Luận văn chọn chủng vi khuẩn chế tạo và sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurrella multocida và streptococcus suis gây ra

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN THỊ NGỌC BÍCH

CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CHẾ TẠO VÀ SỬ DỤNG

VACXIN PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO VI KHUẨN

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida VÀ

Streptococcus suis GÂY RA”

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Thú y

Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CÙ HỮU PHÚ

PGS.TS NGUYỄN HỮU NAM

HÀ NỘI – 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu tôi ñược tham gia thực hiện tại Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y

Các số liệu, kết quả ñược nêu trong luận văn là chính xác, trung thực và khách quan

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Ngọc Bích

LỜI CẢM ƠN

ðế hoàn thành luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi luôn ñược

sự giúp ñỡ của nhà trường, bạn bè ñồng nghiệp Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ quý báu của:

- PGS TS Cù Hữu Phú, người hướng dẫn khoa học trực tiếp ñã giúp ñỡ, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo ñiều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn này

- PGS TS Nguyễn Hữu Nam, các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y; khoa Sau ñại học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñó tận tình giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

- Toàn bộ các cô, các anh, các chị trong Bộ môn Vi trùng – Viện Thú y Quốc gia và ñặc biệt là gia ñình, cơ quan nơi tôi công tác ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 10 năm 2011

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Ngọc Bích

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt trong báo cáo vi

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình ix

1 ðẶT VẤN ðỀ i

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI 1

1.2 MỤC ðÍCH CỦA ðỀ TÀI 2

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI 2

1.4 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE VÀ BỆNH VIÊM PHỔI MÀNG PHỔI 3

2.2.VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG LỢN 10

2.3 VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS VÀ BỆNH DO LIÊN CẦU KHUẨN GÂY RA Ở LỢN 17

2.4 HIỂU BIẾT CHUNG VỀ VACXIN 23

3 NỘI DUNG, ðỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU28 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1 NỘI DUNG 28

3.2 ðỐI TƯỢNG 28

3.3 ðỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU, ðỊA ðIỂM NGHIÊN CỨU 28

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ðƯỢC CHỌN CHẾ VACXIN 38

4.1.1 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh hóa của 10 chủng A.pleuropneumoniae phân lập ñược 38

4.1.2 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hóa của các chủng P.multocida phân lập ñược 39

4.1.3 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Streptococcus suis phân lập ñược 41

4.2 KẾT QUẢ XÁC ðỊNH SEROTYP CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN A.PLEUROPNEUMONIAE, P.MULTOCIDA VÀ S.SUIS PHÂN LẬP ðƯỢC 42

4.2.1 Kết quả ñịnh typ vi khuẩn Actinobacillus, Pasteurella phân lập ñược 42

4.2.2 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng Streptococcus suis phân lập ñược bằng phương pháp huyết thanh học và PCR 44

4.3 KẾT QUẢ KIỂM TRA ðỘC LỰC CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP ðƯỢC 46

4.3.1 Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn P.multocida phân lập ñược 46

4.3.2 Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn A.pleuropneumoniae phân lập ñược 47

4.3.3 Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng vi khuẩn Streptococcus suis

phân lập ñược: 48

4.4 KẾT QUẢ CHẾ TẠO VACXIN VIÊM PHỔI LỢN 50

4.4.1 Kết quả kiểm tra ñậm ñộ vi khuẩn của canh trùng dùng chế vacxin thử nghiệm 50

4.4.2 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của canh trùng chế tạo vacxin51 4.4.3 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin 52

4.4.4 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn và hiệu lực của vacxin trên ñộng vật thí nghiệm 53

4.4.5 Kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin phòng bệnh viêm phổi trên lợn 55

4.4.6 Kết quả xác ñịnh ñộ dài miễn dịch của vacxin phòng bệnh viêm

phổi trên lợn 58

5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 64

5.1 KẾT LUẬN 64

5.2 ðỀ NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÁO CÁO

A.pleuropneumoniae Actinobaccillus pleuroneumoniae

AGID Agargel Immuno Diffuse

BHI Brain Heart Infusion

CAMP Chiristie – Atkinson – Munch – Peterson

DNA Deoxyribonucleic Acid

DNT Dermonecrotic Toxin

ELISA Enzyme – linked Immunosorbant assay

LD50 50 percent Lethal Dose

LPS Lypopolysaccaride

LTA Lipoteibic acid

MR Methyl red

NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide

P.multocida Pasteurella multocida

PCR Polymerase Chain Reaction

S.aureus Staphylococcus aureus

S.suis Streptococcus suis

TCN Tiêu chuẩn ngành

TSA Tryptic Soy Agar

TYE Tryptone Yeast Extract Broth

VP Voges – Prokauer

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn

A.pleuropneumoniae phân lập ñược 39

Bảng 4.2 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn

P.multocida phân lập ñược 40

Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh hóa của các chủng S.suis phân lập

ñược 41

Bảng 4.4 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng vi khuẩn A.pleuropneumoniae và

P.multocida phân lập ñược sử dụng chế vacxin 43

Bảng 4.5 Kết quả xác ñịnh serotype của 1 số chủng vi khuẩn S suis phân lập ñược*45

Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn P.multocida phân lập ñược 47 Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập

Bảng 4.11 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng 3 lô vacxin chế thử nghiệm 52

Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin trên chuột nhắt trắng 53

Bảng 4.13 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 54

Bảng 4.14 Tổng hợp kết quả công cường ñộc cho lợn sau khi tiêm vacxin 56 Bảng 4.15 Kết quả kiểm tra kháng thể trong máu lợn ñược tiêm vacxin sau 1 tháng 59 Bảng 4.16 Kết quả kiểm tra kháng thể trong máu lợn ñược tiêm vacxin sau 2 tháng 60 Bảng 4.17 Kết quả kiểm tra kháng thể trong máu lợn ñược tiêm vacxin sau 3 tháng 61 Bảng 4.18 Kết quả kiểm tra kháng thể trong máu lợn ñược tiêm vacxin sau 4 tháng 62

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Sơ ñồ tóm tắt quy trình chế tạo vacxin viêm phổi lợn 34 Hình 4.1: Kết quả của phản ứng PCR ñịnh type vi khuẩn P.multocida 44

1 ðẶT VẤN ðỀ

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI

Những năm gần ñây, ngành chăn nuôi ñược ñặc biệt quan tâm và có nhiều ñổi mới ñể hòa nhập với ngành chăn nuôi thế giới Khi nói ñến chăn nuôi, trước tiên phải kể ñến chăn nuôi lợn bởi tầm quan trọng chăn nuôi rộng lớn, ý nghĩa thiết thực của thịt lợn và các sản phẩm ña dạng ñược chế biến từ lợn ñối với ñời sống kinh tế xã hội của nhân dân

Hàng loạt các vấn ñề về quản lý, kinh tế, di truyền chọn giống, kỹ thuật chăn nuôi lợn ở nước ta ñã và ñang ñược các nhà khoa học nghiên cứu giải quyết nhằm tiến kịp trình ñộ chăn nuôi lợn ở các nước trong khu vực và thế giới Song trong quá trình chuyển dịch cơ cấu sản xuất: từ sản xuất phân tán nhỏ lẻ tiến tới sản xuất hàng hóa theo hướng tập chung trang trại ñã dẫn ñến nhiều nguyên nhân gây bệnh cho ñộng vật, nhiều loại hình dịch bệnh ñã xảy

ra, trong ñó bệnh ở ñường hô hấp khá phổ biến Hội chứng hô hấp ở lợn do nhiều nguyên nhân gây ra và ñã chết lợn với tỷ lệ không nhỏ hoặc có thể trở thành bệnh mạn tính hoặc với các thể nhẹ hơn trên nhiều lứa lợn, lây lan mạnh, ảnh hưởng tới sự tăng trọng kém tiêu tốn thức ăn cao hay tăng giá thành do việc dùng thuốc ñể ñiều trị hoặc vacxin ñể phòng bệnh Bệnh này lại rất ña dạng, triệu chứng bệnh khác nhau, chính vì vậy ñể xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh cho lợn nuôi tại các khu vực khác nhau ở nước ta hiện nay là rất cần thiết Một số vi khuẩn thường xuyên cư trú ở ñường hô hấp trên của

lợn như: Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và

Streptococcus suis, khi sức ñề kháng của cơ thể giảm sút (ñiều kiện môi

trường, vệ sinh, chăm sóc kém) các vi khuẩn này tăng cường về số lượng và ñộc lực phát thành bệnh gây thiệt hại cho ñàn lợn Biện pháp phòng chống bệnh hô hấp ở lợn, bệnh viêm phổi ở lợn có hiệu quả nhất vẫn là sử dụng vacxin phòng bệnh ðể ñánh giá hiệu lực của vacxin ñược chế từ các chủng vi

khuẩn phân lập ñược từ lợn mắc bệnh là vi khuẩn Actinobacillus

pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis, chúng tôi

tiến hành thực hiện ñề tài: “Chọn chủng vi khuẩn chế tạo và sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra”

1.2 MỤC ðÍCH CỦA ðỀ TÀI

Xác ñịnh hiệu lực và ñộ dài miễn dịch của vacxin chế tạo từ vi khuẩn

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis phân lập ñược ñể phòng bệnh viêm phổi lợn

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI

Kết quả nghiên cứu là cơ sở ñể xây dựng quy trình bảo quản và sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn gây ra ðồng thời cũng là

cơ sở khoa học và thực tế giúp cho người chăn nuôi lợn nước ta sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn có hiệu quả cao nhất

1.4 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và

Streptococcus suis gây bệnh viêm phổi lợn

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE VÀ BỆNH

2.1.1 Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae

Vi khuẩn A.pleuropneumoniae là một tác nhân gây bệnh viêm phổi -

màng phổi ở lợn Bệnh có phân bố rộng rãi và ngày càng trở nên quan trọng

do việc chăn nuôi lợn ngày một phát triển

Vi khuẩn A.pleuropneumoniae thuộc họ Pasteurellae, thuộc giống

Actinobacillus, trước ñây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay Haemophilus pleuropneumoniae ñã ñược chứng minh là nguyên nhân chính

gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn

Vi khuẩn A.pleuropneumoniae là loại cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích

thước 0,3-0,5 x 0,6-1,4 µm, không di ñộng, không sinh nha bào và có hình thành giáp mô Dưới kính hiển vi ñiện tử quan sát thấy vi khuẩn có lông hay còn gọi là pili có kích thước 0,5-2 x 60-450 nm

A.pleuropneumoniae là một vi khuẩn khó tính, khó nuôi cấy Vi khuẩn

phát triển trong môi trường nuôi cấy ñược bổ sung 5% huyết thanh ngựa và trong ñiều kiện có 5 - 10% CO2 Vi khuẩn không mọc trên môi trường thạch máu thông thường, trừ khi thạch máu ñược bổ sung NAD (Nicotinamid adenine dinucleotit) và chúng mọc xung quanh các khuẩn lạc của tụ cầu là do

Staphylococcus aureus trong quá trình phát triển trên thạch máu ñã phá hủy

hồng cầu có trong máu và sản sinh ra chất NAD

Trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn ñòi hỏi yếu tố V ñể phát triển, nó phát triển tốt trên môi trường thạch Chocolate, vi khuẩn không mọc trên môi

trường MacConkey Vi khuẩn A.pleuropneumoniae có khả năng lên men các

loại ñường: Xylose, Ribose, Glucose, Fructose, Maltose, và không lên men: Trehalose, Arabinose, Lactose, Raffinose,… Phản ứng sinh Indol, Catalasa, Ureaza, CAMP Test dương tính

A.pleuropneumoniae cĩ sức đề kháng kém Vi khuẩn chỉ tồn tại trong

mơi trường tự nhiên trong một thời gian ngắn Tuy nhiên khi được bảo vệ bởi chất nhầy hoặc các chất hữu cơ khác thì vi khuẩn cĩ thể sống sĩt trong vài ngày Trong nước sạch ở nhiệt độ 40C, vi khuẩn cĩ thể sống được 30 ngày, nhiều giờ trong khí dung và cĩ thể tồn tại được trong 4 ngày ở mơ phổi và chất thải ở nhiệt độ phịng Nĩ bị diệt nhanh chĩng ở nơi khơ và các chất sát trùng

A.pleuropneumoniae được chia thành 2 biotype dựa trên nhu cầu sử

dụng NAD của vi khuẩn (Pohl và cs, 1983) Biotype 1 của vi khuẩn khi nuơi cấy trên mơi trường nhân tạo phụ thuộc vào NAD, biotype 2 khơng phụ thuộc vào NAD nhưng cần cĩ các pyridine nucleotide đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotide để tổng hợp NAD cần thiết cho sự phát triển của chúng Biotype 1 cĩ độc lực cao hơn biotype 2

Trong biotype 1, cĩ 12 serotyp được tìm thấy và được phân loại theo typ huyết thanh từ 1 - 12 (riêng serotyp 5 được chia làm 5A và 5B) Trong biotype 2, serotyp 2, 4, 7 và 9 cĩ chung nhĩm quyết định kháng nguyên như biotype 1 Gần đây biotype 2 cĩ serotyp 13, 14 được mơ tả cĩ kháng nguyên khác với biotype 1

* Cấu trúc kháng nguyên và yếu tố độc lực của vi khuẩn:

- Lớp vỏ vi khuẩn:

Vi khuẩn A.pleuropneumoniae được bao bọc bên ngồi bởi một lớp vỏ

cĩ bản chất là các polysaccharide ðây là thành phần quyết định độc lực của

vi khuẩn và gây hiệu ứng cho serotype đặc hiệu (Ward and Inzawa, 1997)

nghĩa chẩn đốn và dịch tễ (Inzama, 1991) Sự khác nhau về độc lực liên quan đến cấu trúc và những sản phẩm do vỏ và nội độc tố tạo nên (Dubreuil và cs, 2000) Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy những chủng cĩ độc lực thì cĩ kích thước lớn hơn và cĩ lớp vỏ bám dính hơn trong khi những chủng ít độc thì nhỏ hơn và chỉ cĩ lớp vỏ mỏng (Steffens và cs, 1990; Inzana, 1991)

Jacques và cs (1987), cũng xác ñịnh sự ña dạng trong cấu trúc vỏ khi phân tích lớp vỏ ở các serotyp 1 - 10 dưới kính hiển vi ñiện tử và cho thấy lớp vỏ dày khoảng 80 - 90mm ñến 210 - 230mm tùy từng serotyp Chính ñiều này ñã giải thích cho sự khác nhau về ñộc lực giữa các serotyp

Lớp vỏ giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi sự ñề kháng của ñộng vật như hoạt ñộng thực bào và hoạt ñộng bổ thể Những chủng có vỏ ñề kháng với hoạt ñộng tiêu diệt của bổ thể ñã ñược chứng minh Những thể ñột biến không có

vỏ sẽ bị tiêu diệt ngay sau khi có mặt huyết thanh, trong khi những chủng có

vỏ thì không (Ward và Inzana, 1997)

- ðộc tố của vi khuẩn:

ða số các chủng A.pleuropneumoniae ñều tạo ra 1 hoặc nhiều hơn 1 ñộc

tố phân hủy hồng cầu Phân tích những ñộc tố hồng cầu này quan sát thấy chúng là 1 protein hạt nhân của RTX (Repeat in Toxin), ñược tìm thấy ở hầu

hết các vi khuẩn Gram (-) như E.coli, B.pertussin, M.haemolytica Ở

A.pleuropneumoniae, ñộc tố này gọi là ñộc tố Apx ñược xác ñịnh là Apx I,

Apx II, Apx III (Frey, 1995) và Apx IV (Cho và Chae, 2001b) Người ta xác ñịnh chắc chắn về vai trò của Apx trong quá trình gây bệnh của

A.pleuropneumoniae Mỗi ñộc tố này khác nhau do hoạt ñộng phân giải hồng

cầu gây ñộc tế bào (Frey và cs, 1993)

- Lipopolysaccarit:

Lipopolysaccarit (LPS) là thành phần chính của lớp màng ngoài vi khuẩn

và ñược cho là nguyên nhân gây tổn thương mô Những tổn thương do LPS tinh chế không gây xuất huyết, không gây hoại tử khác với tổn thương ñặc trưng của viêm phổi - màng phổi Song LPS chắc chắn kết hợp với ñộc tố Apx làm tăng ñộc lực và làm tăng ñộc tính cho ñộc tố Apx

LPS có vai trò quan trọng trong sự bám dính của vi khuẩn lên tế bào biểu

mô và lớp màng nhầy khí quản của lợn Bám dính là hoạt ñộng ban ñầu giúp cho sự xâm nhập của vi khuẩn và có thể là ñặc tính gây bệnh, là nguyên nhân gây ra bệnh

2.1.2 Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae

gây ra

Bệnh viêm phổi truyền nhiễm của lợn do A.pleuropneumoniae gây ra ñã

xuất hiện ở nhiều nước trên thế giới Tại Việt Nam trong những năm gần ñây,

A.pleuropneumoniae ñã ñược phân lập và ñược ñánh giá là một vi khuẩn gây

nên một bệnh hô hấp khá quan trọng ở tất cả các trại lợn siêu nạc quy mô lớn Tất cả các lứa tuổi lợn ñều bị cảm nhiễm Trong trường hợp cấp tính của bệnh thì tỷ lệ chết thường cao Tỷ lệ chết cũng phụ thuộc vào ñộc lực của vi khuẩn và sự lưu hành bệnh trong môi trường Bệnh nặng hơn và tỷ lệ tử vong cao hơn nếu nhiễm kế phát các bệnh khác như bệnh Aujeszky và hội chứng

hô hấp sinh sản ở lợn (PRRS) (Pol và cộng sự, 1997)

- Triệu chứng lâm sàng:

Triệu chứng lâm sàng có nhiều mức phụ thuộc vào tuổi của gia súc, tình trạng miễn dịch, ñiều kiện môi trường và mức ñộ cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh Biểu hiện lâm sàng của bệnh có thể là quá cấp tính, cấp tính hoặc mãn

tính

+ Thể quá cấp tính: một hoặc nhiều lợn cai sữa cùng một chuồng hoặc

khác chuồng bị ốm nặng, sốt tới 41,50C, ñờ ñẫn, không muốn ăn, nôn mửa và

ỉa chảy, con vật bị bệnh nằm trên nền chuồng, không có dấu hiệu thở rõ ràng, mạch ñập tăng lên rất sớm và trụy tim mạch Da trên mũi, tai, chân và sau cùng là toàn bộ cơ thể trở nên tím tái ở giai ñoạn cuối và chết

+ Thể cấp tính: nhiều lợn ở 1 chuồng hoặc ở những chuồng khác nhau

cùng mắc bệnh Lợn sốt cao từ 40,5 - 410C, da ñỏ, con vật mệt mỏi, không muốn dậy, không ăn uống Các dấu hiệu hô hấp nặng với khó thở, ho và ñôi khi thở bằng mồm trở nên rõ Thường xuất hiện trụy tim mạch, với xung huyết ở các ñầu tứ chi Toàn thân suy sụp trong vòng 24 giờ ñầu, bệnh diễn biến khác nhau ở từng con vật, phụ thuộc mức ñộ tổn thương phổi và thời ñiểm bắt ñầu ñiều trị

+ Thể bán cấp và mãn tính: xuất hiện sau khi các dấu hiệu cấp tính biến

ñi Không sốt hoặc sốt ít, xuất hiện ho tự phát hoặc thỉnh thoảng, với các cường ñộ khác nhau Có thể súc vật kém ăn, giảm tăng trọng, có thể xác ñịnh các gia súc bị ốm bằng dấu hiệu các con vật này không gắng sức ñược Khi di chuyển, chúng thường ñi lùi lại phía sau và khi bị chặn lại chúng thường ít chống cự Ở các ñàn gia súc bị nhiễm mãn tính thường có nhiều súc vật bị nhiễm không biểu hiện rõ trên lâm sàng

Các dấu hiệu lâm sàng có thể trở lên rõ hơn bởi sự kết hợp với các yếu tố

gây nhiễm trùng ñường hô hấp khác (Mycoplasma, vi khuẩn, virus) Các biến

chứng như viêm khớp, viêm nội tâm mạc và apxe ở các vị trí khác nhau có thể

xảy ra cùng với nhiễm trùng A.pleuropneumoniae

- Bệnh tích:

Tổn thương bệnh lý ñại thể chủ yếu ở ñường hô hấp ða số các trường hợp bị viêm phổi hai bên, với tổn thương ở các thùy ñỉnh và thùy tim, cũng như ít nhất một phần các mỏm trên của thùy hoành và ở ñó viêm phổi thường khu trú, ranh giới rõ

Ở các trường hợp tử vong nhanh chóng, khí quản và các phế quản bị lấp ñầy bởi các chất tiết nhầy bọt nhuốm máu Có thể thấy một số tổn thương ñại thể ở các trường hợp tối cấp tính, các vùng viêm phổi trở nên sẫm màu và chắc, với viêm màng phổi có ít tơ huyết hoặc không tơ huyết và mặt cắt thường mủn Viêm màng phổi tơ huyết thường rất rõ ở các gia súc chết trong giai ñoạn cấp tính của bệnh ít nhất 24 giờ sau khi nhiễm trùng và khoang màng phổi chứa dịch nhuốm máu

Khi tổn thương tiến triển lớn hơn, viêm màng phổi tơ huyết trên vùng phổi tổn thương trở nên xơ và có thể dính rất chặt màng phổi vào thành ngực tới mức làm cho phổi dính vào thành ngực ngay cả khi mổ lợn chết lấy phổi ra phân tích Tổn thương sớm ở phổi là phổi trở nên ñỏ tím hoặc ñen ñồng ñều

và sau ñó trở nên sáng hơn và sau ñó vẫn cứng ở những khu vực bị nặng nhất

Các tổn thương kích cỡ co lại khi bệnh giảm, ở trường hợp mãn tính còn tồn tại các nốt kích thước khác nhau, phần lớn ở thùy tim Những nốt dạng apxe ñược giới hạn bởi vỏ dày tổ chức liên kết và có lẽ kết hợp với khu vực viêm phổi

tơ huyết Trong một số trường hợp khi tổn thương phổi ñược phục hồi thì chỉ còn lại một số ổ di chứng của viêm dính màng phổi tơ huyết Tỷ lệ lưu hành bệnh viêm màng phổi mãn tính cao ở lợn giết thịt có nghĩa là viêm phổi - màng phổi nhiều

Trong các giai ñoạn ñầu của bệnh, những biến ñổi về tổ chức bệnh lý ñược ñặc trưng bởi sự hoại tử, xuất huyết, thâm nhiễm các tế bào bạch cầu trung tính, sự hoạt hóa ñại thực bào và tiểu cầu, nghẽn mạch máu, phù rộng và tiết dịch rỉ viêm lẫn fibrin Sau phản ứng cấp tính ñặc trưng là sự thâm nhiễm ñại thực bào, xơ hóa rõ quanh những vùng hoại tử và viêm màng phổi fibrin

Việc khẳng ñịnh là A.pleuropneumoniae có thể có nhiều cách: bằng kháng

thể huỳnh quang, bằng Peroxidase miễn dịch, bằng ñồng ngưng kết tìm kháng nguyên ñặc hiệu cho serotype ở chiết xuất tổ chức phổi, sử dụng ngưng kết latex hoặc ELISA Có thể dùng kỹ thuật PCR hoặc test huyết thanh với kháng thể hấp thụ hoặc kháng thể ñơn dòng ñể xác ñịnh vi khuẩn phân lập ñược có phải là

A.pleuropneumoniae không Có thể xác ñịnh tới các serotyp bằng cách sử dụng

kỹ thuật PCR cho các gen hoạt hóa cấu trúc của ñộc tố hoặc có thể sử dụng kháng thể ñơn dòng với từng serotyp Có thể xác ñịnh serotyp khi cho ngưng kết

vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường giàu dinh dưỡng với huyết thanh hoặc bằng phản ứng ñồng ngưng kết Trong một số trường hợp dùng phương pháp khuếch

tán trên thạch và phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp

- ðiều trị:

A.pleuropneumoniae trên ống nghiệm rất nhạy cảm với Penicilline,

Ampiciline, Cephalosporin, Tetracycline, Colistin, Sulfonamide, Cotrimoxazole (Trimethoprim+ Sulfamethoxazole) và Gentamycine với nồng ñộ ức chế tối thiểu (MIC: ) thấp Vi khuẩn này có MIC cao với Streptromycine, Kanamycine, Spectinomycin, Spiramycine và Lincomycine (Nicolet và Schifferli, 1982; Gilbride và Rosendal, 1984; Nadeau và cộng sự, 1988; Inoue

và cộng sự 1984)

Prescott và Baggot (1993) ñã thông báo về tính mẫn cảm của vi khuẩn này với các thuốc kháng sinh Sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc với Ampicillin; Streptromycin, Sulfonamides, Tetracyclines và là vấn ñề ñáng lo ngại, thường gặp ở các serotyp 1, 3, 5 và 7 (Gilbride và Rosendal, 1984), nhưng hiếm gặp ở các serotyp khác, nhất là serotyp 2 (Nicolet và Schifferli, 1982; Inoue và cộng sự, 1984)

Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn A.pleuropneumoniae truyền theo

Plasmid Kháng sinh ñược chọn lựa phải là kháng sinh có sự kháng kháng sinh thấp nhất và có ñặc tính diệt khuẩn ñược tốt nhất Do vậy, các kháng sinh nhóm Betalactamin A (chủ yếu Cephalosporin), Cotrimoxazole và với một mức ñộ nhất ñịnh nào ñó, Tetracycline ñược coi là có tác dụng nhất Một số kháng sinh mới có gần ñây như các dẫn xuất Quinolone (Enrofloxacine) hoặc Cephalosporin bán tổng hợp Ceftiofur sodium ñã ñược chứng minh trên thực nghiệm rất có kết quả

Người ta ñã thu ñược những kết quả tốt trên thực nghiệm khi dùng Tiamulin và hỗn hợp Lincomycine và Spectinomycine (Moore và cộng sự, 1996) ñã dùng Tilmicosin cho vào thức ăn Do ñó cần làm kháng sinh ñồ khi thí nghiệm ñiều trị kháng sinh

ðiều trị kháng sinh chỉ có hiệu quả ở giai ñoạn ñầu của bệnh và phải dùng liều cao ngay từ ñầu ðể ñảm bảo có nồng ñộ thuốc có hiệu quả ổn ñịnh

trong máu có thể cần tiêm nhiều lần, tùy theo ựặc tắnh mẫn cảm của thuốc sử dụng Sự thành công của việc ựiều trị phụ thuộc chủ yếu vào việc phát hiện sớm các dấu hiệu lâm sàng của bệnh và can thiệp ựiều trị sớm

- Phòng bệnh:

Có thể tiến hành phòng bệnh viêm phổi - màng phổi theo một số cách Các trại không bị mắc bệnh và nhiễm khuẩn phải duy trì chắnh sách cách ly ựi ựôi với việc sử dụng tinh dịch hoặc bào thai ựể ựưa vào các gen mới Khi nhập lợn mới nào vào ựàn thì con ựó phải xuất phát từ một ựàn không bị bệnh, không nhiễm vi khuẩn, nên cách ly chúng trong một thời gian trước khi cho chúng vào ựàn Một khi ựã xuất hiện nhiễm trùng ở một trại khó có thể loại trừ tác nhân nhiễm trùng, mặc dù về lâm sàng ựàn gia súc có thể bình thường Các chương trình kiểm soát phải tắnh ựến các ựặc ựiểm dịch tễ học của viêm màng phổi Có thể dùng thuốc liên tục hoặc ngắt quãng, nhưng không bao giờ ựược dùng kéo dài và cần thường xuyên theo dõi sự mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh Chỉ sử dụng kháng sinh cho lợn mới vào chuồng khi chúng ựược chuyển ựến từ các ựàn lợn không bị nhiễm khuẩn ựể tránh ựưa vào các serotyp mới hoặc kháng kháng sinh mới

Ở các ựàn bị nhiễm khuẩn mãn tắnh, cần tiêm chủng các con lợn mới mua có chẩn ựoán huyết thanh âm tắnh trước khi cho vào ựàn đã có nhiều loại vacxin ựược sản xuất cho bệnh này gồm 2 nhóm chắnh: Các vi khuẩn ựã chết (vacxin vô hoạt) và các vacxin với một số thành phần cấu tạo của vi khuẩn Vacxin vô hoạt toàn khuẩn ựặc hiệu theo serotyp có thể có miễn dịch với các serotyp khác có phản ứng chéo

Song song với ựó phải tiến hành các biện pháp khử trùng Vi khuẩn nhạy cảm với nhiều chất tiệt trùng thông thường

TRÙNG LỢN

2.2.1 Vi khuẩn Pasteurella multocida

Vi khuẩn P.multocida gây bệnh cho nhiều loài ựộng vật, mỗi một serotyp

lại gây ra 1 thể bệnh khác nhau, trong ñó có bệnh Tụ huyết trùng (bại huyết xuất

huyết) ở lợn do P.multocida serotyp A và B gây ra P.multocida thường gặp 5

serotyp A, B, C, D, E trong ñó thường gặp ở lợn là serotyp A, B, D

P.multocida nằm trong bộ Eubacteriales, thuộc họ Pasteurellaceae, giống Pasteurella và thuộc loài P.multocida Tất cả các loài Pasteurella gây bệnh cho

gia súc, gia cầm ñều thuộc một giống duy nhất, có các ñặc tính cơ bản giống nhau về mặt hình thái, nuôi cấy, chỉ khác nhau ở tính thích nghi gây bệnh ở các loài vật chủ (Nguyễn Như Thanh)

P.multocida là loại cầu trực khuẩn nhỏ, hình trứng hoặc bầu dục, hai ñầu

tròn, kích thước 0,25-0,4 x 0,4-1,5µm Vi khuẩn không có lông, không di ñộng, không hình thành nha bào, bắt màu gram (-), bắt màu ñậm ở hai ñầu (vi khuẩn lưỡng cực)

P.multocida là loại vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, nhiệt ñộ

thích hợp 370C (có thể nuôi ở 130 – 380C ), pH thích hợp từ 7,2 - 7,4 Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém, khi môi trường ñược bổ sung huyết thanh hay máu vi khuẩn phát triển tốt

P.multocida có khả năng lên men ñường Glucose, Saccharose, Mannit,

Sozbit, Xylose Không lên men ñường Lactose, Maltose, Arabinose, Rammo, Salixin, Dunxid, Adonit Các phản ứng Indol, Catalase, Oxydase, H2S dương tính; VP, MR , Urearse âm tính, không làm tan chảy gellatin

P.multocida dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt ñộ, ánh sáng mặt trời và các chất sát

trùng thông thường: vi khuẩn bị diệt sau khi ñun ở 580C/20 phút, 800C/10 phút, 1000C trong vài giây Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn trong canh trùng sau 1 ngày Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn nhanh chóng: axit phenic 5% diệt vi khuẩn trong 1 phút, nước vôi 1% trong 3-

5 phút Vi khuẩn sống khá lâu và sinh sản trong ñất ẩm có nhiều nitrat và thiếu ánh sáng Trong tổ chức của cơ thể ñộng vật bị thối nát vi khuẩn sống ñược 1-3 tháng Trong chuồng nuôi súc vật, trên ñồng cỏ, trong ñất vi khuẩn

có thể sống hàng tháng, có khi hàng năm

Kháng nguyên của P.multocida rất phức tạp, cho ñến nay, các nhà nghiên cứu

ñã xác ñịnh ñược vi khuẩn P.multocida có 2 loại kháng nguyên: kháng nguyên vỏ

nhày (K) và kháng nguyên thân (O) Kháng nguyên K bao xung quanh thân vi khuẩn che chở kháng nguyên thân O khỏi bị các phage tác dụng nhưng ñồng thời cũng ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O (Theo Nguyễn

Như Thanh ) Vi khuẩn P.multocida ñược chia thành các typ giáp mô A, B, D, E, F

tùy thuộc vào cấu trúc polysaccharide bề mặt, trong ñó các serotyp A, B, D ñã ñược

thông báo là gây bệnh cho lợn (ðỗ Ngọc Thúy, 2007 )

Kháng nguyên K có hai thành phần α và β, chúng ñược cấu tạo từ protein và polysaccarit, ngoài ra còn một số ít các Lipopolysaccarit (LPS) Kháng nguyên K

của vi khuẩn P.multocida còn có khả năng gắn với thụ thể của tế bào hồng cầu Một số chủng P.multocida serotype D có sinh ra một yếu tố ñược gọi là ñộc tố gây hoại tử da (Dermonecrotic Toxin - DNT) DNT của P.multocida typ D có liên

quan ñến bệnh viêm teo mũi ở lợn

Kháng nguyên thân O chỉ ñược bộc lộ khi kháng nguyên K ñược tách ra Kháng nguyên O là một phức hợp protein - lipid - polysaccarit, nó có 16 yếu tố

ký hiệu từ 1- 16 (Theo phân loại của Heddleston, 1972)

Vi khuẩn P.multocida có thể xâm nhập vào cơ thể qua ñường hô hấp,

tiêu hóa hoặc qua da có vết thương Tuy nhiên, trong ñiều kiện bình thường

một tỷ lệ nhất ñịnh lợn khỏe mạnh có vi khuẩn P.multocida ký sinh ở niêm

mạc phần phía trên của bộ máy hô hấp Giữa cơ thể và mầm bệnh ở trạng thái cân bằng ñộng Khi ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi hay sự xuất hiện ñồng thời của các bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus, vi khuẩn khác, làm trạng thái cân bằng trên bị phá vỡ, nhân cơ hội này, do sức ñề kháng của cơ thể giảm sút làm mầm bệnh trỗi dậy, tăng lên về số lượng, ñộc lực và gây bệnh

Vi khuẩn P.multocida có thể là nguyên nhân nguyên phát hoặc thứ phát

gây ra thể bệnh viêm phổi ở lợn, bệnh có thể gây chết lợn hoặc làm giảm khả năng tăng trọng của lợn do vậy gây thiệt hại rất lớn cho người chăn nuôi

Bệnh do P multocida gây ra ở gia súc, gia cầm dưới nhiều thể bệnh khác nhau Bệnh tụ huyết trùng ở lợn do vi khuẩn P.multocida serotyp B gây ra, nhưng trong ña số các trường hợp vi khuẩn P.multocida serotyp A, D gây bệnh

ñường hô hấp cho lợn, chúng thường kết hợp với các vi khuẩn ñường hô hấp

khác như: A.pleuropneumoniae, Streptococcus sp, B.bronchiseptica,

Haemophilus parasuis,… gây nên hội chứng bệnh ñường hô hấp

Bệnh do vi khuẩn P.multocida gây ra ñã ñược nhiều nhà khoa học

trên thế giới nghiên cứu trong nhiều năm

Tại Triều Tiên, trong 80 chủng P.multocida phân lập từ 450 phổi lợn

bệnh có 96,3% thuộc typ A; 3,9% thuộc type D (Ahn và Kim, 1994)

Tại Nhật trong số 116 mẫu P.multocida phân lập từ phổi lợn có bệnh tích

nhục hóa, apxe phổi và viêm màng phổi có 81,9% thuộc typ A; 18,1% thuộc type D (Theo Iwanmatsu và Sawada,1988)

Ở nước ta P.multocida cũng ñược thông báo là tác nhân gây bệnh quan

trọng ở lợn và ñược quan tâm nghiên cứu

Nguyễn Ngọc Nhiên năm 1996 khi nghiên cứu 72 phổi lợn có bệnh tích bị

nhục hóa, apxe và viêm màng phổi cho biết: tỷ lệ nhiễm P.multocida là 37,5%,

tỷ lệ nhiễm S.suis là: 30,5% và ñã nghiên cứu chế tạo thành công vacxin toàn

khuẩn chết có bổ trợ keo phèn 20% phòng hội chứng ho thở truyền nhiễm của lợn ñược chế tạo từ 9 chủng thuộc 3 giống gây bệnh ñường hô hấp

Khi tiến hành xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh ñường hô hấp của lợn nuôi tại một số tỉnh phía Bắc, Cù Hữu Phú và cs cho biết: với tổng số 53

mẫu phổi và hạch phổi ñã phân lập ñược 8 chủng Streptococcus chiếm tỷ

lệ 15,09%, không phân lập ñược P.multocida Từ 542 mẫu dịch ngoáy mũi ñã phân lập ñược 48 chủng Pasteurella (8,86%) và 36 chủng

Streptococcus (6,64%)

Theo De Alwis, 1992 hai hội chứng chủ yếu thường gặp do P.multocida

là viêm teo mũi và viêm phổi

Bệnh viêm phổi do P.multocida gây ra xuất hiện rộng khắp thế giới,

nhưng bệnh hay xảy ra và gây thiệt hại ở các nước nhiệt ñới và á nhiệt ñới như: Ấn ðộ, Pakistan, Iran, Thái Lan, Philippin, Indonexia, Triều Tiên, Lào

và Việt Nam, ở tất cả các ñiều kiện khí hậu và ñiều kiện chăn nuôi Vì vi

khuẩn P.multocida thường cư trú ở ñường hô hấp trên của lợn khỏe mạnh do vậy rất khó tiêu diệt Vi khuẩn P.multocida gây bệnh thường kết hợp với các tác nhân khác như Mycoplasma hyopneumoniae, A.pleuropneumoniae, làm

cho quá trình viêm phổi càng nặng thêm

2.2.2 Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra

Bệnh viêm phổi do Pasteurella gây ra là kết quả của sự lây nhiễm của vi khuẩn P.multocida cho phổi Bệnh thường thấy ở giai ñoạn cuối của bệnh

viêm phổi cục bộ hay ở những bệnh ghép ở ñường hô hấp ở lợn Hội chứng này là một trong những bệnh gây thiệt hại cho lợn ñặc biệt khi chúng sản sinh tăng lên

Triệu chứng: triệu chứng lâm sàng của bệnh rất khác nhau tùy thuộc

vào từng chủng vi khuẩn P.multocida , thường xuất hiện 3 thể:

+ Thể cấp tính: ở thể này thông thường là do hầu hết các chủng

P.multocida thuộc serotyp B gây ra Những con vật mắc bệnh thường thấy

chứng khó thở, cố ra sức ñể thở, gõ vào bụng có âm ñục “bịch, bịch”, hóp bụng vào ñể thở, sốt cao nhiệt ñộ lên tới 41- 420C, tỷ lệ chết cao (5-40%) Trong trường hợp những con vật chết và hấp hối có thể thấy những vết ñổi

màu tím ở vùng bụng (có thể là do sốc nội ñộc tố)

+ Thể á cấp tính: ở thể này hiện tượng ho và thở thể bụng thường thấy ở

những lợn lớn Ho ở những lợn ở lứa tuổi này thường ñược coi là tiêu chuẩn xác ñịnh là bệnh nghiêm trọng Triệu chứng lâm sàng của bệnh ở thể này

giống như viêm màng phổi do A.pleuropneumoniae gây ra, nhưng những ñặc ñiểm phân biệt chính là bệnh viêm phổi do Pasteurella thì hiếm khi gây ra chết ñột ngột, hơn nữa lợn mắc bệnh viêm phổi do Pasteurella gây ra có thể

tồn tại một thời gian dài

+ Thể mãn tính: đây là thể đặc trưng thường thấy của bệnh, bởi vì thỉnh

thoảng xuất hiện ho, sốt nhẹ hoặc khơng Những con vật bị ảnh hưởng thường

ở giai đoạn lợn lớn (10- 16 tuần tuổi)

- Bệnh tích:

kèm với bệnh tích của M.hyopneumoniae ðặc trưng của bệnh này xuất hiện ở

thùy đỉnh và mặt trong của phổi, cùng với việc cĩ bọt khí trong khí quản Cĩ

sự phân ranh giới rõ ràng giữa vùng tổ chức phổi bị tổn thương và vùng tổ chức phổi bình thường Phần bị ảnh hưởng của phổi sẽ cĩ sự biến đổi mầu sắc

từ mầu đỏ sang mầu xám xanh phụ thuộc vào giai đoạn của bệnh

Các trường hợp bệnh nghiêm trọng cĩ thể xuất hiện viêm phế mạc và apxe ở các mức độ khác nhau Trong các trường hợp này thường thấy phế mạc dính chặt vào thành xoang ngực và phế mạc cĩ vùng mờ đục, khơ ðấy

chính là bệnh tích chủ yếu để phân biệt được bệnh viêm phổi do Pasteurella với viêm phổi do Actinobacillus, trong đĩ thường thấy mủ chảy ra cĩ mầu

vàng và dính cùng với rất nhiều sợi fibrin (Pijoan, 1989)

- Chẩn đốn

Việc chẩn đốn đúng bệnh do vi khuẩn P.multocida gây ra là hết sức cần

thiết, do đĩ cần tiến hành đồng thời nhiều phương pháp như: dịch tễ học, chẩn đốn lâm sàng, giải phẫu bệnh lý và đặc biệt là dựa trên kết quả xét nghiệm vi khuẩn học trong phịng thí nghiệm

Bên cạnh đĩ cịn cĩ thể sử dụng các phương pháp khác như: phản ứng kết tủa khuếch tán miễn dịch trên gel thạch AGID (Agargel Immuno Diffuse)

để xác định kháng nguyên thân (O) từ vi khuẩn phân lập được với kháng huyết thanh chuẩn, phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính để định loại kháng nguyên vỏ (K), phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp để xác định kháng nguyên vỏ, phản ứng ELISA, kỹ thuật PCR,

Việc xác định chủng vi khuẩn P.multocida phân lập được thuộc serotype

nào là hết sức cần thiết để cĩ thể xác định được thể bệnh mà chúng gây ra, từ

đĩ cĩ biện pháp phịng trị bệnh phù hợp Gần đây, kỹ thuật PCR đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đốn bệnh do vi khuẩn gây ra ở vật

nuơi, trong đĩ cĩ P.multocida và đã được OIE chuẩn hĩa thành quy trình

chung, cĩ thể áp dụng ở các phịng thí nghiệm để định type giáp mơ của vi

khuẩn P.multocida

- ðiều trị

Kháng sinh rất đa dạng và sự kết hợp giữa các loại kháng sinh đã được

sử dụng thường xuyên như: Oxytetracyline 11mg/kg; Oxytetracyline chậm: 20mg/kg; Procaine penicillin 66.000 U/kg; Benzathine penicillin 32.000 U/kg

và rất nhiều loại kháng sinh khác Tuy nhiên việc điều trị bằng kháng sinh ngày càng khĩ khăn hoặc khơng thành cơng, điều này là do tính kháng thuốc

rộng rãi ở vi khuẩn P.multocida

Người ta đã thơng báo rằng Cephalosporins và Fluorinated quinolone thế

hệ thứ 3 là thuốc cĩ hiệu quả nhất Một số thuốc kháng sinh đã được dùng cĩ

hiệu quả cho điều trị P.multocida: Lincomycin- spectinomycin, một số

Cephalosporin và nhiều Quinolones: Enrofloxacin và Danofloxacin Trong đĩ Ceftiofur đã được một số tác giả chứng minh là kháng sinh tốt để chống lại vi

khuẩn P.multocida

- Phịng bệnh

Chúng ta đã cĩ một số vacxin vơ hoạt dùng cho việc phịng bệnh viêm

phổi do Pasteurella Một vài thơng báo gần đây với vacxin chống lại vi khuẩn

P.multocida, nhưng khơng cho kết quả chống lại tính tương đồng

Ở Việt Nam, Cù Hữu Phú và cộng sự đã thử nghiệm vacxin phịng bệnh viêm phổi của lợn do một số loại vi khuẩn gây ra trong đĩ cĩ vi khuẩn

P.multocida

Việc áp dụng nuơi cấy sục khí để tăng số lượng vi khuẩn trong 1ml canh trùng rút ngắn thời gian nuơi cấy trong sản xuất vacxin cũng đang được tiến hành tại Viện Thú y và các cơ sở sản xuất vacxin khác tại Việt Nam

2.3 VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS VÀ BỆNH DO LIÊN CẦU KHUẨN

GÂY RA Ở LỢN

2.3.1 Một số ñặc tính của vi khuẩn Streptococcus suis

Vi khuẩn S.suis là một trong số các tác nhân gây bệnh quan trọng ở lợn,

là nguyên nhân gây ra bệnh ở các thể cấp tính như bại huyết, viêm não, viêm màng trong tim, viêm khớp, viêm phổi, thường dẫn ñến chết ở lợn, ñặc biệt là giai ñoạn lợn ñã cai sữa và lợn trưởng thành Bệnh do vi khuẩn này gây ra từ lâu ñã và ñang ñược coi là 1 bệnh thu hút ñược nhiều sự chú ý trong ngành chăn nuôi lợn Bên cạnh ñó, tác nhân gây bệnh cũng là nhân tố quan trọng, là nguy cơ tiềm tàng gây các bệnh ở người như viêm não, viêm màng trong tim

và nhiễm trùng máu Vi khuẩn này là mối nguy hiểm nghề nghiệp ñặc biệt quan trọng với những người trực tiếp làm công tác chăn nuôi, thú y, những người làm nghề giết mổ và bán thịt lợn

Gần ñây nhất (tháng 7 và 8/2005), một vụ dịch lớn nhất chưa từng gặp trong lịch sử ngành chăn nuôi lợn ñã xảy ra tại tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc gây chết 644 con lợn, gây nhiễm bệnh cho 208 người, trong ñó có 39 người

ñã tử vong Các nhà khoa học Trung Quốc ñã tiến hành các nghiên cứu cơ bản trong phòng thí nghiệm và ñã chế tạo ñược 1 loại vacxin vô hoạt với kháng nguyên là chính các chủng vi khuẩn phân lập ñược tại ổ dịch ñể tiêm phòng cho toàn bộ lợn nuôi trong vùng Các ghi nhận cho thấy kết quả bước ñầu là rất khả quan, dịch bệnh ñã tạm dừng, không thấy lợn và người bị nhiễm bệnh và chết

Vi khuẩn Streptococcus nói chung và vi khuẩn S.suis nói riêng có hình cầu,

hình bầu dục, ñường kính khoảng 1µm, vi khuẩn xếp thành chuỗi như chuỗi hạt có

ñộ dài ngắn không ñều nhau: có khi chúng ñứng thành từng cặp, có thể xếp thành các chuỗi ngắn có 6-10 vi khuẩn hoặc dài hơn Vi khuẩn bắt màu gram dương

Vi khuẩn phát triển trong ñiều kiện hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, nhiệt ñộ thích hợp 370C, vi khuẩn không hình thành nha bào, ña số hình thành giáp mô,

sự hình thành giáp mô có thể ñược xác ñịnh khi chúng sinh sống trong các mô hoặc mọc trong các môi trường nuôi cấy có chứa huyết thanh

Vi khuẩn S.suis có khả năng lên men ñường: Glucose, Lactose,

Saccarose, Salicin, Innulin, Trehalose, Maltose Vi khuẩn không có khả năng lên men ñường: Mannit, Sorbitol, Mannitol, Dextrose, Xylose, Glyxerol Các phản ứng sinh hóa khác: Catalase âm tính, Oxydase âm tính, Indol âm tính, Coagulase âm tính

S.suis có sức ñề kháng kém với nhiệt ñộ và hóa chất: Trong phân, ở 00C

vi khuẩn có thể sống 104 ngày, ở 90C vi khuẩn sống ñược 10 ngày, ở 22 -

250C vi khuẩn có thể sống ñược 8 ngày, ở 700C vi khuẩn chết trong 35 - 40 phút, ở 1000C vi khuẩn chết trong 1 phút; vi khuẩn sống trong bụi 25 ngày ở

90C nhưng không phân lập ñược vi khuẩn ở bụi trong nhiệt ñộ phòng(18 -

200C)/24 giờ Vi khuẩn bị diệt dưới ánh sáng mặt trời sau 40 - 60 phút

Lê Văn Tạo, 2005 cho biết: S.suis dễ bị diệt bởi nhiều chất sát trùng như:

Phenol, Iod, Hypochlorid, Acid phenic 3 - 5% diệt vi khuẩn trong vòng 3 - 15 phút, formol 1% diệt vi khuẩn trong vòng 60 phút, cồn 700 diệt vi khuẩn trong vòng 30 phút Vi khuẩn có thể sống trong xác lợn chết ở 400C trong 6 tuần Vi khuẩn tồn tại lâu trong ñờm, chất bài xuất có protein Tuy nhiên vi khuẩn có thể tồn tại ở trên hạch amidan lợn mang trùng hơn 1 năm, ngay khi các yếu tố thực bào, kháng thể và bổ sung kháng sinh phù hợp trong thức ăn

Streptococcus có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp Có rất nhiều kháng

nguyên ñã ñược tìm thấy:

- Kháng nguyên polyozit hay kháng nguyên “C” do Lancefield phát hiện năm 1928, ñây là một kháng nguyên thân Thành phần kháng nguyên thân có ý

nghĩa quan trọng, quyết ñịnh ñến tính ñộc lực của vi khuẩn Streptococcus và nó nằm ở thành vi khuẩn (Cell wall) Thành tế bào vi khuẩn S.suis gồm 3 lớp: Lớp

ngoài có chứa acid và protein gọi là kháng nguyên M, T, R, , Map (M - Assotated Protein), SOF (Serua Oparty Factor) Phía ngoài cùng của lớp này

thường chứa các fimbriae; Lớp giữa chứa Polysaccharide; Lớp trong cùng là

Peptidoglycan Những Streptococcus khác nhau có cấu tạo chất “C” khác nhau, dựa vào ñó người ta chia Streptococcus thành các nhóm: A, B, C, D, ,R, trong

ñó Streptococcus typ A, B thuộc loại tan máu typ β

- Kháng nguyên protein M là yếu tố ñộc lực chống lại quá trình thực bào

và là kháng nguyên ñặc hiệu của Streptococcus type A, người ta xác ñịnh có

khoảng 42 typ trong ñó có 12 typ quan trọng và thường hay gây bệnh

- Các mucopeptit: Làm cho vách tế bào của Streptococcus cứng rắn và

còn có khả năng gây ñộc

- Kháng nguyên bám dính: Fimbriae có lipoteibic acid (LTA) giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu mô và ở tế bào lympho ña nhân có ñiểm tiếp nhận (receptor) tương ứng với LTA trong quá trình thực khuẩn (Trích theo Nguyễn Như Thanh và Cs)

Hiện có 20 nhóm huyết thanh và 25 serotyp khác nhau Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh trên lợn ñều thuộc typ 1 và typ 2

Vi khuẩn S.suis thuộc nhóm D có 9 serotyp; R và nhóm S có 2 serotyp gây

ra các thể bệnh viêm họng, nhiễm trùng huyết và viêm khớp ở lợn

Vi khuẩn S.suis thuộc nhóm E có 6 serotyp, trong ñó serotyp 2, 4, 1, 6, 7

gây các thể bệnh apxe hạch và các nội quan khác

Vi khuẩn S.suis thuộc nhóm L và C gồm 11 serotyp gây các thể bệnh

nhiễm trùng huyết, viêm nội tâm mạc và viêm ña khớp ở lợn

Vi khuẩn có thể tồn tại trong phân, bụi bẩn, xác lợn và ở cả những con ruồi trong một thời gian dài Bệnh có thể truyền qua ñường hô hấp, các chất bài tiết, máu của lợn bệnh, lây lan thông qua tiếp xúc trực tiếp hoặc lây qua kim tiêm nhiễm trùng Lợn con có thể bị lây nhiễm từ lợn mẹ qua ñường hô hấp, ñường tiêu hóa, ñường máu

Vi khuẩn S.suis lây truyền theo ñường hô hấp xâm nhập vào hạch

amidan, vòm họng, từ ñó di chuyển theo hệ lâm ba tới hạch dưới hàm, cư trú

ở các mô Lúc này cơ thể chưa có dấu hiệu về lâm sàng của bệnh Ở các tổ chức cư trú, chúng sống và nhân lên trong tế bào monocyt rồi chuyển vào xoang dịch não tủy, gây nên viêm màng não, có thể thông qua con ñường nhiễm trùng huyết ñể xâm nhập vào màng não, khớp xương và các mô khác

(Lê Văn Tạo, 2005)

2.3.2 Bệnh liên cầu khuẩn do Streptoccocus suis gây ra ở lợn

Bệnh do vi khuẩn S.suis gây ra ở lợn hay còn gọi là bệnh liên cầu ở lợn

xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi, nhưng phổ biến ở lợn con một vài tuần tuổi ñến sau cai sữa vài tuần ðặc trưng lâm sàng của bệnh là nhiễm trùng huyết, viêm

màng não, viêm khớp và viêm phế quản phổi ðặc biệt Streptoccocus suis typ

2 có thể gây bệnh cho người

Thể nhiễm trùng huyết và viêm não có dịch (thường thấy ở lợn từ 2 - 3 tháng tuổi); thể viêm ñường hô hấp (ở lợn từ 2 tuần tuổi ñến 2 tháng tuổi); thể viêm âm ñạo, tử cung (ở lợn cái hậu bị và lợn mang thai); thể viêm vú (ở lợn ñang nuôi con); thể viêm hạch (ở lợn sau cai sữa và vỗ béo)

tụ huyết và xuất huyết ở một số phủ tạng (lách, thận, hạch lâm ba)

+ Thể viêm não tủy: sốt cao, bỏ ăn, ñi lại siêu vẹo, run rẩy, co giật, nôn

mửa, hôn mê và chết sau 2 - 3 ngày Bệnh thường thấy ở lợn sau cai sữa, lợn

từ 2 - 3 tháng tuổi Tỷ lệ chết 100 % Bệnh tích: màng não tụ huyết và xuất huyết, dịch não và tủy vẩn ñục

+ Thể viêm họng, viêm phế quản phổi: sốt cao, chảy nước mắt, dịch mũi,

họng sưng, bỏ ăn, thở khó, thở nhanh; da tụ huyết từng mảng Thường thấy ở

lợn con đang theo mẹ và sau cai sữa Tỷ lệ chết 60 - 70% Bệnh tích: họng và amidan sưng, tụ máu, niêm mạc phế quản tụ huyết, niêm mạc mũi cĩ màng giả, tiểu phế quản và phế nang viêm cĩ dịch thẩm xuất, cĩ mủ và bọt khí; hạch phổi sưng thũng, tụ huyết

+ Thể viêm hạch: sốt cao, hạch hầu và hạch mang tai sưng thũng, sau

thành apxe mủ, lâu thành bã đậu Bệnh thấy ở lợn vỗ béo, diễn biến 5 - 8 ngày, tỷ lệ chết 20 - 30% Bệnh tích: hạch hầu, hạch trước vai, trước đùi sưng

tụ huyết ở giai đoạn đầu, giai đoạn cuối viêm bã đậu

- Chẩn đốn

Chủ yếu chẩn đốn bệnh dựa vào các triệu chứng, bệnh tích, đặc điểm

dịch tễ học của bệnh, phân lập và xác định vi khuẩn S.suis trong phịng thí

nghiệm Cần lưu ý khi chẩn đốn, phải tiến hành phân lập vi khuẩn từ một vài

cơ quan phủ tạng khác nhau của cùng một lợn mắc bệnh và từ vài lợn trong cùng một đàn để tìm ra serotyp gây bệnh chính

Các kỹ thuật sinh học phân tử là cơng cụ hữu ích giúp phân biệt các chủng

S.suis phân lập được, xác định nguồn gốc lây nhiễm trong đàn, giúp khống chế ổ

dịch hoặc tìm ra đúng chủng để bổ sung vào vacxin Gần đây nhiều phịng thí

nghiệm đã phát triển kỹ thuật PCR để giám định vi khuẩn S.suis, xác định các

yếu tố độc lực và serotyp của chủng vi khuẩn gây bệnh đã được ứng dụng rộng rãi

- Phịng bệnh:

+ Phịng bệnh bằng vệ sinh, chăm sĩc, nuơi dưỡng và quản lý:

Thường xuyên quét dọn vệ sinh, phun thuốc tiêu độc, tẩy uế chuồng trại bằng các loại thuốc sát trùng

Chú trọng cơng tác chăm sĩc nuơi dưỡng và quản lý đàn Xác định và loại thải những lợn mang mầm bệnh, tách riêng điều trị, hoặc loại thải Bổ sung kháng sinh vào thức ăn để giảm tỷ lệ lợn khỏe mang trùng

Khi cĩ dịch xảy ra, phải cách ly những con bệnh ra khu vực nuơi cách ly

ñể tránh lây lan Theo dõi và ñiều trị kịp thời những con bị bệnh Với những con không có khả năng chữa khỏi thì tiến hành loại thải nhằm mục ñích thu hẹp và thanh toán ñược ñàn lợn bị bệnh Trong quá trình theo dõi, phải cách

ly tuyệt ñối không ñược nhập ñàn mới vào, phải tiến hành thường xuyên phun thuốc tiêu ñộc, tẩy uế chuồng trại bằng các thuốc sát trùng

+ Phòng bệnh bằng vacxin:

Các nhà khoa học ñã nghiên cứu và ñưa vào chế tạo thử nghiệm nhiều loại vacxin khác nhau như: vacxin toàn khuẩn, vacxin sống nhược ñộc, vacxin tiểu phần (chế từ kháng nguyên giáp mô hoặc các protein thành tế bào, protein là các yếu tố ñộc lực), Tuy nhiên, miễn dịch bảo hộ ở chuột hoặc lợn thí nghiệm ñược tiêm các loại vacxin này cũng rất thất thường và không ổn ñịnh

Trong một số trường hợp khẩn cấp, việc lựa chọn dùng vacxin vẫn là phương thức tối ưu nhất ñể bảo vệ sức khỏe ñàn lợn Tại Trung Quốc, năm

1994 ñã dùng vacxin chế từ chủng nhược ñộc của vi khuẩn S.suis chủng

ST.171, ñông khô tiêm cho lợn từ cai sữa ñến trưởng thành và nái có chửa ở thời kỳ ñầu Khi sử dụng cho thêm nước muối sinh lý có bổ trợ keo phèn 20% hòa thành huyễn dịch tiêm dưới da hoặc tiêm bắp với liều 1ml/con Sau khi tiêm 7 ngày ñã sinh miễn dịch, miễn dịch cao nhất sau 14 ngày và thời gian miễn dịch kéo dài ñược 6 tháng Sau ñó, năm 2005, chính Trung Quốc cũng

ñã kiểm soát dịch bệnh do S.suis gây ra ở lợn bằng vacxin vô hoạt chế từ các chủng S.suis serotyp 2 (Lê Văn Tạo, ðỗ Ngọc Thúy, 2006)

Tại Việt Nam, từ các kết quả nghiên cứu về bệnh cầu khuẩn ở lợn, Khương Bích Ngọc (1996) ñã chế tạo vacxin cầu khuẩn chết có bổ trợ keo phèn tiêm phòng cho lợn nái, ñạt hiệu quả bảo hộ cao

Vi khuẩn S.suis mẫn cảm với nhiều loại kháng sinh, nhưng cũng rất dễ

kháng lại với các loại kháng sinh này Vì vậy trong quá trình sử dụng kháng sinh ñể phòng và ñiều trị bệnh phải hết sức thận trọng

- ðiều trị:

Chẩn đốn phát hiện sớm bệnh do vi khuẩn S.suis gây ra và điều trị bằng

kháng sinh thích hợp là biện pháp nhằm tăng khả năng sống sĩt cho đàn lợn Với lợn con trước cai sữa và ở giai đoạn đầu của bệnh, nếu sử dụng Penicilin

và Dexametasone sẽ mang lại hiệu quả rất cao Trong thực tế, khi sử dụng

Penicilin điều trị bệnh do S suis gây ra, điều trị từng cá thể kết hợp với chăm

sĩc và nuơi dưỡng tốt cĩ thể khỏi bệnh hồn tồn, tránh được tử vong

Ngồi việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh do S.suis gây ra, nhiều

nước trên thế giới đã sử dụng huyết thanh đặc hiệu để điều trị bệnh và mang lại kết quả tốt

2.4 HIỂU BIẾT CHUNG VỀ VACXIN

Vacxin là một chế phẩm sinh học được dùng để tạo miễn dịch chủ động kháng lại bệnh, nhằm ngăn cản khả năng gây bệnh của mầm bệnh

Hiện nay, vacxin được chia thành 2 nhĩm lớn là nhĩm vacxin truyền thống và nhĩm vacxin thế hệ mới:

+ Vacxin truyền thống gồm cĩ: vacxin vơ hoạt, vacxin nhược độc, vacxin giải độc tố, vacxin dưới đơn vị

+ Vacxin thế hệ mới gồm cĩ: vacxin tái tổ hợp và vacxin AND

Một vacxin cần đảm bảo tính thuần khiết, an tồn và hiệu lực

2.4.1 Vacxin truyền thống

a Vacxin vơ hoạt

Vacxin vơ hoạt là loại vacxin được chế từ các chủng vi sinh vật cường độc, đã được giết chết bằng hĩa chất hoặc nhiệt độ cao Vacxin này thường chứa nguyên vi sinh vật, nên hầu như nĩ tạo miễn dịch khơng hồn tồn, miễn dịch cĩ độ dài ngắn Hiện nay nhờ cơng nghệ mới mà vacxin vơ hoạt đã được cải thiện nhờ chất bổ trợ cĩ chất lượng cao

Vacxin vơ hoạt cĩ một số ưu điểm sau:

+ Cĩ tính an tồn cao, khơng cĩ hiện tượng đột biến và cường độc trở lại

+ Có thể dùng cho mọi ựối tượng vật chủ kể cả vật chủ bị suy giảm miễn dịch

+ Bảo quản dễ dàng, rất thắch hợp cho vùng có khắ hậu nóng hoặc những nơi chưa có ựiều kiện bảo quản

+ Vacxin này kắch thắch miễn dịch tốt nếu ựược dùng nhắc lại

Vacxin vô hoạt có một số nhược ựiểm sau:

+ Do phải sử dụng trực tiếp trên từng cá thể, nên không thể áp dụng tiến bộ khoa học khi số lượng ựàn lớn như biện pháp cho uống hoặc khắ dung

+ Không có khả năng tạo miễn dịch cục bộ

+ Phải sử dụng nhắc lại mới có hiệu quả cao

+ đôi khi không tạo ựáp ứng miễn dịch ở một vài cá thể

+ Giá thành cao hơn so với vacxin nhược ựộc cùng loại

+ Nếu quá trình vô hoạt không triệt ựể, dẫn ựến việc ựưa mầm bệnh cường ựộc vào vật chủ

b Vacxin nhược ựộc

Vacxin nhược ựộc là vacxin ựược chế từ những chủng vi sinh vật ựã ựược làm giảm tắnh ựộc không còn gây hại cho vật chủ, nhưng vẫn giữ ựược tắnh kháng nguyên Do ựó vẫn kắch thắch cơ thể sinh ựáp ứng miễn dịch Hiện nay vi sinh vật ựược làm giảm ựộc bằng cách tiêm truyền nhiều ựời cho vật chủ tự nhiên, hoặc ựược nuôi cấy trong ựiều kiện không thuận lợi ựối với vi sinh vật

Vacxin nhược ựộc có một số ưu ựiểm sau:

+ Hoạt hóa hết hệ thống miễn dịch

+ Không làm thay ựổi tắnh kháng nguyên

+ Tạo ựáp ứng miễn dịch nhanh, mạnh và lâu dài

+ Giá thành vacxin thấp hơn vacxin vô hoạt cùng loại

+ Dễ dàng vận chuyển và có thể sử dụng trên quy mô công nghiệp nhờ khả năng xâm nhập ựược vào cơ thể theo nhiều con ựường, nên có thể cho

uống hoặc sử dụng khí dung

Vacxin nhược ñộc có một số nhược ñiểm sau:

+ Có thể tạo ñột biến, trở lại cường ñộc khi vào cơ thể vật chủ Do khả năng có thể truyền vi sinh vật vacxin từ con tiêm sang không tiêm vacxin Do

sự lưu hành của vacxin nhược ñộc rất khó kiểm soát nên ñặc tính nhược ñộc không ổn ñịnh, có thể ñột biến và cường ñộc trở lại

+ Không sử dụng ñược cho những vật chủ bị suy giảm miễn dịch

+ Cần phải bảo quản tốt nên hạn chế phạm vi sử dụng

Ngày nay vacxin nhược ñộc ñã ñược cải tiến bằng cách cắt bỏ gen ñộc, gen gây bệnh, rồi ñem chế vacxin Nhưng những kết quả thống kê cho thấy chỉ sau ít ñời vi sinh vật lại xuất hiện gen ñộc trở lại Những nước phát triển

có trình ñộ khoa học kỹ thuật cao ưa chuộng sử dụng vacxin vô hoạt Bởi an toàn và hiện nay do có nhiều chất bổ trợ mới nên hiệu quả của vacxin vô hoạt ngày càng ñược cải thiện

c Vacxin giải ñộc tố

Vacxin giải ñộc tố là vacxin chế từ các ñộc tố của vi khuẩn ñã ñược vô hoạt Vacxin này chế ra ñể phòng những vi khuẩn gây bệnh bằng chính ñộc tố của mình

Các vacxin giải ñộc tố ñang ñược sử dụng là vacxin giải ñộc tố uốn ván, vacxin giải ñộc tố bạch hầu

d Vacxin dưới ñơn vị

Vacxin dưới ñơn vị là vacxin thay vì sử dụng toàn bộ vi sinh vật, hay ñộc tố của chúng mà sử dụng các mảnh protein của mầm bệnh ñể kích thích sinh miễn dịch

Có ba loại vacxin dưới ñơn vị là vacxin ñược chế từ protein lấy từ mầm bệnh hay từ mô bào tự nhiên, vacxin protein tái tổ hợp, vacxin chứa các peptit

Vacxin dưới ñơn vị có một số ưu ñiểm sau:

+ Vacxin chứa kháng nguyên tinh khiết hơn vacxin chứa toàn bộ vi sinh vật + Vacxin sử dụng rất an toàn cho mọi vật chủ kể cả vật chủ bị suy giảm miễn dịch, ít khi có tác dụng phụ

Vacxin dưới ñơn vị có một số nhược ñiểm sau:

+ Kháng nguyên của vacxin khó giữ ñược cấu trúc không gian nguyên thủy của chúng, vì thế kháng thể tạo ra chống protein dưới ñơn vị có thể không nhận biết ñược kháng nguyên

Thường protein tự nhiên ñược chiết tách không tinh khiết Do ñó giải ñộc tố ñược xem là thành công của vacxin dưới ñơn vị

2.4.2 Vacxin thế hệ mới

a Vacxin tái tổ hợp

Vacxin tái tổ hợp là vacxin sử dụng một véc tơ sinh học ñể nhân gen mã hóa cho kháng nguyên Véc tơ sinh học ñược sử dụng là vi khuẩn hoặc virus, gen mã hóa cho kháng nguyên sẽ ñược gắn vào bộ gen của véc tơ sinh học Quá trình nhân lên của vật mang sẽ làm gen kháng nguyên nhân lên, chúng ta

sẽ thu ñược kháng nguyên ñể chế vacxin

Vacxin tái tổ hợp có một số ưu ñiểm sau:

+ An toàn hơn vacxin nhược ñộc

+ Giá thành rẻ, chất lượng vacxin ổn ñịnh và ñồng nhất

Vacxin tái tổ hợp có một số nhược ñiểm sau:

+ Cùng một mầm bệnh có thể có rất nhiều kháng nguyên, nên hiệu quả của vacxin tái tổ hợp sẽ không cao

+ Vacxin có thể có hiệu quả với chủng này, nhưng không có hiệu quả với chủng khác

+ Một protein tái tổ hợp ñơn giản có thể không kích thích ñược ñủ tất

cả các thành phần của hệ thống miễn dịch

b Vacxin DNA

Vacxin DNA là loại vacxin sử dụng chính ñoạn DNA của mầm bệnh mã

hóa kháng nguyên bắn vào tế bào vật chủ thích nghi Tế bào này sẽ giúp sao

mã, giải mã và dịch mã ñể tạo ra các protein kháng nguyên Các protein kháng nguyên này sẽ kích thích hệ thống miễn dịch sinh miễn dịch nếu kháng nguyên này xâm nhập vào lần sau

Vacxin này có một số ưu ñiểm sau:

+ Kháng nguyên ñược thể hiện ở dạng nguyên thủy của nó, vì thế quá trình chế biến và trình diện kháng nguyên tới hệ thống miễn dịch tốt hơn

+ Kích toàn bộ hệ thống miễn dịch cả dịch thể và tế bào, kích thích cả ñáp ứng phòng hộ và ñáp ứng CD4 trong cùng một cơ thể Thời gian miễn dịch kéo dài

+ Dễ sản xuất, bảo quản và tinh chế

+ Dễ cải tiến và kết hợp vacxin

+ Tạo ra miễn dịch dài và hoạt phổ miễn dịch rộng

+ Có thể giảm liều vacxin vì kháng nguyên ñược sản xuất và thể hiện trong một thời gian dài

+ Trình tự của DNA có thể thay ñổi dễ dàng trong phòng thí nghiệm nên nó ñáp ứng ñược khả năng biến ñổi của mầm bệnh

Dù là lại vacxin nào cũng cần ñảm bảo một số ñặc tính sau:

+ Vacxin phải chứa kháng nguyên và các kháng nguyên ñó phải ñược

hệ thống miễn dịch coi là mục tiêu cần tấn công

+ Các kháng nguyên trong vacxin phải kích thích sinh ñáp ứng miễn dịch phòng hộ hay vacxin phải có hiệu lực

+ Vacxin phải an toàn

Ngoài ra trên thực tế một vacxin cần phải có giá thành hợp lý, ổn ñịnh

về tính sinh học, dễ sử dụng, ít có tác dụng phụ

3 NỘI DUNG, ðỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG

3.1.1 Xác ñịnh các ñặc tính, serotyp và ñộc lực của các chủng vi khuẩn

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis phân lập ở lợn ñược chọn ñể chế vacxin

3.1.2 Xác ñịnh ñộ vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin phòng bệnh viêm

phổi ñược chế trên ñộng vật thí nghiệm

3.1.3 Xác ñịnh hiệu lực của vacxin phòng bệnh viêm phổi ñược chế trên lợn

bằng phương pháp công cường ñộc tại Viện Thú y

3.1.4 Xác ñịnh ñộ dài miễn dịch của vacxin phòng bệnh viêm phổi trên lợn

nuôi tại Công ty cổ phần giống chăn nuôi tỉnh Thái Bình

3.2 ðỐI TƯỢNG

Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và

Streptococcus suis gây bệnh viêm phổi ở lợn

3.3 ðỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU, ðỊA ðIỂM NGHIÊN CỨU

3.3.1 ðối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và

Streptococcus suis

3.3.2 Mẫu bệnh phẩm

Máu của lợn trước và sau khi tiêm vacxin ñược chế từ 3 loại vi khuẩn

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis ñể xác ñịnh hiệu giá kháng thể có trong máu lợn

3.3.3 ðộng vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh (18-20g/con)

- Lợn sau cai sữa 35 ngày tuổi khỏe mạnh, chưa ñược tiêm vacxin phòng bệnh viêm phổi

3.3.4 Các loại hóa chất, môi trường

Các loại môi trường do hãng Oxoid (Anh), Merck (Pháp) sản xuất gồm:

- Môi trường thông thường: nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate, THB (Todd Herwin Broth), nước thịt gan yếm khí,

- Các loại môi trường, hóa chất dùng ñể giám ñịnh, xác ñịnh các ñặc tính sinh hóa của vi khuẩn: môi trường ñường các loại, dung dịch Kovac’s, dung dịch H2O2 3%, giấy thử Oxydase, nước muối 6,5%,

- Các loại hóa chất và sinh phẩm cho phản ứng PCR (Primer, Taq polymerase, dNTPs, Tris-HCl, (NH4)2SO4, MgCl2, Tween20, Tris, EDTA, DNA ladder)

- Các dụng cụ và máy móc phòng thí nghiệm:

+ Máy PCR, máy ñiện di

+ Máy chụp Gel (Gel Doc System 2000)

3.3.5 Giống vi khuẩn

* Chủng vi khuẩn ñược sử dụng ñể chế vacxin: 03 vi khuẩn phân lập ñược từ lợn mắc bệnh ở các ñịa phương sau khi xác ñịnh ñặc tính, các yếu tố gây bệnh, ñộc lực cao và kháng nguyên tính ổn ñịnh ñã ñược chọn ñể chế tạo vacxin gồm có:

- Actinobacillus pleuropneumoniae 03 chủng thuộc typ 2 và 5a và 5b

- Pasteurella multocida 02 chủng thuộc typ A và D

- Streptococcus suis 01 chủng thuộc typ 2

* Chủng vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella

multocida và Streptococcus suis chuẩn do Nhật Bản và Autralia cung cấp

3.3.6 ðịa ñiểm nghiên cứu

ðề tài ñược tiến hành tại:

- Bộ môn Vi trùng Viện Thú y, 86 ðường Trường Chinh, Quận ðống

ða, Hà Nội

- Công ty Cổ phần Giống chăn nuôi tỉnh Thái Bình

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Phương pháp kiểm tra các ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập ñược

- Thử phản ứng Oxydase:

- Thử phản ứng Catalase:

- Thử phản ứng sinh Indol:

- Thử phản ứng lên men ñường:

3.4.2 Phương pháp xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn phân lập ñược

3.4.2.1 Phương pháp xác ñịnh serotyp của vi khuẩn A.pleuropneumoniae bằng phương pháp ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn

- Chuẩn bị kháng huyết thanh: kháng huyết thanh chuẩn

A.pleuropneumoniae ñược pha loãng theo cơ số 2 thành: 1/2, 1/4, 1/8 Sau ñó

ủ với protein A chiết xuất từ Staphylococcus aureus theo tỷ lệ 1:5 trong thời

Các typ giáp mô A, B, D của vi khuẩn P.multocida ñược xác ñịnh dựa

trên phản ứng PCR phức hợp (Multiplex PCR), gồm các cặp mồi: CAPA-F và CAPA-R ñể xác ñịnh serotyp A, CAPB-F và CAPB-R ñể xác ñịnh serotyp B, CAPD-F và CAPD-R ñể xác ñịnh serotyp D Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm ñược trình bày ở bảng 3.1

Quy trình thực hiện phản ứng PCR như sau: