Luận văn thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà, bước đầu đánh giá tồn dư một số loại kháng sinh trong thịt gà được bán trên thị trường hải phòng

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN TÚ NAM

THỰC TRẠNG SỬ DỤNG KHÁNG SINH TRONG CHĂN NUÔI GÀ, BƯỚC ðẦU ðÁNH GIÁ TỒN DƯ MỘT SỐ LOẠI

KHÁNG SINH TRONG THỊT GÀ ðƯỢC BÁN

TRÊN THỊ TRƯỜNG HẢI PHÒNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Thú y

Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS BÙI THỊ THO

HÀ NỘI – 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận là do bản thân trực tiếp ñiều tra, thu thập thông tin và lấy mẫu với một thái ñộ hoàn toàn khách quan, trung thực Kết quả phân tích tồn dư kháng sinh mẫu

có sự cộng tác với Phòng Thí Nghiệm Trung Tâm – Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng Thúy sản ðại học Nông nghiệp Hà Nội và Phòng thí nghiệm Phân tích thực phẩm – Khoa thú y – ðại học Liege – Vương Quốc Bỉ Các tài liệu ñã trích dẫn của các tác giả ñều ñược liệt kê ñầy ñủ, không sao chép bất cứ tài liệu nào mà không trích dẫn

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2011

Học viên

Nguyễn Tú Nam

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành bản luận văn này, tôi luôn nhận ựược sự giúp ựỡ về

nhiều mặt của các cấp lãnh ựạo, các tập thể và cá nhân

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kắnh trọng tới PGS.TS Bùi Thị Tho, người ựã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Luận văn ựược thực hiện tại Phòng Thắ Nghiệm Trung Tâm Ờ Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng Thúy sản đại học Nông nghiệp Hà Nội Tại ựây tôi nhận ựược sự giúp ựỡ và tạo ựiều kiện thuận lợi của TS Phạm Kim đăng Ờ Trưởng phòng - Phòng thắ nghiệm trung tâm trong quá trình thực hiện ựề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp ựỡ quý báu ựó

Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban giám hiệu Trường đại học Nông nghiệp

Hà Nội, Viện đào tạo sau ựại học, Ban chủ nhiệm Khoa Thú y, các thầy cô giáo trong bộ môn Nội - Chẩn Ờ Dược - độc chất ựã tạo ựiều kiện và giúp ựỡ tôi về kiến thức và chuyên môn trong suốt thời gian học tập và sinh hoạt chuyên môn tại bộ môn

Xin chân thành cảm ơn Sở NN&PTNT Hải Phòng, Chi cục thú y - Thành phố Hải Phòng, các chủ trang trại, các hộ chăn nuôi và các cửa hàng kinh doanh thuốc thú y ở các huyện Tiên Lãng, Vĩnh Bảo, Thủy Nguyên

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ựến gia ựình và bạn bè ựã tạo ựiều kiện thuận lợi, giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả luận văn

Nguyễn Tú Nam

MỤC LỤC

2.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi 72.3 Vấn ñề tồn dư kháng sinh trong sản phẩm có nguồn gốc từ ñộng vật 102.4 Các phương pháp phát hiện và ñịnh lượng kháng sinh trong sản

4.1 Tình hình phát triển chăn nuôi ở Hải Phòng 354.1.1 Các phương thức chăn nuôi hiện ñang ñược áp dụng tại Hải Phòng 354.1.2 Tình hình phát triển ñàn gia cầm ở Hải Phòng 394.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà trên ñịa bàn

4.2.1 Một số ñặc ñiểm kinh doanh thuốc thú y trên ñịa bàn Hải Phòng 434.2.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm ở Hải Phòng 464.3 Kết quả phân tích mẫu thịt gà lấy tại các chợ trên ñịa bàn Hải Phòng 53

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EFAH European Federation of Animal Health

FDA Food and Drug Administration

GC/MS Gas Chromatography / Mass Spectrometry

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HPTLC Hight Performance Thin Layer Chromatography

MRPL Minimum Required Performance Limit

LC/MS Liquid Chromatography / Mass Spectrometry

LOD Limit Of Detection

FAO Food and Agriculture Organization

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm

WTO World Commerce Organization

4.5b Kết quả ñiều tra về mức ñộ sử dụng kháng sinh trong phòng và

trị bệnh cho 2 loại gà theo hướng sản xuất 52 4.5c Số loại kháng sinh ñược sử dụng trong mỗi hình thức nuôi 53 4.6 Kết quả phân tích sàng lọc mẫu thịt gà tại các chợ Hải Phòng 55 4.7 Kết quả phân tích xác ñịnh nhóm kháng sinh trong mẫu thịt gà

4.8 Kết quả phân tích khẳng ñịnh tồn dư kháng sinh nhóm

tetracycline trong thịt gà lấy trên thị trương Hải Phòng 58 4.9 Kết quả phân tích khẳng ñịnh tồn dư kháng sinh nhóm

(fluoro)quinolon trong thịt gà ñược lấy trên thị trương Hải Phòng 59

DANH MỤC SƠ ðỒ

3.2 Qui trình tách chiết mẫu và ñọc kết quả của kít Tetrasensor 29 3.3 Chiến lược phân tích dư lượng kháng sinh trong thịt gà ñược lấy

4.1 Mạng lưới phân phối thuốc thuốc thú y trên ñịa bàn Hải Phòng 44

và ñang kéo theo mức ñộ ô nhiễm môi trường, nên ñã làm cho diễn biến dịch bệnh trên ñàn vật nuôi ngày càng phức tạp và khó kiểm soát (Lê Viết Ly, 2009) Trước tình hình ñó, người sản xuất coi các hợp chất có tính chất kháng khuẩn nói chung là những loại thuốc thú y ñóng vai trò quan trọng không thể thiếu trong chăn nuôi Việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp thuốc thú y nói chung và kháng sinh nói riêng ñã gây nên tồn lưu trong thực phẩm (ðậu Ngọc Hào, 1999; Dang và cs, 2010) Vấn ñề này gây tác ñộng không tốt cho sức khoẻ cộng ñồng, ảnh huởng xấu ñến môi trường sống, tạo ñiều kiện xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc Ngoài ra tồn dư kháng sinh còn làm ảnh hưởng ñến công nghệ lên men, chế biến thực phẩm (Aarestrup, 1999; Bogaard

và Stobberingh, 2000; Pena và cs., 2004)

Vấn ñề vệ sinh an toàn thực phẩm ở nước ta trong những năm gần ñây ñang ở mức báo ñộng cao với nhiều vụ ngộ ñộc thực phẩm cấp tính và mãn tính Một trong những nguyên nhân quan trọng gây ô nhiễm thực phẩm là môi trường chăn nuôi, nhất là việc sử dụng sai nguyên tắc các thuốc trong ñiều trị ñặc biệt là kháng sinh

Nước ta trở thành một trong những nước xuất khẩu lớn và ñược Thế Giới biết ñến nhiều hơn khi trở thành thành viên thứ 150 của WTO Do ñó sức ép

của cam kết ñảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng cao ðây là một vấn ñề nhạy cảm không chỉ nâng cao hiệu quả kinh tế mà còn có ảnh hưởng lớn ñến thu nhập của các ngành khác như du lịch, ẩm thực; ñặc biệt là việc giữ ñúng hình ảnh tốt ñẹp của một nước xuất khẩu

ðể tăng cường kiểm soát dư lượng, Ủy ban Châu Âu ñã ban hành Quyết ñịnh số 2377/90/EC (ñổi thành Quyết ñịnh 37/2010) quy ñịnh giới hạn cho phép thuốc thú y trong sản phẩm ñộng vật (CE, 1990, EU, 2010), các sản phẩm có nguồn gốc từ ñộng vật phải ñược kiểm soát dư lượng theo Chỉ thị số 96/23/EC Các phương pháp phân tích muốn ñược công nhận và áp dụng trong chiến lược kiểm soát dư lượng phải ñược chuẩn hóa theo quyết ñịnh số 2002/657/CE (CE, 2002) Muốn hàng hóa ñược phép lưu thông trên thị trường Châu Âu, các nước xuất khẩu, các nhà sản xuất phải có chiến lược phân tích kiểm soát dư lượng tốt

ðể bảo vệ người tiêu dùng và môi trường, Việt Nam cũng như các nước phát triển EU, Mỹ ñã ban hành các qui ñịnh có liên quan ñến việc quản lý, sản xuất kinh doanh, sử dụng ðặc biệt là giá trị tồn dư tối ña (MRL) của nhiều kháng sinh trong sản phẩm Cụ thể, Quyết ñịnh số 46/2007/Qð-BYT do Bộ Y

Tế ban hành quy ñịnh giới hạn tối ña ô nhiễm sinh học, hóa học trong thực phẩm, trong ñó có giới hạn tối ña dư lượng kháng sinh Cùng với sự tăng cường quản lý nhà nước về chất lượng thực phẩm, các cơ sở sản xuất, chăn nuôi, chế biến thực phẩm cũng ñã rất cố gắng nâng cao chất lượng sản phẩm tạo thương hiệu, niềm tin ñối với người tiêu dùng Nhưng trên thực tế vấn ñề này vẫn còn nhiều hạn chế, các nhà chức trách và Chính Phủ ñặc biệt quan tâm vì ñó là một trong những chủ ñề nóng ñược ñưa ra chất vấn, thảo luận trong một số kỳ họp Quốc Hội gần ñây

ðể nâng cao chất lượng thực phẩm nói chung, chất lượng thịt gà nói riêng, khép kín quy trình kiểm soát chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm

chăn nuôi “từ trang trại ñến bàn ăn”, việc nghiên cứu thực trạng sử dụng và

ñánh giá tồn dư kháng sinh trong thịt ở ñịa phương là hết sức cấp bách không chỉ phục vụ cho việc phát triển chăn nuôi bền vững mà còn có ý nghĩa bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng và sức khỏe cộng ñồng Xuất phát từ những vấn ñề trên, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Thị Tho, chúng tôi ñã tiến hành

nghiên cứu ñề tài: “Thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà, bước ñầu ñánh giá tồn dư một số loại kháng sinh trong thịt gà ñược bán trên thị trường Hải Phòng”

1.2 MỤC ðÍCH CỦA ðỀ TÀI

Khảo sát, ñánh giá thực trạng sự tồn dư một số kháng sinh trong thịt gà ñược bán trên thị trường Hải Phòng Trên cơ sở khảo sát, ñiều tra và phân tích các yếu tố có ảnh hưởng hàm lượng chất kháng sinh còn tồn dư trong thịt gà

từ ñó xây dựng chiến lược kiểm soát chất lượng thực phẩm ñảm bảo ñược vệ sinh an toàn cho người tiêu dùng

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Sử dụng các kết quả, thông tin ñiều tra cũng như các kết quả nghiên cứu trong ñề tài làm cơ sở ñịnh hướng cho các nghiên cứu về phương pháp và chiến lược kiểm soát tồn dư kháng sinh trong thịt gà

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nguồn thông tin quan trọng là cơ sở cho việc quản lý sản xuất, kinh doanh và sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà ñảm bảo an toàn thực phẩm, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng ñồng và môi trường Giảm thiểu tối ña sự hình thành các dòng vi khuẩn kháng thuốc phát tán ra môi trường

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁNG SINH VÀ PHÂN LOẠI KHÁNG SINH

2.1.1 Khái niệm về kháng sinh

Kháng sinh tên quốc tế là Antibiotics Ngày nay kháng sinh ñược ñịnh nghĩa: “Kháng sinh là chất do vi nấm hoặc vi khuẩn tạo ra, hoặc là chất tổng hợp hay bán tổng hợp có tác dụng ñiều trị ñặc hiệu với liều lượng thấp do ức chế một số quá trình sống của vi sinh vật” Như vậy, theo quan ñiểm hiện ñại, kháng sinh có khái niệm rộng hơn, ngoài các chất thiên nhiên kháng sinh còn gồm cả các chất có nguồn gốc từ thực vật thượng ñẳng – phytoncid và các chất kháng sinh khác có nguồn gốc tổng hợp Các thuốc này không chỉ có tác dụng với vi khuẩn mà còn cả vi rút, chống nấm và ñơn bào ký sinh, kìm hãm

sự phát triển của tế bào ung thư (Phạm Khắc Hiếu và Lê Thị Ngọc Diệp, 1999; Hoàng Tích Huyền và cs., 2001, Bùi thị Tho, 2003)

2.1.2 Phân loại thuốc kháng sinh

Kháng sinh có thể ñược phân loại theo nguồn gốc, theo phổ tác dụng, theo cấu trúc hoá học hoặc theo cơ chế tác dụng Tuy nhiên phân loại theo cấu trúc hoá học là cách thông dụng nhất vì hoạt phổ kháng sinh, mức ñộ tác dụng

và cấu trúc hoá học có mối liên quan chặt chẽ với nhau (Phạm Khắc Hiếu và Lê Thị Ngọc Diệp, 1999) Theo cách phân loại này kháng sinh gồm có các nhóm chính sau:

- Nhóm Beta-lactam

ðược gọi là Beta-lactam vì trong cấu trúc phân tử của chúng có một liên kết với Beta-lactamin gồm 2 vòng, vòng A và vòng B Vòng A (Thiazolidin) riêng cho các penicillin, vòng β (beta-lactamin) chung cho penicillin,

Cephalosporin và những phân tử mới tìm ra Cơ chế tác dụng của nhóm lactam là ức chế sự tạo vách tế bào

Beta Nhóm Aminoglycosid (Amimosid, oligosacharid)

Cấu trúc phân tử của các kháng sinh nhóm aminoglycosid có ñường ñính theo các nhóm amin Cơ chế tác dụng của nhóm này là ức chế tổng hợp protein ở mức ribosom

- Nhóm Lincosamid

Cấu trúc phân tử khác với Macrolid, không có vòng lacton nhưng có chức năng amid Phổ tác dụng và cơ chế tác dụng rất giống nhóm Macrolid Gồm Lincomicin và Clindamycin

- Nhóm Macrolid

Nhóm Macrolid có cấu trúc aglycon, nhân lacto, vòng gồm 12 ñến 19 nguyên tử cacbon, có gắn với 1-2 ose ñặc hiệu bằng liên kết glycosid

- Nhóm Phenicol (Chloramphenicol-CAP)- ñã bị cấm sử dụng trong thú y

Cấu trúc phân tử của CAP có hai cacbon bất ñối xứng nên có bốn ñồng phân lập thể, chỉ có ñồng phân D (-) Threo có tác dụng kháng sinh Hiện nay,

ñã tổng hợp ñược Thiamphenicol và Azdamphenicol Cơ chế tác dụng là gắn

có phục hồi vào phần 50s của ribosom

- Nhóm Tetracyclin

Có cấu trúc bốn vòng, mỗi vòng sáu cạnh, khác nhau ở các nhóm chức

gắn vào vòng, có tác dụng ức chế tổng hợp protein vi khuẩn

- Nhóm kháng sinh ña peptid (Polypeptid)

Cấu trúc phân tử có nhiều liên kết peptid Hoạt phổ kháng sinh hẹp

- Các kháng sinh khác: bao gồm Vancomycin, Teicoplanin (glycopeptid, gồm

phần ose và acid amin, ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn); Novobiocin (kìm khuẩn thông qua ức chế tổng hợp acid nhân); Acid fusidic (kháng sinh duy nhất

có cấu trúc steroid, cơ chế giống nhóm Macrolides, ức chế tổng hợp protein) và

Fosfomycin (ức chế quá trình tạo vách tế bào vi khuẩn, hoạt phổ rộng)

- Thuốc cĩ tác dụng như kháng sinh (antibiomimetic)- kháng sinh tổng

hợp, gồm:

• Nhĩm Quinolones: cịn được gọi là thuốc ức chế gyrase vì đích phân

tử của nhĩm này là DNA-gyrase dẫn đến ức chế tổng hợp AND của vi khuẩn Gồm hai loại: Quinolon kinh điển (alidixic acid, Oxolinic acid, Pipemidic, Piromidic và Flumequin) và Quinolon mới (Rosoxacin, Pefloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin, Norfloxacin)

• Nhĩm Nitro-imidazoles: gồm ba dẫn xuất Metronidazol, Orndazol,

Tinidazole cĩ tác dụng diệt đơn bào và vi khuẩn kỵ khí

• Nhĩm các dẫn xuất Nitrofuranes: gồm ba loại

+ Loại 1 gồm Nitrofurantoine, Hydroxymethyl-nitrofurantoine, Niforfoline + Loại 2 gồm Furazolidone, Nifuratel

+ Loại 3 gồm Nitrolural, Nifuroxazid

Ngồi ra cịn cĩ các kháng sinh chống nấm

2.1.3 Nguyên tắc sử dụng kháng sinh trong điều trị

Chỉ sử dụng kháng sinh khi biết chắc chắn đĩ là bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn gây ra và khi cơ thể vật nuơi cĩ nguy cơ bị nhiễm trùng: mổ, vết thương ngoại khoa, thiến … Sự lựa chọn hợp lý và khoa học nếu người kê đơn dựa vào các kết quả của việc hỏi diễn biến bệnh, thăm khám, chẩn đốn, kết quả thử kháng sinh đồ và sau đĩ dựa vào các triệu chứng lâm sàng, dịch tễ học… Tìm hay dự đốn căn nguyên gây bệnh, phát hiện bệnh sớm….Trên cơ sở đĩ chọn thuốc cĩ phổ rộng, điều trị kịp thời và cần phải dùng liều tấn cơng Khi chọn thuốc cần chú ý đến đích (nơi vi khuẩn đang khư trú), đường đưa thuốc thích hợp để kháng sinh nhanh đến được nơi tác dụng với nồng độ cao nhất và tồn tại lâu

Khi điều trị dùng liều cao ngay từ đầu, sau đĩ phải luơn luơn duy trì đủ

liều lượng và ñúng liệu trình

Chỉ phối hợp kháng sinh trong ñiều kiện thật cần thiết: chống lại nguy cơ gây kháng thuốc gia súc bị bệnh ghép… Khi phối hợp kháng sinh cần hiểu rõ

cơ chế tác dụng khi có mặt cùng lúc hai kháng sinh phối hợp tránh tác dụng ñối kháng hoặc không có ảnh hưởng lẫn nhau

Kết hợp với thuốc chữa triệu chứng và nhất thiết phải nâng cao sức ñề kháng ñặc hiệu, tăng cường công năng của gan, thận bằng cách chăm sóc, quản lý, nghỉ dưỡng và khai thác hợp lý

2.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KHÁNG SINH TRONG CHĂN NUÔI

2.2.1 Trên thế giới

Theo kết quả nghiên cứu của hội Liên hiệp sức khoẻ ñộng vật Châu Âu (FEDESA), năm 1999, Châu Âu ñã sử dụng 35% (4.700 tấn) tổng lượng kháng sinh ñăng ký trong chăn nuôi; 65% phần còn lại ñược sử dụng cho người (8.500 tấn) Trong số kháng sinh dùng cho chăn nuôi có 3.900 tấn (hay 29%) ñược dùng ñể ñiều trị bệnh ñộng vật; 786 tấn (6%) trộn vào thức ăn (TA) nhằm kích thích sinh trưởng Như thế lượng kháng sinh ñược sử dụng ñể kích thích sinh trưởng ñã giảm 50% so với năm 1997 (1.600 tấn ) (EU, 2002)

Từ ngày 1/1/2006, Uỷ ban Châu Âu ñã cấm sử dụng tất cả các loại kháng sinh nhằm kích thích sinh trưởng trong chăn nuôi (EC, 2003)

Ở Mỹ hàng năm khoảng 6 triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh dùng trong chăn nuôi Trong ñó cho gia cầm khoảng 80%, 70% lợn, 70% bò sữa

Có khoảng 60% bò thịt ở Mỹ ñược nuôi dưỡng bằng thức ăn có bổ sung kháng sinh Người ta tính cứ một USD chi phí cho kháng sinh dùng trong thức ăn,

người chăn nuôi thu ñược lợi tức 2 - 4 USD (Ensminger và cs., 1990)

Theo số liệu của Viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh ñược sử dụng trong chăn nuôi năm 1999 khoảng 20,42 triệu pao (9270 tấn), trong

ñó kháng sinh nhóm Ionophore chiếm nhiều nhất (47,5%), tetracyclin (15,67%); penicillin (4,26%), các loại khác (32,57%) Trong số 20,42 triệu pao, có khoảng 2,8 triệu pao (13,7%) ñược dùng như chất kích thích sinh trưởng (Trần Quốc Việt, 2007)

Mỹ là nước ñầu tiên phát minh hiệu quả sử dụng kháng sinh làm chất kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi Chính vì vậy, Cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm (FDA) Mỹ ñã ban hành các qui ñịnh về việc cho phép sử dụng kháng sinh ñể kích thích tăng trọng từ năm 1951 Theo NRC, 1998, Mỹ và Canada ñã cho phép sử dụng 17 loại kháng sinh vào thức ăn cho lợn, trong ñó có

8 loại phải ngừng sử dụng trước khi giết mổ từ 5 – 70 ngày Liều lượng bổ sung thường rất thấp tuỳ theo loại kháng sinh, nhưng nếu sử dụng Chlortetracyclline hay Zinbacitracillin thì hàm lượng ñó là 30 ñến 40 ppm

Ở Anh và Pháp, trung bình 1 năm có khoảng 75% số ñộng vật ñược dùng kháng sinh ñiều trị và gần 60% vật nuôi ñược dùng kháng sinh ñể phòng bệnh Ở Anh, Tetracyclin là nhóm kháng sinh ñược sử dụng nhiều nhất ñể bổ sung vào thức ăn, chiếm hơn 50% tổng số kháng sinh (McEvoy, 2002)

Theo số liệu của Ghislain Follet (2000), năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn nuôi của các nước châu Âu là 10500 tấn (theo mức 100% tinh khiết), trong ñó 52% y tế sử dụng, 33% thú y dùng ñiều trị bệnh và 15% dùng như chất bổ sung vào TA chăn nuôi Tỷ lệ các loại kháng sinh ñược sử dụng trong chăn nuôi: penicillin: 9%; tetracycline: 66%; macrolid: 12%; aminoglycosid: 4%; (fluoro)quinolone: 1%; trimethomprim/sulphamide: 2% và các kháng sinh khác: 6%

Việc bổ sung kháng sinh với liều lượng thấp ñược xác nhận là cải thiện ñược các chỉ tiêu: tăng khối lượng sinh trưởng trên ngày do tăng hệ số chuyển hoá thức ăn (từ 2 ñến 6%) Rất nhiều thí nghiệm ñã khẳng ñịnh rằng khi bổ sung kháng sinh trong khẩu phần, lợn con ñã tăng khối lượng cao hơn ñối

Theo Lã Văn Kính và cs (2007), tỷ lệ sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ở nước ta là rất cao, 100% có oxytetracyclin, 67% có chloramphenicol (mặc dù thuốc này ñã bị cầm không ñược dùng trong ñiều trị), 30% có Olaquindox, 77% có Dexamethasol Bên cạnh ñó, hầu hết các cơ

sở chăn nuôi sử dụng kháng sinh trong việc phòng trị bệnh lại không hợp lý, không ngừng sử dụng thuốc theo ñúng quy ñịnh, thậm chí bán chạy khi ñiều trị không hiệu quả

Nghiên cứu của ðinh Thiện Thuật và cs (2003) ñã chỉ ra hiện có 82,89% trang trại nuôi lợn sử dụng kháng sinh không hợp lý, 40,13% ngừng sử dụng thuốc không ñúng Một vài loại thuốc kháng sinh dùng ñể phòng, trị bệnh hoặc kích thích tăng trọng như: zinc bacintracin, tetracycline, tyrosin, neomycin,… ñược khuyến cáo ngừng sử dụng cho gia súc trước khi giết mổ từ

14 - 42 ngày Thế nhưng, nhiều người chăn nuôi do hám lợi ñã cho vật nuôi ăn ñến lúc giết thịt (Xuân Hùng, 2004) Khoa Chăn nuôi Thú y Trường ðại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh (2003) ñiều tra 628 hộ chăn nuôi heo, gà cho thấy ña số người chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý: liều lượng cao, sử dụng liên tục ñể phòng ngừa bệnh cho gia súc cho ñến khi bán ñược

Ngoài ra, còn sử dụng các kháng sinh trong danh mục thuốc dùng trị bệnh nguy hiểm cho người Chắnh ựiều ựó sẽ tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc gây ảnh hưởng xấu ựến hiệu quả ựiều trị các bệnh nhiễm trùng trong cộng ựồng Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các hộ chăn nuôi trên ựịa bàn Hà Nội (Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) cho thấy kháng sinh thuộc hai nhóm Quinolones và Macrolides ựược sử dụng nhiều nhất với tỷ lệ tương ứng là 78,14% và 86,89% Các nhóm kháng sinh khác ựược sử dụng với tỷ lệ tương ứng là 54,92% (Polipeptides), 50,96% (Aminoglycosides), 46,58% (β-lactams), 46,58% (Tetracyclines), 22,27% (Sulfamides) đáng chú ý là kháng sinh nhóm Nitrofurans (ựặc biệt là Furazolidon) mặc dù ựã bị cấm trong chăn nuôi do có ựộc tắnh cao nhưng vẫn ựược các hộ chăn nuôi sử dụng với tỷ lệ 15,71%

Kết quả nghiên cứu của đậu Ngọc Hào và Chử Văn Tuất (2008), ở các trang trại chăn nuôi trên ựịa bàn tỉnh Hưng Yên cho biết có 60,3% mẫu thức

ăn lợn thịt và 70,3% mẫu TA gà thịt phát hiện thấy ắt nhất một trong số các loại kháng sinh kể trên Trong những mẫu phát hiện thấy kháng sinh, 1 mẫu

TA lợn thịt có hàm lượng tylosin vượt giới hạn cho phép khoảng 2 lần

2.3 VẤN đỀ TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ đỘNG VẬT

2.3.1 Tồn dư kháng sinh

Theo chỉ thị 86/469 của Uỷ ban Châu Âu Ộchất tồn dư là chất có tắnh

dược ựộng học và các chất chuyển hóa trung gian của chúng nguy hiểm ựến sức khỏe người tiêu dùngỢ

để bảo vệ người tiêu dùng, Ủy ban Châu Âu ựã quy ựịnh mức giới hạn tồn dư tối ựa (MRL Ờ Maximum Residue Limit) của từng loại kháng sinh cho phép sử dụng ựối với từng loại thực phẩm MRL là lượng kháng sinh cao nhất ựược phép tồn dư trong thực phẩm mà không ảnh hưởng ựến cơ thể người và

vật nuôi khi sử dụng sản phẩm ựó làm thức ăn Do ựặc ựiểm sinh lý, sinh thái, ựặc ựiểm dinh dưỡng, thói quen ăn uống của người dân từng nước nên MRL ựược quy ựịnh rất khác nhau ở các nước khác nhau

Giá trị MRL ựược xác ựịnh bởi 3 yếu tố:

- Lượng tối thiểu có tác dụng trên ựộng vật thắ nghiệm hay ựiều trị gây

ra hiệu quả ựược công nhận

- độ an toàn trong khoảng 1% hay thấp hơn, nếu ựược chấp nhận trong

y học, hoặc ựộ an toàn cao hơn 1%0 nếu có bất cứ bằng chứng nào cho thấy

có nguy cơ giống như các thắ nghiệm trên những hợp chất tương tự

- Các yếu tố ựể cân bằng các tỷ lệ trong các mô ở một khẩu phần ăn trung bình

Nói chung, không ựược dùng thực phẩm có tồn dư kháng sinh cao hơn MRL Lượng ăn hằng ngày chấp nhận là khoảng ước lượng của hàm lượng chất thêm vào trong thực phẩm, ựược tắnh theo thể trọng đó chắnh là lượng thức ăn hằng ngày có thể tiêu thụ trong suốt cuộc sống mà không gây một nguy hiểm nào cho sức khỏe

Cách tắnh lượng thức ăn hằng ngày chấp nhận ựược phụ thuộc vào chất gây ựộc Ảnh hưởng của chất gây ựộc ựược xác ựịnh thông qua nghiên cứu ựộc tắnh trên bộ gen, sinh ung thư, sai lệch về chức năng và ảnh hưởng trên hệ thống miễn dịch lẫn hoạt ựộng sinh dục

2.3.2 Tình hình tồn dư kháng sinh trong thịt

Rất nhiều nghiên cứu trên thế giới và trong nước ựã chứng minh rằng việc bổ sung kháng sinh vào thức ăn cho gia súc, gia cầm ựã có tác dụng cải thiện tốc ựộ tăng trưởng, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn, làm giảm bớt tỷ

lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết vật nuôi Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh sai nguyên tắc, không khoa học trong phòng trị bệnh cho gia súc, gia cầm ngoài việc làm xuất hiện các chủng vi sinh vật kháng thuốc còn gây tồn dư kháng

Oxytetracyclin, Tylosin, Dihydrotreptomycin (AIH, 2008)

Tại Bỉ và Hà Lan, tồn dư Doxycyclin thường gặp ở thịt gà, Oxytetracycline ở thịt bò, Oxytetracycline và Doxycycline ở thịt lợn (Okeman

và cs., 2001)

Hiện nay, EU quy ñịnh thực phẩm nhập khẩu vào Châu Âu có mức dư lượng kháng sinh bằng 0, nhưng thực phẩm họ ñang sử dụng và xuất ñi các nước khác lại không ñáp ứng ñược các quy ñịnh ñó Năm 2002 Trung tâm Dịch vụ phân tích và thí nghiệm thuộc Sở Khoa học – Công nghệ và môi trường thành phố Hồ Chí Minh phát hiện 6 loại thực phẩm ñóng hộp nhập khẩu từ EU và Mỹ có tồn dư kháng sinh ñang ñược bán tại thị trường Việt Nam (trong số 8 loại ñược kiểm nghiệm) Các loại thực phẩm có dư lượng là: thịt bò muối của Pháp (0,3 phần tỷ), cá trích trộn nước sốt ớt của ðức (0,4 phần tỷ) và cá ăn trộn dầu olive và muối (0,3 phần tỷ)

Nghiên cứu của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hàn Quốc (KFDA) trong năm 2006 cho biết, khoảng 40% các mẫu thịt ñược kiểm tra có tình trạng vi khuẩn kháng thuốc KFDA ñã tiến hành lấy mẫu 157 miếng thịt

bò, thịt gà; 35 miếng cá; 78 miếng thực phẩm ñã chế biến ñể kiểm tra sự kháng thuốc của vi khuẩn ñối với 15 loại kháng sinh khác nhau

Theo ðinh Thiện Thuật và cs (2003), kiểm tra 149 mẫu thịt, gan gà ở

tỉnh Bình Dương nghi ngờ tồn dư kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp cho thấy có 44,96% số mẫu tồn dư quá quy ựịnh (so với tiêu chuẩn của Malaysia), chloramphenicol chiếm tỷ lệ cao nhất (87,5%), tiếp theo là flumequine (83,33%), chlotetracycline (62,5%), amoxicilin (60%) Trong số

70 mẫu thịt kiểm tra có tới 42 mẫu có phát hiện tồn dư kháng sinh, trong ựó

25 mẫu vượt quá tiêu chuẩn EU quy ựịnh (Võ Trà An và cs., 2002)

Theo kết quả ựiều tra sơ bộ của Viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, có tới 75% số mẫu thịt và 66,7% số mẫu gan của gia súc, gia cầm bán tại các chợ có mức tồn dư kháng sinh vượt quá ngưỡng cho phép (Xuân Hùng, 2004)

Theo báo cáo của Cục Thú y năm 2006 tại đà Nẵng, kiểm tra 90 mẫu thịt lợn, bò, gà thấy 6 mẫu có chloramphenicol, trong ựó nhiều mẫu vượt quá giới hạn cho phép của EU với hàm lượng rất cao

Kháng sinh tồn dư trong thịt, gan, trứng gà tại Thái Nguyên chiếm tỷ lệ 19,04% Trong ựó, cao nhất là gan (28,57%), sau ựó ựến thịt (23,81%) và thấp nhất là trứng gà (4,76%) Tỷ lệ tồn dư kháng sinh tetracycline (23,81%); oxytetracycline (33,33%) và không phát hiện thấy chloramphenicol (Nguyễn Quang Tuyên, 2008)

2.3.3 Nguyên nhân gây tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm ựộng vật

Sự hiện diện dư lượng kháng sinh trong các sản phẩm có nguồn gốc từ ựộng vật có thể do việc không tuân thủ thời gian chờ sau khi dùng thuốc (Paige và Kent, 1987; Van Dresser và Wilcke, 1989, Paige, 1994), hoặc do sai sót trong việc quản lý của bác sỹ thú y hay người chăn nuôi hoặc do sai sót trong việc nhận diện các ựộng vật ựược ựiều trị (Sundlof, 1989) Việc sử dụng các loại chất thải của các ựộng vật ựang ựiều trị ựể nuôi các loại ựộng vật khác cũng có thể là nguyên nhân gây tồn dư một số nhóm kháng sinh trong

Một nguyên nhân khác là việc ô nhiễm các sản phẩm dùng chế biến thức

ăn gia súc Quan trọng là việc ô nhiễm này tuỳ thuộc vào dược lực học của hợp chất ô nhiễm và loài ñộng vật (McEvoy, 2002) Cũng có thể nhiễm vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh Tóm lại tồn dư kháng sinh trong thực phẩm bao gồm:

+ Kháng sinh cho vào thức ăn, nước uống với mục ñích phòng bệnh và kích thích tăng trọng

+ Kháng sinh dùng ñể chữa bệnh gia súc

+ Kháng sinh cho thêm vào thức ăn cho gia súc ñể bảo quản súc sản lâu hư

Có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục ñích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật ñể bảo quản thực phẩm Do vận chuyển sản phẩm ñi xa, cho kháng sinh vào thực phẩm ñể bảo quản Tất cả những nguyên nhân trên làm cho sản phẩm chăn nuôi, thủy sản tồn dư kháng sinh, có ảnh hưởng không tốt ñối với người tiêu thụ

2.3.4 Mối nguy cơ liên quan ñến tồn dư kháng sinh trong thực phẩm

2.3.4.1 Nguy cơ ñối với hệ vi sinh vật

Hiện tượng kháng thuốc xuất hiện từ thập kỷ 50 - 60 của thế kỷ trước,

ñột biến E.coli chỉ khoảng 10-7 (cứ 10.000.000 cá thể có một cá thể có khả năng phát sinh ñột biến tự nhiên) Vi khuẩn phân chia tế bào mỗi lần 40 phút, như vậy cứ 22 giờ mỗi tế bào ñột biến sẽ có 109 ñời con Qua một ngày ñêm, ñời con của tế bào ñột biến ñã tăng lên rất nhiều và tạo nên một dòng vi khuẩn mới (Bùi Thị Tho, 2003)

Tốc ñộ kháng thuốc và các loại thuốc bị kháng ñã ñược nhiều tác giả quan tâm Theo Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho nghiên cứu tính kháng kháng sinh

của E.coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng tại các tỉnh phía Bắc từ 1975 –

1995 cho thấy số chủng E.coli kháng streptomycin tăng dần từ năm 1975 - 1976

là 40%; năm 1985 – 1986 là 51% và 1995 – 1996 là 77,03%

Theo thông báo của WHO về mức ñộ kháng kháng sinh của các chủng

Acinetobacter và Shighella flexneri tại khu vực tây Thái Bình Dương cho thấy,

ñối với Acinetobacter tại Hàn Quốc và Singapo kháng lại kháng sinh với tỷ lệ

cao Một số thuốc ñược kiểm tra như Gentamycin kháng 10% ở Brunei tăng lên 78% ở Hàn Quốc, fluoroquinolon kháng 4,5% ở Nhật Bản tăng lên 64% ở Hàn

Quốc ðối với Sighella flexneri mức ñộ kháng kháng sinh cũng rất cao, với

Vấn đề kháng kháng sinh cịn là hết sức nguy hiểm đối với sức khoẻ con người, vì vi khuẩn kháng thuốc sẽ từ động vật gây bệnh cho người

Kháng sinh sử dụng khơng đúng nguyên tắc cịn phá hoại đến sự cân bằng đối với hệ vi sinh vật trong đường tiêu hố Các vi khuẩn mẫn cảm với thuốc sẽ bị tiêu diệt trong đĩ cĩ cả vi khuẩn cĩ lợi cho hệ tiêu hố; đặc biệt lại tạo cơ hội tốt cho vi khuẩn cĩ hại phát triển gây rối loạn quá trình tiêu hố, ảnh hưởng tới sức khoẻ của con người

2.3.4.2 Nguy cơ đối với sức khoẻ

Vấn đề tác hại của tồn dư kháng sinh trong sản phẩm cĩ nguồn gốc động vật ảnh hưởng tới sức khỏe con người đã được nhiều tác giả quan tâm

Theo Jones (1999), sự cĩ mặt của kháng sinh tồn dư trong thịt là khơng thể chấp nhận được Khoảng 5 - 10% dân số mẫn cảm đối với penicillin hoặc kháng sinh khác với biểu hiện dị ứng da, mệt mỏi, nơn, thậm chí sốc ngay ở nồng

độ thấp 1 ppb Chỉ với số lượng nhỏ chất kháng khuẩn cĩ thể dẫn đến sự thay đổi đáng kể tính kháng thuốc của tập đồn vi sinh vật trong đường tiêu hĩa

Kháng sinh cịn làm cho cơ quan phịng vệ bị rối loạn, khả năng miễn dịch bị thay đổi dẫn đến cơ thể bị suy nhược Do đĩ, trong thực tế, sau khi điều trị bằng kháng sinh, cơ thể bị tái nhiễm hoặc mắc bệnh khác sẽ rất khĩ điều trị Ngồi ra một số người nhạy cảm với một vài loại kháng sinh nào đĩ

có thể gặp ngay các phản ứng quá mẫn, dị ứng khi tiêu thụ các thực phẩm có tồn dư kháng sinh trên mức quy ñịnh trong một hoặc vài lần tiếp xúc ðiển hình như kháng sinh tổng hợp olaquindox (nhóm quinolones) có tác dụng phòng bệnh tiêu chảy lợn con và làm giảm mắc một số bệnh khác Khi người

ăn các sản phẩm ñộng vật có tồn dư olaquindox, nó sẽ tích luỹ trong cơ thể, lâu ngày sẽ gây ung thư da do dị ứng với ánh sáng (Lâm Thanh Vũ, 2008)

Kháng sinh còn gây ra những mối nguy hiểm tiềm tàng cho các thế hệ sau Nếu sử dụng kháng sinh nitrofurane trong thời gian mang thai có thể gây quái thai, dị dạng Nếu sử dụng kháng sinh chloramphenicol sẽ gây ra các biến chứng như ảnh hưởng ñến quá trình tạo máu, gây suy tuỷ, tỷ lệ quái thai cao,

dị ứng

Theo Black (1984), khả năng gây ñộc của kháng sinh trong thịt ñộng vật là rất thấp, ngoại trừ chloramphenicol - gây ñộc ở bất kỳ liều lượng nào

2.3.4.3 Nguy cơ ñối với môi trường

Kháng sinh vào cơ thể vật nuôi thông qua thức ăn hoặc bằng các con ñường khác ñều ñược thải ra môi trường Ảnh hưởng của việc thải kháng sinh ñến môi trường thể hiện ở các khía cạnh sau:

- Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật ñất

Quần thể vi sinh vật ñất có ý nghĩa rất quan trọng trong các chu trình chuyển hoá vật chất trong ñất và cải thiện ñộ phì của nhiêu của ñất Kháng sinh dù bằng con ñường nào ñược thải ra môi trường ñều phá vỡ sự cân bằng sinh thái hệ vi sinh vật và ảnh hưởng ñến ñộ phì của ñất, tăng ô nhiễm môi trường

- Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường Chất thải của vật nuôi khi ñiều trị hoặc nuôi dưỡng bằng các loại thức ăn

có kháng sinh, không chỉ gồm các cặn bã của quá trình tiêu hóa hấp thu mà còn chứa rất nhiều loài vi sinh vật kháng thuốc, nhất là các chủng vi khuẩn ña

kháng Chúng là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường

2.3.4.4 Nguy cơ ñối với công nghệ chế biến bảo quản

Kháng sinh còn ñược biết ñến trong việc gây trở ngại trong quá trình bảo quản chế biến thực phẩm.Với nồng ñộ 1 ppb của kháng sinh ñã có thể gây trì hoãn sự khởi ñầu tích cực của các vi sinh vật có lợi trong sản xuất bơ, pho mát, sữa chua Kháng sinh còn làm giảm bớt mùi, vị và ñộ axít trong các sản phẩm của việc bơ, làm giảm quá trình ñông tụ của sữa, ñồng thời nó cũng là nguyên nhân không thể chấp nhận ñược ñối với sự chín muồi của phomat (Jones, 1999) Sự có mặt của kháng sinh trong thịt gây nên những tác dụng ngoài mong muốn trong sản xuất xúc xích Ý và các sản phẩm lên men thịt khác

Như vậy, sử dụng kháng sinh cho ñộng vật, sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm có nguồn gốc ñộng vật chỉ là phần nổi của tảng băng tác hại, phần chìm của nó nguy hiểm hơn và ảnh hưởng lâu dài hơn, ñó chính là sự kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, mà ñiều nguy hiểm là sự kháng ñồng chủng loại kháng sinh dùng cho người và ñộng vật sẽ ảnh hưởng trực tiếp ñến sức khỏe cộng ñồng

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ðỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC ðỘNG VẬT

2.4.1 Phương pháp sàng lọc (Screening)

Các phương pháp ñược sử dụng ñể phát hiện sự hiện diện của một hoặc một nhóm chất ở một nồng ñộ quan tâm hay ñể phân biệt giữa các mẫu ñạt và không ñạt yêu cầu vệ sinh Trong chiến lược phân tích tồn dư, phương pháp sàng lọc thường ñược tiến hành trước khi ñịnh danh và ñịnh lượng chính xác Phương pháp sàng lọc hay ñược sử dụng nhất là test vi sinh vật Nguyên tắc của test này là dựa trên sự ức chế vi sinh vật của kháng sinh tạo vòng vô khuẩn trên ñĩa thạch Người ta có thể sử dụng mẫu ñặt trực tiếp lên ñĩa thạch

hoặc dùng dung dịch chiết tách từ mẫu nhỏ vào khoanh giấy thấm rồi ñặt lên

ñĩa thạch Test vi sinh vật có thể thiết kế theo các hướng:

- Sử dụng 1 chủng vi sinh vật ở cùng một ñiều kiện môi trường: test 1

ñĩa dùng chủng Bacillus subtilis (Test thận Bỉ)

- Sử dụng một chủng vi sinh vật nhưng ñiều kiện môi trường khác nhau

(pH khác nhau) như New Two Plate Test (Dang và cs, 2011)

- Sử dụng các chủng vi sinh vật khác nhau ở cùng ñiều kiện môi trường

- Sử dụng các chủng vi sinh vật khác nhau ở các ñiều kiện môi trường

khác nhau (pH khác nhau) ðiển hình là test 4 ñĩa Châu Âu (FPT- Four Plate

Test), test cải tiến test 4 ñĩa CPMA (Combined Plate Microbial Assay)

- Dựa vào phản ứng lên men, kết hợp với chỉ thị màu (Premi®test,

Delvo®test, Copan®test)

Các test vi sinh vật có nhiều ưu ñiểm: ñơn giản, dễ thực hiện, trang thiết

bị thông thường, phổ phát hiện rộng, tương ñối nhạy (tuỳ vào chủng vi sinh

vật và môi trường), tương ñối nhanh, rẻ tiền Tuy nhiên, phương pháp này vẫn

có những nhược ñiểm, cụ thể:

Một số test ñọc kết quả bằng màu, do ñó nếu màu gần giống nhau thì rất

khó phân biệt

Không ñặc hiệu, không ñịnh lượng ñược chất tồn dư

Một số chất (Chloramphenicol, Nitrofurane, Nitroimidasole) không phát

hiện ñược dù có nồng ñộ cao do các chủng vi sinh vật không mẫn cảm với

những chất này

Còn có ảnh hưởng của một số chất có trong mẫu như lysozim - một

enzyme có tác dụng diệt khuẩn có trong dịch sinh học của tế bào ñộng vật,

một số acid amin, các chất có tính bazơ hay các chất sát trùng, những chất này

có khả năng ức chế vi sinh vật dẫn tới cho kết quả dương tính giả

2.4.2 Hậu sàng lọc (Post screening)

Bước hậu sàng lọc nhằm mục ñích nhận diện nhóm kháng sinh, một số phương pháp có khả năng bán ñịnh lượng, gồm có các phương pháp:

- Sử dụng những chủng vi sinh vật chỉ thị mẫn cảm với từng loại kháng

sinh (test vi sinh vật ñặc hiệu): chẳng hạn sử dụng B.cereus K250 kháng với

tetracyclin ñể phát hiện tồn dư nhóm này trong thịt

- Test receptor có khả năng nhận biết ñặc hiệu một kháng sinh nào ñó: Tetrasensor nhận diện tetracycline, Twinsensor nhận diện β-lactams và tetracyclines, ROSA (Rapid One Step Assay) nhận biết β-lactams, sulfamethazine, tetracyclines và quinolones

- Test miễn dịch: Charm®test (sử dụng kháng sinh chuẩn có gắn phóng

xạ C-14 hoặc H3), ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay)

Các phương pháp hậu sàng lọc có ñộ ñặc hiệu cao, cho kết quả nhanh, có thể sử dụng các loại mẫu khác nhau, có thể bán ñịnh lượng và cho kết quả nhanh Tuy nhiên giá thành của các test này lại cao, có thể có phản ứng chéo dẫn ñến dương tính giả, hơn nữa còn ñòi hỏi kỹ thuật viên ñược ñào tạo với trình ñộ chuyên môn cao

2.4.3 Phương pháp khẳng ñịnh và ñịnh luợng chính xác

Mục ñích của phương pháp khẳng ñịnh là ñịnh lượng và ñịnh danh chính xác chất tồn dư Với những kháng sinh cấm sử dụng, việc kiểm soát tồn dư thường không qua bước sàng lọc mà có thể tiến hành ngay bằng phân tích khẳng ñịnh mà chủ yếu sử dụng các phương pháp lý hoá, gồm:

- Phương pháp sắc ký với nguyên tắc phân tách các hợp chất dựa vào sự

bố trí khác nhau giữ hai pha tĩnh và ñộng Pha tĩnh (rắn hoặc lỏng) ở trong cột, pha ñộng ñi qua nhờ mao quản

Có hai loại sắc ký là sắc ký khí (GC – Gas Chromatography) và sắc ký lỏng (LC – Liquid Chromattography) Hiện nay, sắc ký khí và sắc ký lỏng

thường ñược gắn với ñầu ñọc khối phổ (LC-MS) và sắc ký khí khối phổ MS) Ngoài ra còn có các dạng sắc ký khác như: Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC - Hight Performance Thin Layer Chromatography), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - Hight Performance Liquid Chromatography) và sắc

(GC-ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC – Ultra Performance Liquid Chromatography) Các phương pháp lý hoá rất nhạy và nhận diện ñược rõ ràng, ñịnh lượng ñược chính xác khánh sinh tồn dư và rất nhạy Nhưng còn có nhược ñiểm: ñòi hỏi quy trình rất phức tạp (từ khâu chuẩn bị, tách chiết, làm sạch mẫu, ñến khâu vận hành máy), thiết bị rất ñắt tiền, yêu cầu kỹ thuật viên chuyên nghiệp

2.5 MỘT SỐ QUY ðỊNH LIÊN QUAN ðẾN KIỂM SOÁT TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG CÁC SẢN PHẨM ðỘNG VẬT

2.5.1 Một số quy ñịnh trên thế giới

Trước những tác ñộng không mong muốn của kháng sinh, nhiều nước trên Thế giới ñã và ñang từng bước bãi bỏ, nghiêm cấm sử dụng kháng sinh bổ sung trong thức ăn chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gà nói riêng

Theo Vũ Duy Giảng (2007), năm 1986 Thụy ðiển là nước ñầu tiên trên thế giới áp dụng lệnh cấm sử dụng kháng sinh như một chất kích thích sinh trưởng trong chăn nuôi ðan Mạch cấm sử dụng Avoparcine vào năm 1995 và năm 1998 cấm sử dụng Virginiamycine Uỷ ban quốc gia về chăn nuôi lợn của ðan Mạch ñã có nhiều cuộc thảo luận và ra quyết ñịnh nghiêm cấm sử dụng kháng sinh như là chất kích thích sinh trưởng cho lợn vỗ béo, tháng 1 năm 2000 ñã cấm

sử dụng cho lợn ở tất cả các lứa tuổi

Australia bắt ñầu kiểm soát việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi từ khá sớm, những kháng sinh (fluoro)quinolone, chloramphenicol, colistine, carbadox không ñược phép sử dụng từ 1980, Nitrofurane không ñược phép sử dụng từ năm 1992

Trung Quốc cho phép sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi từ

1989, tuy nhiên chỉ cho phép sử dụng những kháng sinh nào không dùng ñể ñiều trị bệnh cho người, ñó là monensine, salinomycine, destomycine, bacitracine, colistine, kitasamycine, enramycine, virginamycine

Nga cũng chỉ cho phép sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ñối với những kháng sinh không dùng làm thuốc trị bệnh: bacitracine, grizine, flavomycine, virginamycine

Ủy ban châu Âu ñã ban hành Chỉ thị 96/23/EC ngày 29/4/1996 (EU, 1996) Chỉ thị này quy ñịnh về các biện pháp giám sát một số hóa chất và dư lượng của chúng trong ñộng vật và các sản phẩm ñộng vật Bên cạch ñó Ủy ban còn ban hành quy ñịnh việc sử dụng thuốc thú y cần tuân thủ giới hạn tồn

dư tối ña ñược quy ñịnh trong Chỉ thị số 2377/90/EC (EC, 1990 nay thay thế bằng Qui ñịnh 470/2009/CE); số 37/2010 Ngoài ra, ñể tăng cường kiểm soát tồn dư EU còn ban hành quyết ñịnh 2002/657/EC ngày 12/08/2002 liên quan ñến việc quy ñịnh hiệu lực và cách giải thích kết quả của phương pháp phân tích Hiện EU ñang thực hiện chính sách “dư lượng = 0” ñối với các chất kháng sinh bị cấm hoàn toàn và ngày càng hạ thấp ngưỡng dư lượng phát hiện trên cơ sở hiện ñại hóa thiết bị kiểm tra Mỗi khi nâng cấp thiết bị kiểm tra, dư lượng kháng sinh ở thịt gia súc, gia cầm nhập khẩu, EU lại hạ thấp ngưỡng Trên thực tế EU ñã hai lần hạ thấp ngưỡng phát hiện dư lượng ñối với Chloramphenicol: lần 1 vào năm 1999 (từ 1ppb xuống 0,1 ppb) và lần 2 vào năm 2001 (từ 0,1ppb xuống 0,003 ppb)

Gần ñây Bộ Lương thực, Nông, Lâm, Ngư nghiệp Hàn Quốc ñã cấm sử dụng 7 loại kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi bao gồm: penicillin, neomycin, chlortetracycline, colistin, oxytetracycline, lincomycin, bacitracin zinc Với ñộng thái này, Hàn Quốc ñã tiến một bước lớn trong việc bảo vệ sức khoẻ con người Bắt ñầu từ năm 2009, các thuốc kháng sinh ñược sử dụng

phổ biến trong trị bệnh sẽ không còn ñược phép sử dụng trong nuôi gia súc, gia cầm và thuỷ sản Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hàn Quốc (KFDA) cho biêt, quyết ñịnh này ñược ñưa ra trước tình trạng lạm dụng quá mức kháng sinh trong quá trình nuôi gia cầm, gia súc và thuỷ sản Sự lạm dụng này có thể giúp vi khuẩn tăng khả năng kháng thuốc, ñe doạ ñến sức khoẻ của con người khi ăn các loại thực phẩm từ ñộng vật nuôi ðại diện của KFDA cho biết, việc sử dụng thường xuyên chỉ với một lượng nhỏ các chất kháng sinh cho ñộng vật sẽ dẫn tới những tác dụng phụ giúp vi khuẩn tăng khả năng kháng thuốc chứ không hề làm chúng chết Tuy nhiên, KFDA vẫn cho phép sử dụng kháng sinh ñể trị bệnh cho vật nuôi Theo tờ The Korea Times, các nhà chức trách ñã công bố danh sách gồm 7 loại kháng sinh bị cấm sử dụng

2.5.2 Một số quy ñịnh ở Việt Nam

Trong vài năm gần ñây, Chính phủ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn nước ta ñã ban hành những văn bản quy ñịnh về sản xuất, kinh doanh, sử dụng thuốc và hóa chất nhằm ñáp ứng những quy ñịnh ngày càng nghiêm ngặt

về VSATTP, cụ thể:

+ Quyết ñịnh ban hành quy trình thực hành chăn nuôi tốt cho chăn nuôi gia cầm an toàn (Bộ NN&PTNT – Qð – 1504/BNN – KHCN, ngày 15/05/2008)

+ Quyết ñịnh số 29/2002/QDD/BNN-TY ngày 24/04/2002 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn về việc cấm một số hóa chất trong nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh, và sử dụng thuốc thú y

+ Quyết ñịnh số 03/2006/Qð-BNN ngày 12/01/2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn về việc công bố danh mục thuốc thú y ñược phép sản xuất, xuất khẩu, ñóng gói lại, nhập khẩu, lưu hành, sử dụng và hạn chế sử dụng ở Việt Nam

+ Quy chuẩn kỹ thuật QCVN 01 - 10: 2009/BNNPTNT ñược ban hành

theo Thông tư số 81/2009/TT-BNNPTNT ngày 25/12/2009 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, quy ñịnh giới hạn về hàm lượng kháng sinh, hóa dược, vi sinh vật và kim loại nặng tối ña cho phép trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà (gà sinh sản, gà thịt)

+ Nghị ñịnh của Chính phủ: Quy ñịnh chi tiết thi hành một số ñiều của pháp lệnh thú y Số 33/2005/Nð – CP ngày 15/03/2005

+ Thông tư số 30/2009/TT – BNN ngày 24/06/2009 Ban hành quy ñịnh kiểm tra, giám sát vệ sinh thú y ñối với sản xuất, kinh doanh sản phẩm ñộng vật, giết mổ ñộng vật làm thực phẩm

+ Chỉ thị số 37/2005/CT-TT ngày 28/10/2005 của Thủ tướng Chính phủ

về một số biện pháp tăng cường quản lý hóa chất, kháng sinh dùng cho sản xuất, kinh doanh thực phẩm

+ Thông tư 20/2010/TT-BNNPTNT ngày 02/04/2010, Bổ sung, sửa ñổi Thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 17/3/2009 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT ban hành Danh mục thuốc, hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng (Phụ lục I và II)

PHẦN III ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðỐI TƯỢNG

Các nông hộ, trang trại chăn nuôi gà, các ñiểm kinh doanh thuốc thú y

và thịt gà ñược bán tại một số chợ ở Hải Phòng

3.2 NỘI DUNG

Trong ñề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

3.2.1 Tỉnh hình phát triển chăn nuôi ở Hải Phòng

- Các phương thức chăn nuôi hiện ñang ñược áp dụng tại Hải Phòng

- Tình hình phát triển ñàn gia cầm của tỉnh Hải Phòng

3.2.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà ở Hải Phòng

- Một số ñặc ñiểm kinh doanh thuốc thú y trên ñịa bàn Hải Phòng

- Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm ở Hải Phòng

3.2.3 Kết quả phân tích mẫu thịt gà ñược lấy tại các chợ ở Hải Phòng

- Kết quả phân tích sàng lọc

- Kết quả phân tích ñặc hiệu ñịnh nhóm tetracyclin và (fluoro)quinolon

- Kết quả phân tích khẳng ñịnh nhận diện và ñịnh lượng tồn dư nhóm tetracycline, (fluoro)quinolon và chloramphenicol trong thịt gà

3.3 NGUYÊN LIỆU

+ Mẫu “trắng” sử dụng trong nghiên cứu này là mẫu thịt gà ñược nuôi

hoàn toàn bằng thóc và ngô chắc chắn không chứa kháng sinh trong hai tháng

+ Hóa chất môi trường và chủng vi sinh vật (VSV) dùng ñể sàng lọc kháng sinh (chi tiết ở phần 3.3.1)

+ Kít phân tích ñặc hiệu dùng ñể ñịnh nhóm (Tetrasensor® ñể phát hiện tetracycline và ELISA ñể phát hiện nhóm (fluoro)quinolon (chi tiết ở phần 3.3.2)

3.3.1 Dụng cụ và nguyên vật liệu dùng ñể sàng lọc kháng sinh (screening)

+ Các dụng cụ, thiết bị cần thiết dùng trong phân tích và nuôi cấy VSV + Hệ thống bay hơi bằng khí Nitơ, ñĩa Petri vô trùng (ñường kính 90

mm), ñĩa giấy (Roth, Art KA 10.1) ñường kính 12,7 mm

* Hoá chất: Glucose, NH4OH 2M, HCL 1M, NaOH 1%, Methanol, hỗn hợp Acetonitrile/Acetone (70/30 v/v), Trimethoprim (TMP), PABA (para – aminobenzoic acid)

* Giống vi sinh vật: Bacillus subtilis BGA dạng huyền phù 107

spores/ml (Merck, 1.10649, Damstadt, Germany)

* Môi trường nuôi cấy: Agar test for inhibition test pH6 (Merck,

1.10663, Damstadt, Germany) và Standard II Nuitrient Agar for microbiology

pH 7,5 (Meck 1.07883, Damstadt, Germany) Môi trường ñược chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sau khi thêm ñường Glucose với tỷ lệ 0,6% Mỗi

ñĩa Petri ñược láng 8ml môi trường ñã ñược trộn B subtilis với tỷ lệ 0,1%

Cân 25g môi trường và 6g ñường Glucose hoà tan vào 1 lít nước cất, ñun sôi và khuấy ñều liên tục Sau ñó chia ra các bình tam giác nhỏ, ñem hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút, ñể nguội tới nhiệt ñộ 40 – 45oC Trộn dung

dịch giống vi khuẩn vào theo tỉ lệ 100µl B.subtilis BGA dạng huyền phù vào

100ml môi trường, lắc ñều Hút 8ml môi trường ñã trộn VSV vào ñĩa Petri Sau khi thạch ñể ñông cứng ñược bao gói và bảo quản ở 4oC tối ña 1 tuần

* Qui trình tách chiết kháng sinh từ mẫu thịt

Qui trình tách chiết ñược thích ứng từ phương pháp Premi-Test (Stead

và cs., 2004; Dang và cs, 2011) Kháng sinh trong mẫu ñược tách chiết từ 12

gam thịt gà trong hỗn hợp Acetonitrile/Acetone (70/30 v/v) Các mẫu tách chiết ñược lắc ñảo ñầu trong 10 phút, sau ñó ñược ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 15°C Lớp trên ñược cho vào hai ống nghiệm thủy tinh khác nhau (ống thứ nhất chứa 115 µl và ống thứ hai chứa 285 µl), sau ñó làm bay hơi ñến khô Phần chất khô còn lại trong hai ống sau khi bay hơi ñược thu hồi trong 115µl nước cất ñối với ống thứ nhất và 285µl methanol ñối với ống thứ hai Phần tách chiết tiếp tục ñược ly tâm như trên và 50 µl lớp trên trong mỗi ống ñược nhỏ lên một ñĩa giấy ñể phân tích khả năng ức chế trên hai môi trường pH6 và pH7,5 (Sơ ñồ 1)

Sơ ñồ 3.1 Sơ ñồ ñặt ñĩa phương pháp hai ñĩa mới (Dang và cs, 2011)

S+

TMP

S+ TMP +PABA

S và Sw: 50µl dung dịch mẫu thu hồi sau khi

bay hơi trong lần lượt Methanol và nước

Na: 20µl NaOH 1%

TMP: 10µl Trimethoprim 10µg/ml PABA: 10µl PABA 100µg/ml

ðĩa Petri II (pH 7.5) ðĩa Petri I

(pH 6)

* Cách ñọc và diễn giải thích kết quả

Kết quả sàng lọc ñược ñọc theo hướng dẫn của Dang và cs (2011) (bảng 3.1)

Bảng 3.1 Bảng diễn giải kết quả phương pháp hai ñĩa mới

ðĩa 1 ðĩa 2 ðĩa 3 ðĩa 4 ðĩa 5 ðĩa 6 ðĩa 7 Kết luận sàng lọc

+ - hoặc↓ + - hoặc↓ - hoặc ↓ -hoặc+ - hoặc+

Nghi ngờ chứa tetracyclines hoặc Oxolinic acid hoặc Flumequine

lysosim

+hoặc± + hoặc↑ +hoặc± + hoặc↑ - hoặc + -hoặc+ - hoặc +

Nghi ngờ chứa các loại kháng sinh khác trừ β-lactam và tetracyclin

Chú thích: -: không xuất hiện vòng vô khuẩn +: vòng vô khuẩn có ñộ rộng ≥1,5 mm

↑ và ↓: ñộ rộng vòng vô khuẩn lớn hơn hoặc bé hơn so với ñĩa bên cạnh cùng môi trường

3.3.2 Kít ñặc hiệu phát hiện tồn dư kháng sinh

* Kít Tetrasensor®: do Unisensor, S.A, Liège, Vương quốc Bỉ sản xuất là kít dạng que thử nhanh, dễ thực hiện có ngưỡng phát hiện kháng sinh nhóm Tetracycline là 20 ppb

Mẫu ñược tách chiết theo qui trình ñơn giản và thử theo hướng dẫn của nhà sản xuất kèm theo kít (sơ ñồ 2)

* Kít (Fluoro)quinolones 2 hours (E.G.3): là kít ELISA phát hiện các kháng

sinh nhóm quinolone do Phòng thí nghiệm CER-Marloie, Vương quốc Bỉ

cung cấp Kít có khả năng phát hiện tốt ñại ña số các kháng sinh nhóm

quinolone trong thịt

Sơ ñồ 3.2 Qui trình tách chiết mẫu và ñọc kết quả của kít Tetrasensor 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Phương pháp ñiều tra

- Thông tin thứ cấp về tình hình phát triển chăn nuôi và dịch bệnh trên ñàn gà nuôi tại Hải Phòng trong những năm gần ñây ñược thu thập từ các nguồn dữ liệu báo cáo tổng kết của Phòng Chăn nuôi, Sở Nông nghiệp và Chi cục thú y Hải Phòng

- ðặc ñiểm kinh doanh thuốc thú y ñược tổng hợp từ biểu mẫu thông tin thu thập trực tiếp từ 12 ðại lý cấp 1 các cửa hàng thuốc thú y ở Hải Phòng

- Tình hình sử dụng kháng sinh ñược thu thập thông qua phỏng vấn bằng bộ câu hỏi với nội dung ñược soạn trước, tiến hành phỏng vấn trực tiếp các hộ và trang trại ñại diện thuộc ba huyện rất phát triển chăn nuôi gà ở Hải Phòng (Tiên Lãng, Vĩnh Bảo và Thuỷ Nguyên) về các loại kháng sinh ñược

sử dụng, tính an toàn và cơ sở của việc chọn lựa kháng sinh Bảng 3.2

Bảng 3.2 Dung lượng mẫu ñiều tra tại các ñịa phương ñại diện

ở Hải Phòng ðại diện các hình thức

nuôi (hộ)

ðại lý phân phối thuốc (ñại lý)

Loại hình

cơ sở chăn nuôi

3.4.2 Phương pháp phân tích tồn dư kháng sinh

3.4.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu ñược lấy theo TCVN 4833-2002 Nguyên tắc chung: Lấy mẫu ñơn

lẻ, ngẫu nhiên và mang tính ñại diện

Bảng 3.3 Dung lượng mẫu thịt gà ñược lấy trên ñịa bàn Hải Phòng

ðịa phương Hình thức phân

3.4.2.2 Chiến lược phân tích mẫu

* ðối với các kháng sinh có qui ñịnh giới hạn tồn dư tối ña

Tất cả các mẫu thu thập ñược trải qua bước phân tích sàng lọc bằng phương pháp vi sinh vật NTPT (New Two Plate Test) (Dang và cs, 2011) ñể phát hiện các mẫu nghi ngờ Các mẫu nghi ngờ này sau ñó ñược phân tích bằng phương pháp hậu sàng lọc (post-screening) ñể nhận diện các nhóm kháng sinh cần tìm Cuối cùng các mẫu dương tính với phương pháp hậu sàng lọc ñược phân tích khẳng ñịnh bằng phương pháp lý hóa

Theo kết quả ñiều tra, các kháng sinh thuộc nhóm (fluoro)quinolone và tetracyclines là hai nhóm ñược sử dụng tương ñối phổ biến trong chăn nuôi

gà, tetracycline vừa ñược sử dụng ñể phòng trị bệnh vừa ñược sử dụng như chất kích thích sinh trưởng, trong khi các quinolon chủ yếu dùng trong phòng trị bệnh Vì lý do ñó, trong khuôn khổ nghiên cứu này các mẫu dương tính sau bước sàng lọc ñược phân tích bằng phương ñặc hiệu pháp hậu sàng lọc (Tetra-Sensor® Test dùng ñể phát hiện tetracycline và ELISA ñể phát hiện các (fluoro)quinolones) Các mẫu dương tính khi phân tích bằng phương pháp ñặc hiệu tiếp tục ñược phân tích khẳng ñịnh bằng phương pháp Sắc ký khối phổ (LC-MS) (Sơ ñồ 3)

Sơ ñồ 3.3 Chiến lược phân tích dư lượng kháng sinh trong thịt gà ñược

lấy tại các chợ Hải Phòng

* Kít Tetrasensor: là kít receptor ñặc hiệu dạng que thử ñể sàng lọc nhanh

sự hiện diện của tetracycline tồn dư trong thịt (ngưỡng phát hiện là 20 ppb) ñược cung cấp bởi Unisensor, S.A (Wandre, Liege, Vương Quốc Bỉ)

Kháng sinh trong 5 gam mẫu ñược tách chiết trong dung dịch ñệm (cung cấp kèm theo kít) nhờ vào hệ thống ñồng nhất stomacher Sau 2 phút, ñồng nhất mẫu, lấy 2 ml huyễn dịch ñược ly tâm ở 20 000 vòng/phút trong 1 phút Hút 200 µl lớp trên nhỏ vào các giếng chứa receptor, lắc lều cho ñến khi tan hết Sau ñó nhúng que thử vào các giếng và ủ ở nhiệt ñộ phòng 10 phút Khi hỗn hợp dung dịch mẫu và receptor trong các giếng ngấm vào que thử qua vạch mầu xanh, màu ñỏ sẽ xuất hiện Vạch thứ nhất giữ lại các receptor từ giếng thử lên và vạch thứ 2 sẽ kết hợp với một phần thừa sau khi ñã bị giữa lại ở vạch

LC-MS LC-MS

Phân tích khẳng ñịnh tồn dư tetracyclines

Mẫu nghi ngờ chứa Quinolon (≥ LOD)

Mẫu ñạt yêu cầu (< LOD)

Tetrasensor

Mẫu nghi ngờ Mẫu ñạt yêu cầu

Phân tích khẳng ñịnh tồn dư quinolon