông nghiệp ở nước ta hiện nay ngày càng phát triển và ñã ñạt ñược những thành tựu to lớn về năng suất cũng như chất lượng nông sản Tuy vậy, năng suất nông sản của chúng ta vẫn bấp bênh theo từng vụ, từng năm do ảnh hưởng của thời tiết, thiên tai, dịch hại mà ñặc biệt là do các bệnh hại, trong

ñó bệnh virus gây thiệt hại ñáng kể

Bệnh virus gây thiệt hại lớn nhất không phải là làm cho cây trồng bị chết nhanh chóng mà chính là chúng làm cho cây bị thoái hóa, giảm sức sống, dần dần tàn lụi Ở cây lâu năm một số virus gây nên hiện tượng mất triệu chứng làm cho người sản xuất nhầm lẫn, không phát hiện ñược bệnh, ñến lúc cây tàn lụi, khi ñó người sản xuất mới biết thì ñã quá muộn Ngoài ảnh hưởng ñến sức sống của cây, bệnh virus còn ảnh hưởng lớn tới sản phẩm cuối cùng như làm biến dạng quả, giảm năng suất và chất lượng quả

Trong số các cây trồng nông nghiệp ở Việt Nam cũng như trên thế giới,

ñu ñủ ñược xem là cây ăn quả quan trọng vì dễ trồng và có giá trị dinh dưỡng cao, có thể ñược ăn tươi hoặc chế biến Tương tự, các cây họ bầu bí như dưa chuột, bí ngô, bí xanh và gần ñây là bí ngồi là các cây rau ăn quả quan trọng và phổ biến

Cả ñu ñủ và bầu bí hiện ñang phải ñối mặt với một nhóm bệnh quan trọng

là bệnh virus Bệnh ñốm hình nhẫn ñu ñủ có thể ñược xem là bệnh virus nguy hiểm nhất ở tất cả các nước trồng ñu ñủ Tại Việt Nam, các vườn ñu ñủ sau trồng khoảng 3-4 tháng thường bị nhiễm bệnh 100% Bệnh ñốm hình nhẫn ñu ñủ không làm chết cây nhưng ảnh hưởng rất mạnh tới sinh trưởng của cây ñu ñủ Lá cây bệnh bị khảm, có ñốm hình nhẫn và bị biến dạng dữ dội, ñặc biệt trên các lá non Quả ñu ñủ bệnh thường bị biến dạng mạnh, chất lượng kém, năng xuất thấp

và các vết ñốm hình nhẫn trên vỏ quả làm giảm mạnh giá trị thương phẩm

Trên cây họ bầu bí, bệnh khảm lá cũng rất phổ biến, ñặc biệt trên các cây bí ngô, bí xanh dưa chuột, bí ngồi và các loại dưa Gọi là bệnh khảm nhưng triệu chứng khác kèm theo thường là cây sinh trưởng còi cọc, lá và quả bị biến dạng dữ dội Hậu quả là năng suất, chất lượng cũng như giá trị thẩm mỹ của quả bị giảm mạnh

Bệnh ñốm hình nhẫn ñu ñủ cũng như bệnh khảm lá trên cây họ bầu bí

ñã ñược xác ñịnh là do Papaya ringspot virus (PRSV) gây ra PRSV là một

virus có bộ gen RNA, thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae Virus PRSV có phổ ký chủ hẹp Ngoài tự nhiên, PRSV gây bệnh ñốm hình nhẫn ñu ñủ và khảm lá trên cây họ bầu bí khắp thế giới PRSV không truyền qua hạt giống nhưng lan truyền ngoài tự nhiên bằng nhiều loài rệp muội họ Aphididae theo kiểu không bền vững

Việc phòng chống bệnh do PRSV trên ñu ñủ và cây họ bầu bí nhìn chung rất khó Một số biện pháp phòng chống PRSV ñã ñược thử nghiệm trên thế giới bao gồm (i) lây nhiễm trước ñu ñủ với chủng PRSV yếu ñể tạo tính kháng chéo với chủng PRSV ñộc hơn, (ii) trồng cây trong nhà lưới chống côn trùng và (iii) gần ñây hơn là tạo cây ñu ñủ chuyển gen vỏ protein (Coat protein, CP) của virus

ñể tạo tính kháng Các biện pháp trên mặc dù ñã ñược chứng tỏ hiệu quả trong ñiều kiện thí nghiệm nhưng không ñược áp dụng rộng rãi do các lo ngại về khả năng ñột biến của chủng PRSV yếu thành chủng ñộc, không hiệu quả về kinh tế hoặc các quan ngại liên quan ñến sinh vật biến ñổi gen

Một số các biện pháp phòng chống virus ñã từng ñược thử nghiệm trên các ñối tượng virus không phải PRSV bao phòng chống vector dùng bẫy xua ñuổi hoặc tạo tính kháng tập nhiễm hệ thống (Systemic Acquired Resystance, SAR) bằng cách xử lý cây với một số hóa chất như Salicylic Acid (SA) và Acybenzolar-S-Methyl (BION) Tính kháng tập nhiễm hệ thống là tính kháng

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 3

phổ rộng, chống ựược nhiều tác nhân gây bệnh kể cả virus Tuy nhiên các biện pháp này chưa từng ựược thử nghiệm ựối với PRSV

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, ựược sự phân công của Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của

TS Hà Viết Cường, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, thực hiện ựề tài: ỘNghiên cứu bệnh virus trên ựu ựủ và bầu bắ do Papaya ringspot virus (PRSV)Ợ

1.2 Mục ựắch và yêu cầu của ựề tài

1.2.1 Mục ựắch

(i) đánh giá hiện trạng bệnh do PRSV trên ựu ựủ và một số cây trồng họ

bầu bắ ánh; (ii) bước ựầu tìm hiểu khả năng áp dụng biện pháp phòng chống

bệnh bằng ngăn chặn vector rệp muội và tạo tắnh kháng tập nhiễm hệ thống

1.2.2 Yêu cầu

- điều tra bệnh virus trên ựu ựủ và bầu bắ do PRSV

- Xác ựịnh bệnh virus trên ựu ựủ và bầu bắ do PRSV bằng ELISA

- đánh giá hiệu qủa của biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh như sử dụng bẫy màu vàng, bẫy phản xạ trong phòng trừ bệnh virus trên ựu ựủ và bầu bắ

do PRSV

- đánh giá khả năng tạo tắnh kháng tập nhiễm chống PRSV trên cây ựu ựủ

và bầu bắ bằng sử dụng chất kắch kháng

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Những nghiên cứu ngoài nước

2.1.1 Nguồn gốc xuất sứ và tình hình sản xuất cây ñu ñủ và cây họ bầu bí

ðu ñủ (Carica papaya L.) là một cây ăn quả có nguồn gốc Châu Mỹ ñược

trồng rộng khắp các vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới trên thế giới Theo thống kê của FAO năm 1988, tổng sản lượng ñu ñủ toàn thế giới khoảng 3,68 triệu tấn, trong ñó Châu Á chiếm 25% Các quốc gia trồng nhiều ñu ñủ trên thế giới là Brazin, Mexico, Ấn ðộ, Công Gô

ðu ñủ là quả nhiệt ñới chính ở Philippin, nó ñứng thứ 6 trong vùng và sản xuất Năm 2003, sản lượng nội ñịa ñạt ñược 131000 tấn trên 8900 ha Sản lượng xuất khẩu của ñu ñủ Solo ñang tăng ở miền Nam của Philippin Trên 1% sản lượng của ñu ñủ toàn cầu, khoảng 5,8 triệu tấn là của Phipippin

Sự mong ñợi chính của các chợ trong nước, ñu ñủ ñược trồng chủ yếu bởi các nông dân nhỏ lẻ với rất ít các ứng dụng trong ñầu tư Năng suất trung bình thấp, chỉ khoảng 14 tấn/ha Sản xuất theo thương mại ñạt 70 – 90 tấn/ha Năng suất thay ñổi bởi côn trùng, bệnh hại và virus Thậm chí năng suất gần ñây vẫn

thấp mặc dù trồng những giống năng suất cao vì sự tác ñộng của Papaya

ringspot virus (PRSV)

Dưa chuột (Cucumis sativus) (miền Nam gọi là dưa leo) là một cây trồng

phổ biến trong họ bầu bí Cucurbitaceae, là loại rau ăn quả thương mại quan trọng, nó ñược trồng lâu ñời trên thế giới và trở thành thực phẩm của nhiều nước Những nước dẫn ñầu về diện tích gieo trồng và năng suất là: Trung Quốc, Nga, Nhật Bản, Mỹ, Hà Lan, Thổ Nhĩ Kỳ, Ba Lan, Ai Cập và Tây Ban Nha

* Tình hình sản xuất

Theo số liệu thống kê từ FAO, năm 2007 diện tích trồng dưa chuột trên thế

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5

giới khoảng 2.583,3 ha, năng suất ñạt 17,27 tấn/ha, sản lượng ñạt 44160,94 nghìn tấn Số liệu từ bảng thống kê cho thấy Trung Quốc là nước có diện tích trồng dưa chuột lớn nhất với 1.653,8 ha chiếm 64,02% so với thế giới Về sản lượng Trung Quốc vẫn là nước dẫn ñầu với 28062 nghìn tấn, chiếm 62,09% tổng sản lượng dưa chuột của thế giới Sau Trung Quốc là Nhật Bản với sản lượng

634 nghìn tấn chiếm 1,42% của thế giới Như vậy chỉ riêng 2 nước Trung Quốc

và Nhật Bản ñã chiếm 64,32% tổng sản lượng của toàn thế giới

Bảng 2.1: Tình hình sản xuất dưa chuột của một số nước trên thế giới qua

các năm 2006, 2007

Nguồn FAO.org

Nhìn chung diện tích, năng suất và sản lượng dưa chuột của các nước trên thế giới ñều tăng qua các năm Do nhu cầu về rau xanh nói chung và dưa chuột nói riêng của người tiêu dùng ngày càng cao khi lương thực và các loại thức ăn giàu ñạm ñược ñảm bảo ðặc biệt là ở các nước phát triển như Trung Quốc, Nhật Bản, Anh, Canada, ðức

Sản lượng (nghìn tấn) Quốc gia

kg/người/năm; Newzealand 136,7 kg/người/năm, Hà Lan lên tới 202 kg/người/năm, ở Canada mức tiêu thụ rau bình quân hiện nay là 227 kg/người/năm

Trước nhu cầu về rau ngày càng tăng, một số nước trên thế giới ñã có những chính sách nhập khẩu rau khác nhau Năm 2005, nước nhập khẩu rau nhiều nhất thế giới là Pháp ñạt 145,224 nghìn tấn; sau Pháp là các nước như: Canada (143,332 nghìn tấn); Anh (140,839 nghìn tấn); ðức (116,866 nghìn tấn) Trong khi ñó, 5 nước chi tiêu cho nhập khẩu rau lớn trên thế giới là: ðức (149.140 nghìn USD); Pháp (132.942 nghìn USD); Canada (84.496 nghìn USD); Trung Quốc (80.325 nghìn USD); Nhật Bản (75.236 nghìn USD) Riêng ñối với dưa chuột ñã trở thành mặt hàng xuất nhập khẩu quan trọng ở một số nước trên thế giới

Mặc dù bí ngô (Curcurbita pepo L var pepo) trồng ở hầu hết các hạt của

California, sản xuất có xu hướng tập trung gần khu dân cư bởi vì hầu hết các quả

bí ngô ñược bán tại thị trường ñịa phương hoặc trực tiếp cho người tiêu dung San Joaquin sản xuất nhất, tiếp theo là Sutter Mặc dù hầu hết bí ngô ñược trồng cho mùa Halloween, họ cũng phát triển cho mục ñích trang trí Bí ngô giàu vi lượng Quả có thịt màu vàng, trong 100g thịt bí ngô có 0,9g protein, 5 - 6g gluxit, ngoài ra còn có nhiều vitamin như B1, B2, PP, B6 ñặc biệt có 400g vitamin B5 và có cả các axit béo quý như linoleic, linolenic, 28 mg beta - caroten Bí ngô còn có nhiều nguyên tố vi lượng và các axit amin như: alanine, valin, leucin, cystin, lysin Hạt bí ngô chứa nhiều dầu béo và có tác dụng trừ giun sán rất tốt Từ lâu người dân ñã dùng hạt bí ăn sống hoặc rang chín ñể trừ giun sán có hiệu quả Trong 100g màng ñỏ bao quanh hạt có tới 250 mg beta - caroten và ngay cả trong 100g lá tươi của bí ngô cũng chứa 1 mg beta - caroten

Dưa hấu (Citrullus lanatus) là cây trồng chính ở miền Nam nước Mỹ

Trên thế giới, trên 10 virus ñược biết gây hại cho sản xuất dưa hấu (Provvidenti,

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 7

1986b) Hầu hết những virus gây bệnh cho dưa hấu ở Mỹ do Papaya ringspot

virus Ờ type W (PRSV-W), watermelon mosaic virus (WMV) và zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) (Namba, 1992), (Adlerz and Crall, 1967)

Biện pháp trừ bệnh do PRSV là khó khăn, chủ yếu là dùng biện pháp diệt trừ vector truyền bệnh

2.1.2 Những nghiên cứu về bệnh virus hại cây ựu ựủ và bầu bắ

Virus PRSV gây bệnh ựốm hình nhẫn ựu ựủ ựược phát hiện ựầu tiên bởi Jensen vào năm 1949 ở Mỹ Sau ựó virus lần lượt ựược phát hiện và công bố ở khắp các quốc gia trồng ựu ựủ trên thế giới, ựặc biệt là ở vùng nhiệt ựới và cận nhiệt ựới (Brunt, 1996; Purcifull, 1972; Gonsalves, 1984)

Các vùng Caribe, Ấn độ, các nước Nam Mỹ, đài Loan, Nhật Bản, đức, Nigeria, Pháp, Philippin, Malaixia, Úc, Trung Quốc

PRSV là trở ngại chắnh và gây thiệt hại nhiều nhất cho nghề trồng ựu ựủ trên thế giới

Các nghiên cứu ở Philippin năm 1984 cho thấy khoảng 200ha ựu ựủ bị nhiễm PRSV với tỷ lệ 60 Ờ 100%, thiệt hại kinh tế 300.000USD Sản lượng ựu

ựủ ở Nam Tagolo giảm từ 36.000 tấn năm 1981 xuống còn 10.000 tấn năm 1987 (Bay et al.) (1997)

Ở Brazin bệnh do PRSV gây ra gần như xóa sổ cây ựu ựủ ở Bang Sao Paulo Diện tắch trồng ựu ựủ giảm từ 7188 ha (1977) xuống còn 4374 ha (1980),

906 ha (1986) và 234 ha (1989)

Ở đài Loan, PRSV ựược phát hiện thấy lần ựầu tiên ở miền Nam năm

1975 Hai năm sau virus lan khắp vùng duyên hải phắa đông và phá hủy gần hết các vườn ựu ựủ thương mại ở ựó Tổng sản lượng ựu ựủ giảm từ 41.595 tấn (1974) xuống còn 18.950 tấn (1977) Hiện tại ựu ựủ ở đài Loan ựã trở thành cây hàng năm thay vì cây lâu năm do PRSV và đài Loan ựã ựánh mất thị trường xuất khẩu ựu ựủ sang Hồng Kong và Nhật Bản, thậm chắ cung cấp cho nội ựịa

cũng không ñủ

PRSV có 2 type: Type P ký hiệu là P và Type W ký hiệu là

PRSV-W PRSV-P nhiễm trên cây ñu ñủ và một số cây họ bầu bí PRSV-W chỉ nhiễm trên cây họ bầu bí mà không nhiễm trên cây ñu ñủ

PRSV-W trước ñây ñược xem là Watermelon mosaic virus (WMV-1)

nhưng Hội nghị quốc tế về phân loại virus thực vật (1995) lại coi WMV-1 là một type của PRSV tức là PRSV-W

Tuy nhiên từ những kết quả nghiên cứu mới nhất dựa trên phân tích cấu trúc bộ gen virus tại Úc năm 1996, J.L Dale, Brunt et al vẫn cho rằng PRSV-P

và PRSV-W là 2 virus riêng biệt Ngoài ra việc phân tích các gen tạo vỏ protein của các isolate PRSV từ Úc, Thái Lan, Mỹ cũng cho thấy ở mỗi nước các isolate của PRSV-P là ñộc lập với các isolate của PRSV-W tại nước ñó (Brunt, 1996; Dale, 1997)

Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) làm cho cây trồng còi cọc,

phiến lá nhỏ và không ñều, lá khảm chỗ tối chỗ xanh chỗ phồng lên (hình 2.1) Quả biến dạng, nổi u và mất màu

Hình 2.1: Triệu chứng trên lá bí ngô (pumpkin) và lá bí xanh (squash)

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 9

PRSV-W trước ñây có tên là Watermelon mosaic virus (WMV-1) Nó là

một potyvirus, với sợi dài 760-800 x 12 nm và có lõi là RNA Phổ ký chủ của PRSV-W là họ bầu bí và ñu ñủ PRSV-P có huyết thanh giống hệt PRSV-W nhưng có khả năng làm ñộc bầu bí và ñu ñủ PRSV-P có ảnh hưởng kinh tế ít hơn tới sản xuất bầu bí PRSV-W có vector truyền bệnh là các loài rệp muội

Cucumber mosaic virus (CMV) ñược tìm thấy khắp nơi trên thế giới và

gây bệnh trên hơn 800 loài cây (cây trồng và cây dại), bao gồm họ bầu bí

CMV làm cây phát triển còi cọc, lá bị biến dạng, giảm kích thước, quăn

và cuộn lại, có vết khảm vàng hoặc vết chấm lốm ñốm với các khoảng vàng Lá non trên ñỉnh sinh trưởng có thể biến dạng hình nơ Hoa có thể bị méo mó và có cánh hoa xanh Quả nhỏ, mất mã và mất màu

CMV là một cucumovirus có dạng hình cầu ñường kính 29 nm và bao gồm 3 sợi ñơn RNAs Virus ñược truyền bởi các loài rệp muội

Squash leaf curl virus (SLCV) ñược tìm thấy ñầu tiên từ những năm

1970s ở vùng Tây Nam của nước Mỹ Ngay sau ñó virus này ñược tìm thấy trên một các loài bàu bí trồng ở vùng nước Mỹ, Mexico và châu Mỹ

SLCV gây triệu chứng trên lá vết khảm vàng sang xen lẫn hoặc các vết chấm lốm ñốm Lá bị quăn, nhỏ Cây còi cọc, kém phát triển Hoa nở muộn hoặc rụng Quả không phát triển, biến dạng, mất màu

SLCV là một geminivirus, có sợi dài 20 x 30 nm và axit nucleic dạng sợi ñơn DNA Vector truyền bệnh là bọ phấn và ñược phát hiện ñầu tiên trên họ bầu bí

Squash mosaic virus (SqMV) ñược biết từ rất sớm của những năm 1990s

Ở nhiều nước trên thế giới giảm sút bởi sử dụng hạt bị virus Tuy nhiên, một số

vùng sản xuất bầu bí mất kinh nghiệm với virus này

Squash mosaic virus (SqMV) có triệu chứng thay ñổi cực ñộ Lá khảm

ñậm nhạt, gân lá xanh thẫm, ñốm hình nhẫn và giống với một số virus khác Lá mầm cũng có triệu chứng Cây còi cọc và quả xấu xí, mất màu

SqMV thuộc nhóm comovirus, kích thước sợi virus 28-30nm Axit nucleic có 2 sợi ñơn RNAs Các chủng khác nhau gây ra các triệu chứng khác nhau trên các loài bầu bí khác nhau

Vector của virus này là bọ cánh cứng có sọc và có ñốm (Acalymma

trivittatum) ,(Diabrotica undecimpunctata) Virus này bền vững và có thể lây

truyền trong suốt quá trình sản xuất và thu hoạch Ký chủ của virus này là các loài thuộc họ bầu bí và họ rau muối

Tobacco ringspot virus (TRSV) ñược tìm thấy ở khắp nơi nước Mỹ và thế

giới TRSV gây ra vết ñốm vàng sang trên lá non, khảm, ñốm hình nhẫn Quả bị rụng, phát triển kém, nhỏ, nổi u, ñốm hình nhẫn, ñốm, vẹo vọ TRSV thuộc nhóm nepovirus, sợi dài 25-29 nm, axit nucleic 2 sợi ñơn RNAs Các chủng khác nhau gây hại trên 20 họ cây trồng khác nhau.Vector truyền bệnh ñầu tiên là

tuyến trùng nematode (Xiphinema americanum) TRSV ñược truyền gián tiếp

bằng vector không ñặc hiệu rệp muội (Aphids) và nhện, cũng có thể qua hạt và phấn hoa

Watermelon mosaic virus (WMV) có tên trước ñây là Watermelon mosaic

virus 2 (WMV-2) và ñược tìm thấy trong sản xuất bầu bí các vùng trên thế giới

WMV gây triệu chứng khảm lá, gân lá, hình nhẫn, ñốm xanh sang và các triệu chứng khác Lá bị cong Quả biến dạng, mất màu (hình 2.2)

WMV thuộc nhóm potyvirus với sợi dài 730–765 nm và axit nucleic dạng RNA WMV gây hại trên cây họ bầu bí, họ ñậu và các cây trồng khác; ký chủ của virus khoảng trên 150 loài Vector truyền bệnh là rệp muội

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11

Hình 2.2: Triệu chứng trên lá và trên quả bí (squash)

Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) là một virus hại bầu bí quan trọng

trên thế giới gây mất mùa màng Bệnh phát hiện ñầu tiên tại miền Bắc Italy và miền Nam nước Pháp những năm cuối 1970s tới 1980s và tìm thấy ở UK năm

1987

Lá bị phồng lên và khảm xanh thẫm, lá biến dạng, có khía, răng cưa, chết hoại và các triệu chứng khác (hình 2.3) Cây phát triển còi cọc, long ngắn Quả biến dạng, nổi u, phồng và nứt

ZYMV thuộc nhóm potyvirus với sợi dài 750 x 11 nm và axit nucleic dạng sợi ñơn RNA Bao gồm một số chủng khác nhau ZYMV ñược truyền bởi

rệp muội, hạt có vỏ mỏng và qua vết cắt trong quá trình thu hoạch

Hình 2.3: Triệu chứng trên lá và trên quả dưa chuột (cucumber)

Phòng trừ bệnh bằng biện pháp sử dụng chất tạo SAR như Salicylic acid, Sử dụng hạt giống ñã ñược kiểm tra là sạch bệnh

Papaya ringspot virus (PRSV) thuộc nhóm potyvirus gây bệnh cho ñu ñủ

và các loài họ bầu bí Potyvirus gây thiệt hại lớn về kinh tế cho cây trồng Aphids truyền PRSV bằng chích hút cây bị bệnh và sau ñó sang cây khỏe Virus không truyền qua hạt của cây bệnh Có nhiều loài PRSV cùng họ nhưng khác nhau về chuỗi gen và tính ñộc

Cây bị bệnh PRSV có triệu chứng ñốm hình nhẫn trên quả, khảm vàng và ñổi màu lá, có ñường sọc trên cuống lá và thân cây, làm biến dạng lá non, Cây phát triển kém và còi cọc, không ñậu quả hoặc quả năng suất thấp và chất lượng kém

PRSV gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất, phẩm chất và kinh tế cho các vườn ñu ñủ

Từ những năm 1960 bệnh virus trên ñu ñủ ñã ñược phát hiện ñầu tiên ở Sao Paulo và miền Nam Rio de Janeiro và ở các khu ñông dân của nước này Năm 1969 PRSV ñược phát hiện và trải khắp các vùng Virus lan chậm tới các

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 13

vùng miền Bắc bao gồm Espiritu Snato và Bahia ðiều này giúp vùng này tạm thời không bị virus hại nhưng tạo khoảng cách từ sự tăng giá vận chuyển sản phẩm và giảm chất lượng quả

PRSV ñược phát hiện ở Taiwan năm 1974 và trải ra khắp ñảo trong một vài năm Virus ñã gây nhiều thiệt hại cho nông dân ðể tiếp tục trồng ñu ñủ, nông dân ñã bảo vệ cây non không bị rệp muội hại bằng sử dụng biện pháp che phủ trong giai ñoạn ngắn sau trồng, khi cây trồng trưởng thành che phủ ñược bỏ

ra ñể cây nhận ñược ánh sáng và tạo chất lượng quả ðiều này giúp sản xuất ñu

ñủ ñược tiếp tục nhưng ảnh hưởng ñến năng suất và chất lượng quả

Ngành công nghiệp ñu ñủ ñã bắt ñầu ở Hawaii trên ñảo Oahu năm 1940s Năm 1945, virus ñược phát hiện và có ảnh hưởng chính ñến công nghiệp năm 1950s Trong thời gian này, virus di chuyển tới vùng Puna của hòn ñảo Hawaii Năm 1992 PRSV bắt ñầu tràn khắp vùng trồng cây ñu ñủ ở Puna Nhiều cây bị chặt ñể tránh virus nhưng sự cố gắng này ñã không thành công và virus trải khắp vùng trong vài năm Kế hoạch ñược phát triển ñể lựa chọn tất cả các cây ñu ñủ

và họ bầu bí (loài cây dại có họ với ñu ñủ) trong vùng ñể loại trừ virus và xây dựng lại ngành công nghiệp ở vùng khác của Hawaii

Phương pháp chính ñể phòng trừ PRSV là ñể người trồng ñu ñủ chuyển tới vùng không có virus như trường hợp với nông dân ở Brazil và Hawaii ðiều này là sự giải quyết tạm thời dể ngăn chặn con người mang nguồn bệnh lan truyền Những vùng mà không có virus PRSV thường không có ñiều kiện ñể cây trồng phát triển hoặc xa chợ, vì vậy làm tăng chi phí sản xuất và giảm chất lượng quả

Phương pháp truyền thống ñược cố gắng ñể kháng virus PRSV của một số giống ñu ñủ Không có loài nào kháng ñược mặc dầu nhiều loài ñã ñược nghiên cứu Carica, một loài cùng họ với ñu ñủ ñược tìm thấy có kháng lại với PRSV và

cây lai giữa 2 loài ñã ñược tạo ra Tuy nhiên, những cây lai này không cho quả

và vì vậy nó không ñược ứng dụng

Ở Philippin PRSV ñược phát hiện ñầu tiên tại Silang năm 1983 Qua các nghiên cứu bằng sử dụng bẫy màu vàng (rộng 35cm, dài 14cm, như chậu bằng chất dẻo chứa ñầy nước) ñã có rất nhiều loại côn trùng tìm thấy như rệp muội, rầy thân, rày lá, bọ phấn Nhưng duy chỉ có rệp muội là vector truyền bệnh PRSV Rệp muội có mật ñộ thấp từ tháng 3 ñến tháng 6 và ñỉnh cao vào tháng 8

Từ ñó họ có biện pháp ñể tránh sự gây nhiễm của PRSV bằng trồng ñu ñủ vào các tháng mà mật ñộ rệp muội thấp

PRSV ñược phát hiện ñầu tiên năm 1982 ở miền Nam Tagalog và Bicol nơi mà gây ra thiệt hại ñáng kể cho vườn cây ñu ñủ Virus lan rộng ở Luzon và Visayas và tăng ở Mindanao nơi mà ñu ñủ ñược trồng bởi các công ty ña quốc gia ñể xuất khẩu PRSV nhiễm vào tất cả các giai ñoạn sinh trưởng của cây trồng từ cây con ñến trưởng thành Triệu chứng hầu hết ñể nhận ra là những ñốm ñồng tâm hình nhẫn trên bề mặt quả Triệu chứng khác bao gồm lá vàng, khảm

và biến dạng, mất thùy Những cây ñu ñủ bị nhiễm virus bị giảm năng suất từ 60 – 100% Chỉ có giống Sinta ñược phát triển năm 1995 ở Philippin có thể kháng

ở mức trung bình với virus Tuy nhiên, ñiều ñó cũng phải kết hợp với quản lý các bệnh khác ñể phòng trừ hiệu quả và giảm sự lan truyền của PRSV

Trong việc tìm kiếm các giống kháng PRSV, chương trình công nghệ sinh học ñu ñủ ñã ñược giới thiệu ở trường ðại học của Philippin – Los Banos (UPLB) năm 1998 ñể thuyết trình sự phát sinh phôi ñu ñủ cho công nghệ gen Nghiên cứu

và ñào tạo công nghệ gen lúc ñầu ñược sự ủng hộ của phòng Khoa học và công nghệ (DOST), Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn Philippin (PCARRD), ISAAA và trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp quốc tế Australia (ACIAR) Agrobacterium – biến ñổi trung gian, kháng dọc PRSV ñã ñược sản xuất và hiện nay ñược hạn chế dưới cánh ñồng thí nghiệm của Viện Cây trồng UPLB

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 15

Papaya ringspot virus-watermelon (PRSV-W) ảnh hưởng tới các loài cây

trồng nông nghiệp quan trọng của họ bầu bí và lợi ích kinh tế bởi sức phá hoại của chúng

Những nghiên cứu ñược phát triển chắc chắn và phù hợp ñể kháng

PRSV-W Các chủng của PRSV-W là 1637, 1870, 2030, 2038, 2040, 2052, 2169, 2201,

2207, and W-1A ñược lây nhiễm vào bí xanh và ñược sử dụng trong tiêm chủng Cây trồng ñược xếp theo cấp từ 0 – 9 tùy theo mỗi triệu chứng chết hoại lá, khảm lá, biến dạng lá Họ ñã tìm ñược phương pháp tốt nhất ñể kháng PRSV-W

là trồng cây con trong chậu vuông cạnh 100mm (hoặc 55mm nếu nảy mầm ñồng ñều) và lây nhiễm chủng 2052 ở giai ñoạn lá thật ñầu tiên bằng phương pháp cơ học Lá bí bệnh ñược nghiền trong cối sứ với tỷ lệ 1 : 5 (1g lá với 5 ml ñệm phosphate 0.02M, pH 7.0)

Bảng 2.2 Thành phần bệnh virus gây hại trên ñu ñủ và bầu bí ñã ñược xác

2 Squash mosaic virus SqMV Comoviridae Comovirus Bọ cánh cứng

3 Squash leaf curl virus SLCV Geminiviridae Begomovirus Bọ phấn

Cơ chế tạo tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR – Systemic acquired resistance) của cây khi dùng Salicyclic acid/Bion chống bệnh virus

Phản ứng phòng thủ tạo ñược của cây ñiều khiển bởi một mạng lưới các ñường hướng dẫn truyền tín hiệu chồng chéo lên nhau Nhiều phân tử tham gia các ñường hướng dẫn truyền tín hiệu

Salicyclic acid (SA) là một phytohormon, có vai trò quan trọng trong

phát triển, quang hợp, hô hấp… của thực vật

SA cũng là một phân tử tín hiệu nội sinh tham gia cảm ứng tính kháng tạo ñược của thực vât Vai trò của SA trong dẫn truyền tính kháng ñã ñược chứng minh trong một số thí nghiệm:

• Xử lý SA trên cây thuốc lá ñã dẫn tới giảm triệu chứng bị nhiễm bởi TMV

và tích lũy nhiều PR protein (thí nghiệm của White, 1970)

• Lây nhiễm TMV trên thuốc lá dẫn tới hàm lượng SA tăng cục bộ (tại vị trí lây nhiễm) và hệ thống (toàn cây)

• Cây Arabidopsis chuyển gen NahG (naphthalene hydroxylase G) của vi khuẩn Pseudomonas putida (là gen mã hóa salicylate hydroxylase, một enzyme chuyển SA thành dạng bất hoạt là catechol) ñã biểu hiện tính mẫn cảm cao ñối với nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau như nấm, vi khuẩn và virus

• Cây chứa các ñột biến mất khả năng tích lũy SA như eds4, eds5 (enhanced disease susceptibility), sid1, sid2 (SA induction-deficient), pad4 (phytoalexin-deficient) biểu hiện tính mẫn cảm cao với tác nhân gây bệnh

SA tương tác với catalase – là một enzyme xúc tác cho sự phân hủy H2O2 thành H2O và O2 H2O2 là phân tử hoạt ñộng phía thượng lưu của quá trình dẫn truyền tín hiệu Phía hạ lưu của ñường hướng dẫn truyền tín hiệu (phía sau SA) là một protein gọi là NPR1 (non-expressor of PR1 protein) cần

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 17

cho dẫn truyền SA Sản phẩm cuối cùng của ñường hướng dẫn truyền SA là các loại PR protein (Protein liên quan ñến sự gây bệnh, là các protein ñược cây tạo ra do sự gây bệnh bởi các tác nhân gây bệnh chủ yếu thuộc các nhóm nấm vi khuẩn, virus, tuyến trùng Hiện có khoảng 17 nhóm (còn ñược gọi là họ) PR protein khác nhau, ñược ký hiệu từ PR1 ñến PR17 (theo thứ tự ñược phát hiện), trong ñó quan trọng nhất là protein nhóm PR1

ðường hướng dẫn truyền SA thường do các tác nhân gây bệnh nhóm biotroph gây ra Nhìn chung các tác nhân gây bệnh này sinh trưởng trong gian bào và nhân lên trong mô nhiều ngày trước khi gây chết hoại mô

BTH (benzo(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothiolic acid (BTH,

acibenzolar-S-methyl) BTH là sản phẩm của hãng Novartis (bán tại Việt Nam với tên

thương mại là BION) BTH có thể cảm ứng SAR ở liều lượng thấp, do vậy tránh ñược hiệu ứng gây ñộc cho cây BTH có cơ chế tạo SAR giống như SA

và có thể chống ñược nhiều nhóm tác nhân gây hại kể cả virus BTH có hiệu

quả chống nấm Cercospora nicotianae, Peronospora tabacina, Phytophthora

parasitica, nhiều nấm phấn trắng, gỉ sắt và sương mai khác, vi khuẩn Pseudomonas syringae, virus TMV, CMV và TSWV

2.1.2.1 Giới thiệu chung về chi Potyvirus

Chi Potyvirus là một trong những chi lớn nhất trong các chi virus thực vật và là chi lớn nhất trong họ Potyviridae Chi Potyvirus có hơn 100 loài, tất

cả các thành viên có virion dạng sợi mềm, lan truyền nhờ rệp muội họ

Aphididae, còn một số lan truyền thông qua hạt giống và qua vết thương cơ

giới (Gibbs và cs, 2008)

Theo ICTV (2009), họ Potyviridae có 8 chi, trong ñó chi Potyvirrus là chi lớn nhất có 143 loài trong tổng số 170 loài virus thuộc họ Potyviridae

Trong ñó các virus phổ biến và có ý nghĩa nhất là PRSV-W và WMV

Hai virus này ñều thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae

2.2 Những nghiên cứu trong nước

2.2.1 Tình hình sản xuất ñu ñủ và bầu bí ở Việt Nam

Thừa Thiên Huế là một tỉnh thuộc khu vực miền Trung, có diện tích ñất

tự nhiên 500.920 ha, diện tích ñất nông nghiệp 51.527 ha trong ñó ñất trồng rau là 2.789 ha Dân số Thừa Thiên Huế 1,1 triệu người, nhu cầu về rau tươi hằng ngày của người dân là rất lớn Mặt khác ñó thành phố Huế là một thành phố du lịch, hằng năm lượng khách trong nước và nước ngoài ñến tham quan rất ñông Do vậy, một yêu cầu ñặt ra là phải cung cấp lượng rau ñầy ñủ cho người tiêu dùng Bên cạnh ñó chất lượng của các mặt hàng rau quả cũng cần ñược ñảm bảo Sản xuất không chỉ mang tính tự cung tự cấp mà còn phải mang tính hàng hóa cao

Trong quá trình phát triển, Thừa Thiên Huế ñã xuất hiện nhiều vùng rau chuyên canh mới trong ñó có dưa chuột, không ngừng ñổi mới về tiến bộ kỹ thuật, giống mới vì vậy năng suất, sản lượng không ngừng tăng lên

Sản phẩm từ dưa chuột sản xuất tại Thừa Thiên Huế chủ yếu cung ứng cho người tiêu dùng ở trong tỉnh và cho các nhà hàng, khách sạn phục vụ khách du lịch

* Tình hình sản xuất

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê, diện tích trồng rau cả năm 2006 là 644,0 nghìn ha, tăng 29,5% so với năm 2000 (452,9 nghìn ha) Năng suất ñạt 149,9 tạ/ha, là năm có năng suất trung bình cao nhất từ trước ñến nay Tổng sản lượng rau cả nước ñạt 9,65 triệu tấn, ñạt giá trị 144.000 tỷ ñồng (tương ñương 900 triệu USD), chiếm 9% GDP của nông nghiệp Việt Nam, trong khi diện tích chỉ chiếm 6% Với khối lượng trên, bình quân sản lượng rau sản xuất trên ñầu người ñạt 115 kg/người/năm, tương ñương mức bình quân toàn thế giới và ñạt loại cao trong khu vực, gấp ñôi trung bình của các nước ASEAN (57 kg/người/năm) Kim ngạch xuất khẩu rau, quả và hoa cây cảnh trong 5 năm (2000 - 2004) ñạt 1.222 triệu USD (bình quân mỗi năm ñạt 224,4

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 19

triệu USD), trong ñó khoảng 60% kim ngạch xuất khẩu rau

Riêng ñối với dưa chuột ñược xem là một trong những loại rau chủ lực,

có diện tích 19.874 ha, năng suất 16,88 tấn/ha, sản lượng 33.537 tấn chỉ ñứng sau cà chua

Bảng 2.3: Diện tích, năng suất và sản lượng một số loại rau chủ lực

năm 2004

(ha)

Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (tấn)

2.2.2 Những nghiên cứu về bệnh virus hại ñu ñủ và bầu bí

1993 K.V Kiritani (Nhật Bản) với mẫu thu ñược của Viện BVTV ñã dung ELISA xác ñịnh sự có mặt của virus PRSV và PLCV trên cây ñu ñủ ở các tỉnh phía Nam

1991 – 1992 Vũ Triệu Mân và H.Lecoq (Inra Pháp) và các CTV ñã xác

định bằng phương pháp ELISA (tại ðHNN I) các virus PRSV, WMMV 2, CMV, SqMN, ZyMV cĩ mặt trên 24 lồi cây họ bầu bí, cà chua, họ đậu…ở miền Bắc Việt Nam

Các virus TMV, CMV, PRSV, PMV,…đã được nghiên cứu và sản xuất thử kháng huyết thanh tại trường ðHNN I Hà Nội Kỹ thuật ELISA được sử dụng từ 1990, kỹ thuật PCR bắt đầu áp dụng từ năm 1995, để chẩn đốn bệnh

Ở Việt Nam gần đây đã cĩ một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật – Viện Cơng nghệ sinh học do GS Lê Trần Bình và TS Chu Hồng Hà đứng đầu là nhĩm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành cơng trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus Một trong những kết quả của đề tài cấp Viện KH&CN Việt

Nam được tiến hành trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật

RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus” là đã tạo được

các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên

Kỹ thuật RNAi cũng đã được tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong đề tài trọng điểm cấp nhà nước thuộc chương trình phát triển cơng nghệ sinh học (KC04-03/06-10) với mục đích tạo cây đu đủ và cây ăn quả cĩ múi chuyển gen kháng bệnh virus ðề tài đã được nghiệm thu cấp nhà nước trong tháng 9/2010 Một trong những kết quả đạt được của đề tài là đã tạo ra được các dịng đu đủ chuyển gen cĩ khả năng kháng hồn tồn với virus đốm vịng

Các kết quả thu được kể trên là cơ sở quan trọng chứng tỏ khả năng tiếp cận với các cơng nghệ mới trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học, mà cụ thể

là làm chủ cơng nghệ RNAi, của các nhà khoa học Việt nam Các thành cơng trên cũng tạo ra một sự lựa chọn mới cho các nhà nghiên cứu trong việc tạo giống cây trồng kháng bệnh virus

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 21

Hình ảnh dòng thuốc lá T-CMV-49 biểu hiện kháng bệnh hoàn toàn và cây

ñối chứng WT2-1 sau 3 lần lây nhiễm

Thử tính kháng virus PRSV trên cây ñu ñủ chuyển gen

A, B: cây sau 2 tháng lây nhiễm virus;

C, D: cây sau 5 tháng lây nhiễm virus;

A, C: dòng cây ñối chứng không chuyển gen;

B, D: dòng cây chuyển gen A19

Bệnh virus trên cây ñu ñủ là một bệnh hại phổ biến, nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn ñối với người trồng Bệnh ñốm hình nhẫn, bệnh khảm lá trên

cây ñu ñủ do 2 virus chính gây ra là PMV (Papaya mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspor virus)

Bệnh ñốm hình nhẫn:

Bệnh do virus ñốm hình nhẫn PRSV gây ra, vết bệnh có ñốm hình nhẫn, khảm loang lổ trên lá, quả, thân và cành có vết thâm và chảy nhựa Ở lá, bệnh thường tạo ra các ñốm sáng vàng nhạt, lúc ñầu lá hơi co lại và có hiện tượng khảm Sau dần vết ñốm phát triển thành ñốm hình nhẫn, xuất hiện rất nhiều trên bề mặt lá Khi cây bị bệnh, lá còn non thường mất thuỳ, chỉ còn cuống, ñôi khi cả cuống cũng bị biến dạng, co quắp Ở quả, vết bệnh lúc ñầu

là những ñốm thâm xanh, sẫm, vết bệnh thường tập trung ở nửa trên của quả gần cuống Khi già, chín, các vết thâm lại và thối sâu vào bên trong Cây bị bệnh lùn, cho ít quả và quả nhỏ theo mức ñộ của bệnh Quả bị bệnh có vị nhạt, do bệnh làm giảm lượng ñường trong quả Khi cây bị nặng có thể không cho quả và chết sớm Virus lây bằng 2 cách: lây tiếp xúc cơ học và lây bằng côn trùng môi giới (các loại rệp, rầy) Virus không lây truyền qua ñường hạt giống Bệnh lây lan rất nhanh, nhất là cây từ 5-6 tháng tuổi

Bệnh khảm lá:

Cây con mới trồng có thể nhiễm bệnh, nhưng thường chỉ thấy bệnh ở cây ñược 1-2 năm tuổi Bệnh chỉ gây ra hiện tượng khảm ở lá cây, lá có nhiều vết màu vàng xanh lẫn lộn, khảm càng nặng lá biến sang màu vàng Lá bị bệnh có kích thước nhỏ lại, biến dạng, số thùy lá già tăng, nhăn phồng Lá già

bị rụng nhiều, chỉ chừa lại chùm lá khảm vàng ở ngọn Quả nhỏ, biến dạng, chai sượng Chùm quả thường có một số quả chảy nhựa sớm thâm xanh lại thành vết dọc Cành và thân có nhiều vết thâm xanh chạy dọc theo chiều dài của thân, cành Virus khảm lá lan truyền bằng tiếp xúc cơ học, không truyền

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 23

qua môi giới côn trùng

Biện pháp phòng trị:

Hiện nay chưa có biện pháp phòng trừ hữu hiệu bệnh này Trước mắt

có thể áp dụng một số biện pháp phòng trị sau:

- Tạo nguồn cây sạch bệnh trong vườn ươm cách ly chống rệp

- Không trồng ñu ñủ ở những vùng ñã nhiễm bệnh

- Phun thuốc hoá học kết hợp biện pháp hoá học ñể diệt côn trùng truyền bệnh, nhất là rệp bông và rệp ñào Một số thuốc hữu hiệu trừ rệp: Bassa, Trebon, Pegasus, Applaud, Sumicidin, Supracid, Zolone

- Thực hiện chọn lọc, vệ sinh vườn ñu ñủ thường xuyên ñể loại bỏ cây bệnh, tránh lây lan

Ở Việt Nam virus gây bệnh trên cây bầu bí ñã ñược xác ñịnh là Chinese

squash leaf curl virus (SqLCV-C), môi giới truyền bệnh là bọ phấn; Cucumber mosaic virus (CMV); Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) và Papaya ringspot virus (PRSV) gồm type P và W, type P trên ñu ñủ, type W

trên bầu bí

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu

Bệnh virus trên ñu ñủ và bầu bí do PRSV

3.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu

- Vùng trồng ñu ñủ và bầu bí tại Hà Nội

- Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt ñới - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

3.1.3 Thời gian nghiên cứu

- Từ tháng 09/2010 ñến tháng 11/2011

3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu cây bệnh có triệu chứng ñiển hình ñược thu thập từ các ñịa ñiểm ñiều tra, sau ñó ñược bảo quản khô bằng hạt Silicagel ñể kiểm tra virus

* Thiết bị nghiên cứu:

Máy ñọc bản ELISA, máy PCR, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ ñịnh ôn

* Dụng cụ nghiên cứu:

- Pipet tự ñộng 1 ñầu côn: 10 - 20 µm, 100 µm, 200 µm, v.v

- Ống ñong 10 - 1000 ml

- Bình thuỷ tinh loại 50 - 1000 ml

- Phễu lọc, vải lọc, giấy thấm

- Hộp nhựa có nắp ñể ñựng bản ELISA

- Các dụng cụ khác: găng tay cao su, que thuỷ tinh, túi nhựa, v.v

- Các bẫy màu vàng, bẫy phản xạ

* Hoá chất:

- Các hoá chất thông dụng và hoá chất ñể pha dung dịch ñệm, chất nền,

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 25

các kháng huyết thanh của các virus thử nghiệm

- Các hoá chất dùng trong PCR

- Các chất kắch kháng SA, Exin, Bion

3.3 Nội dung nghiên cứu

- điều tra và mô tả triệu chứng bệnh virus trên ựu ựủ và bầu bắ ngoài ựồng ruộng

- Xác ựịnh bệnh virus trên ựu ựủ và bầu bắ do PRSV bằng ELISA

- đánh giá hiệu qủa của biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh như

sử dụng bẫy màu vàng, bẫy phản xạ trong phòng trừ bệnh virus trên ựu ựủ và bầu bắ do PRSV

- đánh giá khả năng tạo tắnh kháng tập nhiễm chống PRSV trên cây ựu

ựủ và bầu bắ bằng sử dụng chất kắch kháng

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp ựiều tra ngoài ựồng

* Phương pháp ựiều tra tỷ lệ bệnh virus hại ựu ựủ và bầu bắ ở ruộng sản xuất:

Áp dụng phương pháp nghiên cứu, ựiều tra và phát hiện bệnh hại theo

ỘPhương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vậtỢ của Viện Bảo vệ thực vật (2003)

Chọn ngẫu nhiên 1 ruộng ựại diện cho giống, ựại diện cho giai ựoạn sinh trưởng và phát triển của cây điều tra theo phương pháp 5 ựiểm trên ựường chéo góc (cách bờ 2 mét) mỗi ựiểm ựiều tra từ 50 - 100 cây ựối với ruộng có diện tắch lớn, ựiều tra 100% số cây ựối với ruộng có diện tắch nhỏ

Theo dõi ựịnh kỳ 10 ngày một lần, thu thập số liệu và tắnh tỷ lệ bệnh Quan sát và mô tả ựặc ựiểm cây nhiễm bệnh

* Phương pháp ựiều tra diễn biến mật ựộ rệp muội: Tiến hành ựiều tra theo 5 ựiểm chéo góc, mỗi ựiểm cố ựịnh 5 cây, trên mỗi cây ựếm toàn bộ ấu trùng và trưởng thành

* Phương pháp thu thập mẫu lá bệnh:

Mẫu thu ñựng riêng trong từng túi có ghi ñầy ñủ các thông tin sau: + Tên mẫu;

+ ðịa ñiểm ruộng;

+ Thời gian lấy mẫu;

+ ðặc ñiểm triệu chứng bệnh;

+ Tỷ lệ nhiễm bệnh chung cả ruộng

- Phương pháp bảo quản mẫu bệnh :

Có hai phương pháp bảo quản mẫu: bảo quản khô và bảo quản tươi + Bảo quản khô:

Mẫu thu về ñược ñể trong túi chứa hạt Silicagel Thay hạt Silicagel ñến khi mẫu khô

+ Bảo quản tươi:

Mẫu thu về ñược ñể nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -200C ở Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới

ðược tiến hành theo giai ñoạn sinh trưởng, chọn những lá có triệu chứng ñiển hình ñem về bảo quản khô bằng hạt Silicagel

3.4.2 Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp

Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp dựa theo tài liệu mô

tả của Green (1991) và Vũ Triệu Mân (2003), có các bước sau:

Bước 1: Nghiền mẫu

- Tiến hành nghiền mẫu trong dung dịch ñệm Carbonate pH 9,6 với tỷ

lệ 0,5 g lá/1 ml dung dịch ñệm

- Nghiền mẫu ñối chứng dương

- Nhỏ vào mỗi giếng ELISA 100 µl/giếng Sau ñó ñể bản ELISA vào hộp ẩm và ủ qua một ñêm ở tủ lạnh thường

Bước 2: Rửa bản ELISA

- Sau khi ủ qua ñêm, sáng hôm sau ñem bản ELISA ñi rửa (trước khi

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 27

rửa vảy mạnh bản ELISA ựể loại hết nước ở trong bản ELISA) 3 lần

bằng ựệm PBS Ờ T, mỗi lần cách nhau 3 Ờ 4 phút Mỗi lần rửa bản

ELISA ựều vảy mạnh ựể loại hết ựệm PBS Ờ T ra khỏi các giếng, sau

ựó mới tiến hành nhỏ ựệm PBS Ờ T mới vào ựể rửa tiếp

- Ủ bản ELISA ở 370C trong 45 phút

Bước 3: Cố ựịnh kháng thể thỏ ựặc hiệu virus vào bản ELISA

- Nghiền lá cây khỏe trong dung dịch ựệm PBST Ờ PO với tỷ lệ 1 g

- để bản ELISA trong hộp ẩm rồi ựem ủ ở 370C trong 2 giờ

Bước 4: Hòa kháng thể ựơn dòng IgG (thỏ) của hãng Sigma với tỷ lệ

Bước 6: đánh giá kết quả

để bản ELISA trong hộp ẩm, rồi ựể trong tối 2 giờ Sau ựó ựánh giá kết

quả bằng mắt thường và ựo trị số ELISA (OD) ở bước sóng 405 nm

Các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng (+) Giếng không có

màu là cây không bị nhiễm bệnh đọc kết quả tiếp bằng cách ựưa vào máy

ựọc ELISA ở bước sóng 405 nm

3.4.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR

3.4.3.1 Chiết DNA tổng số từ mơ lá

DNA tổng số từ mơ lá được chiết theo 2 phương pháp:

+ Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang và cs, 1993):

Cho khoảng 50 mg mơ lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 µl dung dịch NaOH 0,5 M vào tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng để nghiền nhuyễn mẫu lá Lấy 100 µl dung dịch đệm Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL, sau khi nghiền mẫu xong lấy 2 µl dịch nghiền cho vào tube 1,5mL chứa

dung dịch đệm Tris 0,1M, pH = 8 Dịch hịa lỗng này được dùng để chạy PCR

+ Phương pháp chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB theo mơ tả của

Doyle & Doyle (1987), Wang và cs ( 1993) như sau:

- Bước 1: Ủ đệm CTAB + βME (100 µl PME + 10 ml CTAB) ở 65oC

trong 30 phút

- Bước 2: Cho mẫu bệnh cần chẩn đốn vào tube 1,5 mL theo tỷ lệ

0,1g/1ml đệm CTAB + βME

- Bước 3: Cho vào tube 500 µl CTAB + βME Nghiền nhỏ mẫu, lắc nhẹ

- Bước 4: Ủ tube trong điều kiện 60 - 65oC, trong khoảng 5 phút

- Bước 5: Ly tâm 7 phút

- Bước 6: Lấy dịch trên tủa (khoảng 400 µl)

- Bước 7: Chiết một thể tích tương đương (400 µl) dung dịch

Chlorofrom:isoanyl alcohol (24:1)

- Bước 8: Ly tâm trong 5 phút

- Bước 9: Lấy dịch trên tủa (khoảng 300 µl), để trong tủ lạnh -200C

trong khoảng ít nhất 2 phút

- Bước 10: Chiết lần 2 với Chlorofrom: isoanyl alcohol (24 : 1) ðể

lạnh 5 phút

- Bước 11: Ly tâm trong 5 phút

- Bước 12: Lấy dịch trên tủa (khoảng 200 µl) cho vào tube trắng 1,5 ml

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 29

- Bước 13: Bổ sung một thể tích tương ñương (khoảng 200 µl)

isopropanol lạnh ðể lạnh ở nhiệt ñộ -20oC trong 20 phút (ñến ñây là bước an toàn nên có thể ñể qua ñêm hôm sau làm tiếp)

- Bước 14: Lắc ñều, ly tâm trong 15 phút

- Bước 15: Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn Spin trong 15 giây ñể hút

hết dịch trong tube ra

- Bước 16: Rửa cặn DNA 2 lần với etol 70% (khoảng 700 µl)

- Bước 17: Làm khô cặn bằng không khí

- Bước 18: Hòa cặn DNA với 20 - 25 µl TE, búng nhẹ ñể DNA tan hết, giữ

tube ở ñiều kiện nhiệt ñộ - 20oC

Bảng 3.1 Các mồi ñược sử dụng trong nghiên cứu

2 BegoAFor1 5’-TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* - 3’

Dùng ñể phát hiện DNA-A Begomovirus

3.4.3.3 Chạy ñiện di sản phẩm PCR và xem kết quả phản ứng

- Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 40oC thì ñổ vào khuôn có ñặt lược tạo lỗ khuôn ðể khuôn ở nhiệt ñộ phòng

- Lấy các tube 0,5mL ñã hấp khử trùng, ñánh số thứ tự Cho vào mỗi tube

4 µl Loading Dye X6, ñảo ñều và Spin trong 5 giây

1 giếng Marker làm chuẩn

- Cắm nguồn ñiện cho máy ñiện di, ñặt ở hiệu ñiện thế 100V trong 25 - 30 phút, tắt máy ñiện di, ñặt bản gel ñược kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại, quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh