Các neurotoxin này có tác dụng lên các kênh ion của tế bào thần kinh bị kích thích và qua đó tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, tim mạch và hô hấp.[18]Tuỳ thuộc v
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1 TSKH Hoàng Ngọc Anh
2 GS TSKH Utkin Yuri Nikolaevich
Trang 3VIỆN HÀM LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VÕ ĐỖ MINH HOÀNG
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT TOXIN CỦA MỘT SỐ
TOXIN MỚI TỪ NỌC BỌ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Trang 4LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
1) Luận văn này là sản phẩm nghiên cứu của tôi 2) Số liệu trong luận văn là trung thực
3) Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình
Trang 5MỤC LỤC
Trang phụ bìa i
Lời cam đoan ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt vi
Danh mục các bảng vii
Danh mục các hình viii
Mở đầu 1
1 TỔNG QUAN 2
1.1.Giới thiệu về bọ cạp 3
1.1.1 Phân bố và môi trường sống 4
1.1.2 Đặc điểm hình thái cơ bản 5
1.1.3 Nọc độc 6
1.1.4 Bọ cạp ở Việt Nam 8
1.2.Cấu trúc và ảnh hưởng của toxin nọc bọ cạp 9
1.2.1 Cấu trúc của toxin 9
1.2.2 Tác động và ảnh hưởng của nọc bọ cạp lên kênh vận chuyển ion 11
1.3 Một số nghiên cứu về toxin có trong nọc bọ cạp 17
1.3.1 Các phương pháp cô lập và tinh chế toxin 17
1.3.2 Một số nghiên cứu nọc độc của chi Heterometrus 19
1.4.Ứng dụng của nọc bọ cạp 22
1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới 22
1.4.2 Nghiên cứu và ứng dụng nọc bọ cạp ở Việt Nam 24
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
Trang 62.2.4 Cô lập toxin từ nọc bọ cạp 31
2.2.5 Xác định trình tự acid amin trong chuỗi polypeptide 35
2.2.6 Xác định trình tự acid amin của các toxin đối với chuột 39
2.2.7 Xác định cấu trúc bậc 1 của phân đoạn 5.21.1 40
2.3.Khảo sát độc tính các phân đoạn độc 40
2.3.1 Khảo sát độc tính sơ bộ các phân đoạn độc lên chuột 40
2.3.2 Khảo sát độc tính sơ bộ các phân đoạn độc lên côn trùng 41
2.3.3 Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc trên chuột 42
2.3.4 Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng 43
2.4.Khảo sát sự tương tác của của các phân đoạn độc với kênh vận chuyển K+ 43
3 NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 45
3.1 Định danh bò cạp thu mua tại An Giang 46
3.2.Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm và thu hoạch nọc 46
3.2.1 Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm 46
3.2.2 Thu nọc bọ cạp H laoticus 47
3.3.Khảo sát, đánh giá và phân tích nọc thô bọ cạp H laoticus 49
3.3.1 Khảo sát độ pH của nọc thô .49
3.3.2 Phân tích hàm lượng protein tổng trong nọc thô 49
3.3.3 Phân tích nọc bọ cạp bằng sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G50 50
3.3.4 Xác định khối lượng phân tử các phân đoạn nọc 52
3.4.Khảo sát độc tính của nọc bọ cạp H laoticus đối với chuột 54
3.4.1 Đánh giá độc tính của các phân đoạn nọc thu được trên chuột 54
3.4.2 Đánh giá độc tính cấp của các phân đoạn độc lên chuột 56
3.4.3 Phân tích thành phần phân đoạn 4 58
3.4.4 Khảo sát độc tính của các phân đoạn peptide thứ cấp lên chuột 59
3.5.Tinh chế và xác định khối lượng phân tử các phân đoạn thứ cấp có độc tính 62 3.5.1 Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.6 62
3.5.2 Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.7 64
3.5.3 Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.11 65
3.5.4 Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.15 66
Trang 73.6.Khảo sát cấu trúc bậc một của các polypeptide phân đoạn 4.6 và tác động lên
kênh vận chuyển K+ 67
3.6.1 Khảo sát cấu trúc bậc một của các polypeptide phân đoạn 4.6 67
3.6.2 Khảo sát tác động của Hetlaxin lên kênh vận chuyển K+ .70
3.7.Khảo sát độc tính của các phân đoạn của nọc bọ cạp H laoticus lên dế 72
3.7.1 Kết quả khảo sát độc tính các phân đoạn nọc trên dế 72
3.7.2 Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng 73
3.7.3 Phân tách phân đoạn 5 75
3.7.4 Khảo sát độc tính của các phân đoạn thứ cấp trên dế 75
3.7.5 Cô lập và xác định khối lượng phân tử protein của các phân đoạn thứ cấp có độc tính trên dế 76
4 KẾT LUẬN 83
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN 86
TÀI LIỆU THAM KHẢO 123
PHỤ LỤC 131
Trang 8DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
HPLC High performance liquid chromatography
Trang 9DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Các đại diện của độc tố bọ cạp tác dụng lên kênh vận chuyển natri 12
Bảng 1.2 Đại diện các nhóm độc tố kênh vận chuyển K+ 16
Bảng 2.1 Tóm tắt lập đường chuẩn định lượng protein bằng phương pháp biuret 29 Bảng 2.2 Thông số sắc ký lỏng hiệu năng cao các phân đoạn độc thứ cấp 34
Bảng 2.3 Thông số quá trình sắc ký lỏng hiệu năng cao của phân đoạn 5 35
Bảng 2.4 Dấu hiệu nhận biết sơ bộ độc tính lên chuột của các phân đoạn gây độc.41 Bảng 2.5 Dấu hiệu nhận biết sơ bộ độc tính côn trùng của các phân đoạn gây độc 42
Bảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang của mẫu và chuẩn 49
Bảng 3.2 Khối lượng các phân đoạn nọc bọ cạp 51
Bảng 3.3 Kết quả đo UV và nồng độ thực tế của 5 phân đoạn nọc bọ cạp 54
Bảng 3.4 Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc 55
Bảng 3.5 Tỷ lệ tử vong của chuột ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100 sau 24 giờ tiêm 56
Bảng 3.6 Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens 56
Bảng 3.7 Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp 60
Bảng 3.8 Khối lượng phân tử của các polypeptide tách ra 68
Bảng 3.9 Kết quả thử độc tính trên dế của các phân đoạn nọc 72
Bảng 3.10 Tỷ lệ tử vong của dế ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100 sau 24 giờ tiêm 73
Bảng 3.11 Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens 74
Bảng 3.12 Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp trên dế 76
Bảng 3.13 Tóm tắt quá trình phân tách phân đoạn 5 bằng HPLC 77
Trang 10DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Một số loài bọ cạp đại diện các họ khác nhau 4
Hình 1.2 Loài bọ cạp Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 5
Hình 1.3 Cấu trúc toxin ngắn của nọc bọ cạp 10
Hình 1.4 Cấu trúc không gian của một số toxin tách ra từ nọc bọ cạp 10
Hình 1.5 Sắc ký đồ trao đổi ion của nọc bọ cạp loài Tityus serrulatatus 18
Hình 1.6 Sắc ký đồ sắc ký lọc gel của nọc bọ cạp Scorpio Maurus 19
Hình 1.7 Sắc ký đồ sắc ký hiệu năng cao của nọc bọ cạp Scorpio Maurus 19
Hình 2.1 Thau nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm 28
Hình 2.2 Thu nọc bọ cạp H laoticus 31
Hình 2.3 Nguyên tắc của phương pháp Edman 36
Hình 2.4 Phản ứng phụ của phương pháp Edman 37
Hình 2.5 Xác định trình tự các chuỗi polypeptide ngắn trong chuỗi ban đầu 38
Hình 2.6 Tách hai chuỗi polypeptide liên kết bằng cầu disulfide 38
Hình 3.1 Trọng lượng bọ cạp trong 6 tháng 47
Hình 3.2 Mẫu nọc thô bọ cạp H.laoticus 48
Hình 3.3 Lượng nọc bọ cạp thu được theo thời gian 48
Hình 3.4 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng protein 50
Hình 3.5 Sắc ký đồ của nọc thô bọ cạp thực hiện bằng sắc ký lọc gel 51
Hình 3.6 Kết quả điện di 5 phân đoạn nọc so với mẫu chuẩn 53
Hình 3.7 Đồ thị tỷ lệ % chuột chết theo liều dùng 57
Hình 3.8 Sắc ký đồ khi phân tách phân đoạn 4 bằng HPLC 59
Hình 3.9 Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.6 63
Hình 3.10 Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.6.2 63
Hình 3.11 Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.6.3 64
Hình 3.12 Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.7.2 64
Hình 3.13 Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.7.2 65
Hình 3.14 Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.11.1 65
Trang 11Hình 3.16 Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.15 66
Hình 3.17 Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.15.8 bằng MALDI MS 67
Hình 3.18 Phân tích trình tự acid amin của Hetlaxin bằng khối phổ 69
Hình 3.19 Xác định cấu trúc bậc 1 của Hetlaxin bằng khối phổ và phương pháp Edman 69
Hình 3.20 So sánh sự tương đồng của Hetlaxin với các toxin khác 70
Hình 3.21 Sự cạnh tranh của Hetlaxin với R-AgTx trong liên kết với kênh KcsA-Kv1.1 (A) và KcsA-Kv1.3 (B) 71
Hình 3.22 Đồ thị tỷ lệ % dế chết theo liều dùng 74
Hình 3.23 Sắc ký đồ của phân đoạn 5 75
Hình 3.24 Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.21 với các bước sóng 226 nm 78
Hình 3.25 Phổ MS của phân đoạn 5.21.1 79
Hình 3.26 Phổ MS của phân đoạn 5.21.2 79
Hình 3.27 Phổ NMR của toxin 5.21.1 77
Hình 3.28 Cấu trúc của toxin 5.21.1 (Leu-Trp) 78
Trang 12Trên thế giới hiện đã có nhiều nghiên cứu về thành phần, cấu trúc, tác dụng và ứng dụng của nọc bọ cạp nhưng vẫn còn nhiều vấn đề chưa thể giải quyết triệt để Nọc
bọ cạp là hỗn hợp các protein có tác động đối với hệ thần kinh, việc xác định cấu trúc các protein này cũng như cách thức các protein này tác động lên hệ thần kinh con người vẫn chưa được nghiên cứu triệt để và còn nhiều tiềm năng nghiên cứu cũng như ứng dụng Từ việc xác định được cấu trúc và cơ chế tác động của nọc bọ cạp đối với
hệ thần kinh con người, có thể đưa ra những phương án sử dụng nọc bọ cạp vào dược phẩm nhằm phục vụ các mục đích về y tế
Trong nọc bọ cạp chứa nhiều các polypeptide có khả năng tác động lên các thụ thể và các kênh ion của màng tế bào bị kích thích, các loại polypeptide này đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu nhằm tạo ra các loại dược phẩm mới Nhằm đóng góp một nguồn nguyên liệu mới và các nghiên cứu khoa học mới, hướng tới làm thuốc chữa bệnh và làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, tác giả đã tiến hành các nghiên
cứu về nọc bọ cạpHeterometrus laoticusCouzijn Hiện nay, chưa phát hiện toxin tách
từ nọc bọ cạp chi Heterometrus có tác dụng mạnh đối với kênh thần kinh Kv1.3 Qua
đề tài “Phân lập và khảo sát tính chất toxin của một số toxin mới từ nọc bọ
cạpHeterometrus laoticus”, hi vọng sẽ mang đến cơ sở cho những nghiên cứu tiếp
theo về việc ứng dụng của nọc bọ cạp dùng làm nguồn nguyên liệu cho dược phẩm
Trang 131 TỔNG QUAN
Trang 141.1 Giới thiệu về bọ cạp
Bọ cạp là một trong những động vật lâu đờinhất trên trái đất với hơn 450 triệu năm tiến hóa, gồm khoảng 1750 loài khác nhau.Bọ cạp thuộc lớp Arachnida, bộ
Scorpionida,có họ hàng gần với loài nhện, ve bét và rệp Trong đó, họ Buthidae có số
lượng lớn nhất với 89 chi và hơn 940 loài, kế đó là họ Scorpionidae có 17 chi gồm 264 loài, họ Vaejovidae có 17 chi gồm 173 loài, họ Chactidae có 12 chi 172 loài, họ Bothriuridae có 15 chi 139 loài, họ Hemiscorpiidae có 12 chi 89 loài [9, 27]Bọ cạp là động vật ăn thịt, thức ăn của bọ cạp rất đa dạng từ các côn trùng như châu chấu, dế, kiến, rết, nhện… đến các động vật nhỏ như thằn lằn, rắn, chuột mới sinh.Bọ cạp hoạt động về đêm, ban ngày ẩn nấp trong hang, dưới lá cây khô Nhiệt độ phát triển bình thường của bọ cạp là 25-28oC, độ ẩm khoảng 72 – 82 % Từ khi mới sinh ra đến khi trưởng thành, bọ cạp trải qua năm lần lột xác Trong họ Buthidae có khoảng 500 loại
có khả năng gây nguy hiểm đối với con người và các loại này được phân bố nhiều ở châu Phi, châu Mỹ, châu Á (Hình 1.1).[22, 23, 69]
Trang 15Hình 1.1 Một số loài bọ cạp đại diện các họ khác nhau.[69]
1.1.1 Phân bố và môi trường sống
Bọ cạp được tìm thấy trên tất cả các châu lục, trừ châu Nam Cực, nhưng phong
Trang 16những hang động sâu (gần 1,000m dưới lòng đất) Môi trường sống ưa thích của bọ cạp trong tự nhiên là các hang hốc, khe đá, không gian dưới vỏ cây hay lớp lá rụng.[15]
Bọ cạp độc nguy hiểm với con người thuộc họ Buthidae, có khoảng 500 loài,
phân bố chủ yếu ở các vùng Nam Mỹ, Đông Á và Ấn Độ Các chiAndroctonus, Leiurus, Buthus, ButhotusvàHeterometrus phân bố chủ yếu ở Châu Á, Bắc Phi, Trung Đông Giống Centruroides phân bố ở Trung Mỹ, và giống Tityus phân bố ở Nam Mỹ,
phần lớn là ở các nước Brazil, Venezuela, Colombia và Argentina.[59, 89]
1.1.2 Đặc điểm hình thái cơ bản
Hình 1.2 Loài bọ cạpHeterometrus laoticusCouzijn, 1981.[69]
Cơ thể bọ cạp gồm hai phần chính là phần đầu ngực (prosoma) và phần bụng (opisthosoma) Phần bụng được chia thành hai phần, phần trước bụng, mesosoma, và phần đuôi, metasoma.Phần đầu ngực bao phủ bởi một cái mai giống tấm khiên, trên mai có một cặp mắt chính ở trung tâm, các cặp mắt phụ ở rìa góc phía trước mai Phía trước mai là đôi kìm nhỏ gọi là kìm miệng dùng để xé con mồi và ăn Ở hai bên phần đầu là đôi kìm to gọi là kìm kẹp có tác dụng chụp giữ con mồi và tự vệ, chung quanh đôi kìm kẹp được che phủ bởi các lông cứng xúc giác Phía dưới bụng có bốn cặp chân
và có một cơ quan giống như tấm lược gọi là pectin, có vai trò như những cảm biến để cảm nhận bề mặt tiếp xúc và những chấn động trên mặt đất (Hình 1.2)
Phần bụng bọ cạp bao gồm mười hai đốt với bảy đốt ở phần trước bụng và năm đốt ở phần đuôi và kết thúc là cơ quan telson (một túi tích trữ nọc độc từ tuyến nọc của
Trang 17bọ cạp), tận cùng của cơ quan này là ngòi đốt cong và nhọn dùng để truyền nọc độc Phần bụng trước được coi là cơ thể chính và là nơi chứa phổi, cơ quan tiêu hóa và cơ quan sinh dục của bọ cạp.[53]
Bọ cạp có sự thay đổi bề ngoài rõ rệt qua các giai đoạn phát triển Những biến đổi bên ngoài này có thể được quan sát rõ rệt nhất ở các loài bọ cạp thuộc
chiHeterometrus là sự thay đổi về màu sắc Khi mới sinh, bọ cạp con có màu trắng
như bông và chuyển màu sẫm dần sau vài ngày nằm trên lưng bọ cạp mẹ (màu nâu đen với ánh màu xanh) Sau khi lột xác lần thứ nhất,bọ cạp con có màu nâu đen gần giống màu của bọ cạp mẹ (chưa có ánh màu xanh).Khi mới sinh, bọ cạp con có kích thước
10-15 mm và tăng dần kích thước qua các lần lột xác Thí dụ, loài H spinifer có chiều
dài cơ thể qua các tháng tuổi như sau: tháng 1: 12-15 mm, tháng 2: 32-40 mm, tháng 3: 44-51 mm, tháng 4: 56-62 mm, tháng 5: 69-75 mm và tháng 6: 82-90 mm Trong phòng thí nghiệm, ở dạng trưởng thành loài này có chiều dài từ 95-110 mm, trong tự nhiên có thể dài tới 125 mm Nhiều loài bọ cạp rất khó phân biệt giữa con đực và con
cái Một số loài bọ cạp con đực có kích thước nhỏ hơn con cái như loài H spinifer, cơ thể con đực dài 110 mm, con cái dài 125 mm Ở một số loài thuộc chiIsometrus, sự
khác nhau giữa bọ cạp đực và cái biểu hiện rất rõ, bọ cạp đực có đuôi và các đốt đuôi (phần bụng sau) dài hơn bọ cạp cái.[15]
Trang 18làm đông máu và dừng sự hoạt động của tim hoặc ngăn cản quá trình đông máu tự nhiên và xuất huyết để giết con mồi.[1, 3]
Tất cả các loài bọ cạp đều có nọcđộc sử dụng để giết hoặc làm tê liệt con mồi trong hoạt động săn mồi Hầu hết nọc bọ cạpcó chứa nọc độc thần kinh, riêng ở loài
Hemiscorpius lepturus, trong nọc độc còn phát hiện nọc độc tế bào.Nọc bọ cạp là hỗn
hợp gồm các thành phần như: enzyme, peptide, nucleotide, lipid, mucoprotein, những biogenic amin và các thành phần chưa biết.Trong số các thành phần của nọc bọ cạp thì các polypeptide neurotoxin đóng vai trò đặc biệt quan trọng Các neurotoxin này có tác dụng lên các kênh ion của tế bào thần kinh bị kích thích và qua đó tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, tim mạch và hô hấp.[18]Tuỳ thuộc vào tác dụng của các toxin với các kênh ion, các toxin được chia ra làm bốn loại, đó là các toxin tác dụng trên các kênh vận chuyển ion: kênh Na+, kênh K+, kênh Cl- và kênh
Ca2+.[70, 83] Ngoài các neurotoxin, nọc bọ cạp còn chứa các serotonin, góp phần gây đau tại chỗ và các serotonin cũng có thể gây ra sự co thắt tử cung và gây sảy thai ở phụ nữ trong giai đoạn sớm của thai kì nếu bị bọ cạp chích phải.[23, 59]
Bọ cạp có khả năng điều chỉnh lượng nọc chính, thông thường trong khoảng 0,1 – 0,6 mg Gần đây, bọ cạp được phát hiện có khả năng sinh ra hai loại nọc độc tố khác nhau (nọc kép) trong cùng một lúc Đầu tiên, nọc nhẹ gọi là tiền độc tố (pretoxin) được sử dụng để gây tê cứng con mồi, tiếp sau đó là siêu độc tố, một loại dịch đậm đặc giống như sữa có độc tính cao hơn để giết chết con mồi.[70]
Trang 191.1.4 Bọ cạp ở Việt Nam
Bọ cạp ở Việt Nam phân bố rộng rãi khắp cả nước bao gồm các họ Buthidae, Scorpionidae, Chaerilidae và Pseudochactidae
Họ Buthidae[3]
Loài Lychas mucronatusFabricius, 1798phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền
Trung và miền Nam, phát triển mạnh về số lượng cá thể ở Đồng Phú (Bình Phước)
LoàiIsometrus basilicus Karsch, 1879 phân bố ở các tỉnh Nghệ An, Quảng
Trị, Bình Định, Khánh Hoà (Trường Sa), Bình Phước (Đồng Phú)
LoàiIsometrus spKovařík, 1998 phân bố ở Nghệ An (Vinh)
LoàiIsometrus deharvengi sp Lourenço, 2010phân bố ở Hòn Chồng, Kiên
Giang
Họ Scorpionidae[3]
Loài Heterometrus spinifer Ehrenberg, 1828 phân bố ở Bình Phước (Bù
Đốp, Bù Gia Mập, Đồng Phú)
Loài Heterometrus petersiiThorell, 1876ở thành phố Hồ Chí Minh, Bình
Thuận, Khánh Hoà, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh
LoàiHeterometrus laoticus Couzijn, 1981: phân bố ở Thành phố Hồ Chí
Minh, Tây Ninh, Đồng Nai (Biên Hoà), An Giang
Loài Heterometrus cyaneusC L Koch, 1836: phân bố ở Thừa Thiên Huế,
Trang 20 Họ Pseudochactidae[3]
LoàiVietbocap canhi Lourenço& Pham, 2010
LoàiVietbocap thienduongensisLourenço& Pham, 2012
Cả 2 loài này đều được phát hiện ở động Thiên Đường, Phong Nha – Kẻ Bàng thuộc tỉnh Quảng Bình
1.2 Cấu trúc và ảnh hưởng của toxin nọc bọ cạp
1.2.1 Cấu trúc của toxin
Các toxin có khả năng tương tác với các kênh vận chuyển Na+ được cấu tạo từ
60 - 70 gốc acid amin và cấu trúc được ổn định bởi bốn cầu disulfide [19]Trong khi
đó các toxin có khả năng tương tác với kênh vận chuyển K+ thường cấu tạo từ 31-39 đơn vị acid amin với cấu trúc được ổn định nhờ ba hoăc bốn cầu disulfide.[43, 48] Các toxin này tác dụng lên kênh vận chuyển K+ sẽ liên kết với các thụ thể kích thích của kênh và ức chế sự vận chuyển ion K+ qua kênh.[49, 72, 82]
Gần đây, hai peptide khác nhau của nọc bọ cạp thay đổi sự liên kết với ryanodine đã được xác định có tác dụng trên kênh vận chuyển Ca2+ Một trong số peptide đó cấu tạo từ 33 acid amin, toxin này tăng sự liên kết với ryanodine, còn toxin khác là heterodimer peptide cấu tạo từ 104 và 27 gốc acid amin, có tác dụng ức chế sự liên kết với ryanodine Chlorotoxin tác dụng với kênh Cl- là peptide cấu tạo từ 36 gốc acid amin với bốn cầu disulfide [21, 51, 93, 94]
Các toxin của nọc bọ cạp có cấu trúc không gian tương tự nhau trừ cấu trúc của các toxin tác dụng lên kênh Ca2+ là chưa biết, còn tất cả các peptide toxin bọ cạp đều
có lõi cấu trúc bảo thủ Các toxin ngắn của nọc bọ cạp thường có cấu trúc bậc hai gồm một xoắn alpha và hai nhánh đối song song của cấu trúc beta, giữa cấu trúc alpha và beta được cố định bằng hai cầu disulfide, còn cầu disulfide thứ ba gắn đầu N với đầu
C của chuỗi peptide (Hình 1.3).[80, 96]
Trang 21Hình 1.3 Cấu trúc toxin ngắn của nọc bọ cạp.[80]
Cấu trúc không gian của toxin dài gồm một xoắn alpha và ba nhánh đối song song của cấu trúc beta, trong cấu trúc này có bốn cầu disulfide Ngoài ra còn có một
ngoại lệ với quy luật này là cấu trúc của insectoxin tách từ nọc bọ cạp Hotentotta jundaicus, toxin này có hai đoạn xoắn alpha thay vì một đoạn như ở toxin tìm thấy ở
Trang 221.2.2 Tác động và ảnh hưởng của nọc bọ cạp lên kênh vận chuyển ion
Kênh vận chuyểnNa+ là một tập hợp các protein xuyên màng hình thành nên kênh vận chuyển ion có chức năng điều tiết sự di chuyển của ion Na+ xuyên qua màng sinh chất của tế bào Kênh vận chuyển Na+ được phân loại dựa trên các tác nhân kích thích làm mở kênh Na+, thí dụ như kênh điện thế (kênh cổng điện thế, nhạy điện thế với tên viết tắt “VGSCs”), kênh cổng ligand natri Về cấu tạo, kênh vận chuyển Na+ bao gồm một protein thứ cấp kích thước lớn α có khả năng tương tác với các protein khác (protein thứ cấp β) Protein thứ cấp α hình thành nên trung tâm của kênh và hoạt động tự do.Khi protein thứ cấp α bị tác động bởi tế bào, nó có thể hình thành kênh dẫn điều khiển hướng đi của ion Na+ theo đường cổng điện thế, ngay cả khi protein thứ cấp β hay các protein khác không được tác động.[17] Khi các protein đính kèm kết hợp với protein α, hai protein sẽ hình thành phức có khả năng điều chỉnh sự phụ thuộc điện thế của màng tế bào và vị trí của phức hai protein.[66, 67, 74]
Các toxin có nguồn gốc từ bọ cạp có khả năng tương tác với kênh vận chuyển
Na+ ban đầu được phân thành 2 loại α và β Dạng α được tìm thấy đầu tiên trong nọc
độc của loài bọ cạp Bắc Phi Độc tố Androctonus australis australis toxin II của loài
bọ cạp này có khả năng gắn vào vị trí số 3 trên kênhvận chuyểnNa+ tùy thuộc vào điện thế của màng tế bào (voltage-dependent manner), từ đó làm chậm hoặc ức chế hoàn toàn cơ chế kích hoạt của các kênh này Độc tố loại β là nhóm độc tố có khả năng gắn vào vị trí số 4 (site 4) để ức chế hoạt động của kênh vận chuyểnNa+ mà không chịu ảnh hưởng của điện thế màng tế bào Mô hình của độc tố loại β là toxin II trích từ loài
bọ cạp Centru-roides suffusus.[37, 42] Ngoài hai dạng độc tố trên, nhiều loại độc tố
khác đã được phát hiện và công bố xếp loại riêng do chúng có khả năng phân biệt kênhvận chuyểnNa+ của tế bào các loài không phải động vật có vú, thí dụ như màng tế bào kích ứng của côn trùng và loài giáp xác Số lượng các loại độc tố mới đang ngày càng tăng, cho đến nay đã có 85 dạng đã được biết đến và được phân loại thành 10 nhóm dựa vào sự khác biệt về cấu trúc và chức năng Bảng 1.1 trình bày các dạng điển
Trang 23hình của từng nhóm, các chuỗi acid amin trong bảng chỉ đại diện cho loại độc tố đặc trưng của nhóm.[67]
Bảng 1.1 Các đại diện của độc tố bọ cạp tác dụng lên kênh vận chuyển natri.[67]
Trang 241.2.2.2 Tác dụng của nọc bọ cạp trên kênhvận chuyển K +
Trong nghiên cứu sinh học tế bào, kênh vận chuyển K+ là loại kênh vận chuyển ion phổ biến và được tìm thấy ở gần như tất cả mọi loài sinh vật sống Kênh vận chuyển
K+ hình thành các lỗ rỗng thẩm thấu chọn lọc ion K+ giúp mở rộng màng tế bào Ngoài
ra, kênh K+ còn được tìm thấy ở hầu hết các dạng tế bào và điều khiển hoạt động nhiều chức năng khác nhau của tế bào Trong các tế bào kích thích như tế bào thần kinh, kênh K+ định hình điện thế hoạt động và thiết lập điện thế phục hồi của màng tế bào Kênh vận chuyển K+ hỗ trợ sự điều chỉnh điện thế hoạt động của cơ tim, do vậy nếu
có sự cố xảy ra với kênh vận chuyển K+ có thể dẫn tới rối loạn nhịp tim gây ảnh hưởng đến khả năng sống sót Kênh vận chuyển K+ cũng tham gia vào duy trì nuôi dưỡng mạch máu và kiểm soát các quá trình hoạt động tế bào như quá trình bài tiết hormone (quá trình tạo insulin trong tế bào beta ở tuyến tụy) Do vậy khi xảy ra rối loạn chức năng ở kênh vận chuyển K+ sẽ gây ra nhiều bệnh tật đối với cơ thể con người.[11, 12,
35, 40, 52, 60, 85]
Kênh vận chuyển K+ được chia làm 4 nhóm chính:
Kênh vận chuyển K+ kích hoạt bằng calcium (Calcium-activated) – Kênh được mở ra khi có sự hiện diện của ion calcium hoặc các phân tử gây tín hiệu khác
Kênh vận chuyển K+ hiệu chỉnh trong (Inwardly rectifying) – Giúp dẫn truyền dòng điện (tích điện dương) dễ dàng hơn vào bên trong tế bào
Kênh vận chuyển K+ tandem pore domain – Nhóm kênh này luôn mở hoặc
cơ bản luôn ở trong tình trạng kích hoạt Nhóm kênh này (“kênh vận chuyển Kali hồi phục” hoặc “kênh thải”) có chức năng thiết lập điện thế âm trên màng bao tế bào thần kinh Khi mở, kênh cho phép ion Kali đi xuyên qua màng với vận tốc ngang với tốc độ thẩm thấu phân tử nước
Kênh vận chuyển K+ cổng hiệu điến thế (voltage-gated) – Dạng kênh này
có thể mở hoặc đóng tương ứng với sự thay đổi điện thế trên màng tế bào
Trang 25Từ mục đích sử dụng ban đầu như một chất ligand để nghiên cứu bản chất và
sự chọn lọc điện sinh lý học của các kênh ion, việc nghiên cứu nọc độc bọ cạp đã dần dần phát triển trở thành nền tảng công nghệ sinh học đa năng để thiết kế các que thăm
dò chức năng đa dạng giúp xác định vị trí các kênh ion ở cấp độ phân tử, làm sạch các kênh ion, xác định trung tâm khối u để hỗ trợ trị bệnh ung thư… Các kênh ion trong
cơ thể điều khiển dòng chảy của các ion giúp phát sinh và lan truyền các xung thần kinh và điện thế hoạt động Giải phẫu phân tử các kênh ion bằng peptide nọc độc bọ cạp đã đưa ra được các bằng chứng cụ thể về các các đột biến, đặc tính hóa sinh lý dưới sự điều chỉnh lên xuống của các kênh ion liên quan đến các thay đổi, đôi khi gây nguy hiểm trong suốt quá trình lan truyền và dẫn truyền xung điện trong cơ thể Một thí dụ cụ thể ở người mắc triệu chứng Long QT, sự biến đổi chức năng liên quan đến quá trình điều khiển ion và hoạt động của kênh vận chuyển K+ Kv11.1 quy định bởi gene Ether-a-gogo (hERG) gây đột quỵ ở người bệnh.[77, 88]
Báo cáo đầu tiên về sự tương tác giữa nọc độc bọ cạp và kênh vận chuyển K+
được công bố vào năm 1982 bởi Carbone và các đồng sự Khi truyền nọc độc của loài
bọ cạp Centruroides noxius vào loài mực khổng lồ Axon, đồng thời theo dõi bằng
phương pháp xác định hiệu điện thế (kẹp điện thế) Hoạt tính duy nhất được ghi nhận trong suốt quá trình theo dõi là của Noxiustoxin (NTX), một peptide 39 AA được tinh chế từ nọc độc thô và tách bằng máy sắc ký Sephadex G-50 với phương pháp trao đổi ion Mặc dù đã cô lập và tinh chế, điện thế đa chiều của độc tố bọ cạp vẫn chưa được xác định chính xác Từ thời điểm Carbone công bố báo cáo, rất nhiều báo cáo về các độc tố bọ cạp khác đã được xác định có hoạt tính đặc trưng đối với kênh vận chuyểnn
K+ Cùng với tiến bộ trong các kỹ thuật sắc ký, kết hợp với khả năng thiết lập ghi nhận các tín hiệu đơn kênh, khả năng ứng dụng độc tố của bọ cạp đã được phát triển rộng
Năm 1985, Miller và các cộng sự sử dụng Charybdotoxin (Leiurus quinquestriatus;
ChTx) để định danh và phân tích dược lý của một kênh vận chuyển K+ điều khiển ion
Trang 26(áp suất thấp) giúp làm tăng khả năng định danh và tinh chế độc tố cũng đã góp phần rất lớn vào việc nghiên cứu độc tố trong nọc độc bọ cạp.[16, 24, 30, 33, 60, 65, 79]
Hiên nay, đã có 49 chuỗi polypeptide được cô lập từ độc tố bọ cạp có tác động đối với kênh vận chuyển K+ đã được phát hiện Các loại độc tố này đều có khả năng nhận diện kênh vận chuyển K+ nhờ các tế bào đặc trưng có các đặc điểm như: phụ thuộc điện thế, độ dẫn thấp, phụ thuộc ion Ca2+ từ màng tế bào não và cơ Trong báo cáo gần đây Tytgat và cộng sự đã đưa ra bảng phân loại tên của các peptide đại diện cho 12 nhóm độc tố kênh vận chuyển K+ Thí dụ về chuỗi acid amin của từng nhóm được trình bày trong bảng 1.2 Các nhóm độc tố có chiều dài chuỗi acid amin đa dạng
từ 29 đến 41 và chứa 3 hoặc 4 cầu nối disulfide Trong bảng 1.2 không bao gồm độc
tố Ergtoxin mới được phát hiện gần đây với 42 chuỗi acid amin, gây tác động lên kênh vận chuyển K+ HERG.[66]
Một số cDNA và chuỗi gene có tác dụng lên kênh vận chuyển K+cũng được phát hiện trong thời gian gần đây Các chuỗi gene và cDNA đã được công bố là KTX2
từ loài Androctonus australis Hector, BmPO1, BmPO3 và BmPO5 từ loài Buthus martensii Karsch; ChTx-a từ Leiurus quinquestriatus hebraeus Các dạng độc tố chỉ
có chuỗi cDNA là CoTx1 từ Centruroides noxius Hoffmann; BmPO2 từ loài Buthusmartensii Karsch; ChTx-b, ChTx-c và ChTx từ Leiurus quinquestriatus hebraeus Chuỗi cDNA của 1 nhóm độc tố mạch dài mới (60-64 acid amin) có khả
năng ức chế kênh vận chuyển K+ và ổn định bởi 3 cầu nối disulfide cũng đã được công
bố: AaTXK` từ loài Androctonus australis Hector; TsTXK` từ Tityus serrulatus; BmTXK` và BmTXK`2từ loài Tityus serrulatus; BmTXK` và BmTXK`2 từ loài Buthus martensii Karsch Sự sắp xếp gene của các phân đoạn DNA trong các loại độc
tố này cho thấy nhiều điểm tương đồng với gene độc tố kênh Na+: bao gồm 2 exon và
1 intron ngăn cản vùng ghi nhận mã và tín hiệu peptide Phân tích chuỗi gene và cDNA cho thấy kích thước của peptide tín hiệu lớn hơn (22-28 chuỗi acid amin) so với peptide ghi nhận mã của kênh vận chuyển Na+, còn intron lại ngắn hơn (78-133 nucleotide) [8, 44, 46, 50, 68]
Trang 27Bảng 1.2 Đại diện các nhóm độc tố kênhvận chuyển K+ [66]
thống
Tên thông dụng
TSRGKCMNKKCRCYS
L quinquestriatus hebraeus
α-KTx12.1
Trang 281.3 Một số nghiên cứu về toxin có trong nọc bọ cạp
1.3.1 Các phương pháp cô lập và tinh chế toxin
Nghiên cứu bọ cạp và nọc độc từ bọ cạp đã bắt đầu được tiến hành từ những năm 1970 Ban đầu, việc tách chiết và tinh chế các toxin gặp nhiều khó khăn do trong nọc bọ cạp ngoài các protein và peptide, các chất có hoạt tính sinh học còn tồn tại ở nhiều dạng hợp chất khác Trong giai đoạn đầu tiên, nọc bọ cạp được thu bằng tay nhằm hạn chế các tạp chất không tan trong nước, nguyên nhân chính gây nghẹt các cột sắc ký Nhược điểm của phương pháp này là lượng nọc thu được thấp do chỉ một phần nọc trong túi nọc được bọ cạp phóng ra Để có một lượng nọc đủ lớn cho các giai đoạn
cô lập, tinh chế cũng như thử nghiệm hoạt tính, cần thiết phải có một phương pháp để thu được lượng nọc lớn với hiệu quả cao Một trong những phương pháp được chọn là
sử dụng một dòng điện xung kích thích vào phần đuôi chích của bọ cạp để buộc bọ cạp tiết nọc, nọc thô thu được nhiều hơn so với phương pháp thu bằng tay
Năm 1984, Martin và Rochat và các cộng sự của mình đã tiến hành phân tách
và tinh chế độc tố từ nọc bọ cạp Androctonus australis Hector từ 10.000 cá thể sử dụng
dòng điện xoay chiều 55V để kích thích sự tiết nọc Nọc thô sau khi được trích bằng nước và thẩm tách được đưa vào hệ sắc ký lọc gel sử dụng bốn cột Sephadex G-50 ghép và dung môi giải ly là dung dịch ammonium acetate 0,1 M, pH 8,5 để thu được các phân đoạn trong đó có hai phân đoạn có độc tính RI và RIIgây chết đối với chuột
Để phân tách toxin có độc tính gây chết từ phân đoạn RI, phân đoạn RI tiếp tục được phân tách trên cột DEAE-Sephadex A-50 (4 × 200 mm) trong dung dịch ammonium acetate 0,1 M, pH 8,5, tốc độ rửa cột 50 mL/giờ thu được ba phân đoạn D1, D’1, D2 Phân đoạn D’1 tiếp tục được phân tách trên cột Amberlite CG-50 (4 × 150 mm) trong dung dịch ammonium acetate 0,2 M, pH 6,3 để thu được toxin I và toxin I”.Hai toxin này sau đó được phân tích cấu trúc để xác định cấu trúc bậc một Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi một lượng nọc thô lớn để thu được lượng toxin phù hợp, từ 100 g nọc chỉ thu được 40 mg toxin I” Sau đó, năm 1986, tác giả đã cải thiện quy trình tách chiết
và thu được kết quả tốt hơn với lượng toxin thu được lên tới 0,8 % so với 0,45 % trước đây.[56, 57]
Trang 29Năm 1989, Arantes và đồng sự đã tiến hành thử nghiệm phương pháp mới để
phân tách và làm sạch nọc bọ cạp Brazin thuộc loài Tityus serrulatatus bằng sắc ký
trao đổi ion nhiều lần trên cột CM-Cenlulose-52 Kết quả đã tách được 5 loại toxin có
trong nọc bọ cạp Tityus serrulatatus trong đó có 4 loại toxin đã được công bố là IX13,
IX 5, X4, XIII và một loại toxin mới được đặt tên là TsTX-IV (Hình 1.5).[7]
Hình 1.5 Sắc ký đồ trao đổi ion của nọc bọ cạp loài Tityus serrulatatus.[7]
Vào năm 1987, Martin và Rochat tiến hành làm sạch toxin thô từ bọ cạp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Kết quả thu được rõ ràng, phân tách rõ Đến nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm để tách chiết và làm sạch các toxin từ nọc bọ cạp Kharat R và đồng sự phối hợp phương pháp lọc gel (Hình 1.6) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hình 1.7) để tách
toxin từ nọc bọ cạp Scorpio Maurus.[43, 58]
Trang 30Hình 1.6 Sắc ký đồ sắc ký lọc gel của nọc bọ cạp Scorpio Maurus.[43, 58]
Hình 1.7 Sắc ký đồ sắc ký hiệu năng cao của nọc bọ cạp Scorpio Maurus.[43, 58]
1.3.2 Một số nghiên cứu nọc độc của chi Heterometrus
1.3.2.1 Nghiên cứu thành phần và cấu trúc nọc độc chi Heterometrus
Heterometrus laoticusCouzijn là một trong 33 loài thuộc chi Heterometrus
được tìm thấy trên thế giới, chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc Đông Nam Á ở các nước Campuchia, Lào, Thái Lan, Việt Nam, Ấn Độ, Sri Lanka,
Nepal và Trung Hoa Nọc của các loài thuộc chi Heterometrus gây ra một số triệu
Trang 31chứng và biểu hiện ở nạn nhân khi nhiễm độc như đau rát cục bộ, tấy đỏ hoặc mất màu
ở da, tăng huyết áp, suy hô hấp, chóng mặt và nôn mửa, đau quặn dạ dày, khát nước, nhức đầu, sốt, run rẩy Hiện nay, điều trị nhiễm độc bọ cạp chưa thể thực hiện do chưa các loại kháng huyết thanh chưa được sản xuất, biện pháp chủ yếu là điều trị giảm các triệu chứng cho bệnh nhân.[36]
Từ nọc của loài H petersii đã phát hiện mười nhóm peptide và protein, trong
đó có hai nhóm có khả năng gây độc đối với kênh vận chuyển K+, bốn nhóm peptide
có khả năng kháng vi sinh vật và gây nhược trương đối với tế bào, một nhóm có độc tính đối với kênh vận chuyển Ca2+, một nhóm peptide tương tự Lal, một nhóm PLA2
và serine protease.Ngoài ra còn 12 nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học khác cũng
được xác định từ nọc của loài H petersii Một peptide có cấu trúcmới xoắn alpha (Hp1090) từ nọc của loài H petersii cũng được xác định nhờ kỹ thuật cDNA, peptide
này có khả năng ức chế sự lây nhiễm viêm gan siêu vi C vớiIC50 7,62 µg/mL và khả
năng tiêu diệt HCV in vitro nhờ tương tác trực tiếp với màng virus.[54, 92]
Toxin HsTx1 được cô lập từ nọc độc của loài H spinifer là một chuỗi peptide
gồm 34 đơn vị acid amin và 4 cầu disulfide So sánh cấu trúc sơ cấp với một số toxin
khác, HsTx1 có độ tương đồng về cấu trúc sơ cấp 53% đối với toxin của loài Pandinus imperator, 59% đối với maurotoxin và chỉ có độ tương đồng 32 – 47% với các peptide
ức chế kênh vận chuyển K+ khác Khi thử nghiệm trên kênh vận chuyển K+ của chuột, HsTx1 ức chế kênh Kv1.3 và khi kết hợp với 125I-kaliotoxin HsTx1 có thể ức chế hoàn toàncác kênh vận chuyểnK+ cổng điện thế HsTx1 có cấu trúc gồm 34 acid amin
và 3 – 4 cầu disulfide và được xếp vào nhóm các toxin ngắn từ nọc bọ cạp (có 24 – 39 acid amin) Từ mô hình phân tử đã xác định được các acid amin Tyr 21, Lys 23, Met
25 và Asn 26 quyết định hoạt tính sinh học của HsTx1 đối với kênh vận chuyển K+.[49, 73]
Từ túi nọc của loài H spinifer, một lớp các peptide mới có khả năng kháng vi
Trang 32thấy Trong đó, HsAp có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gram âm và gram dương với giá trị MIC trong khoảng 11,8 – 51,2 µM.[61]
Nọc độc loài bọ cạp đen châu Á H longimanus được phân tách và tinh chế sử
dụng các phương pháp sắc ký và điện di và được phân tích sử dụng khối phổ nhiều lần trên hệ thống MALDI-TOF/TOF cùng với việc so sánh với các peptide đã biết từ cơ
sở dữ liệu protein Swiss-Pot Kết quả cho thấy nọc độc của loài H longimanus chứa
nhiều hợp chất có độc tính có khả năng kháng vi sinh vật cũng như ức chế các kênh thần kinh.[14, 61]
Nọc của loài bọ cạp H laoticus phân bố ở Thái Lan được phân tách bằng sắc
ký lọc gel trên Sephadex G50 Các phân đoạn thu được được đánh giá độc tính trên vi sinh vật để xác định khả năng kháng vi sinh vật và PD50, các phân đoạn có hoạt tính cao tiếp tục được phân tách sử dụng sắc ký trao đổi ion Sau khi sắc ký đã cô lập được toxin heteroscorpine-1 (HS-1) với trình tự cấu trúc tương tự 80% panscorpine và opiscorpine và cho thấy khả năng ức chế đối với nhiều loại vi sinh vật Cũng từ loài
H laoticus, bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và xác định cấu trúc bằng phương pháp
Edman dựa trên phổ khối lượng MALDI-TOF MS của một số phân đoạn, đã xác định được cấu trúc sơ cấp hoàn toàn mới của một peptide, HelaTx1 Peptide này sau đó được sinh tổng hợp theo cấu trúc có được từ quá trình phân tích cấu trúc và được đánh giá khả năng tương tác với các kênh vận chuyển K+ HelaTx1 cho thấy khả năng tương tác mạnh nhất đối với các kênh Kv1.6 và Kv1.1 (EC50 = 9,9 ± 1,6 mM).[81, 84]
1.3.2.2 Nghiên cứu về dược tính của nọc chi Heterometrus
Khả năng kháng ung thư máu của nọc loài H bengalensis được thử nghiệm trên
các dòng tế bào ung thư máu U937 và K562, các tế bào ung thư sau khi phơi nhiễm
với nọc của loài H bengalensis cho thấy các biểu hiện của hiện tượng chết tế bào như
co màng tế bào, suy thoái DNA Giá trị IC50 tương ứng của nọc loài H bengalensis
đối với dòng tế bào ung thư máu U937 và K562 là 41,5 µg/mL và 88,3 µg/mL Cũng
từ nọc của loài H bengalensis đã tách được proteinBengalin có khối lượng phân tử
lớn gồm 20 đơn vị acid amin (G-P-L-T-I-L-H-I-N-D-V-H-A-A/R-F-E-Q/G-F/G-N-T), hoàn toàn khác với các protein từng được cô lập từ nọc bọ cạp Bengalin được thử
Trang 33nghiệm hoạt tính trên dòng tế bào ung thư máu U937 và K562 cho kết quả dương tính với giá trị IC50 tương ứng là 3,7 µg/mL và 4,1 µg/mL.[20, 39]
Nọc độc trích từ loài H xanthopus khi được phân tách cũng cho thấy một số
peptide có khả năng kháng vi sinh vật với cấu trúc tương tự hadrurin, scorpine và
Pandinin 1 và 2 Nọc loài H xanthopus thô có thể tiêu diệt các dòng vi sinh vật như B subtilis ATCC 6633, S typhimurium ATCC 14028, P aeruginosa ATCC 27853 và E faecalis ATCC 14506 và thể hiện hoạt tính cao nhất đối với B subtilis Nọc thô của loài H laoticus cũng thể hiện khả năng kháng vi khuẩn B subtilis, K Pneumoniae, P aeruginosa và S aureus Sau khi phân tách nọc thô loài H laoticus, polypeptide Heteroscorpine 1 được cô lập với khối lượng phân tử 8-93 Da có khả năng kháng B subtilis, K Pneumoniae, P aeruginosa và S aureus mạnh hơn nọc thô 300 lần Từ loài H petersii, Hp1090 có cấu trúc xoắn alpha mới được cô lập và được thử nghiệm
khả năng tiêu diệt virus đối với dòng HCV, kết quả cho thấy Hp1090 có khả năng tiêu
diệt HCV khi thử nghiệm trên mô hình in vitro có thể ngăn chặn bước đầu lây nhiễm
HCV.[6, 61, 91]
1.4 Ứng dụng của nọc bọ cạp
1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới
Nọc của loài Buthusmartensii Karsch được báo cáo có tác dụng tiêu diệt tế bào khối u não U251-MG in vitro nhưng lại không có tác dụng đối với các tế bào ung thư gan ở người cũng như ung thư buồng trứng ở chuột Nọc độc của loài B martensii có
khả năng ức chế sự phát triển khối u trên chuột nhờ khả năng ức chế các kênh vận
chuyển ion của các tế bào não Từ loài bọ cạp đỏ Trung Hoa B martensii Karsch, một
serine protein BMK-CBP được cô lập và có khả năng liên kết với các tế bào ung thư dòng MCF-7 Hyaluronidase, enzyme có trong nọc của nhiều loài như rắn, ong, tò vò,
bọ cạp, có khả năng tán trợ sự phát tán của nọc độc xảy ra nhanh hơn trong cơ thể
Trang 34Tamapin, được cô lập từ nọc loài bọ cạp đỏ Ấn Độ Mesobuthus tamulus, là một
toxin có 31 acid amin, thuộc dòng toxin α,5-4 Tamapin có khả năng ức chế các kênh vận chuyển K+ hoạt hóa bởi ion Ca2+ Khi thử nghiệm khả năng ức chế trên các kênhvận chuyển K+ hoạt hóa bởiion Ca2+, Tamapin thể hiện khả năng chọn lọc giữa các kênh KCa2.2 (SK2/KCNN2, IC50 = 24 pM) và KCa2.1 (SK1/KCNN1, ~ 1750 lần)
và KCa2.3 (SK3/KCNN3, ~ 70 lần).[63, 64]Các nghiên cứu gần đây cho thấy độc tố
chlorotoxin tách từ nọc bọ cạpLeiurus quinquestratus của Israel có khả năng gắn rất
đặc hiệu với các tế bào ung thư não Điều này mở ra triển vọng sử dụng chúng như các chất đặc hiệu để đưa thuốc đặc trị đến các tế bào ung thư hoặc sử dụng chúng như các loại thuốc để tiêu diệt tế bào ung thư.[29, 55, 76]
Nghiên cứu của nhóm Grez Kaczorovski tại công ty Merck đã xác định độc tố
margatoxin, tách chiết từ nọc bọ cạpCentrurodies margaritatus, có tác động rất đặc
hiệu lên kênh vận chuyển Ca2+, tham gia quá trình hoạt hóa lymphocyte, làm ức chế hoạt hóa bạch huyết bào và quá trình tổng hợp ra interleukin-2 bởi T-lymphocyte người Công ty Merck đã đăng ký bản quyền sử dụng margatoxin như chất ức chế miễn dịch dùng để điều trị các bệnh tự miễn dịch hoặc dùng để ngăn cản sự đào thải trong quá trình cấy ghép cơ quan.[32, 34]
Chế phẩm Vidatox – sản xuất từ nọc bọ cạpRhopalurus junceus được sử dụng
ở Cuba để điều trị bệnh ung thư và Parkinson Sự thay đổi cấu trúc bậc 1 của độc tố
bọ cạp có thể sử dụng để chế tạo ra những loại thuốc mới với hoạt tính sinh học riêng Thí dụ nghiên cứu cấu trúc của charybdotoxin đã mở ra khả năng sản xuất ra những protein nhỏ nhưng ổn định có hoạt tính mới có thể ứng dụng trong y dược.[74]
Ngoài ra nọc độc bọ cạp còn có tính kháng khuẩn và kháng nấm, vì vậy cũng
có thể làm thuốc trị các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra Chính vì các dược tính quan trọng của nọc bọ cạp hiện nay nhiều hãng dược phẩm lớn trên thế giới như Wyeth, Ayest, Genetech … rất quan tâm đến việc ứng dụng của chúng để sản xuất thuốc Nọc
bọ cạp đã được chứng minh có tác dụng giảm đau, kháng viêm, chống co giật, động
kinh Những năm gần đây đã có những nghiên cứu nọc bọ cạp loài Heterometrus để
ứng dụng trong y dược.[13, 70, 72]
Trang 351.4.2 Nghiên cứu và ứng dụng nọc bọ cạp ở Việt Nam
Ngược lại với sự phân bố phong phú và ứng dụng của nọc bọ cạp trong y học thì những nghiên cứu của nọc bọ cạp ở Việt Nam chỉ mới ở giai đoạn bắt đầu Nghiên
cứu nọc bọ cạp nâu (Lychas mucronatus họ Buthidae) của tác giả Hoàng Ngọc Anh và
đồng sự cho thấy trong nọc này có hai nhóm toxin với khối lượng phân tử 3.500-5.000
Da và 6.000 – 8.000 Da Từ nọc bọ cạp này nhóm tác giả đã tách ra và khảo sát tính chất bảy toxin ngắn (Mw = 3.500 – 5.000 Da) Các neurotoxin này ức chế điện thế tác dụng của dòng điện Na+ trên dây thần kinh ếch và tác dụng của phụ thuộc vào khối lượng phân tử Trong số các neurotoxin đã tách được, đã xác định cấu trúc bậc một một phần của một toxin (Toxin 10) và cấu trúc toàn phần của một toxin khác (Toxin
14),các cấu trúc này đã được đăng ký ở ngân hàng dữ liệu protein Ngoài ra từ bọ cạpL mucronatus, một glycoprotein có hoạt tính lectin đã được cô lập và khảo sát cấu trúc
cũng như hoạt tính.[41]
Toxin 10: EWTCAGKQEQCRV
Toxin 14: VSIG IKCDP S I DLCEGQCRIRYFTGYCSGDTCHCS
Nhóm nghiên cứu của tác giả cùng với TSKH.Hoàng Ngọc Anh đã bước đầu
tiến hành khảo sát, nghiên cứu nọc bọ cạp từ loài H.laoticus phân bố ở miền Nam Việt
Nam, bước đầu đã thu được các kết quả khả quan Nọc thô sau khi tiến hành làm sạch bước 1 đã được thử độc tính với chuột thu được 2 phân đoạn có độc tính, các phân
đoạn này tiếp tục được khảo sát dược tính Nọc bọ cạp đen Heterometrus laoticus tiêm
dưới da liều 8,5 mg/kg và 17 mg/kg có tác dụng giảm đau trung ương trên mô hình nhúng đuôi chuột tương đương với tác dụng của morphine liều 2,5 mg/kg và tác dụng giảm đau ngoại biên trên mô hình đau quặn gây ra bởi acetic acid tương đương với tác dụng của aspirin tiêm dưới da liều 50 mg/kg Ngoài ra, nọc bọ cạp đen còn có tác dụng kháng viêm với liều 8,5 mg/kg và17 mg/kg khi tiêm dưới da Kết quả nghiên cứu cho
Trang 36thuốc chữa đau cơ, xương rất hiệu quả Trong y học cổ truyền, bọ cạp nếu được dùng nguyên con được gọi là toàn yết, chỉ dùng đuôi được gọi là yết vĩ, có thể dùng để trị bệnh kinh giật, co quắp, méo miệng, bán thân bất toại, uốn ván…[4]
Trang 372 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang 382.1 Đối tượng nghiên cứu
Bọ cạp đen Heterometrus laoticus được thu mua ở tỉnh An Giang thành 2 đợt,
đợt 1 vào tháng 5 và đợt 2 vào tháng 8 với tổng số 2 lần là 850 cá thể Bọ cạp thu mua sau đó được nuôi trong phòng thí nghiệm để lấy nọc phục vụ cho các nghiên cứu
2.2 Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm
2.2.1 Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm
Bọ cạp H laoticus được nuôi trong phòng thí nghiệm để thu nọc phục vụ cho
việc nghiên cứu ở nhiệt độ từ 24oC đến 32oC và độ ẩm từ 78% đến 82% dưới ánh sáng
tự nhiên Bọ cạp là động vật ăn thịt, thức ăn của chúng rất đa dạng từ các loại côn trùng như: nhện, ruồi, dán, bướm, cào cào, châu chấu, dế, kiến, và các động vật nhỏ như rết, chuột nhắt mới sinh Trong điều kiện phòng thí nghiệm, thức ăn sử dụng để nuôi
bọ cạp là dế vì dễ kiếm và là nguồn dinh dưỡng tốt để nuôi bọ cạp.[5]
Chọn ngẫu nhiên 20 cá thể đem cân lần lượt để xác định khối lượng trung bình của mỗi cá thể trước khi nuôi Sau đó, 850 cá thể này được chia ra nuôi trong 13 chậu (khoảng 60-75 cá thể/chậu) có đường kính 70 cm, cao 30 cm (Hình 2.1) 20 cá thể bọ cạp được chọn ngẫu nhiên và cân từng cá thể để xác định trọng lượng trung bình ban đầu Để tạo môi trường sống tương đối phù hợp với môi trường thiên nhiên, trong mỗi chậu đặt hai bọt xốp thấm nước để cung cấp nước cho bọ cạp, cỏ và lá khô được sử dụng để phủ lên trên nhằm tạo bóng tối và giữ ẩm cho môi trường nuôi Bọ cạp được cho ăn một tuần một lần sau khi dọn vệ sinh chậu nuôi, chậu nuôi bọ cạp được dọn vệ sinh 2 lần một tuần
Trang 39Hình 2.1 Thau nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm
2.2.2 Xác định pH và hàm lượng protein trong nọc bọ cạp H laoticus
Nọc thô được thu từ bọ cạp H laoticus nuôi trong phòng thí nghiệm được hòa
tan vào nước theo tỷ lệ 15 mg nọc thô vào 1,5 mL nước cất, mẫu sau đó được hòa tan bằng máy quay ly tâm, 6.000 vòng/phút trong thời gian 15 phút, sau đó tiến hành lọc mẫu, tách phần không tan trong nước ra ngoài, sử dụng máy đo pH xác định độ pH của nọc thô
Lượng protein tổng có trong nọc bọ cạp được định lượng sử dụng thuốc thử Biuret và phương pháp đo hấp thu ánh sáng ở bước sóng 540 nm Dung dịch chuẩn để lập đường chuẩn là dung dịch albumin 1% theo các nồng độ protein từ 0 – 10 mg/mL Đường chuẩn là đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thu ∆OD vào hàm lượng protein (mg/mL).[75]
Trang 40Bảng 2.1.Tóm tắt lập đường chuẩn định lượng protein bằng phương pháp biuret
Sau khi có được đường chuẩn và phương trình đường chuẩn, nọc bọ cạp thu được cũng được hiện màu bằng cách hòa tan nọc bọ cạp (15 mg) trong nước cất (1,50 mL), ly tâm để loại bỏ phần không tan chỉ lấy phần dung dịch Lấy 1,00 mL dung dịch nọc đã chuẩn bị hòa tan cùng với 4,00 mL thuốc thử Biuret và để yên trong 20 phút, sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm và tính toán nồng độ protein có trong mẫu sử dụng phương trình đường chuẩn đã lập
2.2.3 Xác định khối lượng phân tử của nọc bọ cạp H laoticus
2.2.3.1 Xác định khối lượng phân tử các phân đoạn sau sắc ký lọc gel bằng
phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)
Dung dịch đệm sodium dodecyl sulfate (SDS) dùng để chuẩn bị mẫu protein được pha ở nồng độ 4X bằng cách hòa tan Tris-HCl 1 M, pH 6,8 (2,0 mL), sodium
dodecyl sulfate (0,80 g), glycerol 10% (4,00 mL), β-mercaptoethanol 14,7 M (0,4 mL),
EDTA 0,5 M (1,0 mL), bromophenol blue (8 mg) trong một lượng nước chất khử ion cho đủ 10,0 mL Khi sử dụng, dung dịch đệm SDS 4X được pha loãng 4 lần với nước khử ion