Luận văn nghiên cứu sự phân bố của e coli gây bệnh tiêu chảy theo kiểu gene ở lợn con sau cai sữa tại một số tỉnh phía bắc

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ MỸ HẠNH

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA E.COLI GÂY BỆNH

TIÊU CHẢY THEO KIỂU GENE Ở LỢN CON SAU

CAI SỮA TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Thú y

Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN VIẾT KHÔNG

HÀ NỘI, 2011

LỜI CAM ðOAN

ơ

- Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là

trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2011

Tác giả

Nguyễn Thị Mỹ Hạnh

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược nhiều sự giúp ñỡ của các cá nhân và tập thể Nhân dịp này cho phép tôi ñược bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Viết Không ñã cung cấp những kiến thức chuyên môn bổ ích

và dẫn dắt tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và viết luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới cán bộ, nhân viên – Bộ môn Hóa sinh, Miễn dịch, Bệnh lý, Viện Thú y ñã tạo ñiều kiện, chỉ bảo và giúp ñỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Bộ môn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý, khoa Thú y – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã dạy dỗ, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn ñối với gia ñình, các cán bộ viên chức thuộc Trung tâm kiểm tra Vệ sinh thú y trung ương I ñã tạo ñiều kiện tốt nhất

ñể tôi hoàn thành quá trình nghiên cứu và viết luận văn của mình

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Mỹ Hạnh

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

E.coli Escherichia coli

EAggEC hay EAEC Enteroaggregative E.coli

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Danh mục các từ viết tắt iii

Mục lục iv

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

ðẶT VẤN ðỀ 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tình hình nghiên cứu về E.coli gây tiêu chảy ở lợn con 2

1.1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 2

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 3

1.2 Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) 3

1.2.1 ðặc điểm hình thái 3

1.2.2 ðặc tính nuơi cấy 4

1.2.3 ðặc tính sinh hĩa 4

1.2.4 Sức đề kháng 5

1.2.5 Các kháng nguyên 6

1.2.6 Các yếu tố gây bệnh chung của vi khuẩn E.coli 7

1.2.7 Phân loại E.coli 10

1.3 Bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn con sau cai sữa 19

1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh 19

1.3.2 Cơ chế sinh bệnh 19

1.3.3 Triệu chứng 21

1.3.4 Bệnh tích 21

1.3.5 Chẩn đốn 22

2 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 ðối tượng và nội dung nghiên cứu 23

2.1.1 ðối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 23

2.3 Vật liệu nghiên cứu 24

2.3.1 Mẫu bệnh phẩm 24

2.3.2 Môi trường, hoá chất, sinh phẩm 24

2.3.3 Máy móc, trang thiết bị 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 25

2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu 25

2.4.2 Phân lập vi khuẩn 25

2.4.3 Giám ñịnh ñặc tính sinh vật, hóa học 26

2.4.4 Phương pháp PCR – xác ñịnh ñặc tính gene học 27

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 29

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Tình hình tiêu chảy ở lợn tại 3 tỉnh nghiên cứu 30

3.1.1 Tình hình lợn con tiêu chảy 30

3.1.2 Tình hình lợn con cai sữa mắc tiêu chảy 33

3.2 Kết quả phân lập và xác ñịnh ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn từ phân lợn sau cai sữa bị tiêu chảy 35

3.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ phân lợn sau cai sữa bị tiêu chảy 35

3.2.2 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hóa của E.coli phân lập 37

3.3 Kết quả nghiên cứu xác ñịnh gene mã hóa một số yếu tố ñộc lực 39

3.3.1 Kết quả xác ñịnh một số gen mã hóa yếu tố ñộc lực 39

3.3.2 Tần số xuất hiện gene mã hóa cho từng yếu tố ñộc lực 41

3.3.3 Kết quả xác ñịnh tổ hợp kiểu gene của các chủng E.coli 45

4 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 52

4.1 Kết luận 524.2 ðề nghị 534.3 Phụ lục 01 Tình hình tiêu chảy trên ñàn lợn tại Bắc Ninh, Bắc Giang, Ninh Bình từ 2006 ñến 2010 644.4 Phụ lục 02 Tình hình tiêu chảy trên ñàn lợn sau cai sữa tại Bắc Ninh, Bắc Giang, Ninh Bình từ 2006 ñến 2010 65

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 ðặc tính sinh hóa chung của E.coli [20] 5

Bảng 2.1 Trình tự nucleotid các cặp mồi sử dụng trong PCR 28

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 28

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của PCR 29

Bảng 3.1 Tổng hợp tình hình lợn con tiêu chảy và chết do tiêu chảy 30

Bảng 3.2 Tình hình hội chứng tiêu chảy ở lợn sau cai sữa 33

Bảng 3.3 Kết quả phân lập vi khuẩn từ phân lợn sau cai sữa bị tiêu chảy 36

Bảng 3.4 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hóa của các chủng E.coli phân lập 38

Bảng 3.5 Tỷ lệ E.coli mang gene mã hóa cho các yếu tố ñộc lực 40

Bảng 3.6 Tần số xuất hiện gene mã hóa các yếu tố ñộc lực riêng rẽ 42

Bảng 3.7 Kết quả xác ñịnh sự liên kết gene trong các chủng E.coli phân lập tại Bắc Ninh 46

Bảng 3.8 Kết quả xác ñịnh sự liên kết gene trong các chủng E.coli phân lập tại Bắc Giang 47

Bảng 3.9: Kết quả xác ñịnh sự liên kết gene trong các chủng E.coli phân lập tại Ninh Bình 48

Bảng 3.10 Sự phân bố của E.coli gây tiêu chảy ở lợn con theo kiểu gene 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sơ ñồ phân lập E.coli 25Hình 3.1 Biến ñộng tỷ lệ lợn con tiêu chảy từ 2006 ñến 2010 31Hình 3.2 Biến ñộng tỷ lệ tiêu chảy ở lợn sau cai sữa từ 2006 ñến 2010 34Hình 3.3 Tần số kiểu gene theo nhóm (trái) và tần số 9 kiểu gene gây

tiêu chảy (phải) 50

Song hành với sự phát triển của chăn nuôi lợn luôn luôn là vấn ñề dịch bệnh Dịch bệnh gây chết lợn, giảm thiểu sự tăng trọng và là trở ngại lớn, gây nhiều thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi Trong số những dịch bệnh phổ biến, hội chứng tiêu chảy ở lợn con nói chung và lợn sau cai sữa nói riêng thực sự là vấn ñề tồn tại lâu dài và dai dẳng ở tất cả mọi hình thức chăn nuôi Tiêu chảy ở lợn con là một hội chứng ña nguyên nhân Trong số các

nguyên nhân vi sinh vật, E.coli là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây tiêu chảy ở lợn con giai ñoạn sau cai sữa E.coli gây tiêu chảy dựa vào hai yếu

tố ñộc lực chính: yếu tố bám dính và ñộc tố ñường ruột Xét về bản chất sinh hóa, các yếu tố ñộc lực này là những protein do các gene mã hóa tương ứng

quyết ñịnh Nghiên cứu về kiểu gene của E.coli gây tiêu chảy và sự phân bố

của chúng sẽ cung cấp thông tin căn bệnh ñặc thù cho từng khu vực Trong

nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành ñề tài “Nghiên cứu sự phân bố của

E.coli gây bệnh tiêu chảy theo kiểu gene ở lợn con sau cai sữa tại một số tỉnh phía Bắc” nhằm phát hiện các tổ hợp gene mã hóa cho các yếu tố ñộc lực

chính ở ñối tượng E.coli phân lập từ lợn con sau cai sữa, bước ñầu nhận ñịnh

về sự phân bố của căn bệnh tại ñịa bàn của ba tỉnh miền Bắc

Mục ñích của ñề tài: Xác ñịnh ñược các tổ hợp gene quyết ñịnh yếu tố

bám dính và ñộc tố ñường ruột của các chủng E.coli phân lập từ lợn sau cai

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu về E.coli gây tiêu chảy ở lợn con

1.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1885, bác sỹ người ðức Theodor Von Escherich ñã phân lập và mô

tả E.coli gây bệnh tiêu chảy Từ ñó ñến nay, trên thế giới ñã có rất nhiều công

trình khoa học nghiên cứu về vi khuẩn E.coli và bệnh do E.coli gây ra

Năm 1944, Kauffman ñề xuất một phương pháp phân loại E.coli dựa trên

3 nhóm kháng nguyên O (Somatic) – kháng nguyên thân, H (flagellar) – kháng nguyên roi và K (Capsular) – kháng nguyên vỏ Sau này, phần lớn kháng nguyên K ñược biết có bản chất là protein, thành phần của lông vi khuẩn nên ñược gọi là kháng nguyên F (fimbriae hay pili)

Năm 1961, kháng nguyên bám dính K87 và K88 lần ñầu tiên ñược mô tả bởi Orskov, I.F và cs [70]

Năm 1975, Evans, D G và cs [36] ñã chỉ ra rằng gene mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt nằm trên plasmid của vi khuẩn

Năm 1976, Nagy.B và cs [65] mô tả lần ñầu tiên về một loại protein bám dính – intimin

Việc tinh chế, xác ñịnh kích thước và khối lượng phân tử của K99 ñược Isaacson [50] công bố vào năm 1977

Năm 1985, nhờ kỹ thuật PCR nhiều công trình nghiên cứu về DNA và bộ

gene của E.coli ñã ñược thực hiện và công bố Dựa trên 700 tài liệu nghiên cứu về bệnh tiêu chảy do E.coli, Nataro J.B (1998) [68] ñã tổng hợp khá chi

tiết về nguồn gốc, cấu trúc phân tử, cơ chế hoạt ñộng của các loại ñộc tố LT,

STa, STb, Stx, EAST1 và cơ chế gây bệnh của 6 loại E.coli là ETEC, EHEC,

EIEC, EPEC, EAEC, DAEC

Mối tương quan giữa các gene mã hóa cho các yếu tố ñộc lực của E.coli

cũng ñược nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu Francis D.H (2002) [42]

ñã thông báo về một số tổ hợp các gene mã hóa cho yếu tố bám dính F4, F5, F6, F18 và khả năng sinh ñộc tố STa, STb, STx2e của các chủng ETEC gây bệnh cho lợn con trước và sau cai sữa

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, nghiên cứu về E.coli gây bệnh cho lợn cũng ñược rất nhiều

nhà khoa học quan tâm Trước ñây, các nghiên cứu chủ yếu dựa vào những phương pháp kinh ñiển như soi kính hiển vi, kiểm tra ñộc lực trên ñộng vật thí nghiệm, sử dụng phản ứng ngưng kết, gần ñây, nhờ phương pháp PCR, các

nhà khoa học có thể nghiên cứu sâu hơn và ña chiều hơn về vi khuẩn E.coli

ðỗ Ngọc Thúy và cs (2002) [13] ñã xác ñịnh ñược 5 tổ hợp gene mã hóa cho các yếu tố ñộc lực gồm bám dính và sinh ñộc tố và 5 nhóm serotyp kháng

nguyên O của các chủng E.coli phân lập ñược từ lợn con tiêu chảy ở miền

Bắc Việt Nam

Võ Thành Thìn và cs (2009) [11] ứng dụng phương pháp PCR-RFTP với các enzym cắt giới hạn ñể xác ñịnh các biến thể của kháng nguyên bám dính F4 (F4ab, F4ac và F4 ad) và F18 (F18ab và F18ac) của các chủng vi khuẩn

E.coli gây bệnh tiêu chảy lợn con tại khu vực Nam Trung Bộ và Tây Nguyên

Trên ñối tượng lợn con sau cai sữa, một số tác giả ñã công bố kết quả

nghiên cứu về E.coli gây tiêu chảy tại một số tỉnh như Hưng Yên [14], Phú

Thọ [12], Lâm ðồng [1], Bắc Giang [2],

Trong ñề tài này, chúng tôi tập trung nghiên cứu về các chủng E.coli gây

bệnh trên lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy và sự phân bố theo kiểu gene của chúng tại các tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang, Ninh Bình

1.2 Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli)

1.2.1 ðặc ñiểm hình thái

E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, bắt màu Gram âm, hiếu khí tùy tiện

và không sinh nha bào E.coli thường có hình que, kích thước 2×0,5 µm

Trong cơ thể, chúng có hình cầu trực khuẩn, ñứng riêng lẻ, ñôi khi xếp thành

chuỗi ngắn E.coli có lông xung quanh thân [20] Những chủng có tiên mao

có khả năng bơi và di ñộng hơn [31]

1.2.2 ðặc tính nuôi cấy

E coli có thể sống trong nhiều loại môi trường dinh dưỡng ở nhiệt ñộ từ

18°C ñến 44°C hoặc thấp hơn, nhiệt ñộ thích hợp nhất là 37°C [20], một số chủng phòng thí nghiệm có thể nhân lên ở nhiệt ñộ 49°C [40]

Sau 24h nuôi cấy ở 370C, E.coli phát triển trên các môi trường thông

thường với các ñặc ñiểm sau:

- Môi trường nước thịt thường: E.coli phát triển tốt, môi trường ñục, có

cặn màu tro nhạt, có mùi thối

- Môi trường thạch thường: khuẩn lạc lồi, tròn, bóng láng và màu tro nhạt

- Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, có thể có hoặc không có dung huyết tuỳ thuộc vào chủng

- Môi trường MacConkey: Khuẩn lạc màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

- Môi trường Endo: Khuẩn lạc màu ñỏ mận chín, có hoặc không có ánh kim

- Môi trường thạch Brilliant Green: Khuẩn lạc màu vàng chanh

- Môi trường Eosin Methyl Blue: Khuẩn lạc tròn, rìa gọn, màu xanh ñen

có ánh kim, ñường kính khoảng 0,5 mm

Môi trường MacConkey hoặc Eosin Methyl Blue ñược dùng ñể phân lập

E.coli trong phân [68]

1.2.3 ðặc tính sinh hóa

E coli có khả năng lên men sinh hơi ñường glucose, lactose, maltose,

mannitol, xylose, rhamnose, sorbitol, và arabinose, nhưng không lên men sinh hơi các ñường dextrin, starch, inositol Môi trường thạch Sorbitol MacConkey

ñược dùng ñể phân biệt E.coli O157:H7 với các E.coli khác vì E.coli O157:H7 không lên men sorbitol E.coli sinh indol, dương tính với phản ứng

ñỏ methyl và chuyển nitrat thành nitrit Phản ứng oxidase âm tính và H2S không ñược sinh ra trên môi trường Kligler Vi khuẩn không phát triển trong môi trường có muối cyanide, có hydrolyze urea, gelatin tan chảy Những ñặc

tính sinh hóa ñược dùng ñể phân biệt E.coli với các giống Escherichia khác

và những vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae [23]

Bảng 1.1 ðặc tính sinh hóa chung của E.coli [20]

Nitrates-7 nitrites + Phenylalanine deaminase -

E.coli có sức ñề kháng yếu với nhiệt ñộ, bị bất hoạt ở 550C trong 1 giờ,

600 trong 15-30 phút, và bị tiêu diệt ngay ở 1000C Chúng có thể tồn tại ở nhiệt ñộ thấp và sống sót trong nhiệt ñộ ñóng băng Trong phân rác, ở 370C số lượng vi khuẩn giảm khoảng 90% trong 1 -2 ngày, ở 40C từ 6 -22 tuần Khí

4,5 và trên 9, E.coli bị ức chế phát triển nhưng không bị chết Các axit hữu cơ

ức chế vi khuẩn hiệu quả hơn axit vô cơ [20]

1.2.5 Các kháng nguyên

Kháng nguyên O: Kháng nguyên thân O ñược cấu thành bởi

lipopolysaccharides (LPS) gồm lipid A liên kết cùng hóa trị với polysaccharide Lipid A bao gồm một phosphorylated N-acetylglucosamine (NAG) kết hợp với 6 hoặc 7 axit béo Lipid A có vai trò tạo ñộc tính còn polysaccharide có vai trò trong tạo miễn dịch Có thể chiết xuất LPS từ tế bào bằng cách xử lý với phenol 45% ở 90OC Thủy phân LPS cho ra Lipid A và polysaccharide Kháng nguyên O khá ổn ñịnh với nhiệt, không bị phá hủy khi ñun sôi trong 30 phút nhưng bị phả hủy bởi các tác nhân oxy hóa mạnh như peroxide, superoxide và hypochlorite

Kháng nguyên H (Flagellar): Kháng nguyên H nằm ở roi dài (tiên mao)

của vi khuẩn, có bản chất là protein, giúp vi khuẩn chuyển ñộng [19] Kháng nguyên H là những protein chịu nhiệt kém, dễ bị tiêu huỷ ở nhiệt ñộ 100°C Khi gặp kháng thể H tương ứng, phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra [20]

ðể kiểm tra kháng nguyên H, nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch bán cố thể (manitol mobiliti) Kháng nguyên H thường không dùng ñể ñịnh

type E.coli và kháng nguyên này cũng thường không tương quan với khả

năng gây bệnh của vi khuẩn

Kháng nguyên K (capsular): Kháng nguyên K là kháng nguyên vỏ nằm

trên bề mặt tế bào vi khuẩn Có hai loại kháng nguyên K:

- Kháng nguyên K kinh ñiển có bản chất là một axit cao phân tử Kháng nguyên K làm cản trở phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O với kháng thể

O tương ứng Kháng nguyên K bị phá hủy ở 100°C trong 1 giờ, một vài chủng yêu cầu cao hơn, 121°C trong 2,5 giờ Trên cơ sở của sự ổn ñịnh nhiệt, kháng nguyên K ñược chia thành các dạng L, A, và B [74]

- Kháng nguyên F (fimbriae hay pili) ñặc trưng cho khả năng bám dính của vi khuẩn Chúng thể hiện ở nhiều dạng hình thái khác nhau tùy thuộc vào môi trường mà vi khuẩn phát triển Khả năng gây ngưng kết hồng cầu và bám dính vào tế bào biểu mô ruột của kháng nguyên F phụ thuộc nhiều vào nhiệt

ñộ nuôi cấy vi khuẩn [14] Các hình thái fimbriae có thể thấy là dạng que cứng, bó que linh hoạt, dạng mỏng, dẻo, dai và kích thước 2-6 nm [58]

Các fimbriae phổ biến từ các chủng Enterotoxigenic E coli là : F4 (K88),

F5 (K99), F6 (987P), F18, F41, F42, F165 và F17 [61]

1.2.6 Các yếu tố gây bệnh chung của vi khuẩn E.coli

Kháng nguyên F4 (K88): Các kháng nguyên F4 lần ñầu tiên ñược

Orskov và cs mô tả trong năm 1961, là yếu tố xâm chiếm (colonization factor

– CF) của ETEC ở lợn [70] Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy chủng ETEC K88 là phổ biến gây tiêu chảy ở lợn sau cai sữa Các chủng này chủ yếu thuộc các serogroups O8, O45, O138, O141, O147, O149 và O157

F4 là fimbriae dạng sợi dài, bản chất là một protein cao phân tử ở bề mặt

của vi khuẩn ETEC F4 bao gồm một tiểu phần lớn (FaeG) và các tiểu phần

nhỏ (FaeF, FaeH, FaeC, và có thể có FaeI) Tiểu phần lớn chứa các epitop (vùng quyết ñịnh kháng nguyên) a, b, c và d Dựa trên các epitop, F4 ñược chia thành các biến thể là F4ab, F4ac, và F4ad [92] Trong các chủng ETEC ñược phân lập từ lợn, F4ac là phổ biến nhất [37], [4] F4 giúp vi khuẩn bám vào ruột nhờ thụ thể của nó trên bề mặt các tế bào biểu mô ruột Trên cơ sở ba biến thể F4ab, F4ac và F4ad, có sáu kiểu liên kết giữa thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô với F4 là A, B, C, D, E, F Kiểu A: sự liên kết với cả ba biến thể, kiểu B: gắn với F4ab và F4ac, kiểu C: liên kết với F4ab và F4ad, kiểu D: liên kết với F4ad, kiểu E: liên kết không có biến thể, và kiểu F: gắn với F4ab Thụ thể dành cho bcd là nhóm glycoprotein khác nhau có khối lượng 45-70 kDa, thụ thể của bc là hai glycoprotein có khối lượng phân tử tương ứng là 210

kDa và 240 kDa, thụ thể của b là một glycoprotein 74 kDa và thụ thể của d là một glycosphingolipid với trọng lượng phân tử chưa biết [92] Theo Baker

DR và cs (1997), kiểu liên kết A và E là phổ biến hơn các kiểu còn lại [17] Shipley và cs (1978) cho thấy các gene mã hóa K88 và men raffinoza ñược nằm ở nonconjugative plasmid khoảng 50 × 106 daltons [81] Giữa các chủng, hai gene này thường ñược vi khuẩn truyền cho nhau [76]

Kháng nguyên F5 (K99): Bệnh tiêu chảy ở lợn con sơ sinh gây ra chủ

yếu do các chủng ETEC sở hữu F5 Cấu tạo chủ yếu của kháng nguyên F5 là protein và có ñiểm ñẳng ñiện lớn hơn 10 Nó gồm hai tiểu phần: tiểu phần chính có khối lượng 22,5 kDa và tiểu phần còn lại có khối lượng 29,5 kDa Khi quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử, F5 là một tiêm mao có dạng hình que với ñường kính 8,4 nm và ñộ dài 130 nm F5 tinh khiết không gây ngưng kết hồng cầu chuột lang [49] Richard E Isaacson và cộng sự (1992) [51] ñã xác ñịnh các kháng nguyên K99 ñược liên kết với một plasmid có kích thước

khoảng 87,8 kb K99 giúp E.coli bám dính vào niêm mạc ruột non của lợn sơ

sinh nhờ các ganglioside glycolipid trên bề mặt tế bào biểu mô ruột F5 bị ức chế

ở nhiệt ñộ thấp và hoạt ñộng tốt ở nhiệt ñộ cơ thể [93]

Kháng nguyên F6 (987P): F6 cũng ñược tìm thấy từ các chủng gây tiêu

chảy ở lợn sơ sinh, với vai trò làm trung gian kết dính với các tế bào ñường ruột [33] Kháng nguyên F6 gồm hai tiểu phần protein có khối lượng phân tử

là 17,5 và 21,9 kDa Tiểu phần protein có khối lượng 21,9 kDa ñược xác ñịnh

là của kháng nguyên F6 thuộc nhóm serogroups O9 và O141 Tiểu phần còn lại (17,5-kDa) ñược liên kết với các chủng ETEC của serogroups O9 và O20 [94] 987P có thể biến ñổi theo các giai ñoạn phụ thuộc vào ñiều kiện sống của vi khuẩn [65] Các gene mã hóa cho F6 có thể nằm trên plasmid hoặc trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn và vấn ñề này vẫn còn nhiều tranh cãi [26]

Kháng nguyên F18: Sự hiện diện của kháng nguyên F18 thường tìm thấy

trong ETEC và VTEC - chủng gây tiêu chảy và phù ñầu lợn con [39], [30]

F18 thường biểu hiện ở hai biến thể là F18ab và F18ac F18ab là ñặc trưng của VTEC trong khi F18ac lại ñiển hình hơn cho ETEC

Các F18 ñược mã hóa bởi các gene trên plasmid Các F18 plasmid ñã ñược xác ñịnh là plasmid unireplicon thuộc họ replicon RepFIc Không có sự khác biệt giữa F18ac plasmid của ETEC và F18ab plasmid của VTEC về chủng loại replicon hoặc phân nhóm Tuy nhiên, kích thước của F18ab plasmid của các chủng VTEC thay ñổi giữa 42 và 98 MDa, khác với F18ac plasmid của các chủng ETEC, kích thước thường là 98 MDa [39]

Colicin V: ColV plasmid bắt ñầu ñược nghiên cứu kể từ khi Gratia phát

hiện ra hiện tượng" nguyên tắc V" vào năm 1925 Theo ñó, ông ñã mô tả một chất ñược sản xuất bởi một "dòng colibacillus" có khả năng dung giải các tế bào khác [95] Colicin là những protein ñược sản xuất bởi một số chủng

E.coli mang plasmid colicinogeneic có gene quy ñịnh tổng hợp colicin, miễn

dịch và phóng thích colicin ra khỏi tế bào vi khuẩn Colicin ñược cấu tạo bởi

ba vùng, mỗi vùng tham gia một bước khác nhau vào quá trình tiêu diệt vi khuẩn nhạy cảm Ban ñầu, colicin gắn vào thụ thể là các protein trên màng ngoài tế bào Các protein này có vai trò thu nhận một số chất dinh dưỡng của

tế bào Tại ñây, chúng di chuyển qua màng ngoài và vượt qua periplasm (khoảng giữa màng ngoài và màng trong) Sau ñó, colicin tiến tới ñích của chúng là tiêu diệt tế bào bằng cách hình thành một kênh ñiện thế phụ thuộc vào lớp màng trong hoặc bằng cách sử dụng các men endonuclease (có vai trò tách liên kết phosphodiester trong chuỗi polynucleotide) trên DNA, rRNA, hoặc tRNA [25] Hầu hết các colicin có khối lượng phân tử trong khoảng 27 ñến 80 kDa Theo Virginia và cs, cơ chế thu hồi sắt, khả năng tồn tại trong huyết thanh, kháng ñại thực bào, khả năng di chuyển, khả năng bám dính vào

tế bào biểu mô ñược liên kết với plasmid ColV [95]

Khả năng kháng kháng sinh: Khả năng kháng kháng sinh của E.coli ñã

ñược biết từ lâu, tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh dễ dàng và bừa bãi như

hiện nay ñã gây ra hiện tượng E.coli tăng kháng và kháng nhiều loại thuốc Gene mã hóa cho khả năng kháng thuốc của E.coli nằm trên plasmid R

(resistance plasmid) [66] Khả năng kháng các loại kháng sinh khác nhau có thể hình thành trong quá trình vi khuẩn tiếp xúc với thuốc Có 3 cơ chế phổ biến là gene kháng thuốc mã hóa tổng hợp enzyme phân hủy thuốc kháng sinh, gene kháng thuốc mã hóa tổng hợp enzyme làm biến ñổi kháng sinh, và gene kháng thuốc mã hóa tạo ra một kênh bơm thuốc kháng sinh ra ngoài tế bào vi khuẩn (efflux pumps)

Một số kháng sinh thông dụng ñã ñược xác ñịnh là bị kháng bởi nhiều

chủng E.coli là tetracycline, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin,

ampicillin, sulfamethoxazol-trimethoprim [61], oxacillin, colistin, nalidixic acid Trên plasmid R, ngoài gene mã hóa kháng kháng sinh còn có gene mã hóa cho khả năng kháng thủy ngân [66]

1.2.7 Phân loại E.coli

Dựa vào các ñặc trưng về tổn thương mô học, E.coli gây bệnh ñược chia thành 6 loại là: Enterotoxigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC), Enterohemorrhagic E.coli (EHEC), Enteropathogenic E.coli (EPEC), Enteroaggregative E.coli (EAEC) và Diffusely adherent E.coli (DAEC)

Enterotoxigenic E coli - ETEC

ETEC là nguyên nhân chính gây ốm và chết ở lợn sơ sinh và lợn cai sữa [42] ETEC là các chủng gây bệnh nhờ hai ñặc tính chủ yếu là khả năng bám dính và sản sinh ñộc tố ñường ruột Khả năng bám dính vào các tế bào biểu

mô ruột nhờ các yếu tố bám dính bề mặt của vi khuẩn như F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41, F17 và F18

Khả năng sinh một hoặc hai loại ñộc tố ñường ruột là ñộc tố không chịu nhiệt (LT-I và LT-II) và ñộc tố chịu nhiệt (STa và STb) ETEC gây tiêu chảy thông qua tác ñộng của hai ñộc tố LT và ST Các chủng này có thể sản sinh chỉ LT hay chỉ ST, hoặc cả LT và ST [68]

- ðộc tố LT (Heat-labile toxins): ðộc tố LT của E.coli có có mối quan

hệ gần về cấu trúc và chức năng với cholerae toxin (CT) của phẩy khuẩn tả -

Vibrio cholerae [83] LT và CT chia sẻ nhiều ñặc tính bao gồm cấu trúc, trình

tự protein (khoảng 80% tương ñồng), nhận dạng thụ thể chính, hoạt ñộng enzym ðộc tố LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II và giữa chúng

không có phản ứng chéo LT-I thấy ở các chủng E.coli gây bệnh cho cả người

và ñộng vật, LT-II chủ yếu ñược phân lập từ các chủng E.coli gây bệnh cho

ñộng vật, hiếm khi thấy ở chủng gây bệnh cho người

ðộc tố LT-I: LT-I là một ñộc tố oligomeric, bao gồm một tiểu phần A

(240 amino acid) và 5 tiểu phần B giống nhau (103 amino acid/một tiểu phần) [84] Các tiểu phần B sắp xếp như hình chiếc nhẫn hay “bánh rán” và liên kết mạnh với các GM1 ganglioside (là một glucolypide), liên kết yếu với GM2, GD2, GD1 ganglioside của tế bào ruột [85] Tiểu phần A chịu trách nhiệm cho các hoạt ñộng enzym của ñộc tố Tiểu phần A là protein phân giải (proteolytically) gồm A1 và A2 ñược liên kết bởi cầu nối disulfua Các gene

mã hóa cho LT nằm trên plasmid và trên ñó có thể chứa các gene mã hóa ST

và gene mã hóa cho CFA (colonization factor antigene) [68] ðộc tố LT bị vô hoạt ở 600C trong 15 phút [22]

Cơ chế hoạt ñộng của LT-I: Toàn bộ LT-I bao gồm một tiểu phần A và

năm tiểu phần B ñược tiếp nhận bởi các tế bào biểu mô ruột non thông qua endocytosis (thực bào) A1 qua màng không bào và từ ñó ñi vào thể Golgi Tại ñây, A1 kích thích hoạt ñộng của men adenylate cyclase thông qua sự hoạt hóa G protein, làm tăng quá trình chuyển hóa ATP thành cAMP Vai trò

của cAMP trong tế bào là vận chuyển các chất từ trong tế bào ra ngoài màng

tế bào Cụ thể ở ñây là tăng thải Cl-, giảm nhận Na+ và Cl- từ ngoài màng tế bào Kết quả của quá trình tăng ñào thải quá mức Cl- , Na+, làm nồng ñộ muối trong lòng ruột tăng và nước bị rút thụ ñộng từ các tế bào ruột vào lòng ruột [68] Biểu hiện là con vật tiêu chảy, cơ thể bị mất nước trầm trọng dẫn tới quá trình trao ñổi chất bị rối loạn hoặc ngưng trệ, cơ thể rơi vào trạng thái trúng ñộc axit và có thể dẫn ñến chết

ðộc tố LT-II: LT-II có 55-57% tương ñồng với LT-I và CT về tiểu phần

A nhưng lại không tương ñồng về tiểu phần B [71] Hai biến thể của LT-II là LT-IIa và LT-IIb giống nhau về tiểu phần A và B ñến 71-66% LT-II làm tăng cAMP trong tế bào theo cơ chế tương tự như LT-I nhưng LT-II sử dụng GD1 như là thụ thể của nó hơn là GM1 [68]

- ðộc tố chịu nhiệt ST (Heat-stable toxins): Ngược với ñộc tố LT, trọng

lượng các ST khá nhỏ Trong cấu trúc phân tử của ST, các cysteine liên kết với nhau bởi cầu nối disulfua, có tác dụng giúp cho ST bền với nhiệt ðộc tố

ST có hai nhóm là STa và STb, chúng khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt ñộng Gene mã hoá cho cả ST và LT nằm trên plasmid, một số gene mã hoá cho ST ñược tìm thấy trên transposon (gene chuyển vị) [68] ST chịu ñược

1000C trong 15 phút

ðộc tố STa: STa còn gọi là ST-I, ñược sinh ra bởi ETEC và một số vi

khuẩn Gram âm khác bao gồm Yersinia enterocolitica và Vibrio cholerae

non-01 STa có khoảng 50% protein giống với EAST1 của EAEC Ngoài STa, một số chủng ETEC cũng sản xuất EAST1 [77], [97]

STa là 1 peptide gồm 18 hoặc 19 amino axit với khối lượng phân tử 2kDa STa có hai biến thể là STp (ñộc tố ST ở lợn hay STla) và STh (ñộc tố

ST ở người hay STlb) ñược phát hiện ñầu tiên từ các chủng ETEC phân lập từ lợn và từ người Cả hai biến thể ñều có thể ñược tìm thấy ở ETEC phân lập từ

người [68] STa ban ñầu là một tiền chất gồm 72 amino axit rồi ñược cắt bởi một peptidase ñể còn 53 amino axit [72] Sau ñó, peptide gồm 53 amino axit ñược vận chuyển ñến vùng periplasm, tại ñây chúng ñược gắn các cầu nối disulfua bởi các protein DsbA [98] Một enzym protease xử lý tiền STa thành ñộc

tố STa hoàn chỉnh với 18 hoặc 19 amino axit peptide và khuếch tán qua màng tế bào vi khuẩn

Thụ thể chính của STa là một enzym ñược gọi là guanylate cyclase C (GC-C) [91] Một vài thụ thể khác của STa có thể tồn tại nhưng GC-C là thụ thể ñã ñược xác ñịnh chắc chắn GC-C nằm ở ñỉnh của màng tế bào biểu mô ruột Guanylin là một hormon ñóng vai trò cân bằng trong ñường ruột và nó cũng có thụ thể là GC-C [24], nhưng khả năng kích hoạt GC-C kém hơn STa

do nó là một peptide 15 amino axit trong ñó có 4 cysteine Vì thế, ñộc tố STa (có 6 cysteine) với hoạt tính mạnh hơn là nguyên nhân gây ra tiêu chảy [68]

Cơ chế hoạt ñộng của STa: Sự kết hợp GC-C và STa ñã kích hoạt

guanylate cyclase dẫn ñến tăng nồng ñộ cGMP nội bào [29] Hoạt ñộng này cuối cùng là sự kích thích tiết Cl- ra khỏi tế bào biểu mô ruột hoặc cùng với

ức chế sự hấp thu Na+Cl- vào tế bào, kết quả là nước tràn vào lòng ruột, kích thích gây tiêu chảy [43]

ðộc tố STb: Các STb chủ yếu thấy ở các ETEC phân lập từ lợn Tiền

STb là một protein gồm 71 amino axit sau ñó ñược cắt và thành STb hoàn chỉnh với 48 amino axit có khối lượng phân tử là 5,1kDa Trong trình tự protein của STb có 4 cystein ñược liên kết bởi hai cầu nối disulfua Không giống STa, STb gây tổn thương biểu mô ñường ruột theo cách làm mất hoặc làm teo tế bào Thụ thể của STb chưa ñược làm rõ mặc dù một số nhà khoa học cho rằng nó có thể kết hợp không ñặc hiệu với màng nguyên sinh chất trước khi gây ñộc tế bào [27]

Cơ chế hoạt ñộng của STb: không giống STa kích thích [15] tăng tiết

Cl-, STb kích thích sự tăng tiết HCO3- ra khỏi tế bào vào lòng ruột [80] STb không kích thích sự gia tăng nồng ñộ cAMP hoặc cGMP trong tế bào mặc dù

nó kích thích làm tăng nồng ñộ Ca2+ trong tế bào từ môi trường ngoại bào [35] STb cũng kích thích sự tiết PGE2 và serotonin [48]

- Yếu tố bám dính: Fimbriae ETEC ñặc trưng cho từng chủng gây bệnh

và yếu tố kháng nguyên này ñược viết tắt là CFA (colonization factor antigene) CFA ñược phân loại dựa trên ñặc ñiểm hình thái của chúng Các hình thái có thể thấy là dạng que cứng, bó que linh hoạt, dạng mỏng, dẻo, dai

và kích thước 2-6nm [58]

Enterohemorrhagic E coli – EHEC

Việc công nhận EHEC như là một nhóm riêng biệt trong số E.coli gây

bệnh là kết quả nghiên cứu của Riley và cs, 1983 [73] và Karmali và cs vào

năm 1983, [53] nhờ kết quả phân lập ra một loại E.coli O157:H7 là tác nhân gây bệnh cả ở ñường ruột và thận Thuật ngữ "verotoxigenic E coli" hay

"Vero cytotoxin – producing E coli" (VTEC) bắt nguồn từ những quan sát năm 1977 của Konowalchuk và cs., [56] là các chủng sản xuất ra chất ñộc gây ñộc tế bào Vero Một danh pháp khác là "Shiga toxin-producing E coli"

[STEC (trước ñây là SLTEC)] ñể phản ánh những vi khuẩn giống nhau về cơ bản ở mức ñộ gene và protein cùng sản xuất ra một trong các ñộc tố Stx (Shiga toxin)

Các nhà khoa học ñã ñồng thuận coi STEC và VTEC là những thuật ngữ

tương ñương Thuật ngữ "enterohemorrhagic E coli" (EHEC) ñã ñược ñặt ra

ñể biểu thị chủng E.coli gây viêm xuất huyết ñại tràng (hemorrhagic colitis -

HC) và HUS, chúng sản xuất ñộc tố Verotoxin hay Stx gây ra tổn thương dạng attaching-and-effacing (A/E) trên các tế bào biểu mô và sở hữu 60-MDa plasmid có gene mã hóa cho yếu tố bám dính [59] Trong khi không phải tất

cả các chủng STEC ñược cho là tác nhân gây bệnh thì tất cả các chủng EHEC

theo mô tả trên ñây ñược coi là tác nhân gây bệnh

ðặc tính gây bệnh của E coli O157: H7 là xuất huyết và phù nề [45]

Ruột bị phù và xuất huyết dưới lớp màng nhày

- ðộc tố Stx: Stx có hai nhóm chính là Stx1 và Stx2 Chúng có 58%

tương ñồng về trình tự nucleotide trong gene cấu trúc và 56% tương ñồng về trình tự các amino acide trong các tiểu phần A và B của protein cấu trúc [52] Trong khi Stx1 khá bảo thủ thì Stx2 lại có nhiều biến thể Các biến thể của Stx2 là Stx2c, Stx2v, Stx2vhb, Stx2e, và các subtype khác ñược hoán ñổi

giữa các Stx và danh pháp VT (tức là, Stx1 = VT1, Stx2e = VT2e, vv) [34]

Cấu trúc của Stx gồm tiểu phần A có khối lượng 32 kDa [28-kDa peptide (A1) và 4-kDa peptide (A2)] và 5 tiểu phần B giống nhau (7,7 kDa/B) Các peptide A1 chứa enzim hoạt ñộng, và các peptide A2 có tác dụng nối các tiểu phần A với 5 tiểu phần B Năm tiểu phần B giúp liên kết ñộc tố với một thụ thể là globotriaosylceramide hoặc Gb3 nằm trên bề mặt của tế bào nhân chuẩn Gb3 là thụ thể chính của Stx, nhưng các biến thể Stx2e lại sử dụng thụ thể Gb4 [68], [34] Mặc dù Stx2e là ñộc tố cổ ñiển gây phù ñầu lợn con nhưng cũng phân lập ñược từ bệnh nhân bị HUS hoặc tiêu chảy [86] Sau khi kết hợp với thụ thể trên bề mặt tế bào, nội ñộc tố qua các lỗ màng và ñược chuyển ñến

bộ máy Golgi và sau ñó ñến mạng lưới nội chất Các tiểu phần A tác ñộng lên tiểu phần 60S của ribosome Cụ thể, các peptide A1 là một N-glycosidaza, nó cắt một adenine từ rRNA 28S của ribosome, do ñó ñã gây ức chế tổng hợp protein Kết quả của rối loạn tổng hợp protein là làm chết các tế bào nội mô thận, tế bào biểu mô ñường ruột, các tế bào HeLa, Vero hoặc bất kỳ tế bào có thụ thể Gb3 (hoặc Gb4 cho Stx2e)

Stx trong bệnh ñường ruột: Stx gây tích tụ dịch lỏng và làm tổn thương

tổ chức mô Các tế bào hấp thụ ở lông nhung bị chết có liên quan ñến dịch tiết ra ñể ñáp ứng Stx

Vai trò của Stx trong bệnh ñường ruột có thể khác nhau ñối với từng loài ñộng vật Ở lợn con, sự có mặt hay vắng mặt của Stx không làm nên sự khác biệt trong các bệnh tiêu chảy [89] mà quan trọng là sự phân bố của các tổn thương A/E Các nghiên cứu trên những loài ñộng vật khác nhau chỉ ra rằng khả năng gây các tổn thương A/E của EHEC là ñủ ñể gây ra tiêu chảy không

có máu nhưng sự có mặt của Stx là cần thiết ñể gây tiêu chảy ra máu và viêm ñại tràng xuất huyết

- ðộc tố EAST1: EAST1 là ST-Like Toxin, lần ñầu tiên ñược mô tả trong

EAEC cũng ñược tìm thấy tại nhiều chủng EHEC Trong một nghiên cứu, tất

cả 75 chủng O157: H7 sở hữu gene astA mã hóa EAST1 [76], [77]

- ðộc tố Enterohemolysin: Phần lớn tất cả các chủng O157: H7 ñược tìm

thấy có gene mã hóa cho hemolysin (gọi là enterohemolysin ) [79] và gene này thuộc 90-kbp plasmid [21] Các gene mã hóa cho hemolysin (ehxA) có

60% tương ñồng với gene hlyA mã hóa hemolysin ở uropathogeneic E.coli

[78] Enterohemolysin thuộc về họ ñộc tố Rtx, nó gây dung giải hồng cầu làm giải phóng nhóm heme và huyết sắc tố

- Yếu tố bám dính: Yếu tố bám dính của E.coli O157: H7 là protein

intimin có khối lượng phân tử 97 kDa và nó ñược mã hóa bởi các gene eae

(E.coli attaching and effacing) [62]

- pO157 plasmid: Tất cả các chủng O157: H7 ñều chứa pO157 với kích

thước 93,6 kb [79] Một ñoạn kích thước 3.4-kb của plasmid này mã hóa cho ñộc tố enterohemolysin [78]

- Vận chuyển sắt: Hệ thống vận tải sắt là protein màng ngoài, có khối

lượng 69-kDa ñược mã hóa bởi các gene chuA (E.coli heme-utilization protein A) [87] Sự phát triển của E coli O157: H7 ñược kích thích bởi sự

hiện diện của heme và hemoglobin [57] và sự dung giải hồng cầu giải phóng sắt gây ra bởi ñộc tố hemolysin càng giúp vi khuẩn nhanh chóng sinh sôi và

phá hủy tế bào biểu mô ruột

Enteropathogenic E coli - EPEC

EPEC là một nhóm quan trọng trong các E.coli gây tiêu chảy Những serogroups phổ biến thuộc EPEC là O26, O55, O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128ab, O142, and O158 [88]

Các dấu hiệu của bệnh do EPEC có thể ñược quan sát trong mẫu sinh thiết ruột từ người hoặc ñộng vật nhiễm bệnh [55] ðặc trưng của thể này là sự lu

mờ các microvilli và sự bám dính của vi khuẩn với màng tế bào biểu mô Tại

vị trí bám dính, hệ thống cytoskeletal (khung xương) của tế bào thay ñổi cùng với sự tập trung nhiều sợi actin tạo một sự liên tưởng giống như cấu trúc bệ

Sự hình thành của tổ chức bệ là một quá trình năng ñộng, nó có thể uốn cong

và gợn sóng, dài hoặc ngắn trong khi vẫn nằm trên bề mặt tế bào [75] Tổn thương này ñược miêu tả bằng thuật ngữ ‘attaching-and-effacing’(A/E)

Cơ chế gây tiêu chảy: Một lượng ñáng kể microvilli bị mất hoặc tổn

thương bởi sự kết dính chặt chẽ của vi khuẩn với tế bào biểu mô gây ra hiện tượng tiêu chảy do kém hấp thu EPEC làm cho tế bào biểu mô tăng tiết canxi [18], [16] và sinh ñộc tố EAST1 [77] Một cơ chế khác là sự nhiễm một lớp EPEC trên lớp tế bào biểu mô làm cho tế bào biểu mô tăng tính kháng ñể chống lại vi khuẩn, ñiều ñó ñã dẫn ñến tăng tính thấm của lớp tế bào này và kết quả là tiêu chảy Tất cả các cơ chế có thể tham gia ñồng thời và hiện tượng tiêu chảy là kết quả của sự kết hợp ñó

Enteroaggregative E coli - EAggEc hay EAEC

Yếu tố ñộc lực: EAEC là nhóm E.coli bám dính vào các tế bào HEp-2

theo kiểu Aggregative adherence (AA) Nhóm EAEC gồm hai dòng là E.coli không có khả năng gây bệnh và dòng E.coli không gây bệnh [67] EAEC là

chủng ñặc trưng gây ra hiện tượng tăng tiết chất nhày niêm mạc ruột [90]

ETEC Nó có cấu trúc gồm 38 amino axit với 4 cystein

Cơ chế gây tiêu chảy: Giai ñoạn một, EAEC bám vào niêm mạc ruột

hoặc lớp chất nhày nhờ AAF/I và AAF/II (Aggregative Adherence Fmbriae) Giai ñoạn hai là tế bào biểu mô ruột tăng cường sản xuất chất nhầy làm cản trở sự hấp thu dinh dưỡng Giai ñoạn ba, căn cứ vào các bằng chứng về tổ chức bệnh và phân tử, ñó là một loại ñộc tố ñược sinh ra, kết quả là tế bào ñường ruột bị hư hại ðiều ñó giải thích rằng, vật chủ bị kém hấp thu, suy dinh dưỡng, suy yếu sức ñề kháng trong khi vẫn có khả năng phục hồi tổn thương, dẫn ñến hội chứng tiêu chảy kéo dài [68]

Enteroinvasive E.coli - EIEC

Nhiều nghiên cứu cho thấy cơ chế gây bệnh của EIEC hầu như giống hệt

Shigella spp [7] Goldberg (1993) cho biết quá trình gây nhiễm của vi khuẩn

như sau: Thâm nhập vào tế bào biểu mô; dung giải không bào; nhân lên ở trong tế bào; di chuyển qua tế bào chất; lan sang các tế bào lân cận [44] Theo Nataro và cs, EIEC sản xuất ngoại ñộc tố là một protein có khối lượng phân

tử 63kDa [69] và ñặc trưng của tiêu chảy do EIEC gây ra là lúc ñầu nhiều nước sau ñó là nhầy lẫn máu

Gene mã hoá cho khả năng thâm nhập và gây bệnh của EIEC ñều nằm trên plasmid [82] Các gene này mã hoá ñể tổng hợp các protein, trong ñó IpaA là tiền IpaD giúp vi khuẩn xâm nhập vào tế bào [46], [63], IpaC gây ảnh hưởng ñến hoạt ñộng của protein kynase trong tế bào biểu mô do ñó nó thúc ñẩy sự xâm lấn của vi khuẩn vào tế bào ñích [60], IpaB có vai trò dung giải các không bào và kháng lại ñại thực bào [99], [47]

Diffusely adherent E coli - DAEC

DAEC là những chủng E.coli bám dính vào tế bào HEp-2 với hình thức

không giống như EPEC Các tác giả Cookson và Nataro (1996) [28] cho thấy DAEC là chủng có thể gây ra một hình thức kết hợp của vi khuẩn với màng tế

bào giống như ngón tay mở rộng từ bề mặt tế bào HEp-2

1.3 Bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn con sau cai sữa

1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh

E.coli gây tiêu chảy ở lợn chủ yếu thuộc các chủng ETEC, một số khác

thuộc chủng EHEC (hay VTEC hay STEC), EPEC, EAggEC Các chủng

E.coli thuộc ETEC gây bệnh nhờ hai ñặc tính chủ yếu: (1) kháng nguyên bám

dính và (2) ñộc tố ñường ruột

Sự xuất hiện E.coli gây tiêu chảy phụ thuộc vào mối tương quan giữa vi

khuẩn gây bệnh, ñiều kiện môi trường và ñối tượng vật chủ nhất ñịnh Chỉ

những E.coli mang yếu tố ñộc lực, với số lượng ñủ lớn mới có thể gây ra tiêu

chảy Sự thay ñổi về khẩu phần ăn ñột ngột khiến hệ tiêu hóa của cơ thể chưa

kịp thích nghi là ñiều kiện thuận lợi ñể E.coli có hại phát triển Nhiệt ñộ môi

trường cũng ñóng vai trò quan trọng ñối với tiêu chảy ở lợn sau cai sữa Nhiệt

ñộ dưới 250C, nhu ñộng ruột giảm, hoạt ñộng của kháng thể ở ñường tiêu hóa

bị cản trở, E.coli gây bệnh tăng số lượng nhanh chóng và gây tiêu chảy

nghiêm trọng hơn so với ở nhiệt ñộ 300C [22] Stress kết hợp với sự thay ñổi khẩu phần ăn và chế ñộ chăm sóc lúc cai sữa cũng là yếu tố quan trọng ñể phát triển tiêu chảy

1.3.2 Cơ chế sinh bệnh

Trong ruột, khi có ñủ các ñiều kiện thuận lợi, các chủng E.coli mang các

yếu tố ñộc lực nhân lên với số lượng lớn, sản sinh yếu tố kháng khuẩn ColicinV (ColV) ColV tiêu diệt hoặc hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn

ñường ruột khác, ñặc biệt là các vi khuẩn có lợi như B subtylis, các vi khuẩn lactic, và E.coli có hại trở thành vi khuẩn chiếm số lượng lớn trong lòng ruột Nhờ các yếu tố bám dính, E.coli bám ñược vào lớp tế bào biểu mô niêm

mạc ruột, chúng xâm nhập vào lớp tế bào này rồi tiết các ñộc tố gây hủy hoại

tế bào, gây rối loạn quá trình trao ñổi muối - nước hoặc theo ñường huyết di

chuyển khắp cơ thể và gây bệnh với trạng thái và mức ựộ tùy thuộc vào từng loại ựộc tố [9]

ETEC là nguyên nhân chắnh gây tiêu chảy ở lợn thuộc mọi lứa tuổi trong

ựó có giai ựoạn sau cai sữa Theo nhiều kết quả nghiên cứu, sự nhiễm trùng của những chủng mang kháng nguyên F5, F6 phụ thuộc vào lứa tuổi Receptor của F6 xuất hiện ở lợn con theo mẹ và sau cai sữa, tuy nhiên receptor này rất dễ dàng tách khỏi niêm mạc ruột của lợn con sau cai sữa do

ựó chủng mang kháng nguyên F6 không bám ựược vào niêm mạc ruột [32] Receptor của F5 cũng giảm nồng ựộ theo lứa tuổi nên cũng ắt gặp ở giai ựoạn sau cai sữa [42] Các chủng mang kháng nguyên F4 thường xuyên phân lập ựược từ lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy Các thụ thể cho F4 là một mucin loại sialoglycoprotein (IMTGP) Những lợn có biểu hiện IMTGP dễ bị nhiễm K88 + ETEC, và tắnh nhạy cảm của lợn con với K88 ETEC có liên quan chặt chẽ với các biểu hiện của IMTGP [42]

Các receptor của F4 xuất hiện nhiều ở niêm mạc lợn con sơ sinh và có xu hướng giảm nhẹ ở lợn con sau cai sữa Ngược lại, các receptor của F18 lại tăng dần theo lứa tuổi cho ựến giai ựoạn sau cai sữa [49] Thụ thể của F18 tập trung nhiều ở mảng payer của niêm mạc ruột [68] Ở lợn con sơ sinh, thụ thể của F18 không có hoặc có rất ắt ở niêm mạc ruột [41] Bên cạnh ựó, hàm lượng kháng thể thụ ựộng kháng F18 trong cơ thể lợn con lúc 21-28 ngày tuổi (giai ựoạn cai sữa) giảm xuống mức thấp nhất (6,25%) [5] đó là những nguyên nhân khiến bệnh phù ựầu thường xuất hiện ở lợn con sau cai sữa ETEC sản xuất một trong các ngoại ựộc tố LT (LT-I, LT-II), ST (STa, STb) hoặc cả hai độc tố kắch thắch tế bào biểu mô ruột tăng tiết Cl-, ngăn cản hấp thu Na+, hậu quả là nước bị rút thụ ựộng vào lòng ruột Nước tập trung làm cho ruột căng lên, cộng với khắ là sản phẩm của quá trình vi khuẩn lên men ựường càng tạo áp lực trong lòng ruột Sức căng cùng với quá trình viêm

ở niêm mạc ruột ñã kích thích vào hệ thần kinh thực vật ở ruột tạo nên những cơn nhu ñộng mạnh nhằm ñẩy nước và phân ra ngoài [9] Biểu hiện là con vật tiêu chảy, phân nhiều nước Con vật có thể chết do nhiễm ñộc axit

Một số chủng VTEC thuộc serogroup O138, O139, O141 ñược phân lập

từ lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy có sản xuất cả ñộc tố ñường ruột và ñộc tố

VT Mặc dù vai trò của VT trong bệnh phù ñầu lợn con ñã ñược xác ñịnh nhưng vai trò của nó ñối với tiêu chảy vẫn chưa ñược biết ñến

có biểu hiện thần kinh, ñi vòng tròn theo một chiều hoặc liệt chân sau

Bệnh ban ñầu xuất hiện ở một vài con, sau ñó lan ra cả ñàn Tỷ lệ ốm và chết có thể lên tới 100% Bệnh kéo dài 6-7 ngày, những con sống sót thường gầy yếu, chậm lớn, còi cọc và dễ nhiễm các bệnh khác

1.3.4 Bệnh tích

nhiều vào tuổi mắc bệnh, thời gian diễn biến bệnh nhưng nhìn chung xác lợn chết thường gầy bẩn, dính phân, mắt trũng sâu [9], vùng da mềm thường chuyển sang trắng bệch [22] Trường hợp quá cấp tính, lợn chết nhanh, chết trước khi tiêu chảy, cĩ thể khơng quan sát thấy các bệnh tích Hạch màng treo ruột bị tụ huyết, tím bầm Mạch quản ở màng treo ruột bị tắc nghẽn, vài nơi xuất huyết lốm đốm, một số chỗ bị phù Niêm mạc dạ dày sung huyết nhẹ, hoặc xuất huyết [38] Ruột non bị dãn và chứa chất dịch màu vàng cĩ thể lẫn máu hoặc chứa đầy khí Niêm mạc ruột non sung huyết hoặc xuất huyết Các lơng nhung bị teo hoặc bị bào mịn Nếu lợn bị tiêu chảy kéo dài, niêm mạc ruột cĩ thể trĩc ra từng mảng

1.3.5 Chẩn đốn

Tiêu chảy do E.coli ở lợn con sau cai sữa thường xảy ra trong khoảng

3-10 ngày khi thay đổi thức ăn hoặc chế độ chăm sĩc nuơi dưỡng

Bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn con sau cai sữa cần phân biệt với tiêu chảy

do TGE virus hay do rotavirus Cĩ thể so sánh độ pH của phân để phân biệt

Phân của tiêu chảy do E.coli thường cĩ pH nghiêng về bazơ, tiêu chảy do

TGE virus hay rotavirus, pH phân thường nghiêng về axit Với tiêu chảy do Salmonella, hai bệnh cùng cĩ triệu chứng là tiêu chảy và chết nhưng

Salmonellosis thường gặp ở lợn lớn và thường khơng liên quan đến giai đoạn cai sữa hay sự thay đổi về thức ăn hay cách chăm sĩc nuơi dưỡng Phân cĩ mùi thối khắm, cĩ lẫn dịch nhày và cĩ thể lẫn máu

Chẩn đốn bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn con sau cai sữa căn cứ vào các

triệu chứng, bệnh tích đại thể, bệnh tích vi thể và cần thiết phải phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm (phân, hạch ruột, ruột, chất chứa trong ruột) Xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn gây bệnh bằng các phản ứng ngưng kết, phương pháp ELISA, PCR

2 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

2.1 ðối tượng và nội dung nghiên cứu

2.1.1 ðối tượng nghiên cứu

- Vi khuẩn E.coli ñược phân lập từ lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy (giai ñoạn sau cai sữa ñến 60 ngày tuổi)

- Các gene mã hoá cho yếu tố bám dính: F4, F5, F6, F18

- Các gene mã hóa cho ñộc tố: LT, STa, STb, Stx2e

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu tình hình tiêu chảy ở lợn con

- Tình hình tiêu chảy ở lợn nói chung

- Tình hình tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa

(2) Nghiên cứu phân lập E.coli, giám ñịnh ñặc tính sinh vật hóa học :

- Thu thập mẫu hồi cứu và tiến cứu tại các ñịa phương của 3 tỉnh lựa chọn

- Xác ñịnh tỷ lệ E.coli phân lập ñược ở lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy

- Phân lập, giám ñịnh E.coli dựa vào ñặc tính sinh hóa

(3) Nghiên cứu xác ñịnh gene mã hóa một số yếu tố ñộc lực của E.coli

chủng phân lập

- Xác ñịnh chủng E.coli phân lập mang gene mã hóa yếu tố bám dính

- Xác ñịnh chủng E.coli phân lập mang gene mã hóa ñộc tố ñường ruột

- Nghiên cứu xác ñịnh tổ hợp các gene mã hóa yếu tố ñộc lực, tần số và ñặc ñiểm phân bố

2.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

- ðịa ñiểm nghiên cứu thực ñịa: Nghiên cứu ñiều tra tình hình lợn con tiêu chảy và thu thập mẫu tại 3 tỉnh: Bắc Ninh, Bắc Giang, Ninh Bình

- ðịa ñiểm nghiên cứu phòng thí nghiệm: xét nghiệm mẫu ñược tiến hành

tại Bộ môn Hóa sinh-Miễn dịch-Bệnh Lý, Viện Thú y

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2011 ñến tháng 9/2011

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Mẫu bệnh phẩm

Mẫu phân lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy chưa ñược ñiều trị kháng sinh

Các chủng E.coli trong dự án về kiểm soát bệnh do E.coli ở lợn phân lập

năm 2010 tại các ñịa phương thuộc Bắc Ninh, Bắc Giang và Ninh Bình

2.3.2 Môi trường, hoá chất, sinh phẩm

- Các loại môi trường, hóa chất dùng ñể nuôi cấy, phân lập, giám ñịnh

một số ñặc tính sinh hóa của E.coli: BHI (Cat #1.10493.0500, Merck), Blood

Agar base (Cat#M089, Himedia), KIA (Cat#1.03913.0500, Merck), Kovac’s, VP-MR, Simmons Citrate, MacConkey Agar, Mannitol-Mobility (Cat#1.05404.0500, Merck), Pepton (Cat #M885, Himedia), Urea-Indol (Cat#880239, Bio-Rad)

- Các nguyên liệu, hóa chất dùng trong phản ứng PCR (trong bảng 2.2)

- Các hóa chất dùng ñể chạy ñiện di: Agarose (Cat.#A9539, Aldrich), TAE Buffer (Cat #24710-030, Gibco), Ethidium Bromide (Cat.#E-

Sigma-1385, Sigma-Aldrich)

- Các hoá chất thông thường phòng thí nghiệm

2.3.3 Máy móc, trang thiết bị

Buồng cấy vô trùng, ñèn UV, tủ ấm, máy lắc ấm, tủ lạnh 4OC, tủ lạnh âm

30OC, nồi hấp, tủ sấy, cân phân tích, máy vortex,

Máy PCR , máy ñiện di, hộp ñèn tử ngoại, máy ảnh,

Micro-pipet: 2µ, 10µ, 20µ, 100µ, 200µ, 1000µ và các ñầu tip tương ứng Dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm: chai Scotte, ống nghiệm, ñĩa Petri, ống ly tâm, ñèn cồn, que cấy, pince, bơm tiêm, Eppendorf,

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu phân ñược lấy trực tiếp từ trực tràng lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào hậu môn, lấy ra và cho ngay vào ống Eppendorf có chứa sẵn môi trường thích hợp cho vận chuyển mẫu vi khuẩn, cắt phần trên của cán tăm bông, ñóng chặt nút, ghi ký hiệu mẫu

Mẫu sau khi lấy ñược bảo quản trong ñiều kiện 4-8OC và ñược vận chuyển ngay ñến phòng thí nghiệm ñể tiến hành các xét nghiệm

2.4.2 Phân lập vi khuẩn

Phân lập E.coli từ mẫu phân ñược tiến hành ở buồng cấy vô trùng theo

thường quy của Bộ môn Hóa sinh-Miễn dịch-Bệnh lý, Viện Thú Y như sơ ñồ tóm tắt tại hình 2.2 và mô tả dưới ñây :

Hình 2.1 Sơ ñồ phân lập E.coli

(i) Ria cấy mẫu trên hai môi trường thạch máu và thạch MacConkey, nuôi cấy ở 37OC/18-24h

(ii) Chọn khuẩn lạc: Trên thạch MacConkey, chọn khuẩn lạc màu hồng

ñỏ, ñứng riêng lẻ; trên thạch máu: chọn khuẩn lạc có dung huyết

(iii) Thử phản ứng Oxydase: dùng que cấy lấy 1 lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc ñã lựa chọn, phết 1 ñường lên giấy thử Oxydase Phản ứng dương tính khi vạch phết vi khuẩn chuyển nhanh sang màu ñen Những khuẩn lạc cho phản ứng Oxydase dương tính ñược cấy chuyển sang môi trường thạch máu ống, nuôi cấy ở 37OC/18-24h ñể giữ chủng cho thí nghiệm kế tiếp

(iv) Kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram

2.4.3 Giám ñịnh ñặc tính sinh vật, hóa học

(i) Kiểm tra ñặc tính lên men ñường glucose, lactose, sinh H2S và sinh hơi trên môi trường KIA

- Thạch ống KIA màu ñỏ gồm 2 phần: phần thạch ñứng ñể kiểm tra khả năng lên men ñường glucose, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng ñể kiểm tra khả năng lên men ñường lactose

- Ria cấy: Lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ ria cấy lên phần thạch nghiêng và trích sâu tới ñáy ống nghiệm của phần thạch ñứng, nuôi cấy ở 37OC/18-24h

Lên men ñường Lactose: ðọc tại phần thạch nghiêng, (+) dương tính khi

phần thạch nghiêng chuyển màu vàng; (-) âm tính khi giữ nguyên màu hồng

Lên men ñường Glucose: ðọc tại phần thạch ñứng (+) dương tính khi

chuyển màu vàng; (-) âm tính khi giữ nguyên màu hồng

Sinh H 2 S: ðọc tại phần thạch ñứng (+) dương tính khi ñường cấy trích

sâu chuyển sang màu ñen; (-) âm tính khi giữ nguyên màu hồng

Sinh hơi/khí: ðọc tại phần thạch ñứng (+) dương tính khi thạch bị nứt vỡ

hoặc bị ñẩy lên trên khỏi ñáy ống nghiệm; (-) âm tính khi phần thạch ñứng giữ nguyên khối, không bị nứt hay có bọt khí

(ii) Kiểm tra ñặc tính lên men ñường manitol và khả năng di ñộng

Cấy vi khuẩn trích sâu vào giữa ống môi trường Mannitol-Mobiliti, ủ ở tủ

ấm 37OC/ 18- 24 h

Lên men ñường Mannitol: (+) dương tính khi môi trường chuyển sang màu vàng, là âm tính khi giữ nguyên màu ñỏ

Khả năng di ñộng: (+) dương tính khi vi khuẩn mọc ñục lan rộng ra khỏi ñường cấy hoặc vi khuẩn làm ñục môi trường, (-) âm tính khi không có hiện tượng lan ra quanh ñường cấy

(iii) Kiểm tra ñặc tính phân giải Urê, sinh Indol

Cấy vi khuẩn vào môi trường Urê - Indol, ủ trong tủ ấm 37OC/18-24h Dương tính phân giải Urê khi môi trường màu cánh sen; âm tính khi môi trường màu ñỏ

Khả năng sinh Indol: Nhỏ 1 - 2 giọt dung dịch Kovak vào môi trường, lắc nhẹ, ñể yên trong vài phút; (+) dương tính khi xuất hiện một vòng ñỏ ñậm trên mặt môi trường; âm tính khi không có sự ñổi màu

2.4.4 Phương pháp PCR – xác ñịnh ñặc tính gene học

PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch ñại chọn lọc một ñoạn ADN theo luật số mũ Phản ứng nhân gene ñược thực hiện với DNApolymerase, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP) Các bước tiến hành:

- Tách DNA của vi khuẩn: Canh khuẩn nuôi cấy 37OC/16-18h, lắc 220 vòng/phút Chuyển vào ống Eppendorf 200µl canh khuẩn, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút ở 4OC, hút bỏ dịch phía trên, hòa tan phần cặn vi khuẩn trong 200µl H2O 2x ðun cách thủy 100OC trong 5 phút Lập tức chuyển ống chứa vi khuẩn ñã ñun vào trong ñá lạnh, giữ trong 3 phút Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút ở 40C Giữ trên ñá lạnh, dịch trong chứa DNA dùng làm sợi mẹ trong PCR

- Chuẩn bị mồi: Sử dụng các cặp mồi do Invitrogene cung cấp, trình tự

nucleotide các cặp mồi trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình tự nucleotid các cặp mồi sử dụng trong PCR

Gene ñích Trình tự chuỗi oligo (5′-3′) Kích cỡ sản phẩm (bp)

F4 GCA CAT GCC TGG ATG ACT GGTG

CGT CCG CAG AAG TAA CCC ACCT

F18 GTG AAA AGA CTA GTG TTT ATT TC

CTT GTA AGT AAC CGC GTA AGC

510

LT AAT TAC GGA GTT ACT ACT CTC

TTT TGG TCT CGG TAC GAT AGT

272

STa TCC GTG AAA CAA CAT GAC GG

ATA ACA TCC AGC ACA GGC AG

158

STb GCC TAT GCA TCT ACA CAA TC

TGA GAA ATG GAC AAT GTC CG

133

VT2e CTT CGG TAT CCT ATT CCC GG

CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC

516

- Chuẩn bị các thành phần của phản ứng PCR: Trên ñá lạnh, cho tuần

tự các chất và dung lượng ở bảng 2.2 vào ống PCR

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

1 Dnase-, Rnase – Free water Cat#P119, Promega 6

5 Gotaq Green 2 x MasterMix (Cat# M1522,romega) 12,5