Luận văn nghiên cứu sự phát triển của trứng dê trong ống nghiệm tại việt nam

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NễNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
 -

GIANG HOÀNG HÀ

NGHIấN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CỦA TRỨNG Dấ

TRONG ỐNG NGHIỆM TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ NễNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: ts Nguyễn hữu đức

Khoa Cụng nghệ sinh học – Trường ðHNN Hà Nội

Hà Nội - 2011

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất

kì công trình nghiên cứu nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Giang Hoàng Hà

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hữu đức, Phó Trưởng Khoa Công nghệ sinh học Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã tận tình hướng dẫn, góp ý và giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Thanh, Trưởng Bộ môn Ngoại Sản Ờ Khoa Thú y và toàn thể các Thầy, Cô giáo thuộc Bộ môn Ngoại Sản, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội nơi tôi ựăng ký sinh hoạt ựã tận tình hướng dẫn và giúp ựỡ, cung cấp thông tin cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu ựể hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các Thầy, Cô giáo và anh chị em kỹ thuật trong phòng thắ nghiệp của Khoa Công nghệ sinh học ựã hướng dẫn và giúp ựỡ tôi thực hiện ựề tài trong phòng thắ nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ựỡ nhiệt tình của ông Nguyễn Văn

Võ, chủ lò mổ dê thuộc quận Long Biên, Hà Nội và toàn thể anh chị em công nhân của lò mổ trong việc lấy mẫu trứng dê phục vụ nghiên cứu

Tôi xin chân trọng cảm ơn Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện đào tạo Sau ựại học, các Thầy, Cô giáo Khoa Thú y ựã tạo ựiều kiện, ủng hộ

và giúp ựỡ trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin trân thành cảm ơn sự hậu thuẫn, tạo ựiều kiện và giúp ựỡ, ựộng viên về mọi mặt của gia ựình và bạn bè trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn

Giang Hoàng Hà

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… iii

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

COCs Cumulus Oocyte Complexes

EGF Epidermal Growth Factor

EGS Estrous Goat Serum

FBS Fetal Bovine Serum

FCS Fetal Calf Serum

FF Follicular Fluid

FSH Follicular Stimulating Hormon

HCG Human Chorionic Gonadotropin

MI, MII Metaphase I, II

PBS Phosphate Buffered Saline

TCM199 Tissue Culture Medium 199

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… v

MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC BIỂU ðỒ viii

PHẦN 1 MỞ ðẦU 1

1.1 Mục tiêu và cách tiếp cận của ñề tài 4

1.2 Tính cấp thiết của ñề tài 5

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

2.1 ðặc ñiểm và khả năng sinh sản của con dê 7

2.2.Các yếu tố trong việc nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm 11

2.2.1 ðiều kiện nuôi 11

2.2.2 Môi trường nuôi 12

2.2.3 Các chất bổ sung vào môi trường nuôi 13

2.3 Một số phương pháp sử dụng ñể nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm 18

2.3.1 Các phương pháp khai thác trứng 18

2.3.2 Phân loại chất lượng trứng 20

2.3.3 Phương pháp nuôi trứng in vitro và ñánh giá sự thành thục 22

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 24

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 24

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 30

PHẦN 3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 ðối tượng và nội dung, ñịa ñiểm nghiên cứu 32

3.1.1 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu 32

3.1.2 Nội dung nghiên cứu 32

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ vi

3.1.3 địa ựiểm nghiên cứu 32

3.2 Phương pháp nghiên cứu 33

3.2.1 Tiêu chắ lựa chọn phương pháp 33

3.2.2 Thu và bảo quản buồng trứng dê Cỏ 33

3.2.3 Thu trứng từ buồng trứng 33

3.2.4 Nuôi thành thục trứng in vitro 34

3.2.5 Phân tách lớp tế bào cumulus 36

3.2.6 đánh giá sự thành thục của trứng dê 37

3.2.7 Xử lý số liệu 37

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Nghiên cứu các ựiều kiện thắch hợp ựể thu và bảo quản buồng trứng 38

4.2 Nghiên cứu khả năng khai thác trứng dê từ buồng trứng 40

4.3 Nghiên cứu phân loại, ựánh giá và nâng cao chất lượng trứng dê trước và sau nuôi in vitro 41

4.3.1 Ảnh hưởng của nồng ựộ enzym Hyaluronidaza 43

4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt ựộ môi trường 45

4.3.3 Ảnh hưởng của tác ựộng cơ học ựến thời gian xử lý với enzym Hyaluronidaza 46

4.3.4 Biến ựộng của thời gian làm sạch các lớp tế bào cumulus 48

4.4 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của FSH và nồng ựộ khắ CO2, O2 trong tủnuôi ựến trứng dê nuôi trong ựiều kiện in vitro 50

4.4.1 Ảnh hưởng của nồng ựộ FSH 50

4.4.2 Ảnh hưởng của nồng ựộ Oxy 54

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 57

5.1 Kết luận 57

5.2 đề nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 65

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ bảo quản ñến tỉ lệ trứng dê thành thục

in vitro 38

Bảng 2 : Mức ñộ phân rã của lớp tế bào cumulus trong môi trường

Bảng 3: Mức ñộ phân rã của lớp tế bào cumulus trong TCM199-Hepes

Bảng 4: Kết quả tách lớp tế bào cumulus bằng cách kết hợp sử dụng

enzym Hyaluronidaza và tách cơ học ở các khoảng thời gian khác nhau 47

Bảng 6 Tỷ lệ thành thục của trứng dê nuôi trong môi trường TCM199

với các nồng ñộ FSH khác nhau 52

Bảng 7 Tỷ lệ thành thục của trứng dê nuôi trong hai môi trường có

nồng ñộ oxy khác nhau 54

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… viii

DANH MỤC BIỂU ðỒ

Biểu ñồ 1: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ bảo quản ñến tỉ lệ trứng dê thành

thục in vitro 39

Biểu ñồ 2 Mức ñộ phân rã trung bình của lớp tế bào cumulus trong môi

trường TCM199-Hepes có nồng ñộ enzym Hyaluronidaza khác nhau 44

Biểu ñồ 3 Mức ñộ phân rã của lớp tế bào cumulus trong

TCM199-Hepes có bổ sung enzym Hyaluronidaza tại các nhiệt ñộ khác nhau 46

Biểu ñồ 4: Kết quả tách lớp tế bào cumulus bằng cách kết hợp sử dụng

enzym Hyaluronidaza và tách cơ học ở các khoảng thời gian khác nhau 47

Biểu ñồ 6 Tương quan tỷ lệ thành thục của trứng dê nuôi trong môi

Biểu ñồ 7 Tương quan tỷ lệ thành thục của trứng dê nuôi trong hai ñiều

kiện oxy khác nhau 55

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 1

PHẦN 1 MỞ đẦU

Chăn nuôi dê ựã ựược chú trọng phát triển từ rất lâu trên thế giới Từ khoảng 2000 Ờ 6000 năm trước công nguyên ở vùng núi Tây Á, dê ựã ựược con người thuần hóa từ dê rừng (Nguyễn đình Rao và cs, 1979) nhằm mục ựắch cung cấp thịt, lông, daẦCon dê ựã gắn bó với người nông dân từ rất lâu

ựó cho ựến nay vẫn ựược coi là con vật của người nghèo bởi lẽ chúng là loài Ộ

ăn lá cây, uống nước lã và hắt khắ trờiỢ (Nguyễn Văn Thanh) Chăn nuôi dê không những ắt vốn mà còn dễ chăm sóc bởi lẽ chúng rất ắt bị bệnh, dễ thắch nghi mà sản phẩm bán ra lại khá ựược giá Theo thống kê năm 2004 của FAO cho biết: sản lượng thịt các loại của toàn Thế giới ựạt 249.851.017 tấn, sản lượng thịt dê ựạt 4.0910190 tấn (chiếm 1,64 % tổng sản lượng) Khu vực các nước ựang phát triển là nơi sản xuất nhiều thịt dê nhất (3.903.357 tấn - chiếm 95,4% tổng sản lượng), tập trung chủ yếu ở Châu Á (3.003.742 tấn - chiếm 73,42%) Nước cung cấp nhiều thịt dê nhất là Trung Quốc (1.518.081 tấn),

Ấn độ (473.000 tấn), Pakistan (373.000 tấn) Sản lượng sữa các loại trên toàn Thế giới ựạt 600.978.420 tấn, trong ựó sữa dê là 11.816.315 tấn (chiếm 1,97%), tập trung ở các nước ựang phát triển (9.277.942 tấn - 78,52%), ựứng ựầu là Ấn độ (2.610.000 tấn), Bangladesh (1.312.000 tấn), Pakistan

(1.312.000 tấn) Thế giới còn cung cấp 824.654 tấn da (trong ựó Châu Á,

Nam Thái Bình Dương ựóng góp 421.673 tấn - chiếm 51,13%), 103.210 tấn

lông Hiện nay, Ủy ban thịt và gia súc Anh cho biết, sức tiêu thụ thịt trên thế

giới sẽ tăng 35% từ năm 2000 ựến năm 2010 do số người tiêu thụ thịt tăng lên 2,7 tỷ vào năm 2010, tập trung ở các nước ựang phát triển Tiêu thụ thịt dê, cừu dự ựoán sẽ tăng lên trong các nước E.U trong khi tiêu thụ thịt bò, gia cầm

và thịt lợn lại giảm xuống[16]

Trong khi ựó ở Việt Nam, mặc dù ựiều kiện thời tiết, khắ hậu và môi trường ở ựây rất thuận lợi cho việc chăn nuôi dê và tuy dê cũng ựã ựược nuôi

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 2

từ rất lâu nhưng ñều mang tính chất nhỏ lẻ, manh mún và tự phát Giống dê chỉ ñơn ñiệu có 2 loài là dê ñịa phương (dê Cỏ) và dê Bách thảo Mãi ñến năm

1991 mới ñược quan tâm nghiên cứu

Những năm gần ñây ngành chăn nuôi dê nước ta ñã tăng cả về mặt số lượng và chất lượng, thịt dê ñược xem là loại thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao, hàm lượng cholesterol thấp (dê cỏ: 167,66±1,45 mg/100g thịt, dê lai Cỏ x Bách thảo: 125±2,88 mg/100g, dê Boer x F1 (Bách thảo x Cỏ): 115±2,88 mg/100g (Nguyễn Bá Mùi, 2011) rất tốt cho sức khỏe của con người Sự tăng giá thịt dê hơi trên thị trường do nhu cầu, thị hiếu người tiêu dùng trong nước ñang ngày càng tăng, năm 1996 giá thịt hơi chỉ 8000 ñ/kg, ñến năm 2003 ñã tăng lên 23.000ñ/kg (cao hơn gần gấp ñôi so với thịt lợn (11.000 - 12.000 ñ/kg thịt hơi) và ñến năm 2005 giá thịt dê lên ñến 35.000 ñ/kg Năm 2010, Nguyễn Bá Mùi ñiều tra tại Yên Bái cho thấy, giá thịt dê hơi tăng từ 45000 ñ/kg tới 60000 ñ/kg ðến năm 2011 tăng lên 70000 ñ/kg, trong khi ñó giá lợn hơi năm 2010 nằm trong khoảng 30000 – 35000 ñ/kg, năm 2011 nằm trong khoảng 40000 – 50000 ñ/kg (Nguyễn Bá Mùi, 2011) Tại Ninh Bình năm

2011, giá dê hơi ñã tăng lên 100000 ñ/kg Tập quán sử dụng sản phẩm từ chăn nuôi dê (thịt, sữa) ñã ñược hình thành Nhu cầu tiêu thụ về sữa tươi cũng ñược tăng lên vì sữa dê ñã ñược khoa học và người tiêu dùng công nhận giá trị cao

về dinh dưỡng, giá của sữa dê năm 2001 là 7000 ñồng/lít (cao hơn sữa bò

3000 ñồng/lít) Hiện tại giá sữa dê là 16.000 ñồng/lít (Hà Nội) và 20.000 ñ/lít (TP Hồ Chí Minh) (cao hơn sữa bò 9.000 – 13.000ñ/lít) ðây là ñộng lực mới, mạnh ñể thúc ñẩy mạnh tiến trình cải tạo ñàn, tăng qui mô ñàn, số lượng ñàn và công nghệ chế biến sản phẩm[16] Tuy vậy, ngành chăn nuôi dê ở nước ta vẫn còn nhỏ lẻ, chưa thực sự xứng tầm với tiềm năng của nó

Về vấn ñề ứng dụng công nghệ sinh học trong chăn nuôi, trên thế giới cũng như ở Việt Nam ñang tập chung sức lực lớn vào vấn ñề này và ñã gặt hái

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 3

ựược rất nhiều thành công đã có nhiều sản phẩm ựộng vật ựược tạo ra, mở màn là sự ra ựời của chú thỏ năm 1959 bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm Sau ựó là việc ra ựời của cô bé người Anh: Louise Brown, sinh ngày 25/7/1978 do Robert Edward thực hiện thụ tinh ống nghiệm

Công nghệ sinh học cũng ựã mang lại những thành công lớn trong lĩnh vực y học (y sinh học), nhờ công nghệ sinh học mà con người ựã có thể sử dụng ựộng vật như các nhà máy sản xuất protein dược phẩm phục vụ cho ngành y (có thể sản xuất hàng loạt các loại kháng thể ựặc hiệu chống lại một

số bệnh nguy hiểm như bệnh dại, bệnh uốn vánẦ), có thể giúp ựỡ những người không có khả năng có con có thể có con Hơn nữa, con người cũng có thể tạo ra các mô bào có khả năng thay thế từ chắnh cơ thể vật chủ ựó dựa vào việc biệt hóa các mô tế bào gốc lấy từ máu, dây rốnẦựể sử dụng khi cần thiết ựảm bảo sự an toàn cao Cũng nhờ công nghệ này mà con người có thể bảo tồn và nhân nhanh các nguồn gen quý phục vụ công tác bảo tồn (ựộng vật sắp

bị tuyệt chủng) và sản xuất (các cá thể ựộng vật có năng suất cao), cho ra các sản phẩm có chất lượng cao (sữa có hàm lượng ựạm caoẦ), số lượng nhiều

và giá thành hạ động vật chuyển gen ựược tạo ra với các mục ựắch khác nhau

là nguồn nguyên liệu không thể thiếu ựể cung cấp cho ngành y dược phẩm phục vụ con người

Vì những lý do trên mà việc tạo ra các trang trại y sinh học (Biomedical farm) trên thế giới cũng như ở Việt Nam là rất cần thiết

Ở Việt Nam những năm gần ựây, công nghệ sinh học mà ựặc biệt là công nghệ phôi cũng ựã ựược chú trọng nghiên cứu và cũng ựã cho ra ựời ựược rất nhiều thành tựu như việc tạo ra ựược 6 bê thụ tinh ống nghiệm từ công nghệ nuôi cấy phôi năm 2005 (Nguyễn Hữu đức, 2005), tạo ra thỏ chuyển phôi năm 1979, chuột bạch chuyển phôi năm 2004[17] Công nghệ phôi trên con dê ở Việt Nam chỉ có rất ắt tác giả ựề cập tới, Nguyễn Hữu đức và cs ựã thành công trong quá trình sử dụng enzym Hyaluronidaza kết hợp với dùng phương pháp cơ học ựể

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 4

tách các lớp tế bào cumulus ra khỏi trứng dê ñã ñược nuôi thành thục (Nguyễn Hữu ðức và cs, 2011) Chính vì vậy, vấn ñề nghiên cứu công nghệ phôi trên dê vẫn ñang rất sơ khai

Dê là ñộng vật ña thai (thường ñẻ sinh ñôi), bình quân 1,48 (dê cỏ) và 1,66 (dê lai) (Nguyễn Bá Mùi, 2011) Khả năng sinh sản nhanh (150,42 – 151,24) (Nguyễn Bá Mùi, 2011), dễ chăm sóc, nuôi dưỡng, chi phí ñầu tư thấp, ít bệnh tật (Hồ Quảng ðồ), nên ñây là một con vật rất có tiềm năng trong việc nghiên cứu công nghệ sinh sản ở Việt Nam

Việc nghiên cứu công nghệ sinh sản trên dê bao gồm: Gây ñộng dục ñồng pha, thu trứng dê, trưởng thành trong ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm, nuôi phôi, cấy truyền phôi vào tử cung con nhận phôi Thực tế ở Việt Nam có rất ít nghiên cứu về công nghệ sinh sản trên con dê nên bước ñầu tiên là việc trưởng thành trứng dê trong ống nghiệm, ñây là bước cần thiết ñể phục vụ các bước tiếp theo trong quy trình ñầy ñủ vì vậy tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Nghiên cứu sự phát triển của trứng dê trong ống nghiệm tại Việt Nam”

Trong phạp vi nghiên cứu của ñề tài, tác giả chỉ tập chung vào nghiên cứu, xây dựng và chuẩn hóa quy trình và những kỹ thuật liên quan ñể nuôi thành thục ñược trứng dê trong ống nghiệm

1.1 Mục tiêu và cách tiếp cận của ñề tài

1.1.1 Mục tiêu chung

Nghiên cứu công nghệ sinh học sinh sản với ñối tượng là trứng dê làm

cơ sở cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của công nghệ thụ tinh ống nghiệm, tạo phôi nhân bản tại Việt Nam

1.1.2 Mục tiêu cụ thể

• Xây dựng phương pháp thu, bảo quản và vận chuyển an toàn buồng trứng

dê với yêu cầu ñảm bảo sức sống của trứng và tránh nhiễm khuẩn

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5

• Xây dựng phương pháp khai thác trứng ổn ñịnh từ buồng trứng, nuôi in

vitro trứng dê từ giai ñoạn bóng mầm (Germinal Vesicle) phát triển ñến

giai ñoạn thành thục (Metaphase II) với tỷ lệ ñạt từ 50 ñến 60%

1.1.3 Cách tiếp cận

Lý thuyết và phương pháp tiếp cận theo chuẩn của các phòng thí nghiệm chuyên sâu về công nghệ sinh học ñộng vật của thế giới như Viện Nông học Quốc gia (Cộng Hoà Pháp), ðại học Wisconsin Madison (Mỹ), ðại

học Connecticut (Mỹ)

1.2 Tính cấp thiết của ñề tài

Trong khi các nước phát triển (Mỹ, Pháp, ðức, Nhật Bản…), ñang phát triển (Trung Quốc, Hàn Quốc…), thậm chí những nước xung quanh ta như Thailand, Indonesia, Malaysia… ñều ñang ñầu tư mạnh mẽ nhằm phát triển công nghệ sinh học ñộng vật, thì tình hình này ở nước ta ñang còn ở dạng ñầu

tư nhỏ giọt, không có ñịnh hướng lâu dài hoặc ñầu tư phân tán Chính vì vậy,

có thể nói, công nghệ sinh học ñộng vật nước ta còn ở “ vùng trũng gần ñáy” của thế giới

Trong hai thập kỷ qua, công nghệ sinh học ñộng vật nước ta với sự trợ giúp của quốc tế, cũng có một số thành tựu về cấy chuyển phôi bò, thụ tinh ống nghiệm….nhưng kết quả ñều khu trú ở các phòng thí nghiệm hoặc các ñề tài nhỏ lẻ Gần ñây, khi Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ trì Chương trình trọng ñiểm về phát triển công nghệ sinh học (tầm nhìn ñến năm 2020), thì mới có 02 ñề tài liên quan công nghệ sinh học sinh sản ở bò và lợn ñược tiến hành (bắt ñầu từ năm 2007) Tuy nhiên, lực lượng và kết quả mong ñợi cũng còn khiêm tốn

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 6

Trong xu thế ựào tạo và phát triển nghiên cứu tại các trường ựại học, Bộ Giáo dục và đào tạo ựã ưu tiên ựầu tư cho Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội một dự án về phát triển và ựào tạo nhân lực, khả năng nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học (dự án bắt ựầu từ năm 2007) Mới ựây, Khoa Công nghệ sinh học của Trường cũng ựã ựược thành lập, quy tập ựược ựội ngũ các giảng viên và nghiên cứu viên có khả năng nghiên cứu chuyên sâu từ các ựơn vị trong và ngoài trường Lực lượng này ựủ khả năng tiếp cận và triển khai các nghiên cứu ở trình ựộ cao trong công nghệ sinh học ựộng vật như thụ tinh ống nghiệm và nhân bản, chuyển gen, tế bào gốcẦ

Với những ưu thế về nhân lực, về ựầu tư cho Chương trình công nghệ sinh học của Bộ Giáo dục thời gian qua và ựịnh hướng khoa học công nghệ của Nhà trường, Tôi ựã ựăng ký thực hiện ựề tài này dưới sự hướng dẫn và chỉ bảo của các thầy cô Khoa Thú y kết hợp với các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học và tin tưởng các nghiên cứu triển khai không những có giá trị về mặt khoa học công nghệ mà còn góp phần thiết thực cho việc ựào tạo ựội ngũ cán bộ nghiên cứu có trình ựộ khu vực trong lĩnh vực công nghệ sinh học ựộng vật, góp phần thực hiện tốt mục tiêu và kế hoạch của ựề án 322 mà Bộ Giáo dục ựang triển khai

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 7

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 ðặc ñiểm và khả năng sinh sản của con dê

ðể ñánh giá khả năng sinh sản của dê cái, người ta thường dựa vào một

số chỉ tiêu sau:

Tuổi ñẻ lứa ñầu là một chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật quan trọng, phản ánh thời gian ñưa con vật vào khai thác sớm hay muộn Nó ñược tính từ khi con vật sinh ra ñến ngày ñẻ lứa ñầu tiên Tuổi ñẻ lứa ñầu chủ yếu phụ thuộc vào tuổi thành thục (cả về tính và về thể vóc), ñồng thời còn phụ thuộc vào việc phát hiện ñộng dục và kỹ thuật phối giống Ngoài ra, nó còn liên quan ñến ñiều kiện ngoại cảnh, di truyền, chế ñộ chăm sóc Tuổi ñẻ lứa ñầu của dê Ấn ñộ là: dê Barbari: 398,6 ngày; dê Jumnapari: 581,3 ngày; dê Beetal: 556,4 ngày Trong khi ñó dê Ấn ðộ nuôi ở Sông Bé lần lượt là: 415,6 ngày; 535,4 ngày; 547,1 ngày Theo (S.N Sing và P.S Sengar, 1985) cho biết, ở dê Beetal có tuổi ñẻ lứa ñầu là 675 ngày, dê Jumnapari là 735ngày, dê Black Bengan là 483 ngày (ðặng Xuân Biên, 1979) thông báo tuổi ñẻ lứa ñầu của dê Cỏ Việt Nam là 300 ngày, (Lê Văn Thông, 2005) cho là 336,4 ngày

Tuổi ñộng dục lần ñầu

Tuổi ñộng dục lần ñầu là khi dê cái ñã thành thục chức năng sinh dục và xuất hiện sự ham muốn giao phối lần ñầu Tuổi ñộng dục lần ñầu ñược tính bằng ngày hoặc tháng tuổi Theo (ðinh Văn Bình, 1998) công bố, tuổi ñộng dục lần ñầu trên dê Ấn ðộ lần lượt là: dê Barbari là 313,1 ngày; dê Jumnapari là 406,5 ngày và dê Beetal là 372,7 ngày (Lê Văn Thông, 2005) theo dõi ở Thanh Hóa cho biết, dê Cỏ có tuổi ñộng dục lần ñầu là 176,81 ngày, theo (Mai Hữu Yên, 1998) ở Thái Nguyên là 198,3 ngày Trong chăn nuôi, khi dê cái ñộng dục nên

bỏ qua chu kì ñộng dục ñầu tiên, tốt nhất cho dê cái phối ở 2 - 3 chu kì ñộng dục sau ñể ñảm bảo sức khỏe cho dê cái và ñời con của chúng

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 8

Tuổi phối giống lần ñầu

Chỉ tiêu này chủ yếu do người chăn nuôi quyết ñịnh Mặc dù dê hậu bị

có tuổi ñộng dục lần ñầu sớm là 5 - 7 tháng nhưng ñến 7 - 8 tháng tuổi mới cho phối giống, khi ñó dê ñạt khoảng 70% khối lượng trưởng thành Theo tác giả (ðinh Văn Bình, 1998) cho biết, tuổi phối giống lần ñầu trên dê Ấn ðộ như sau: dê Barbari là 246,5 ngày; dê Jumnapari là 415,3 ngày và dê Beeltal

là 401,3 ngày Còn ở dê Bách Thảo là 202,81 ngày (từ 165-255 ngày): vào khoảng 7 - 8 tháng tuổi, (ðinh Văn Bình, 1994) và (Lê Văn Thông, 2005) theo dõi trên dê Cỏ thông báo: dê Cỏ có tuổi phối giống lần ñầu là 186,26 ngày, (ðinh Văn Bình và Nguyễn Duy Lý, 2003) cho biết, dê Cỏ có tuổi phối giống lần ñầu là 140 - 200 ngày

Chu kì ñộng dục

Chu kì ñộng dục là thời gian hoạt ñộng sinh dục xuất hiện một cách ñều ñặn và có tính chu kì Chu kì ñộng dục của dê khoảng 19 - 21 ngày, ñộng dục kéo dài 1 - 3 ngày Những biểu hiện khi ñộng dục: âm hộ hơi sưng ñỏ hồng, chảy dịch nhờn, kêu la, bỏ ăn, nhảy lên lưng con khác, nếu dê ñang tiết sữa thì giảm ñột ngột Thời gian cho dê giao phối sau 16 - 38 giờ phát hiện ñộng dục là tốt nhất Trong thực tế chăn nuôi, nếu phát hiện ñộng dục ngày hôm nay thì ngày hôm sau cho phối 2 lần sáng, chiều là phù hợp Các tác giả theo dõi trên dê Ấn ðộ thấy chu kì ñộng dục như sau: dê Barbari: 26,2 ngày; dê Jumnapari 27,29 ngày; dê Beeltal là 18,03 ngày Dê Cỏ có chu

kì ñộng dục là 22,35 ngày (Lê Văn Thông, 2005), 20,35 ngày (Mai Hữu Yên, 1998), 17-19 ngày (ðặng Xuân Biên, 1979) Tại Ấn ðộ, theo (Singh.N.S và Sengar.O.P.S, 1985) cho biết dê Barbari có chu kỳ ñộng dục

là 17,1 - 49,2 ngày; dê Beetal là 16,9- 41,2 ngày, dê Jumnapari là 19,0 - 49,7 ngày, dê Black bengan là 17,8 - 46,2 ngày

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 9

Khoảng cách lứa ñẻ

Khoảng cách lứa ñẻ là khoảng thời gian giữa lần ñẻ trước và lần ñẻ tiếp sau, ñây cũng là một trong những chỉ tiêu quan trọng ñể ñánh giá khả năng sinh sản của dê cái Khoảng cách lứa ñẻ phụ thuộc vào các yếu tố như: giống, thức ăn, dinh dưỡng, chế ñộ chăm sóc… Khoảng cách lứa ñẻ chủ yếu là do thời gian có chửa lại sau khi ñẻ quyết ñịnh, bởi vì ñộ dài thời gian mang thai

là một hằng số sinh lý và không thể rút ngắn ñược Tuy nhiên trong thực tế, khoảng cách lứa ñẻ thường kéo dài hơn do nhiều nguyên nhân (ðặng Xuân Biên, 1979) cho biết, dê Cỏ có khoảng cách giữa 2 lứa ñẻ là 270 ngày (Nguyễn Thị Mai, 2002) thông báo, dê Bách Thảo nuôi tại Ninh Thuận có khoảng cách giữa hai lứa ñẻ là 180 - 210 ngày ðối với các giống dê Ấn ðộ nuôi tại Việt Nam, các tác giả ñã thu ñược kết quả là: dê Barbari: 225 ngày;

dê Jumnapari: 312 ngày và dê Beetal là 282 ngày

Thời gian có chửa lại sau khi ñẻ

Muốn rút ngắn khoảng cách lứa ñẻ cần phải tuân thủ và áp dụng những quy trình chăn nuôi hợp lý hoặc phải tác ñộng ñể rút ngắn giai ñoạn từ khi ñẻ ñến khi phối giống có chửa xuống, tốt nhất là 3 tháng Thời gian này phụ thuộc vào gia súc ñộng dục lại sau ñẻ, khả năng phát hiện ñộng dục, phối giống lại, cũng như khả năng thụ thai

Thời gian ñộng lại sau khi ñẻ

Thời gian ñộng dục lại sau khi ñẻ là khoảng thời gian tính từ khi gia súc cái ñẻ ra con ñến khi xuất hiện kỳ ñộng dục tiếp theo Khoảng thời gian ñộng dục lại của dê phụ thuộc vào quá trình hồi phục của cơ quan sinh dục, ñặc biệt là buồng trứng Những dê cái ñược nuôi dưỡng kém trước và sau khi

ñẻ hay ñang cho con bú thường ñộng dục trở lại muộn hơn Thời gian ñộng dục lại sau ñẻ của dê núi Hà Giang là 40,22 ngày(Nguyễn Văn Bình và cs,

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 10

2008), dê cỏ, dê lai ở Yên Bái lần lượt là 43,54 ±10,42, 51,82±10,42 (Nguyễn

Bá Mùi, 2011)

Tỷ lệ thụ thai

Tỷ lệ thụ thai một mặt phụ thuộc vào bản thân con vật, nhất là sự hồi phục của ñường sinh dục và hoạt ñộng chu kỳ sau khi ñẻ Mặt khác, còn phụ thuộc vào kỹ thuật thụ tinh nhân tạo Cùng với việc ñộng dục trở lại sớm, tỷ lệ phối giống thụ thai cao góp phần rút ngắn thời gian có chửa lại sau ñẻ và khoảng cách lứa ñẻ

Thời gian mang thai

Thời gian mang thai là thời gian tính từ lúc gia súc cái thụ thai ñến khi

ñẻ Theo (ðặng Xuân Biên, 1979) cho biết, thời gian mang thai trung bình của dê là 146-156 ngày (ðinh Văn Bình và cs, 1998) theo dõi trên dê Ấn ðộ thấy: dê Barbari là 148,1 ngày (ở Ấn ðộ là 146 ngày), Jumnapari là 149,61 ngày (ở Ấn ðộ là 149 ngày), dê Beetal là 148,1 ngày (ở Ấn ðộ là 148 ngày) Tại Ấn ðộ, theo (Sing S.N và Sengar P.S., 1985) cho biết: dê Jumnapari là

149 ngày, dê Beetal là 148 ngày, dê Barbari là 146 ngày

Số con sơ sinh trên lứa

ðây là chỉ tiêu cho biết số dê con sơ sinh ñẻ ra trong một lứa ñẻ của dê

mẹ Tác giả (Lê Văn Thông, 2005) theo dõi ở Thanh Hóa cho biết dê Cỏ ñẻ 1,61 con/ lứa, (Mai Hữu Yên, 1998) là 1,52 con/lứa, (ðinh Văn Bình, 1998) nghiên cứu trên dê Ấn ðộ cho biết: dê Barbari: 1,45 con/lứa; dê Jumnapari: 1,36 con/ lứa; dê Beetal: 1,3 con/ lứa

Số con sơ sinh/ cái/năm

Là số con sơ sinh ñược sinh ra trong một năm của một dê cái Chỉ tiêu này phản ánh số dê con ñẻ ra hàng năm của dê mẹ Theo nghiên cứu của một

số tác giả cho biết chỉ tiêu này ở dê Cỏ là 1,97 con/ cái/ năm, dê Bách Thảo là 3,07 con/cái/năm (ðinh Văn Bình, 1994)

Số lứa/cái/năm

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11

Chỉ tiêu này xác ñịnh số lứa ñẻ của một dê cái trong một năm Các giống dê khác nhau thì số lứa ñẻ cũng khác nhau trong một năm Dê Jumnapari là 1,3 lứa/năm, dê Barbari là 1,4 lứa/năm

2.2.Các yếu tố trong việc nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm

ðể nuôi thành thục trứng trong ñiều kiện in vitro thành công thì bắt

buộc phải tạo các ñiều kiện nuôi (nhiệt ñộ, thành phần không khí, môi trường

nuôi ) gần giống với trong ñiều kiện in vivo nhất Ngoài ra, thời gian nuôi

cũng không ñược dài quá hay ngắn quá, cũng cần phải tương ñương với thời gian phát triển trong cơ thể ñộng vật ðể làm ñược ñiều này cần phải có những nghiên cứu từng bước, từng công ñoạn của các nghiên cứu cơ bản Có rất nhiều nghiên cứu về vấn ñề này và các tác giả ñã ñưa ra ñược con số tương ñối cụ thể cho công việc nuôi thành thục trứng nêu trên

2.2.1 ðiều kiện nuôi

Nhiệt ñộ: Yếu tố nhiệt ñộ nuôi cần phải tương ñương với nhiệt ñộ

trong cơ thể con vật Với dê, nhiệt ñộ nuôi cần ñảm bảo ổn ñịnh ở khoảng

390C (Cù Xuân Dần, 1996), tuy nhiên ñó là nhiệt ñộ trung bình của dê, trên thực tế ta cần phải xác ñịnh lại bằng thực nghiệm với các mức nhiệt ñộ giao ñộng trong khoảng 390C ñể tìm ra khoảng nhiệt ñộ thích hợp nhất Trong thí nghiệm của (N.Crozet và cs, 1995), ông ñã nuôi trứng dê trong ñiều kiện nhiệt

ñộ 38,50C ñể chuẩn bị trứng thành thục cho việc thụ tinh ống nghiệm Tương

tự như kết quả của N.Crozet, (Z.G.Wang và cs, 2007) cũng nuôi thành thục trứng dê Boer trong ống nghiệm ở nhiệt ñộ 38,50C, 5%CO2 trong 24 giờ ñể nghiên cứu sự ảnh hưởng của các phương pháp khai thác trứng ñến khả năng thụ tinh sau khi nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm dê Boer (M.Khatun

và cs, 2010) nuôi trứng dê trong ñiều kiện nhiệt ñộ là 390C

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 12

Thành phần không khí: Cũng giống như trong cơ thể ñộng vật, thành

phần CO2 và O2 trong môi trường nuôi phải phù hợp với sự phát triển của tế bào trứng Nếu nồng ñộ các khí trên không phù hợp thì khả năng trứng thành thục cũng bị ảnh hưởng rất lớn Thông thường các nghiên cứu của các tác giả không nghiên cứu sâu về sự ảnh hưởng của thành phần không khí lên tỷ lệ nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm mà thường mặc ñịnh thành phần khí trong tủ nuôi là 5%CO2(N.Crozet và cs, 1995); (Z.G.Wang và cs, 2007); (M.Khatun và cs, 2010), rất ít nghiên cứu nghiên cứu về sự ảnh hưởng của nồng ñộ O2 tới sự phát triển của trứng dê trong khi nuôi cấy Trên thế giới mới có công bố của Singh và cs, 2009) Ông thấy rằng khi nồng ñộ O2 giảm xuống còn 10% thì hiệu quả thu trứng thành thục cao hơn ở nồng ñộ bình thường (20%) (P<0,05) Trong nước mới ñây nhất có công bố của Nguyễn Hữu ðức và cs, 2011) nhận thấy tỷ lệ nuôi thành thục trứng tốt hơn khi ñồng thời khống chế thành phần khí trong tủ nuôi là 5%CO2 và 5%O2

Thời gian nuôi: Thời gian nuôi quá ngắn sẽ làm trứng không ñủ thời

gian ñể thành thục, nếu quá dài sẽ làm trứng kém phẩm chất vì bị biến ñổi quá mức hoặc môi trường không còn phù hợp nữa Vì vậy cần phải có một thời gian nuôi hợp lý ñể thu ñược trứng có chất lượng tốt nhất Theo (Z.G.Wang và cs, 2007) thì thời gian nuôi trứng dê Boer phù hợp là 24h, theo (M.Khatun và cs, 2010), (Keskintepe L và cs, 1975) thì thời gian nuôi thành thục trứng dê là 27h (P.Tajika và cs, 2002) nuôi thành thục trứng dê trong 24 – 26h, (Nguyễn Hữu ðức và cs, 2011) nuôi trứng dê trong ống nghiệm sau 32h

2.2.2 Môi trường nuôi

Môi trường TCM199 (Sigma - Adrich)

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 13

Năm 1950, Morgan và cs ñưa ra một báo cáo về khả năng sản xuất một môi trường dinh dưỡng có khả năng nuôi ñược tế bào ngoài cơ thể Nó gồm tập hợp của nhiều chất gồm các vitamin, amino axit và các chất có tác dụng kích thích sinh trưởng khác và ñặt tên là Tissue Culture Medium 199 Ngày nay môi trường ñó ñã ñược phát triển ra nhiều môi trường khác nhau (10 môi trường) ñể phù hợp với từng mục ñích nghiên cứu như nuôi tế bào, nuôi phôi, chế vaccine… Môi trường ñể nuôi tế bào trứng thành thục trong ống nghiệm

có tên là Medium 4530 (M4530 dạng dung dịch) bao gồm 8 loại muối khác nhau chiếm ña số khối lượng, 21 loại amino acid, và 17 loại vitamine khác nhau với một lượng rất nhỏ

2.2.3 Các chất bổ sung vào môi trường nuôi

Hormon

Với môi trường TCM199 ñã có thể nuôi trứng trong ống nghiệm ñược, tuy nhiên trứng không thể phát triển như mong muốn ñược do trong quá trình phát triển của trứng tự nhiên có yếu tố hormon tác ñộng Trứng có chín ñược hay không là do hormon ñiều khiển Vì lý do này, trong quá trình nuôi thành thục trứng, ta cần có hormon ñể làm cho trứng phát triển ñến giai ñoạn thành thục

Trong cơ thể có rất nhiều hormon khác nhau nhưng chỉ có một số hormon có tác ñộng ñến quá trình phát triển và thành thục của trứng, trong số

ñó phải kể ñến FSH, LH và Oestradiol

Vậy các hormon trên bổ sung với một lượng bao nhiên là ñủ cho trứng

dê phát triển tốt như mong muốn?

Theo (N.Crozet và cs, 1995), lượng LH, FSH và Oestradiol bổ sung vào môi trường nuôi cấy TCM199 lần lượt là 10, 10 và 1 µg/l Theo (Y.Congnie và cs, 2003), ông bổ sung hormon FSH, Oestradiol 17β vào môi trường TCM199 với lượng tương ñương là 100 µg/l (gấp 10 lần và 100 lần so với N.Crozet) ñể nghiên cứu hiệu quả của việc sử dụng Cysteamine trong

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 14

nuôi cấy trứng Theo (Nguyễn Hữu ðức, 2005) thì tỷ lệ bổ sung FSH, LH và Oestradiol vào môi trường TCM199 lần lượt là 500, 100, 100 µg/l ñể nuôi thành thục trứng bò trong ống nghiệm (Keskintepe L và cs, 1975) ñã dùng

LH, FSH và Oestradiol 17β với lượng tương ứng là 100; 0,5; 1 µg/ml

Hiệu quả của việc bổ sung hormon vào môi trường nuôi cấy ñược trứng

dê ñược A.I Younis và cs, 1991 nghiên cứu năm 1991 Ông ñã làm thí nghiệm

so sánh ảnh hưởng của hormon LH và FSH ñến sự phát triển của trứng và thấy rằng Với nồng ñộ FSH và LH bổ sung vào môi trường là 5 µg/ml và 100 µg/ml, khả năng nuôi thành thục trứng ñạt rất cao: 100% và 90% trứng nuôi thành thục

so với không bổ sung hormon: 60% trứng nuôi thành thục

ñó mà người ta thường dùng Penicillin + Streptomycin ñể mở rộng phổ kháng khuẩn, có thể dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng là gentamycin Tất cả những kháng sinh dùng trong công nghệ nuôi trứng phải là kháng sinh ñược tinh chế

và có chất lượng tốt nhất, thường phải nhập khẩu từ công ty Sigma – ðức ñể

bổ sung vào môi trường với lượng vừa ñủ ñể kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn: (A.I Younis và cs, 1991) dùng Gentamycin Sulfate với lượng 50 µg/ml (P.Tajika, 2002), (Nguyễn Hữu ðức, 2005) dùng Penicillin và Streptomycin ñể bổ sung vào môi trường nuôi cấy với lượng 100.000UI và 50 mg/l (Kharche.S.D và cs, 2006) nghiên cứu nuôi thành thục trứng dê cừu trong ống nghiệm ñã dùng 100 UI/ml Penicillin và 100 µg/ml Streptomycin

ñể bổ sung vào môi trương bảo quản và nuôi trứng

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 15

Pyruvate

ðược tạo ra từ glucoza qua quá trình chuyển hóa kỵ khí của glucoza (glycolisis), từ ñó 1 phân tử pyruvate ñược chuyển thành 2 phân tử acetyl coenzymA nhờ enzym Pyruvate Dehydrogenaza Complex ñể tham gia vào chu trình crebs Một phân tử Pyruvate còn chuyển thành 2 phân tử oxaloacetate qua sự hoạt hóa của enzym Pyruvate Carboxylaza ñể tham gia bổ sung dưỡng chất cho chu trình crebs Ngoài ra Pyruvate còn có khả năng chuyển hóa thành alanine nhờ enzym Alanine Transaminaza ñể bổ sung acid amin cho cơ thể Pyruvate còn có thể chuyển hóa thành acid lactic nhờ enzym Lactate Dehydrogenaza ñể giải phóng năng lượng phục vụ các hoạt ñộng

sống Trong nuôi cấy trứng in vitro, việc bổ sung Pyruvate có tác dụng cung

cấp thêm năng lượng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào Theo (Chian và cs, 2002) lượng Pyruvate bổ sung khoảng 0,2 mM/ml

Dịch nang trứng

Dịch nang trứng (Follicular Fluid – FF) (Alberto Revelli và cs, 2009) là một chất lỏng có trong nang trứng, bao bọc xung quanh trứng, ñược huyết tương trong máu hình thành và cung cấp các chất dinh dưỡng Dịch nang trứng có thể coi như nguồn dinh dưỡng chính ñể nuôi trứng phát triển và thành thục trong cơ thể Trong dịch nang trứng có rất nhiều các thành phần khác nhau, nhưng có thể gộp chung thành những nhóm chất sau:

- Hormon: Gonadotropin (LH, FSH, HCG), hormon sinh trưởng (GH), Prolactin (PRL), Oestrogens (E2), Progesteron (P), Androgens, Corticoid Các hormon này không thể thiếu trong việc nuôi thành thục trứng

- Các yếu tố tăng trưởng của nhóm yếu tố tăng trưởng biến ñổi – beta beta) gồm Inhibin (A và B) và Activin (A), Anti-mullerian hormon (AMH), Bone Morphogenetic Protein-15 (BMP-15)

(TGF-Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 16

- Các Interleukin và các yếu tố tăng trưởng khác gồm IGF (Insulin – like Growth Factors): IGF-I và IGF-II và nhóm IGFBP (1 – 6) (IGF-Binding Proteins) Các yếu tố phát triển khác gồm Tumour Necrosis Factor-alpha (TNF-alpha), Epidermal Growth Factor (EGF), và Basic Fibroblast Growth Factor (BFGF), Các Interleukin (IL)(yếu tố miễn dịch dịch thể)

- Yếu tố phân giải oxy ROS (Reactive Oxygen Species), Nitric Oxyde; Yếu

tố phát triển hệ mạch trong màng (VEGF) (Vascular Endothelial Growth Factor)

- Proteins, peptides và amino-acids, alpha-fetoprotein, CEA và CA-125, alpha1-antitrypsin, leptin, endothelin-2

- Antigen CD44, beta-endorphin (beta-EP), lactoferrin angiotensin II (ATII), oocyte maturation inhibitor (OMI), homocysteine (HCY), prorenin

- ðường hyaluronan, myo-inositol, prostanoids

Huyết thanh

Huyết thanh bào thai bê: Fetal Calf Serum – FCS hoặc Fetal Bovine Serum – FBS, huyết thanh dê ñộng dục: Estrous Goat Serum – EGS: Là những huyết thanh của ñộng vật non hoặc ñộng vật ñang chửa (thường dùng huyết thanh bê, dê) Cũng giống như dịch nang trứng, nó có thể coi như một nguồn dưỡng chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy, trong ñó chủ yếu là những yếu tố sinh trưởng, protein và hormon, nó có tác dụng làm tăng khả năng sinh trưởng và phát triển của tế bào khi nuôi cấy

Cysteamine

Theo (Y.Congnie và cs, 2003) nghiên cứu bổ sung cysteamine (Sigma Ref M9768) vào môi trường TCM199 vào môi trường TCM199 thì thấy rằng hiệu quả của việc nuôi thành thục trứng dê sang giai ñoạn MII rất rõ ràng Với các nồng ñộ nghiên cứu là 0; 50 và 100 µM, ông thấy rằng nếu có mặt

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 17

cysteamine thì số lượng trứng phát triển ñến giai ñoạn MII nuôi sau 16 giờ tăng từ 21% ñến 32% Nuôi sau 20h tăng từ 46% - 71% Nếu nuôi ñến 24h thì tăng từ 72 – 79% Như vậy cysteamine không những làm tăng tỷ lệ trứng phát triển ñến giai ñoạn MII mà còn làm rút ngắn thời gian nuôi trứng

sử dụng enzym, chúng còn sử dụng cả phần ñuôi ñể quẫy như một phương pháp

cơ học hỗ trợ việc phân tách hiệu quả hơn Enzym này không có mang tính chất loài, Tất cả tinh trùng của các loài khác nhau ñều có enzym này Ngoài ra nó còn

có thể có ở một số vi khuẩn như Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, và Clostridium perfringens Chúng sử dụng enzym này ñể phân tách

các lớp mô tế bào nhằm xuyên qua tổ chức vào trong cơ thể

Dựa vào ñặc ñiểm và tính chất này, người ta ñã sử dụng chúng vào trong công nghệ nuôi thành thục trứng và thụ tinh nhân tạo nhằm phân tách các lớp tế bào cumulus ra khỏi tế bào trứng ñã thành thục nhằm quan sát ñược thể cực ñể ñánh giá khả năng thành thục của trứng cũng như giúp tinh trùng tiếp xúc dễ dàng với trứng ñã thành thục

Tuy nhiên việc sử dụng chúng với hàm lượng bao nhiêu cho ñủ lại là một dấu hỏi cho các nhà nghiên cứu Với mỗi loài khác nhau, hàm lượng enzym ñưa vào là khác nhau Nếu ít quá thì lớp tế bào cumulus xung quanh không hoàn toàn ñược phân tách ra, rất khó cho việc quan sát và ñánh giá

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 18

Nếu nhiều quá thì chúng không những tác ñộng lên lớp tế bào sinh dưỡng trên

mà còn tác ñộng có hại lên lớp màng tế bào trứng làm ảnh hưởng tới chất lượng trứng Theo (Nguyễn Hữu ðức và cs, 2011) lượng enzym Hyaluronidaza sử dụng trong phân tách các lớp tế bào cumulus xung quanh trứng dê tối ưu nhất với nồng ñộ 1,0 mg/ml trong khoảng thời gian 120 – 180 giây ở nhiệt ñộ 370C kết hợp với phương pháp dùng pipet thủy tinh có ñường kính trong là 130 – 150 mm hút lên hút xuống

2.3 Một số phương pháp sử dụng ñể nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm

2.3.1 Các phương pháp khai thác trứng

Khai thác trứng in vitro

Khai thác trứng in vitro là phương pháp khai thác trứng trực tiếp từ các

buồng trứng ðây là phương pháp chủ yếu ñể tiến hành thu lượm trứng phục vụ lĩnh vực công nghệ phôi ñộng vật ở góc ñộ nghiên cứu cơ bản và ñược ứng dụng

ở hầu hết các phòng thí nghiệm về công nghệ phôi trên thế giới (Fukushima và cs, 1985); (Fukuda và cs, 1990); (Keskintepe và cs, 1995); (Mizushima và cs, 2000); (Paloma Duque và cs, 2003) Phương pháp này cho phép cung cấp một lượng trứng lớn với chất lượng ổn ñịnh

Các bước khai thác trứng

Thu buồng trứng từ lò mổ: Thu buồng trứng ngay sau khi con vật bị

giết, dùng panh cố ñịnh buồng trứng và dùng kéo cắt lấy toàn bộ buồng trứng

Bảo quản và vận chuyển: Buồng trứng ñược rửa 3 – 4 lần trong dung

dịch muối sinh lý (NaCl 0,9%) có bổ sung kháng sinh (100.000 ñơn vị Penicillin và 50 mg/lít Streptomycin) và bảo quản trong môi trường PBS (Phosphate Buffered Saline) ở nhiệt ñộ khống chế 30 – 350C Các buồng trứng thu ñược ñược chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2 – 4 giờ

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 19

bộc lộ nang trứng từ buồng trứng trong ñĩa

petri có chứa môi trường nuôi dưỡng PBS

Kể từ giai ñoạn này, các bước tiếp theo ñều

ñược thực hiện trong tủ vô trùng Thông

thường, người ta tiến hành chọc hút các

nang trứng có ñường kính từ 2 – 6 mm

Rửa và chọn lọc trứng: Dịch nang

trứng sau khi hút ra gồm trứng và các tế bào nang trứng ñược bơm vào các ñĩa Petri (hãng NUNC-CHLB ðức) Tiến hành soi tìm trứng trên kính hiển vi soi nổi có ñộ phóng ñại 40 – 100 lần Trứng ñược hút ra bằng pipet thủy tinh và rửa vài lần trong môi trường DPBS (Dulbecco’s Phosphate Bufferred Saline) hoặc các môi trường thích hợp khác

Khai thác trứng in vivo

Ngoài phương pháp khai thác trứng in vitro ñã trình bày ở trên, người ta

nghiên cứu áp dụng một phương pháp

mới gọi là phương pháp Ovum Pick Up

(OPU) Phương pháp này ñược xây dựng

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 20

trên cơ sở phương pháp hút trứng với sự trợ giúp của máy siêu âm dùng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ở người

Phương pháp OPU ñược sử dụng ñể khai thác trứng từ các cá thể có tiềm năng di truyền cao (Sản lượng sữa cao, sản lượng thịt nhiều…), kết hợp với công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm sử dụng tinh ñược giống tốt cho phép tạo ra các phôi có nhiều ưu ñiểm vượt trội Các phôi này ñược cấy vào ñộng vật nhận phôi (ñã ñược gây ñộng dục ñồng pha) ñể tạo ra các con non như mong muốn

Các thí nghiệm về thu trứng bò bằng

phương pháp trên ñược tiến hành bởi

(Callesen và cs, 1987); sau ñó là

(Pieterse và cs, 1988) là những người ñầu

tiên sử dụng phương pháp OPU như là

một phương pháp khai thác trứng hiệu

quả và ñều ñặn trên bò Trên dê cũng ñã có một số tác giả trên thế giới ñã sử dụng phương pháp này như (Wieczorek và cs, 2009) ñể thu trứng làm thí nghiệm, tuy nhiên ở Việt Nam vẫn chưa ai sử dụng

2.3.2 Phân loại chất lượng trứng

Sau khi thu thập ñược trứng bằng phương pháp khai thác in vitro hoặc

in vivo, cần tiến hành phân loại chất lượng trứng và việc phân loại này là rất

quan trọng, nó là một trong các nhân tố có ảnh hưởng trực tiếp ñến kết quả nuôi thành thục trứng, thụ tinh trong ống nghiệm cũng như khả năng phát triển của phôi về sau

Chất lượng

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 21

A

Có trên 4 lớp tế bào cumulus bao quanh trứng, các lớp tế bào này dày, ñều ñặn và có sự liên kết chặt chẽ giữa các tế bào ñó với nhau

Nguyên sinh chất ñồng ñều Toàn bộ trứng nhìn trong và ñầy ñặn

B

Có ít hơn 4 lớp tế bào cumulus bao quanh trứng, các lớp tế bào này liên kết không chặt chẽ, có nơi bị mất một phần

Nguyên sinh chất ñồng ñều nhưng

có màu hơi tối ở vùng ngoại vi của trứng

Toàn bộ trứng nhìn ít trong và ít ñầy ñặn

C Có ít tế bào cumulus bao quanh, nguyên sinh chất không

ñồng ñều hoặc có màu tối, bị tan rã hoặc trương to

Trứng thường ñược phân loại theo 3 cấp: A, B, C dựa theo hình thái bên ngoài, nguyên sinh chất bên trong của chúng và các lớp tế bào sinh dưỡng (cumulus) bao xung quanh trứng Phương pháp này tương ñối phổ biến và ñược rất nhiều phòng thí nghiệm lớn trên thế giới áp dụng

Việc ñánh giá trực tiếp chất lượng của trứng ñòi hỏi một khả năng tinh tế ñể không làm hỏng và phân loại nhầm chúng ðể ñánh giá trạng thái của nhân trứng ñòi hỏi phải tiến hành phương pháp nhuộm nhân vì trong nguyên sinh chất của trứng có nhiều hạt lipid, chúng sẽ cản trở sự quan sát trực tiếp nhân trứng trên kính hiển vi Chính vì vậy người ta không tiến hành ñánh giá chất lượng trứng thông qua việc ñánh giá trực tiếp tình trạng của nhân trứng trên kính hiển vi

Tuy nhiên qua nhiều lần quan sát cho thấy có sự liên quan chặt chẽ giữa hình thái bên ngoài (cấu trúc lớp tế bào cumulus bao quanh trứng và ñộ ñồng ñều, màu sắc của nguyên sinh chất) với chất lượng trứng Do vậy người

ta mới tiến hành ñánh giá phân loại chất lượng trứng trên cơ sở quan sát và ñánh giá hình thái bên ngoài của trứng (Leibfried và cs, 1979); (De Loos và

cs, 1989); (Hazeleger và cs, 1995)

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 22

2.3.3 Phương pháp nuôi trứng in vitro và ựánh giá sự thành thục

Phương pháp nuôi trứng in vitro

Cơ sở của các phương pháp nuôi thành thục trứng các loài ựộng vật bậc cao trong ống nghiệm là việc hiểu biết và vận dụng tốt quá trình thành thục trứng trong tự nhiên của chúng

Các trứng thu ựược bằng

phương pháp in vitro hay in vivo

ựã trình bày ở trên ựược ựưa vào

nuôi thành thục Do có sự liên

quan chặt chẽ giữa chất lượng

trứng và hình thái bên ngoài, người

ta chọn những trứng có chất lượng

tốt ựể ựưa vào nuôi trong môi

trường giàu chất dinh dưỡng với

sự có mặt của những tế bào granulose (nồng ựộ 1-5 triệu tế bào/ml) Nhiệt ựộ

tủ nuôi = 390C, nồng ựộ khắ CO2 = 5% (Donnay và cs, 1997), (Gali và cs, 2001)

Môi trường nuôi ựược bổ sung huyết thanh dê ựang ựộng dục (giàu LH, FSH, Oestradiol) hoặc bằng huyết thanh bào thai dê (FCS) (giàu IGF-1) và bổ sung thêm Oestradiol 17β Tuy nhiên ựể hoàn thiện quá trình thụ tinh trong ống nghiệm thì vẫn phải bổ sung thêm LH và FSH vào môi trường nuôi trứng (Pieterse và cs, 1988); (Mizushima và cs, 2000); (Paloma Duque và cs, 2003)

Hiện nay môi trường cơ bản dùng ựể nuôi thành thục trứng trong hầu hết các phòng thắ nghiệm là môi trường TCM199 có bổ sung thêm LH, FSH, Oestradiol, huyết thanh ựộng vật mang thai, pyruvate NaẦViệc bổ sung các chất trên là rất cần thiết nhằm ựảm bảo sự phát triển bình thường và ựầy ựủ của trứng, nhân trứng, bào tương và lớp tế bào trong suốt ựến giai ựoạn thành thục

đánh giá sự thành thục của trứng

Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 23

để ựánh giá ựược sự thành

thục của trứng nuôi trong ống

nghiệm cần phải ựem nhuộm nhân

hoặc nhiễm sắc thể của trứng Như

vậy những trứng ựem xác ựịnh sẽ

không thể tiếp tục ựem làm các công

ựoạn tiếp theo như thụ tinh ống

nghiệm hay cấy chuyển nhân

(nuclear transfer) để ựỡ mất ựi

những quả trứng quý giá ựó, chúng

ta có thể dùng biện pháp ựánh giá sự

thành thục của trứng thông qua việc

quan sát những dấu hiệu bên ngoài

sau một thời gian nuôi trong ống

nghiệm đó chắnh là các căn cứ dựa trên sự bông tơi của các tế bào cumulus bao quanh trứng hoặc sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (Leibfried và cs, 1979)

Thông thường ựể ựánh giá sự thành thục của nhân trứng, người ta tiến hành nhuộm nhân của lô trứng ựối chứng bằng thuốc nhuộm Orcein 1% Kết quả thu ựược ựược dùng như một thông số tham khảo cho các lô trứng cùng nguồn gốc, cùng chất lượng ban ựầu hoặc cùng phương pháp và ựiều kiện nuôi thành thục Việc ựánh giá sự thành thục của nguyên sinh chất là rất khó

Hiện nay, khi các kỹ thuật nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm, thụ tinh trong ống nghiệm và nuôi phôi trong ống nghiệm ựã trở thành một tổ hợp công nghệ sinh học hoàn chỉnh thì việc ựánh giá kết quả của giai ựoạn nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm thường ựược phản ánh qua kết quả thụ

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 24

tinh ống nghiệm (số phôi dâu, số phôi nang) thu ñược về sau này (Paloma Duque và cs, 2003)

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, việc nghiên cứu nuôi thành thục trứng non trong ống nghiệm (IVM) trên dê cũng ñã có nhiều nghiên cứu và cho nhiều kết quả khả quan ở nhiều quốc gia khác nhau trong nhiều năm gần ñây Thường thì việc

nghiên cứu nuôi thành thục trứng non trong ống nghiệm (In vitro maturation –

IVM) hay kết hợp với các nghiên cứu khác như: Thụ tinh trong ống nghiệm

(In vitro fertilization – IVF) và nuôi cấy phôi (In vitro culture – IVC) tạo

thành bộ 3 hoàn chỉnh trong quy trình công nghệ phôi hiện ñại (Y.Congnie và

cs, 2003), các kết quả ñó cũng ñã ñược công bố trên nhiều tạp chí lớn trên thế giới như Jorurnal of animal science, Biology of reproduction, ELSEVIER…

A.I.Younis, K.A.Zuelke, K.M.Harper, M.A.I.Oliveira và B.G.Brackett

ñã nghiên cứu ñề tài “Thụ tinh trứng dê trong ống nghiệm” (In vitro

Fertilization of Goat Oocytes) và ñã công bố trong tạp chí Biology of reproduction năm 1991: 23 dê các giống ñược chuẩn bị tiêm kích tố phát triển buồng trứng (FSH, PGF2α, Lutalyse…) sau ñó ñược mổ ra ñể thu buồng trứng lấy nang Các nang trứng sau khi thu ñược phân loại rồi ñem nuôi cấy với môi trường TCM199 có bổ sung các hormon khác nhau vào Kết quả cho thấy môi trường bổ sung thêm LH hoặc/ và FSH nuôi cấy cho kết quả tốt hơn hẳn việc không bổ sung

Năm 1995, N.Crozet, M.Ahmed-Ali và M.P.Dubos nghiên cứu công trình “khả năng phát triển của trứng dê qua các giai ñoạn IVM, IVF, IVC thu ñược từ các loại nang trứng có kích cỡ khác nhau” (Developmental competence of goat oocytes from follicle of different size categories

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 25

following maturation, fertilization and culture in vitro) tại Pháp và ñã ñược

công bố trong tạp chí Journal of Reproduction and Fertility Kết quả cho thấy:

Số lượng phức hợp tế bào trứng – tế bào cumulus (Cumulus oocyte complexes – COCs) có thể chọn ñem nuôi (IVM) ở các buồng trứng cỡ lớn (>5 mm) và cỡ vừa (3,1 – 5 mm) là cao nhất, chiếm 87% và 84% tổng số nang trứng hoàn thiện Thấp nhất là ở những nang trứng cỡ nhỏ (2 – 3 mm), chiếm 62% tổng số nang trứng hoàn thiện Số nang trứng ñược chọn ñem nuôi (IVM) chuyển sang giai ñoạn Metaphase II (MII) thành công ở các buồng trứng có kích cỡ khác nhau cũng khác nhau Buồng trứng có kích cỡ to (>5 mm) cho kết quả tốt nhất (97%), sau ñó là cỡ vừa (3,1 – 5 mm): chiếm 83%

và thấp nhất là cỡ nhỏ (2 – 3 mm): chiếm 70% và khi ñem thụ tinh cũng như nuôi cấy phôi thì kết quả cũng tương tự, tỷ lệ thành công ở trứng thu từ buồng trứng lớn cao hơn từ buồng trứng nhỏ

E Amoah và S Gelaye ñã công bố công trình nghiên cứu “ Những tiến

bộ khoa học công nghệ trong việc nhân bản dê (Biotechnological Advances in Goat reproduction) trong tạp chí khoa học ñộng vật (Journal of animal science) năm 1997 Ông ñã nghiên cứu nuôi cấy trứng dê qua việc ñi lấy mẫu buồng trứng dê ở lò mổ và ông cho rằng thu trứng bằng phương pháp cắt lát buồng trứng với chọc hút buồng trứng ñều cho kết quả tương tự nhau bởi dê ở

lò mổ ña phần là dê chưa ñến tuổi thành thục về tính Ông cũng thấy rằng số nang trứng thu ñược ở những buồng trứng có kích thước to (>5 mm) cho kết quả sau nuôi thành thục (IVM) tốt hơn nhiều so với số nang trứng thu ñược ở những buồng trứng nhỏ (<5 mm) Trong quá trình nuôi cấy, ông cũng nhận thấy rằng việc bổ sung các glycoprotein hormon (LH, FSH, HCG, TSH) vào môi trường nuôi TCM199 cho kết quả tốt hơn nhiều so với không cho chúng vào

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 26

Từ những năm 2000 trở ñi, các công trình nghiên cứu nuôi thành thục trứng dê trong ống nghiệm trên thế giới ñược công bố ngày càng nhiều, năm

2002, P Tajika, N.Shams Esfandabadid nghiên cứu ñề tài “nuôi thành thục trứng dê cừu trong ống nghiệm ở các môi trường nuôi khác nhau” Các ông ñã thử nghiệm nuôi thành thục trứng non bằng môi trường TCM199 có bổ sung Penicillin và Streptomycin và một trong các loại huyết thanh khác nhau: huyết thanh bê (FBS), huyết thanh cừu (ESS), huyết thanh dê (EGS) Sau khi nuôi trong một khoảng thời gian là 24 – 26 tiếng ñem kiểm tra thấy việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết và việc bổ sung huyết thanh nào vào môi trường nuôi trứng cũng ñều rất tốt, không có sự khác biệt

rõ ràng với các loại huyết thanh khác nhau

Năm 2003, Y.Cognié và cs nghiên cứu ñề tài “hiện trạng công nghệ phôi trên dê cừu” và ñược ñăng trên tạp chí ELSEVIER Ông làm thí nghiệm giữa việc dùng hay không dùng Cysteamine vào môi trường nuôi TCM199 có

bổ sung 10% FF, 100 ng/ml FSH Ông nhận thấy rằng việc bổ sung Cysteamine vào môi trường nuôi cấy làm tăng hiệu quả nuôi thành thục trứng sang giai ñoạn MII rất rõ ràng E.González và cs nghiên cứu ñề tài năm 2012

“khả năng phát triển của trứng dê non ñược chọn lựa bằng BCB (Brilliant Cresyl Blue) và nuôi với môi trường có bổ sung systeamine” Tác giả ñưa ra kết luận: Trong môi trường có thêm BCB và systeamine ñể nuôi trứng dê thì trứng dê non phát triển tốt hơn môi trường bình thường Yohan Rusiyantono

và cs thuộc khoa Chăn nuôi Thú y, khoa Nông nghiệp – Trường ðại học Tadulako – Indonesia ñã công bố kết quả công trình nghiên cứu “sự ảnh hưởng của môi trường CR1aa trong nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm và những phát triển bước ñầu của trứng dê trong phòng thí nghiệm” (Yohan R

và cs, 2003) Ông ñã ñưa ra thí nghiệm so sánh việc nuôi thành thục trứng non bằng hai loại môi trường là TCM199 và CR1aa Sau khi nuôi, kết quả không

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 27

có sự khác biệt nhiều giữa hai môi trường này Tuy nhiên sự phát triển về sau này của phôi (giai ñoạn thụ tinh và nuôi phôi) thì những trứng nuôi ở môi trường CR1aa cho khả năng thành công cao hơn

Năm 2004, Herrick và cs công bố kết quả nghiên cứu ñề tài trên tạp chí

PUBMED “Sự ảnh hưởng của việc bổ sung các ñại phân tử trong suốt quá

trình nuôi thành thục trứng dê non tới tiềm năng phát triển” Ông ñã ñưa ra 3 thí nghiệm nuôi thành thục trứng bằng môi trường TCM199 Thí nghiệm 1:

Bổ sung thêm 10% huyết thanh dê hoặc dịch ống dẫn trứng nhân tạo (mSOFmat) với 2,5; 8, hoặc 20 mg/ml huyết thanh bê (BSA) Thí nghiệm 2:

Bổ sung mSOFmat với 4; 8; 12 hoặc 16 mg/ml BSA Thí nghiệm 3: Bổ sung

1 mg/ml Polyvinyl alcohol (PVA; coltrol), 4 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml Hyaluronate với 0,5 mM citrate Nuôi trứng trong cùng ñiều kiện nhiệt ñộ, thời gian… và ông thu ñược kết quả: Ở thí nghiệm 1, lượng BSA bổ sung bằng 2,5 hoặc 8 mg/ml vào dung dịch cho kết quả tốt hơn bổ sung 20 mg/ml Với 2 thí nghiệm sau ñều cho kết quả tương tự như nhau

Năm 2006 S.D.Kharche và cs công bố kết quả trên tạp chí ELSEVIER

ñề tài “nuôi thành thục trứng non dê cừu trong các nồng ñộ huyết thanh dê khác nhau” Ông chọn lựa và thu hoạch trứng dê từ lò mổ, chọn những trứng ñạt tiêu chuẩn loại 1 (COCs) và chia thành 4 nhóm Nhóm 1 (n=105)(ñối chứng), nuôi trong môi trường TCM199 không bổ sung huyết thanh Nhóm 2,3,4 (n>100), trứng ñược rửa 5 lần rồi nuôi trong môi trường TCM199 có bổ sung huyết thanh dê (EGS) với các nồng ñộ: 10%, 15%, 20% Sau 24 – 27 tiếng nuôi, trứng ñược bổ sung thêm 0,1% Hyaluronidaza và ñem cố ñịnh, nhuộm orcein Kết quả cho thấy có sự khác biệt lớn giữa lô ñối chứng và lô thí nghiệm Các lô thí nghiệm cho tỷ lệ nuôi trứng thành công cao hơn lô ñối chứng từ 61 – 78% Lô 2 và 3 không có sự khác biệt lớn nhưng lô 3 thì cho

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 28

kết quả nuôi thành công hơn rõ rệt Như vậy việc bổ sung EGS vào môi trường là rất cần thiết và nồng ñộ khuyến cáo bổ sung là 20%

Năm 2007, Z G Wang và cs – Trường ðại học Zhejiang, Hang Zhou, Trung Quốc công bố kết quả nghiên cứu “ảnh hưởng của phương pháp thu trứng và phương tiện nuôi trong nuôi thành thục trứng non và sự phát triển về sau của trứng dê boer” trên tạp chí khoa học ñộng vật (Journal Animal Science) Ông làm thí nghiệm với các cách lấy trứng khác nhau (cắt lát, chọc, hút cách I và hút cách II) (thí nghiệm 1) Trứng thu ñược ñược ñếm tổng số và phân loại ra Trứng loại 1 ñược ñem nuôi cấy trong các môi trường (TCM199 + 1UI/ml FSH), (TCM199 + 10 ng/ml EGF), (TCM199 + 10 ng/ml EGF + 1UI/ml FSH), (TCM199 + 10% FCS), (TCM199 + 10% FCS + 1UI/ml FSH) Kết quả cho thấy phương pháp cắt lát và chọc cho kết quả cao hơn hẳn (6,3

và 5,8 trứng/buồng trứng) so với hai phương pháp chọc hút (2,9 và 3,1 trứng/ buồng trứng) Môi trường có mặt FSH cho kết quả nuôi trứng tốt hơn những môi trường còn lại

Năm 2010 M.Khatun và cs thuộc trường ðại học Nông nghiệp Bangladesh công bố công trình nghiên cứu trên tạp chí khoa học công nghệ thú y (journal of veterinary science) “nuôi thành thục trứng non và thụ tinh ống nghiệm trứng dê Bengal ñen hậu bị và trưởng thành” Các tác giả ñã thu lượm 31 buồng trứng dê nhỏ và 61 buồng trứng dê Bengal ñen lớn từ lò mổ Sau khi phân tích, thu lượm trứng và nuôi cấy, kết quả cho thấy tỷ lệ số trứng chuyển sang MII của dê trưởng thành cao hơn của dê non (66,3% và 60,3%, P<0,05)

M.T.Paramio công bố công trình “Những sản phẩm mô phôi dê nuôi trong phòng thí nghiệm và bản ñộng vật” ñược ñăng trên tạp chí ELSEVIER Tác giả cũng ñã nghiên cứu cho ra một quy trình chuẩn ñể nuôi trưởng thành trứng trong ống nghiệm và ông cũng kết luận rằng trứng thu ñược từ dê