KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (DL và DLS) đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường típ 2 của cao chiết hạt cà phê xanh

Mặc dù đã có những tiến bộ đáng kể trong điều trị bệnh tiểu đường bằng các thuốc đườnguống nhưng việc tìm kiếm các loại thuốc mới vẫn tiếp tục vì những hạn chế docác tác dụng bất lợi và

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

-

 -ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TÍP 2 CỦA

CAO CHIẾT HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

-

 -ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TÍP 2 CỦA

CAO CHIẾT HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn hai thầy đã hướng dẫn tôi trong

khóa luận này là PGS.TS Bùi Thanh Tùng và PGS.TS Vũ Mạnh Hùng và các thầy cô trong Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng khoa Y Dược Các thầy

cô là người trực tiếp hướng dẫn khoa học đã luôn dành nhiều thời gian, côngsức hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đềtài nghiên cứu khoa học Thầy cô cũng là người luôn quan tâm, tận tình chỉbảo những kĩ năng, kiến thức không chỉ trong khóa luận này mà còn địnhhướng cho tôi trên con đường tương lai sắp tới, giúp tôi vững tin trên conđường phía trước

Tôi xin trân trọng cám ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược cùng toàn thểcác thầy cô giáo công tác trong khoa đã tận tình truyền đạt những kiến thứcquý báu, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tuy có nhiều cố gắng, nhưng trong đề tài nghiên cứu khoa học nàykhông tránh khỏi những thiếu sót Em kính mong quý thầy cô, các chuyên gia,những người quan tâm đến đề tài, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè tiếp tục cónhững ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài được hoàn thiện hơn

Một lần nữa em xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2020

Sinh viên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

Chương I: TỔNG QUAN 2

1 Bệnh tiểu đường 2 1.1 Khái niệm 2

1.2 Phân loại 2

1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh tiểu đường típ 2 3

1.3.1 Thừa cân và béo phì 3

1.3.2 Tuổi 3

1.3.3 Tiền sử gia đình 4

1.3.4 Yếu tố gen 4

1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực 4

1.4 Cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2 4

1.5 Các biến chứng bệnh tiểu đường 6

1.6 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường 6

1.6.1 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 1 6

1.6.2 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 2 7

1.7 Dịch tễ học 7

2 Mô hình gây tiểu đường 8

2.1 Tác nhân hóa học 9

2.2 Phẫu thuật gây tiểu đường 12

2.3 Tiểu đường do di truyền 12

3 Tổng quan về enzym α–glucosidase và chất ức chế enzym α- glucosidase 12

3.1 Enzym và chất ức chế enzym 12

3.2 Enzym α–glucosidase 13

3.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidase 14

4 Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 16

4.1 Quá trình oxy hóa trong cơ thể 16

4.2 Cơ chế chống oxy hóa 17

4.3 Các chất chống oxy hóa 17

4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 19

5 Quan niệm về tiểu đường của đông y 21

6 Cây cà phê vối (Coffea canephora )– hạt cà phê xanh 22

6.1 Cây cà phê vối (Coffea canephora ) 22

6.2 Đặc điểm thực vật và phân bố cây cà phê vối 23

Đặc điểm thực vật của cây cà phê vối 23

6.3 Thành phần hóa học của hạt cà phê 24

6.4 Tác dụng dược lý 26

Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

1 Đối tượng nghiên cứu 28

1.1 Mẫu nghiên cứu 28

1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 29

1.3 Động vật thí nghiệm 29

2 Phương tiện nghiên cứu 30

2.1 Hóa chất và thuốc thử 30

2.2 Thiết bị và dụng cụ 30

3 Phương pháp nghiên cứu 31

3.1 Xây dựng mô hình chuột tiểu đường típ 2 31

3.2 Đánh giá tác dụng hạ glucose của dịch chiết hạt cà phê xanh 32

3.3 Đánh giá tác tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo phương pháp DPPH 33

3.4 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết

hạt cà phê xanh 35

4 Phương pháp xử lý số liệu 36

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

1 Kết quả 37

1.1 Quy trình chiết, tách hạt cà phê xanh bằng ethanol 37 1.2 Xây dựng mô hình tiểu đường típ 2 thực nghiệm 37

1.3 Tác dụng của cao chiết hạt cà phê xanh trên chuột nhắt thực nghiệm38 1.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo phương pháp DPPH 41

1.5 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt cà phê xanh 42

2 Bàn luận 44

Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47

1 Kết Luận 47

2 Đề Xuất 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

DMSO Dimethyl sulfoxid

EtOAc Ethyl Acetate

EtOH Ethanol

FDA Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ

HPTLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%)

IU Đơn vị quốc tế (Interational Unit)

mTOR Mammalian target of the rapamycin

n-BuOH n-buthanol

RNS Nitrogen hoạt tính

ROS Oxy hoạt tính

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1 1 Các biến chứng của bệnh tiểu đường 6

Hình 1 3 Công thức hóa học của Streptozocin 9

Hình 1 4 Công thức hóa học của Alloxan 10

Hình 1 5 Công thức hóa học của Acarbose 14

Hình 1 6 Cây cà phê vối (Coffea canephora) 23

Hình 1 7 Cấu trúc phân tử của acid clorogenic 25

Hình 1 8 Cấu trúc phân tử của Cafein 25

Hình 2 1 Cây cà phê vối (Coffea canephora) 28

Hình 2 2 Hạt cà phê vối (Coffea canephora) 28

Hình 2 3 Chuột nhắt trắng chủng Swiss 29

Hình 2 4 Chuột được tiêm màng bụng Alloxan monohydrate 31

Hình 3 1 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do DPPH của cao chiết toàn phần, các phân đoạn của hạt cà phê xanh và axit ascorbic 41

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Các chất tự nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzym α – glucosidase 15Bảng 1 2 Các chất chống oxy hóa nội sinh 18Bảng 1 3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 20

Bảng 1 4 Các chất thơm trong cà phê rang Coffea canephora và Coffea arabica 26

Bảng 3 1 Sự thay đổi nồng độ glucose huyết trước và sau 72 giờ tiêm

Alloxan 38Bảng 3 2 Chỉ số đường huyết của chuột tiểu đường do Alloxan gây ra trước

và trong 28 ngày điều trị bằng thuốc và cao chiết hạt cà phê 39Bảng 3 3 Trọng lượng của chuột trước và sau 28 ngày điều trị 40Bảng 3 4 Giá trị IC50 của cao chiết toàn phần và các phân đoạn của hạt cà phêxanh và axit Ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH 42Bảng 3 5 Kết quả IC50 của cao chiết của hạt cà phê xanh và Acarbose 42

MỞ ĐẦU

Ngày nay, bệnh tiểu đường hay còn gọi là tiểu đường ngày càng phổ biến

và có sự gia tăng về tỉ lệ và mức độ ảnh hưởng đến sức khỏe Tiểu đường là mộttrong những nguyên nhân gây tử vong và gây ra các biến chứng bệnh trầm trọngảnh hưởng đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống của người bệnh Mặc dù

đã có những tiến bộ đáng kể trong điều trị bệnh tiểu đường bằng các thuốc đườnguống nhưng việc tìm kiếm các loại thuốc mới vẫn tiếp tục vì những hạn chế docác tác dụng bất lợi và chi phí điều trị của các thuốc đang được sử dụng [60]

Ở Việt Nam, các bệnh nhân mắc bệnh mãn tính thường có xu hướng sửdụng các loại thuốc Đông Y hoặc thuốc Y học cổ truyền có nguồn gốc từ tựnhiên do độc tính thấp, rẻ tiền và sẵn có của chúng để giảm bớt các gánh nặng

về kinh tế khi sử dụng các thuốc tân dược[40] Vì vậy, trong những năm gầnđây đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành để đánh giá tiềm năngcủa các hợp chất tự nhiên được tìm thấy từ cây cỏ để chữa bệnh béo phì và tiểuđường mà ít gây tác dụng phụ, đồng thời tác dụng của thuốc có hiệu quả trongthời gian kéo dài điển hình như: Thân cây Ý dĩ, thân cây Mướp đắng, quả câyChuối hột [14], [18], [21] Các nghiên cứu này đã cho thấy kết quả khả quan, cóthể dần dần đưa vào sử dụng lâm sàng [4]

Cây cà phê là loài cây công nghiệp khá phổ biến ở nước ta, được trồngnhiều ở vùng Tây Nguyên Trong đó, 3 loài cà phê được trồng nhiều nhất ở nước

ta là cà phê chè (coffea arabica), cà phê vối (coffea canephora), cà phê mít (coffea excels) Loài được trồng nhiều, cho năng suất cao là cà phê vối (coffea canephora) Cây cà phê là loài cây thân gỗ hoặc cây bụi chứa nhiều thành phần

có tác dụng điều trị nhiều bệnh Một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằngcây cà phê có tác dụng trên tim mạch, thần kinh, hô hấp… Nhưng qua tìm hiểuthì tại Việt Nam chưa có nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa, hạ đườnghuyết của hạt cà phê xanh để phục vụ cho việc phát triển thành sản phẩm có

tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường Do đó, đề tài nghiên cứu khoa học:

“Đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường type 2 của cao chiết

hạt cà phê xanh (Coffea canephora)” được thực hiện nhằm các mục tiêu sau:

1 Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của cao chiết hạt cà phê xanh

trên mô hình in vivo của chuột nhắt bị tiểu đường bằng Alloxan.

2 Đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro theo phương pháp DPPH.

3 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro.

Chương I: TỔNG QUAN

1 Bệnh tiểu đường

1.1 Khái niệm

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) “Tiểu đường là một rối loạn chuyển hóa

do rất nhiều nguyên nhân, được mô tả là sự tăng đường huyết mạn tính cùng vớirối loạn chuyển hóa carbohydrat, chất béo và protein, nó là hậu quả của sự suygiảm tiết insulin và giảm hoạt tính insulin” [57]

Theo định nghĩa của Hiệp hội Đái Tháo Đường Hoa Kỳ năm 2019(American Diabetes Association - ADA): “Tiểu đường là bệnh rối loạn chuyểnhóa đặc trưng bởi sự tăng đường huyết, gây ra bởi sự giảm tiết insulin và/hoặcgiảm hoạt tính của insulin Sự tăng đường huyết mạn tính dẫn đến những tác hạilâu dài, rối loạn hoặc suy yếu chức năng các cơ quan đặc biệt là mắt, thận, hệthần kinh, tim và mạch máu” [30]

Theo hướng dẫn của bộ y tế Việt Nam: “Bệnh tiểu đường là bệnh rối loạnchuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết

về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai Tăng glucose mạn tính trongthời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrat, protid, lipid,gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận,mắt, thần kinh” [7]

Tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa của cơ thể, đặc trưng bởi sự tăngglucose trong máu Bệnh gây ra nhiều biến chứng phức tạp trên nhiều bộ phậncủa cơ thể

1.2 Phân loại

Tiểu đường nguyên phát [2], [6], [7], [30]

- Tiểu đường típ 1: do phá hủy tế bào β đảo tụy, thường dẫn đến sự thiếuinsulin tuyệt đối

- Tiểu đường típ 2: do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nềntảng đề kháng insulin

- Tiểu đường thai kỳ: được chẩn đoán trong khoảng từ tháng thứ ba đến tháng thứ chín của thai kỳ và được phát hiện lần đầu trong lúc mang thai

Tiểu đường thứ phát:

Bệnh tiểu đường do các nguyên nhân khác: giảm chức năng tế bào β dokhiếm khuyết gen; bệnh nội tiết; tăng đường huyết do thuốc và hóa chất như sửdụng glucocorticoid, trong điều trị HIV/AIDS hoặc sau khi ghép tạng

1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh tiểu đường típ 2

Bệnh tiểu đường típ 2 hay còn gọi là tiểu đường không phụ thuộc insulinthường thấy ở người trên 40 tuổi và có thể trạng béo Bệnh tiểu đường típ 2 làmột rối loạn mạn tính mà nguyên nhân được cho là do có sự tương tác giữ yếu

tố gen và yếu tố môi trường [24]

1.3.1 Thừa cân và béo phì

Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân (BMI từ 25 – 30 kg/m2) và béo phì(BMI >30 kg/m2) trên thế giới đã được dự đoán là sẽ tăng lên 57% vào năm

2030 Thừa cân và béo phì dẫn tới viêm, tăng tiết từ mô mỡ các hoạt chấtnhóm adipocytokyne Tất cả những hiện tượng này đều có vai trò gây ra khánginsulin ở gan, mô cơ và làm tăng nguy cơ dẫn đến bệnh tiểu đường [58] Theokhuyến cáo của tổ chức y tế thế giới, đối với người châu Á, BMI từ 23-25kg/m2 là thừa cân và trên 25 kg/m2 là béo phì [24]

Đặc điểm của đa số bệnh nhân tiểu đường ở Việt Nam thường có BMIbình thường nhưng lượng mỡ của cơ thể thường cao, đặc biệt là ở phụ nữ [36].Nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy những người có BMI > 23 kg/m2 thì có nguy

cơ mắc tiểu đường typ 2 cao gấp 2,89 lần so với người bình thường

1.3.2 Tuổi

Nguy cơ tiểu đường tăng cùng với tuổi do tăng tính kháng insulin liênquan tới béo phì và tình trạng ít vận động Cùng với thời gian, các tế bào β suyyếu do chúng phải tăng tiết insulin để bù đắp cho sự tăng mức độ kháng insulincủa cơ thể Ở châu Á, tỷ lệ này cao ở người trẻ tuổi và trung niên (độ tuổi laođộng sản xuất chính của xã hội) Điều này gây nên gánh nặng lớn cho các nướcChâu Á mà trong đó chủ yếu là những nước đang phát triển và kém phát triển[55]

Tại Việt nam, nghiên cứu dịch tễ bệnh tiểu đường tại 4 thành phố lớn thựchiện năm 2003 cho kết quả tỷ lệ mắc tiểu đường ở nhóm người dưới 35 tuổi là

0,9% còn ở nhóm người 45-54 tuổi là 6,5% và ở nhóm người 55-64 tuổi là10,3%.

Nghiên cứu này cũng chứng minh rằng tuổi cao là một yếu tố nguy cơ đặc biệt,

có liên quan chặt chẽ đến bệnh tiểu đường

1.3.3 Tiền sử gia đình

Tiền sử gia đình là một yếu tố quan trọng liên quan tới bệnh tiểu đường,điều này thể hiện cho vai trò của yếu tố di truyền đối với nguy cơ mắc bệnh.Những đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao nếu có ít nhất 1 người trong gia đình

bị bệnh Theo một nghiên cứu của Tạ Văn Bình và cộng sự, tiền sử gia đình có

bố mẹ hoặc con ruột, anh, chị, em ruột bị mắc tiểu đường thì có nguy cơ mắcbệnh cao gấp 3,28 lần so với nhóm bình thường không có người thân trong giađình mắc bệnh tiểu đường [36]

1.3.4 Yếu tố gen

Nghiên cứu ở các cặp sinh đôi đã cung cấp những bằng chứng thuyết phục

về những ảnh hưởng của yếu tố di truyền đối với bệnh tiểu đường Các cặp sinhđôi cùng trứng có tỷ lệ tương đồng cao hơn so với các cặp sinh đôi khác trứng

Sự tương đồng về nguy cơ mắc tiểu đường típ 2 ở người sinh đôi cùng trứng từ34- 83% và ở người sinh đôi khác trứng là 16-40% [57]

1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực

Chế độ dinh dưỡng và luyện tập phù hợp là chìa khóa để chống lại trìnhtrạng béo phì và cao huyết áp, tăng hoạt động của insulin và giảm sự tạoglucogen ở gan Hoạt động thể lực có vai trò đặc biệt quan trọng đối với bệnhtiểu đường típ 2 Nhóm đối tượng ít vận động (<30 phút/ ngày) có nguy cơmắc bệnh tiểu đường cao gấp 2,4 lần so với nhóm hoạt động nhiều Nhiềunghiên cứu đã có thấy rằng việc vận động thể lực thường xuyên có tác dụng làmgiảm nồng độ glucose máu đồng thời giúp duy trì sự ổn định của lipid máu,huyết áp và giúp cải thiện tinh thần Sự phối hợp các hoạt động thể lực và điềuchỉnh chế độ ăn phù hợp có thể giúp giảm 58% tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường típ 2[58]

1.4 Cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2

Tiểu đường típ 2 là dạng tiểu đường thường gặp nhất, chiếm khoảng 80 90% trong số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường Thông thường, với bệnh tiểuđường típ 2, trong cơ thể vẫn còn khả năng sản xuất insulin, nhưng insulin đượcsản xuất

-ra không đủ hoặc các tế bào không thể sử dụng nó và được gọi là kháng insulin [30].

Có hai yếu tố cơ bản đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh củatiểu đường típ 2 là đề kháng với insulin và suy giảm chức năng tiết insulin kếthợp với nhau [30]

Glucose đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng chính cho các tế bàotrong cơ thể Tuy nhiên để có thể nhận được glucose các tế bào phải cần đếninsulin hoạt động như một “chiếc chìa khóa” giúp glucose có thể vào được tếbào Kháng insulin có thể xảy ra ở gan và các mô ngoại vi theo các hình thứcsau: giảm sử dụng glucose ở các cơ quan, giảm thu nhận glucose ở mô ngoại vi

và khả năng ức chế sản xuất glucogen ở gan bị giảm Thừa cân và béo phì lànhững yếu tố quan trọng làm gia tăng tình trạng kháng insulin, trong đó béo phìthường là do cơ thể hấp thu quá nhiều chất béo nhưng lại ít vận động Axit béo

tự do có nhiều ở những người bệnh béo phì sẽ cạnh tranh với glucose trongchuyển hóa tại cơ vân dẫn đến sự rối loạn sử dụng glucose ở ngoại biên và gâynên tình trạng đề kháng insulin [14]

Khi cơ thể có hiện tượng kháng insulin, nồng độ glucose trong máu sẽtăng cao hơn mức bình thường Tế bào β đảo tụy lại đáp ứng bằng cách sản xuấtnhiều hơn insulin Quá trình này diễn ra kéo dài sẽ dẫn đến chức năng của tếbào β bị suy giảm Ngoài ra khi cả axit béo tự do và insulin đều tăng, quá trìnhchuyển hóa sẽ tăng lên tại ty thể, làm gia tăng các gốc tự do dẫn đến gia tăng tìnhtrạng viêm Thêm vào đó, insulin trong máu cao còn gây hiện tượng stress lướinội chất Cả hai tình trạng này đều dẫn đến kết quả là tế bào sẽ chết theo chutrình Hậu quả là tế bào β giảm tiết insulin Khi nồng độ insulin ở tế bào cửa ganthấp, gan đáp ứng bằng cách giải phóng glucose vào máu trong khi nồng độglucose đã cao sẵn sau bữa ăn Ngoài ra ở tế bào cơ vân, nồng độ insulin thấplàm glucose ít vào tế bào, góp phần dẫn đến glucose trong máu cao Trong giaiđoạn này, nồng độ insulin thấp do tụy ít sản xuất và bài tiết insulin kèm theotình trạng kháng insulin làm khả năng kiểm soát nồng độ glucose ngày càngxấu đi và có thể gây nên nhiều biến chứng nghiêm trọng cho người bệnh [14]

1.5 Các biến chứng bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường nếu không được điều trị tốt và quá trình điều trị khôngchặt chẽ sẽ gây ra các biến chứng nguy hiểm và các bệnh mạn tính, cấp tính kèmtheo Một số biến chứng cấp tính giai đoạn đầu của tiểu đường như: Nhiễm toanceton – thường xảy ra với tiểu đường típ 2, hạ đường huyết – thường gặp bệnhnhân dùng thuốc hạ đường huyết quá liều hoặc dùng thuốc trong lúc đói bỏ bữa,hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu máu Một số biến chứng mãn tính như: Biếnchứng mạch máu lớn (bệnh mạch vành, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, ), cácbệnh lý mạch máu nhỏ (bệnh lý võng mạc, bệnh lý thận, bệnh lý thần kinh,.)[2],[6] Hậu quả để lại nặng nề, gây ra gánh nặng cho người bệnh và gia đình ngườibệnh

Hình 1 1 Các biến chứng của bệnh tiểu đường.

1.6 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường

1.6.1 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 1 [2], [26]

Do tế bào β tuyến tụy bị phá hủy bởi chất trung gian miễn dịch nên cơ thểkhông có khả năng tạo ra insulin Do đó, bệnh nhân phải tiêm insulin thườngxuyên trong suốt cuộc đời để bổ xung đủ lượng insulin cho cơ thể

1.6.2 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 2 [2], [26]

Thuốc điều trị đối với nhóm đối tượng này được chia làm 3 nhóm chính:

- Nhóm thuốc kích thích tụy bài tiết insulin như nhóm sulphonylurea:gliclazid, glibenclamid, glimepiride…

- Nhóm thuốc làm tăng nhạy cảm insulin ở ngoại vi, giảm đề khánginsulin như nhóm biguanide: metformin (thuốc duy nhất được sử dụng thuộcnhóm này); nhóm thiazolidinedion

- Thuốc ức chế enzym α-glucosidase như: acarbose, voglibose, miglitollàm hấp thu chậm glucose từ ruột vào máu

Đối với bệnh nhân tiểu đường típ 2, ngoài uống thuốc điều trị cần phải kếthợp với chế độ ăn, vận động thể lực hợp lí để điều trị đạt hiệu quả tốt nhất Chế

độ ăn lành mạnh là một yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh tiểuđường, cần lựa chọn các loại thực phẩm có nhiều chất xơ, ăn nhiều đạm cónguồn gốc thực vật, ăn nhiều trái cây, ít chất béo Chế độ tập luyện thườngxuyên sẽ giúp cải thiện sức khỏe, giúp chống lại bệnh tật nhất là các bệnh vềtim mạch, xương khớp Vận động thường xuyên giúp tăng cường sức khỏe, giảmcân và giảm đường huyết nên được coi là một biện pháp quan trọng trong điềutrị bệnh tiểu đường [58] Hơn nữa, mỗi đối tượng cụ thể sẽ có bệnh lý kèmtheo cũng như thể trạng khác nhau nên việc kết hợp các thuốc trong nhóm vớinhau nhằm giảm đường huyết hữu hiệu

1.7 Dịch tễ học

Bệnh tiểu đường là căn bệnh rối loạn chuyển hóa hay gặp ở các nước pháttriển và đang phát triển gây ra các gánh nặng về tài chính, y tế, xã hội nghiêmtrọng Bệnh gây ra các biến chứng nguy hiểm liên quan mật thiết với nhau, lànguyên nhân hàng đầu về các bệnh tim mạch, cụt chi, mù lòa, suy thận

Tiểu đường trở thành bệnh lý đáng báo động nhất trên toàn thế giới từnhững năm đầu của thế kỷ 21 Theo cuộc điều tra của Liên đoàn Tiểu đườngThế giới (International Diabetes Federation - IDF): năm 2015 toàn thế giới có

415 triệu người (trong độ tuổi 20-79) bị bệnh tiểu đường (tiểu đường), tươngđương cứ 11 người có 1 người bị tiểu đường Năm 2017 dân số thế giới là 7,5

tỷ người trong đó có 425 triệu người (trong độ tuổi 20 - 79) bị bệnh tiểu đường

Dự tính đến năm

2040 con số này sẽ là 642 triệu, tương đương cứ 10 người có 1 người bị tiểuđường [8] và đến năm 2045 con số này sẽ là 629 triệu; đặc biệt trong hai ngườitrưởng thành (trong độ tuổi 20 - 79) bị tiểu đường thì có một người khôngđược chẩn đoán Đông Nam Á có số người trưởng thành bị tiểu đường cao thứhai trong các vùng theo IDF, chiếm tỷ lệ 8,5% tổng số người bị tiểu đường trênthế giới, trong đó khoảng 45,8% các trường hợp bị tiểu đường không đượcchẩn đoán và gần 48,8% người trưởng thành mắc bệnh tiểu đường sống ở cácthành phố [42].

Tại Việt Nam, trong kết quả công bố của “Dự án phòng chống tiểu đườngquốc gia” do Bệnh viện Nội tiết Trung ương thực hiện năm 2012 trên 11000người trong độ tuổi 30 - 69 sống tại 6 vùng miền gồm: miền núi phía Bắc,đồng bằng sông Hồng, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ vàTây Nam Bộ đã cho thấy tỷ lệ hiện mắc tiểu đường trên toàn quốc ở ngườitrưởng thành là 5,42%, tăng gấp gần hai lần so với tỷ lệ tiểu đường năm 2012 là2,7% Ngoài ra, tỷ lệ tiểu đường chưa được chẩn đoán trong cộng đồng lên tới63,6% [3] Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose trong cả nước là 7,3%, rối loạnglucose máu lúc đói 1,9% (năm 2003) Theo kết quả điều tra của Bộ Y tế, hiệphội Nội tiết – Tiểu đường Việt Nam, nước ta hiện có hơn 3,16 triệu người mắcbệnh tiểu đường Tỷ lệ này đang chiếm hơn 5% dân số trưởng thành trong độtuổi 20-79 Và tỷ lệ người mắc bệnh tiểu đường ngày càng trẻ hoá Nhưng mộtđiều đáng mừng là có tới 70% trường hợp tiểu đường típ 2 có thể dự phònghoặc làm chậm xuất hiện bệnh bằng tuân thủ lối sống lành mạnh, dinh dưỡnghợp lý và tăng cường luyện tập thể lực [8]

2 Mô hình gây tiểu đường

Thử nghiệm tiểu đường trên mô hình động vật là điều cần thiết để nângcao nhận thức và hiểu biết về các khía cạnh khác nhau của cơ chế bệnh sinh từ

đó tìm ra các liệu pháp và các phương pháp điều trị mới Hầu hết các mô hìnhhiện nay đều sử dụng động vật gặm nhấm làm đối tượng thí nghiệm do nhiều ưuđiểm của chúng như kích thước nhỏ, khoảng cách thế hệ ngắn, tính sẵn có và chiphí thấp Bệnh tiểu đường thực nghiệm thường được gây ra ở động vật thínghiệm bằng các phương pháp phổ biến như: tác nhân hóa học, phẫu thuật, ditruyền [45]

2.1 Tác nhân hóa học

Các tác nhân hóa học gây ra tiểu đường có thể phân thành ba loại: phá hủy

tế bào β đảo tụy, gây ức chế tạm thời việc sản xuất và/hoặc tiết insulin, làm giảmchuyển hóa insulin trong mô đích

Streptozocin (STZ 61%) và Alloxan (31%) cho đến nay là những thuốcđược sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về bệnh tiểu đường và giúp íchcho nghiên cứu nhiều khía cạnh của bệnh Các loại thuốc này có thể được đưavào cơ thể bằng cách tiêm tĩnh mạch, tiêm màng bụng hoặc tiêm dưới da Liềucần thiết để gây ra bệnh tiểu đường phụ thuộc vào loại động vật, đường dùngthuốc và tình trạng dinh dưỡng Tùy theo liều dùng của các thuốc này mà cáchội chứng tương tự như tiểu đường típ 1, tiểu đường típ 2 hoặc không dung nạpglucose có thể được gây ra Tác dụng gây độc tế bào của các loại thuốc này đềuqua trung gian là các phản ứng oxy hóa nhưng chúng có sự khác nhau về cơ chếhoạt động [45]

 Streptozotocin

Streptozotocin (STZ) là chất hóa học thuộc nhóm hợp chất glucosaminenitrosorea, có công thức hóa học là C8H15N3O7, đã được thử nghiệm lâm sàng từnăm 1967 STZ tồn tại trong tự nhiên, chúng có khả năng gây độc đặc hiệu với tếbào β sản xuất insulin của tuyến tụy ở động vật có vú STZ được phát hiện cótrong một chủng vi khuẩn có tên là Streptomyces achromogenes vào những năm

50 của thế kỷ 20, hiện nay STZ đang được sử dụng trong y tế để điều trị một sốung thư trên đảo tụy Langerhan và là chất gây tiểu đường được sử dụng phổbiến nhất và có hiệu quả trên các mô hình động vật thực nghiệm, nhằm phục vụcho các nghiên cứu y học [56]

Hình 1 2 Công thức hóa học của Streptozocin

STZ xâm nhập vào tế bào β đảo tụy thông qua chất vật chuyển glucose GLUT2 và gây ra sự alkyl hóa axit deoxyribonucleic (DNA) Ngoài ra, STZ còngây kích hoạt sự ribosyl hóa poly adenosin diphosphat và giải phóng nitric oxid.Kết quả là tế bào tụy bị phá hủy do hoại tử [45]

-Sử dụng STZ trong mô hình bằng nhiều phương pháp:

- STZ cho chuột mới sinh: Mô hình tiêm STZ cho chuột mới sinh (với sựthay đổi liều và ngày tiêm STZ) biểu hiện các giai đoạn khác nhau của tiểuđường típ 2 như làm giảm dung nạp glucose, glucose máu giảm nhẹ/ trungbình/ nặng Các tế bào β ở chuột mới sinh tiêm STZ có sự tương đồng về đặcđiểm bài tiết insulin ở bệnh nhân tiểu đường típ 2 [31], [61]

- Kết hợp Nicotinamid - Streptozocin (NAD - STZ): Nicotinamid là mộtchất chống oxy hóa có tác dụng bảo vệ bằng cách làm sạch các gốc tự do và do

đó bảo vệ được một phần tế bào β khỏi tác động gây độc tế bào của STZ [52]

Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiến hành tiêm thuốc mà có thể gây

mô hình động vật tiểu đường típ 1 hoặc tiểu đường típ 2 Liều trên chuột nhắtdao động từ 100 - 150 mg/kg [29], trên chuột cống dao động từ 40 - 100 mg/kg[28]

Một vấn đề khi sử dụng STZ là tác dụng độc hại của nó không giới hạn ởtuyến tụy vì nó có thể gây tổn thương thận, gây viêm và rối loạn chức năng nộimô

 Alloxan

Alloxan, đôi khi được gọi là alloxan hydrate; 2,4,5,6-Tetraoxypyrimidine;2,4,5,6-pỷimidinetetrone; Axit 5,5-dihydroxybarbituric Nó là dẫn xuất của axituric, không bền ở pH trung tính, khá ổn định ở pH=3

Hình 1 3 Công thức hóa học của Alloxan

Alloxan cũng giống như streptozotocin là những hóa chất gây tiểu đườngnổi bật nhất trong nghiên cứu bệnh tiểu đường Cả hai đều là chất tương tựglucose gây độc tế bào Mặc dù độc tính tế bào của chúng đạt được thông quacác con đường khác nhau, cơ chế hoạt động chọn lọc tế bào β của chúng là giốnghệt nhau

Alloxan tác động trên tế bào qua bốn giai đoạn [54]:

Giai đoạn thứ nhất: hạ đường huyết thoáng qua đầu tiên lên đến 30 phútbắt đầu trong vòng vài phút sau khi tiêm Alloxan Phản ứng hạ đường huyếttrong thời gian ngắn này là kết quả của sự kích thích thoáng qua bài tiếtinsulin, được ghi nhận bằng sự gia tăng nồng độ insulin trong huyết tương Cơchế cơ bản của chúng là giảm tiêu thụ tạm thời và tăng khả năng tiêu thụATP do ức chế quá trình phosphoryl hóa glucose thông qua ức chế glucokinase.Giai đoạn hạ đường huyết thoáng qua ban đầu này không được quan sát khigây mô hình tiểu đường bằng streptozotocin, vì streptozotocin không ức chếglucokinase Sự thay đổi hình thái là tối thiểu trong giai đoạn này

Giai đoạn thứ hai bắt đầu với sự gia tăng nồng độ glucose trong máu, 1 giờsau khi tiêm alloxan và giảm insulin huyết tương Giai đoạn tăng đường huyếtnày, thường kéo dài 2 - 4 giờ, được gây ra bởi sự ức chế bài tiết insulin dẫnđến hạ đường huyết Trong giai đoạn này, các tế bào β cho thấy các đặc điểmhình thái thay đổi như: không bào nội bào, giãn màng lưới nội chất thô, giảmdiện tích Golgi, giảm bài tiết và hàm lượng insulin, ty thể bị sưng…

Giai đoạn thứ ba, một lần nữa là giai đoạn hạ đường huyết, thường xảy rasau khi tiêm alloxan và kéo dài vài giờ Nó có thể gây co giật và thậm chí có thểgây tử vong nếu không sử dụng glucose, đặc biệt là khi glycogen ở gan bị cạnkiệt do đói Sự hạ đường huyết nghiêm trọng này được tạo ra do lưu thônginsulin (kết quả của việc tiết ra chất độc làm vỡ màng tế bào) Ngoài những thayđổi về hình thái được thấy trong giai đoạn đầu tiên, các nhân tế bào β có hìnhchóp và không có màu dương tính với TUNEL

Giai đoạn thứ tư là giai đoạn tăng đường huyết vĩnh viễn Sự thoái hóahoàn toàn và mất tính toàn vẹn của tế bào β được nhìn thấy trong 48-72 giờ saukhi tiêm Alloxan Các tế bào khác vẫn còn nguyên vẹn, thể hiện tính chất chọnlọc tế bào β Các mảnh vụn tế bào có nguồn gốc từ các tế bào β bị phá hủy đượcloại bỏ bởi các đại thực bào

2.2 Phẫu thuật gây tiểu đường

Phương pháp này bao gồm cắt bỏ hoàn toàn hoặc một phần tụy để gây tiểuđường típ 1 hoặc típ 2 Trong lịch sử, mô hình mắc bệnh tiểu đường ở chó đượcOskar Minkowski phát hiện thông qua phẫu thuật cắt bỏ tụy được coi là mô hìnhđộng vật đầu tiên về bệnh tiểu đường [51] Một số nhà nghiên cứu đã sử dụng

mô hình này để thử nghiệm các sản phẩm tự nhiên trên chuột, chó, linh trưởng[48], [77]

2.3 Tiểu đường do di truyền

Các động vật mắc bệnh tiểu đường típ 2 có thể được lấy từ việc chọngiống (các động vật có một hoặc một số gen đột biến được truyền từ thế hệ nàysang thế hệ khác) hoặc từ lai tạo chuột ob không bị tiểu đường bằng nhân giốnglặp đi lặp lại qua nhiều thế hệ với chuột BB, chuột tiểu đường béo phìTsumara Suzuki Những động vật này bị tiểu đường là do di truyền hoặc dokhiếm khuyết đơn hoặc đa gen (chuột KK, chuột db/db hoặc chuột béo Zucker).Bệnh tiểu đường típ 2 ở người phần lớn là kết quả của sự tương tác giữa môitrường và sự khiếm khuyết đa gen Do đó, động vật khiếm khuyết đa gen sẽgần giống với người hơn động vật khiếm khuyết đơn gen [71]

3 Tổng quan về enzym α–glucosidase và chất ức chế enzym glucosidase

α-3.1 Enzym và chất ức chế enzym

Enzym là chất xúc tác sinh học được hình thành trong tế bào sinh vật cócấu trúc đặc thù và có thành phần cơ bản là protein Trong tế bào sinh vật luônxảy ra quá trình trao đổi chất, nhờ có enzym mà nhiều phản ứng hóa học xảy ranhanh chóng với hiệu suất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, ápsuất, pH Các phân tử tham gia vào ngay lúc đầu của quá trình phản ứng đượcgọi là chất nền và enzym biến đổi chất nền thành các phân tử khác Chúng cóthể được thu nhận từ các cơ thể sống khác nhau của động vật, thực vật và visinh vật [27] Enzym có tính đặc hiệu và chọn lọc rất cao đối với các chất nềncủa nó [19] Vì vậy trong cơ thể sinh vật enzym có chức năng xúc tác chọn lọc,đóng vai trò định hướng tất cả các phản ứng xảy ra trong tế bào Khi ở ngoài tếbào, nhiều enzym vẫn có khả năng hoạt động tương tự [75]

Chất ức chế enzym là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàntoàn tác dụng của enzym Các chất ức chế enzym có bản chất hóa học rất khácnhau, chúng có thể là các cation, các anion, các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏhoặc thậm chí là các protein Chất ức chế có thể có phản ứng thuận nghịch hoặckhông thuận nghịch với enzym Thông thường được phân chia thành hai loại ứcchế thuận nghịch là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh [76].

Đối với chất ức chế cạnh tranh: chất kìm hãm có cấu trúc tương tự cơchất, gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzym, gây giảm chức năngxúc tác của enzym

Đối với chất ức chế không cạnh tranh: chất kìm hãm gắn thuận nghịch vào

vị trí khác trên enzym (vị trí dị lập thể) chứ không gắn vào vị trí xúc tác và làmthay đổi cấu hình vị trí hoạt động của enzym khiến chúng không phù hợp để cơchất gắn vào Dù theo hình thức ức chế nào thì khi chất kìm hãm được giảiphóng, hoạt động xúc tác của enzym sẽ bình thường trở lại [19]

3.2 Enzym α–glucosidase

Enzym α-glucosidase có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase,glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α-glucopyranosidase,glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, thuộc nhómhydrolase (nhóm enzym làm gẫy các liên kết bằng thủy phân) [64]

Enzym α-glucosidase là enzym 1 thành phần, có hoạt tính exohydrolysis,xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khửcủa carbonhydrate để giải phóng phân tử α-D-glucose Chất nền đặc trưng củaenzym này là các disaccharide, oligosaccharide, các aryl và akyl- α-glucosidasekhác [74]

Enzym α-glucosidase là một trong những enzym thuộc lớp glycosidehydrolase – là một lớp các enzym thường tách liên kết glycoside giữa 2 phân tửcarbohydrate, một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các polymer

tự nhiên Các enzym này có khả năng bẻ gãy các liên kết glycoside nhanh hơn10- 17 lần so với phản ứng không có enzym xúc tác [34]

Nguồn gốc, phân bố: Enzym α-glucosidase được tìm thấy trên màng bềmặt của đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa [10]

(α-Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase có thể làmgiảm sự thủy phân của carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu[34].

3.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidaseglucosidase

Một số chất tổng hợp được sử dụng để ức chế hoạt động của enzym nàyđược được sử dụng rộng rãi như Acarbose, Miglitol, Voglibose …[2] Các chấtnày được sử dụng như một thuốc giúp điều trị tiểu đường típ 2, chúng ức chếcác enzym α-glucosidase ở ruột Acarbose là một tetrasaccharid, ít hấp thụ ởđường tiêu hóa và ức chế cạnh tranh với enzym α-glucosidase ở ruột non [26] cótác dụng chống tăng đường huyết sau ăn và không làm tăng tiết insulin, khônglàm hạ đường huyết Tuy nhiên, Acarbose có tác dụng phụ thường gặp trênđường tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng, tiêu chảy, buồn nôn… nhất là khi

ăn đường mía và thực phẩm có đường do carbohydrate không được hấp thu vàlên men ở đại tràng [26] Vì vậy, việc nghiên cứu các dược liệu có tác dụng ứcchế enzym α-glucosidase rất cần thiết để giúp quá trình điều trị tiểu đường típ 2

có nhiều lựa chọn phù hợp

Hình 1 4 Công thức hóa học của Acarbose

Ngoài các chất được tổng hợp hóa học thì trong tự nhiên cũng có nhiềuchất có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase như: flavonoid, anthocyanidin,isoflavone, phenolic, curcuminoids, terpinoid,… trong khi các chất hóa học đượctổng hợp để sử dụng gây ra nhiều tác dụng phụ cho người dùng thì việc tìm kiếmcác hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng tương tự là rất cần thiết và đượcquan tâm trên toàn thế giới [80].

Bảng 1 1 Các chất tự nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzym α – glucosidase

STT Nhóm hợp chất Tên hoạt chất

Luteolin, Apigennin,Hesperetin,Cyaniding-3-galactoside,(2R,3R,4R,5R) 2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4-dihydroxypyrrolidine,

1-deoxynojirimycin…

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axitAxit 28-O- α-larabinopyranosyl-(14)- α-1-arabinopyranosyl-(13)-β-d-xylopyranosyl- (14)-

α-lrhamnopyranosyl-(12)-β-d- fucopyranosyl ester,…

triterpenoid

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axitAxit 28-O- α-larabinopyranosyl-(14)- α-1-arabinopyranosyl-(13)-β-d-xylopyranosyl- (14)-

α-lrhamnopyranosyl-(12)-β-d- fucopyranosyl ester,…

4 Curcuminoid Curcumin Demethoxycurcumin

Bídemethoxycurcumin

5 Miscellaneous

Bromophenols2,4,6-tribromophenol2,4-dibromophenol

4 Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro

Tiểu đường là một trong những những bệnh rối loạn chuyển hóa do sảnxuất quá mức các loại oxy phản ứng (ROS) so với mức bình thường hoặc rốiloạn chức năng trong cơ chế bảo vệ chống oxy hóa hoặc cả hai xảy ra đồngthời ROS dư thừa được quét bởi các chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóachống lại các gốc tự do thông qua các cơ chế sau: suy thoái gốc tự do; nhặt cácgốc tự do… Theo một số nghiên cứu, người bệnh bị tiểu đường mức độ chốngoxy hóa giảm Điều đó góp phần gây ra các biến chứng bệnh tiểu đường nhưchấn thương mô, tổn thương tế bào, dây thần kinh [9], [82]

4.1 Quá trình oxy hóa trong cơ thể

Oxy hóa là quá trình xảy ra các phản ứng hóa học, trong đó các electronđược chuyển sang chất oxy hóa hình thành nên gốc tự do Sự gia tăng các gốc tự

do trong cơ thể sinh ra các phản ứng dây chuyền gây phá hủy tế bào

Các gốc tự do là nguyên tử, phân tử hoặc ion với các electron chưa đượcghép cặp rất không ổn định và chúng có xu hướng đạt cân bằng bằng cách lấymột electron từ một phân tử mà nó tiếp xúc Phần lớn các phân tử sinh họckhông phải là gốc

Các gốc tự do trong cơ thể có 2 nguồn gốc chính sau: nguồn gốc nội sinh

và nguồn gốc ngoại sinh

- Gốc tự do nội sinh: các gốc tự do được chính cơ thể tạo ra trong nhữngquá trình chuyển hóa tự nhiên như hô hấp tế bào (chủ yếu là superoxidesau đó H2O2), lưới nội chất (tạo thành superoxide – bởi cytochromeP450), quá trình trao đổi chất của tế bào… Trong cơ thể, ty thể là nguồntạo ra nhiều gốc tự do nội bào

- Gốc tự do ngoại sinh: Do tác động bởi các yếu tố ngoại lai như tia tử ngoại

từ ánh sáng mặt trời, thuốc lá, ô nhiễm môi trường…

Các dạng hoạt động của gốc tự do gồm có ROS (oxy hoạt tính), RNS(nitrogen hoạt tính), RSS có tác dụng chống lại vi sinh vật [12], [16], [65] Bảnchất của các gốc tự do là có khả năng phản ứng cao, thời gian tồn tại ngắn phụthuộc vào bản chất và điều kiện của hệ mà nó tồn tại [22], [65]

Cơ chế hình thành các gốc tự do trong cơ thể, gồm 3 cơ chế:

 Tạo ra từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể

 Tạo ra từ quá trình peroxyd hóa lipid

 Tạo ra từ phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể

Đích phân tử chính của các gốc tự do là protein, ADN (aciddeoxyribonucleic), ARN (acid ribonucleic), đường và lipid Những phản ứng củagốc tự do có liên quan đến nhiều bệnh nguy hiểm như ung thư, tim mạch, béophì, tiểu đường, bệnh Alzheimer, Parkinson, lupus ban đỏ, loét dạ dày…[65],[68]

4.2 Cơ chế chống oxy hóa

Các cơ chế chống oxy hóa [73]:

- Ức chế các enzym xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS

- Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đẩy quá trình chốngoxy hóa của tế bào

- Phản ứng trực tiếp với ROS/ RNS tạo ra các chất ít độc hoặc mất hoạt tính.Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa các chất oxy hóa và chất chốngoxy hóa dẫn đến sự gián đoạn chuyền tín hiệu và kiểm soát oxy hóa khử gây ranhiều thiệt hại cho các phân tử sinh học ảnh hưởng xấu đến cơ thể [78]

- Tổn hại tới lipid do bị oxy hóa: làm mất các dây nội chưa bão hòa (gâythay đổi trong tính lưu chảy và tính thấm của màng), tạo ra các chất cóhoạt tính mạnh (gây ảnh hưởng tới tính đồng nhất của enzym màng)

- Tổn hại tới protein do bị oxy hóa: làm kết tập, phân mảnh, phân táchprotein; phản ứng với ion sắt của hem; biến đổi nhóm chức năng Hậu quả:thay đổi hoạt tính enzym và phân giải protein

- Tổn hại tới DNA: bị oxy hóa làm đứt, gẫy chuỗi; tách vòng saccharide dẫnđến các đột biến, lỗi di truyền hoặc ức chế tổng hợp protein

- Các bệnh lý rối loạn: già hóa, béo phì, tiểu đường, viêm nhiễm, viêm tụycấp, các bệnh thoái hóa thần kinh (bệnh Parkinson và bệnh Alzheimers)

4.3 Các chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là các chất khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóabằng cách oxy hóa chính chúng, vì vậy người ta hay dùng các chất khử để chốngoxy hóa

 Các chất chống oxy hóa nội sinh

Các chất chống oxy hóa nội sinh do cơ thể sinh ra được chia thành 2 loại,các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym và các chất chống oxy hóa khôngphải enzym

Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym quan trọng ngăn chặn sựhình thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể là: glutathion peroxidase,catalase, superoxid dismutase, Glucose-6-phosphat dehydrogenase Các chấtchống oxy hóa không phải enzym cũng được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít

và chủ yếu được bổ sung từ thức ăn [65]

Mỗi chất chống oxy hóa có cơ chế tác dụng riêng với từng loại gốc tự dokhác nhau và có thể hiệp đồng với nhau để loại trừ gốc tự do Nhờ các chấtchống oxy hóa mà quá trình oxy hóa chỉ xảy ra ở mức độ sinh lý nhất định, khi

đó các dạng oxy hóa hoạt động thực hiện được chức năng sinh lý và duy trì được

sự cân bằng quá trình trao đổi chất Việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóamới có thể tạo ra sự kết hợp hiệu quả trong điều trị một số bệnh có liên quan đếnquá trình oxy hóa trong cơ thể

Bảng 1 2 Các chất chống oxy hóa nội sinh

 Chất chống oxy hóa trong hóa dược

Thuốc chống viêm: Theo nghiên cứu, nhóm thuốc nàyđược chứng minh là có tác

dụng chống oxy hóa và được chia thành 3 nhóm:

 Nhóm 1: Những chất làm giảm gốc O ●

,indomethacin, ibubrofen…

●OH, H2O2 như aspirin,

Các chất chống oxy hóa tổng hợp: BHA (butylated hydroxyanisole), BHT

(butylated hydroxytoluene), PG (propyl gallate), OG (octyl gallate), TBHQ (tert –butylhydroquinon)…

 Các chất oxy hóa có nguồn gốc thực vật

Trong thế giới thực vật có rất nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa vàthuộc nhiều nhóm khác nhau Đáng chú ý nhất là các vitamin và dẫn xuất củaphenol:

 Vitamin E: Ức chế phản ứng oxy hóa lipid, bảo vệ các tế bào và các phần

tử chức năng khỏi sự oxy hóa quá mức do đó có tác dụng chống lão hóa,kéo dài tuổi thọ

 Vitamin C: Là chất cho điện tử, có khả năng loại bỏ những gốc tự do ởpha nước của tế bào, có khả năng tái tạo Vitamin E từ dạng oxy hóa vềdạng khử [35]

 Flavonoid: Là một nhóm các phenolic thực vật có tác dụng chống oxy hóa

và tạo phức chelat rất đáng chú ý Chúng tập trung nhiều nhất trong cácloại trái cây, rau quả, rượu, trà và cacao Flavonoid tồn tại trong thựcphẩm dưới dạng glycoside và polymer, được thoái hóa ở nhiều mức độkhác nhau trong đường tiêu hóa Xu hướng ức chế quá trình trung giantạo gốc tự do của một số flavonoid bị chi phối bởi cấu trúc hóa học của

nó (cấu trúc nhân flavan, số lượng và vị trí các nhóm thế) Một sốflavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao EGCG trong chè xanh,Genistein trong đậu nành, quercetin, resveratrol [69]

 Xanthan: Là một hợp chất phenol thực vật có hoạt tính chống oxy hóa, cómặt trong một số thực vật nhiệt đới

Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiêncũng có tác dụng chống oxy hóa như carotenoid, acid phenolic, lignin…

4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro

Đánh giá khả năng chống oxy hóa có rất nhiều phương pháp thường được sử

dụng, chúng được chia thành 2 loại: phương pháp in vitro và phương pháp in vivo [63]:

20 2

Bảng 1 3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

Các phương pháp in vitro Các phương pháp in vivo

Ưu điểm: Nhanh, cho kết quả khá chính xác, dễ thực hiện và không tốnkém Tuy nhiên, DPPH không tồn tại trong cơ thể sống nên phép thử này chỉmang ý nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử Dùng trongsàng lọc các mẫu dược liệu [22], [49], [63], [65]

Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O 2 ●

Nguyên tắc: Gốc tự do O

● được hình thành trong quá trình oxy hóa xanthin

●thành acid uric được xúc tác bởi enzym xanthinoxidase Gốc O2 tạo thành phảnứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp thụ ở bước sóng 560 nm, đo hấp thụ quang của dung dịch phản ứng tại bước sóng 560 nm

sẽ biết

●

lượng O2 tham gia phản ứng [22], [50], [63], [65]

ở bước sóng 532 nm Đo hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng 532 nm sẽcho biết nồng độ MDA được tạo ra sau quá trình oxy hóa Từ đó tính được mức

độ deoxyribose bị oxy hóa và mức độ dọn gốc tự do ●OH của mẫu thử

Ưu điểm: Nhanh chóng, dễ thực hiện, chi phí thấp Tuy nhiên gốc ●OH cóhoạt tính rất mạnh nên rất khó để đánh giá mức độ tác dụng và kết quả ít chínhxác hơn các thử nghiệm khác [22], [49], [63], [65]

5 Quan niệm về tiểu đường của đông y

Bệnh tiểu đường trong y học cổ truyền được gọi là chứng tiêu khát mànguyên nhân chủ yếu là do ăn uống không điều độ, ăn nhiều các chất cay nóng,béo, ngọt, do lao lực, do căng thẳng thần kinh tạo thành hỏa nhiệt, uất nhiệt làmphần âm của phủ tạng: phế, vị, thận bị hao tổn Hải Thượng Lãn Ông có viếttrong cuốn Y Trung Quan Kiện như sau: “chứng bệnh tiêu khát phần nhiều dohỏa làm tiêu hao chân âm 5 chất dịch bị khô cạn mà sinh ra” [4].Muốn chữabệnh phải trị cả gốc và ngọn: trị ngọn là trị chứng khát nước, đói, tiểu nhiều.Bệnh tiểu đường trong y học cổ truyền chia ra làm ba mức độ: Nếu bệnh nhânthích uống nước nhiều thì bệnh chủ yếu ở thượng tiêu do phế âm hư; nếu thích

ăn nhiều bệnh chủ yếu ở trung tiêu do vị âm hư gây đói và gầy; nếu bị đi tiểunhiều thì bệnh chủ yếu ở phần hạ tiêu do thận âm hư không tàng trữ được tinhhoa của ngũ cốc, không làm chủ được thủy gây tiểu nhiều và nước tiểu cóđường [4]

Muốn chữa bệnh tiểu đường phải trị cả gốc và ngọn: trị ngọn là trị chứngkhát nước, đói, tiểu nhiều; trị gốc là trị phế, tỳ, thận là những cơ quan có chứcnăng chuyển hóa và điều tiết trong cơ thể

Các thuốc Đông y được sử dụng trong điều trị tiểu đường: Sử dụng thuốc

có nguồn gốc thực vật trong phòng và chữa bệnh là thói quen, kinh nghiệm vàtruyền thống của người dân Việt Nam và một số nước trên thế giới Một nghiên

cứu về vấn đề sử dụng thảo dược thường xuyên cho bệnh nhân tiểu đường đã chothấy liệu pháp thực vật là kinh tế nhất và hiệu quả hơn thuốc hiện đại [37] Có rấtnhiều loài cây đã được dùng theo kinh nghiệm dân gian để làm giảm nhẹ triệu

chứng cũng như biến chứng của bệnh tiểu đường như: Cải xoong (Nasturium officinale Brassicaceae); Củ cải trắng (Ravanus sativus); Mướp đắng (Mormordica charantia Cucurbitaceae); Dừa cạn (Catharanthus roseus Apocynaceae); Bồ công anh (Taraxacum officinale Asteraceae); Dứa (Ananas sativus); Ổi (Psidium guajava); Rau má (Celltela asiatica); lựu (Punica granatum Linn.Fruits); Ngò tàu (Eryngium foetidum Apiaceae); Quỉ trâm thảo (Bidens pilosa Asteraceae); Bạch truật (Atractiloides macrocephala Asteraceae); Chuối Hột (Musra barjoo Sieb); Cam thảo nam (Scoparia ducis Scrophulariaceae); Hoài Sơn (Dioscorea persimilis Dioscoreaceae); Ngọc trúc (Polygotanum officinale Liliaceae); Xấu Hổ (Mimosa pudica Linn.) [33].

6 Cây cà phê vối (Coffea canephora ) – hạt cà phê xanh

6.1 Cây cà phê vối (Coffea canephora )

Cây cà phê (loài Coffea.L) ở nước ta thường trồng 4 giống chính là: cà phê chè (coffea arabica), cà phê vối (coffea canephora), cà phê mít (coffea excels) và

cà phê mít dâu da (coffea liberria) [1], [15], [17], [25]

Cây cà phê vối được trồng nhiều nhất trong 4 loài, chúng có nguồn gốc từvùng rừng xích đạo châu Phi, từ Guinca đến Uganda, phân bố rải rác dưới các táncây thưa, thấp thuộc vùng châu thổ sông Côngô khoảng giữa 10o vĩ bắc và 10o vĩnam Cà phê vối sớm được thuần hóa và được trồng ở các vùng ở châu phi, đếnnăm 1900 du nhập vào đảo Java sau đó tiếp tục được đưa sang nhiều nước nhiệtđới khác Hiện nay, chúng được trồng nhiều nhất ở các nước châu Phi, Indonesia,Việt Nam, Ấn Độ, … chiếm trên 90% tổng diện tích trồng cà phê vối trên thếgiới [13]

Cây cà phê vối (Coffea canephora) có:

Tên khoa học: Coffea canephora Pierre hoặc Coffea robusta

Vị trí phân loại trong giới thực vật [23]:

Lớp: Magnoliopsida

Bộ: Rubiales

Họ: Rubiaceae

Chi: Coffea

Loài: Coffea canephora

Hình 1 5 Cây cà phê vối (Coffea canephora)

6.2 Đặc điểm thực vật và phân bố cây cà phê vối

Đặc điểm thực vật của cây cà phê vối [5], [13], [17], [20]

Cà phê vối thuộc loại cây nhỡ, trong điều kiện tự nhiên có thể cao từ 12m phát triển theo một trục chính tạo thành nhiều đốt liên tục, mỗi đốt mangmột đôi lá Cành mang quả cấp một thường hình thành một lần theo chiều nganghoặc nửa thẳng hay đứng so với thân chính Mỗi năm cà phê có thể cho từ 8 đến

8-14 cặp cành mang quả Cành là bộ khung của cây và quyết định năng suất hàngnăm Những cành phát sinh từ những đốt trên cành cơ bản hoặc cành nối tiếpgọi là cành thứ cấp

Rễ cà phê phân bố chủ yếu ở 0 – 30 cm và rộng xung quanh tán Rễ chínhmọc sâu 60 – 100 cm, rễ nhánh mọc theo hướng xiên ngang Rễ rất thích hợp vớivùng đất thoáng khí, tơi xốp, hàm lượng mùn cao Khi pH thấp và hàm lượngnhôm tự do cao (> 50 ppm) có thể làm chết rễ tơ cà phê vối

Phiến lá to trung bình, chiều rộng từ 10-15cm, dài từ 20-30cm, hình bầudục, hình mũi mác hoặc hình trứng, mũi nhọn, phiến lá gợn sóng, đuôi lá nhọn,mép là thường gợn sóng, có màu xanh sáng hoặc đậm