KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (DL và DLS) ứng dụng phương pháp docking phân tử trong sàng lọc tìm kiếm hợp chất ức chế thụ thể interleukin, 6 hướng điều trị VKDT

Phương pháp này dựa trên cấu trúc đích phân tử để dự đoán, với độ chính xác khá cao, sự hình thành liên kết của cấu tử cácchất cần sàng lọc với đích phân tử của nó thường có bản chất là

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện:

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING PHÂN TỬ TRONG SÀNG LỌC TÌM KIẾM

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành

tới TS Lê Thị Thu Hường, công tác tại bộ môn Dược liệu và Dược học cổ

truyền - khoa Y Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội là người thầy tận tìnhchỉ bảo, động viên, hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Phạm Thế Hải công tác tại Trường Đại

học Dược Hà Nội đã chỉ bảo tận tình cho tôi từ những bước đi ban đầu khinhận đề tài

Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Khoa YDược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được làmkhóa luận, được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại Khoa suốt 5 năm học qua

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em vàbạn bè luôn sát cánh, đồng hành, ủng hộ động viên tôi trong quá tình học tập,nghiên cứu hoàn thành luận văn

Dù đã rất cố gắng nhưng kiến thức, kỹ năng và thời gian thực hiện cònhạn hẹp, tôi khó tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong nhận được những ýkiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, Ngày 30 tháng 4 năm 2018

Sinh Viên

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

FDA Food and Drug Administation Cơ quan Quản lý Thực

phẩm và Dược phẩm HoaKỳ

hydro

kết hydroHTS High throughput screening Sàng lọc thông lượng cao

IL-6R Interleukin 6 receptor Thụ thể Interleukin 6

MIL-6R membrane-bound Interleukin

6 receptor

Thụ thể Interleukin 6 bámmàng tế bào

SIL-6R soluble Interleukin-6 receptor Thụ thể Interleukin 6 dạng

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Cơ chế b ệnh sinh viêm kh ớ p d ạ ng th ấ p 4Hình 1.2: Hai con đường kích ho ạ t ph ả n ứ ng viêm c ủ a IL-6 5Hình 1.3: C ấ u trúc 3 chi ề u (3D) c ủ a ph ứ c h ợ p IL-6 v ớ i th ụ th ể c ủ a nó Hai IL-

6 (xanh tím đậ m, h ồ ng), hai IL- 6R (xanh dương, xám) tạ o ph ứ c h ợ p v ớ i vùng màng ngoài c ủ a c ấ u trúc hai protein gp130 (xanh lá,vàng) 5Hình 1.4: Các quá trình nghiên c ứ u và phát tri ể n thu ố c 7Hình 2.1: Phân tích protein 1 ALU v ề c ấ u trúc hình h ọ c so v ớ i IL-6 ph ả n ánh qua màu sắc trên Ngân hàng d ữ liệu protein Châu Âu (https:// www.rcsb.org/) 12 Hình 2.2: Hình ả nh 3D củ a protein 1ALU 13Hình 3.1: Minh h ọ a k ế t qu ả sàng l ọ c 16Hình 3.2: Minh ho ạ hai chi ều tương tác củ a Madindoline A trong trung tâmho

ạt độ ng c ủ a IL-6 17Hình 3.3: Minh h ọ a 2 chi ều tương tác củ a (-)-Hydnocarpin trong trung tâmho

ạt độ ng c ủ a IL-6 24Hình 3.4: Minh h ọ a 2 chi ều tương tác củ a 24-methylene cycloartane- 3 β ,21 - diol trong trung tâm ho ạt độ ng ủc a IL-6 25Hình 3.5: Minh h ọ a 2 chi ều tương tác củ a 20(R),24(E)-3-oxo- 9 β -lanosta- 7,24-dien-26-oic acid trong trung tâm ho ạt độ ng c ủ a Il-6 26Hình 3.6: Minh h ọ a 2 chi ều tương tác củ a 3,6,7-Tri-O-acetyl- α -mangostin trong trung tâm ho ạt độ ng c ủ a Il-6 27Hình 3.8: Minh h ọ a 2 chi ều tương tác củ a 3-epibartogenic acid trong trung tâm ho ạt độ ng c ủ a IL-6 29Hình 3.9: Minh h ọ a 2 chi ều tương tác của 3 α -hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid trong trung tâm ho ạt độ ng c ủ a IL-6 30Hình 3.10: Minh h ọ a 2 chi ều tương tác củ a 6-O-benzoyl- α -mangostin trong trung tâm ho ạt độ ng c ủ a Il-6 31Hình 3.11: Minh h ọ a 2 chi ều tương tác củ a 9-hydroxycanthin-6-O- glucopyranoside trong trung tâm ho ạt động c ủ a IL-6 32Hình 3.12: Minh h ọ a 2 chi ều tương tác củ a apigenin 7-O- β -D-glucosid trong trung tâm ho ạt độ ng c ủ a IL-6 33

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH VẼ

DANH MỤC BẢNG

MỤC LỤC

ĐẶ

T V ẤN ĐỀ 1

C HƯƠN G 1 - T Ổ NG QUAN 3

1.1 T ổ ng quan v ề b ệ nh viêm kh ớ p d ạ ng th ấ p 3

1.2 T ổ ng quan v ề Interleukin-6 4

1.2.1S ợ lượ c v ề IL-6 4

1.2.2Vai trò c ủ a IL- 6 đố i v ớ i b ệ nh viêm kh ớ p d ạ ng th ấ p 5

1.2.3Trung tâm ho ạt động và cơ chế ứ c ch ế Interleukin-6 7

1.3 Quá trình nghiên c ứ u và phát tri ể n thu ố c 7

1.4 Sàng l ọ c ả o d ự a trên c ấ u trúc 8

1.5 Phương pháp Docking 9

1.5.1Đại cương về phương pháp Protein docking 9

1.5.2Quy trình Docking 10

C HƯ ƠNG 2 - NGUYÊN LI Ệ U, THI Ế T B Ị VÀ P HƯ ƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U 12

2.1 Nguyên li ệ u và thi ế t b ị nghiên c ứ u 12

2.2 N ộ i dung nghiên c ứ u: 13

2.3 Phương pháp nghiên cứ u 14

2.3.1Sàng l ọ c b ằ ng quy t ắ c 5 c ủ a Lipinski 14

2.3.2Sàng l ọ c b ằ ng Docking 14

C HƯƠN G 3: KẾ T QU Ả 16

3.1 K ế t qu ả sàng l ọ c b ằ ng quy t ắ c s ố 5 c ủ a Lipinski 16

3.2 Sàng l ọ c docking 16

3.3 Ch ọ n 10 h ợ p ch ấ t t ố t nh ấ t t ừ k ế t qu ả Docking 18

3.4 Đặc điể m hoá lý c ủ a các h ợ p ch ất đượ c ch ọ n 22

3.5 Đặc điể m chi ti ế t t ừ ng ch ất theo tương tác vớ i Interleukin-6 và thông tin

v ề cây dượ c li ệ u 23

HƯƠN G 4 BÀN LUẬ N 35 4.1.V ề k ế t qu ả 35 4.2.V ề phương pháp 36

K

Ế T LU Ậ N VÀ KI Ế N NGH Ị 38

TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Interleukin-6 (IL-6) là một cytokine đa chức năng điều chỉnh đáp ứngmiễn dịch và gây ra các phản ứng cấp tính Mặc dù có vai trò quan trọng với cáchoạt động sinh lý nhưng việc sản sinh không kiểm soát IL-6 lại liên quan đến cácbệnh viêm miễn dịch IMID bao gồm cả bệnh viêm khớp dạng thấp (rheumatoidarthritis, RA) [25], do đó ức chế IL-6 có thể được xem là một hướng đi đầy tiềmnăng trong điều trị bệnh RA Madindoline A là hợp chất tự nhiên có tác dụng ứcchế chọn lọc IL-6, nhưng khó phát triển thành thuốc do sự khan hiếm nguồnnguyên liệu cùng với quá trình sản xuất phức tạp, tốn kém [17] Thuốc điều trị

RA hiện nay nhiều tác dụng phụ và đắt tiền, đó là lý do giới nghiên cứu hiện rấtquan tâm đến các thuốc có nguồn gốc tự nhiên cho điều trị RA

Nguồn thực vật phong phú và cây thuốc Việt Nam được xác định có chứacác hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý và cũng là nguồn nguyên liệu quý

để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế IL-6 Do số lượng các hợp chất tựnhiên rất lớn, nhằm tiết kiệm và nâng cao hiệu quả tìm kiếm, các phương phápsàng lọc hiệu năng cao sử dụng máy tính đã trở thành một công cụ rất hữu ích hỗtrợ quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới Trong đó, docking là một trongnhững phương pháp phổ biến nhất Phương pháp này dựa trên cấu trúc đích phân

tử để dự đoán, với độ chính xác khá cao, sự hình thành liên kết của cấu tử (cácchất cần sàng lọc) với đích phân tử của nó (thường có bản chất là protein) Nhờ

đó, chúng ta tìm được vị trí và cấu hình phù hợp nhất để cơ chất gắn kết vớiprotein

Từ các phân tích nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khóa luận “Ứngdụng phương pháp docking phân từ trong sàng lọc tìm kiếm hợp chất ức chế thụthể Interleukin-6 hướng điều trị viêm khớp dạng thấp” với 2 mục tiêu chính:

1 Sàng lọc và tìm kiếm hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế IL-6 bằng phươngpháp docking

9

2 Nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất tốt nhất, thu được sau quátrình sàng lọc, thông qua chỉ số hóa lý của cấu trúc và đặc điểm của cây dượcliệu.

Bệnh viêm khớp dạng thấp hiện nay được cho là bệnh tự miễn [] Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ được các tế bào trình diện kháng nguyên (đại thực bào, các tế bào đuôi gai, tế bào diệt tự nhiên) nhận biết, sau đó được trình diện cho các tế bào lympho T và B Các tế bào lympho T CD4 (T help) được kích hoạt và sản xuất ra các lymphokin (Inteleukin-4,10,13), các lymphokin này sẽ kích thích các tế bào lympho B tăng sinh và biệt hoá thành các

kháng nguyên – kháng thể, do đó có thực bào xuất hiện với sự hiện diện của các bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào, tế bào mastocyt Sau đó, chính các tế bào này lại tiết ra các cytokin khác như TNF-α, IL-1,2,6, interferon, yếu tố phát triển nội mạc mạch máu (VEGF) và các yếu tố hoá ứng động khác tạo vòng xoắn bệnh lý thúc đẩy quá trình viêm Sự tăng sinh mạch dưới tác dụng của VEGF

(mảng pannus) Mảng pannus xâm lấn vào đầu xương, sụn khớp và các enzym tiêu huỷ tổ chức do các tế bào viêm giải phóng như stromelysin, elastase, collagenase cùng sự xâm nhập các nguyên bào xơ gây phá huỷ khớp, dính khớp và hậu quả là tàn tật ] Như vậy có sự tham gia của cả miễn dịch dịch thể (tạo thành phức hợp miễn dịch) và miễn dịch tế bào (giải phóng ra các cytokin

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về bệnh viêm khớp dạng thấp

Rheumatoid arthritis (RA) là bệnh viêm khớp mạn tính phổ biến với đặc

trưng là viêm đa khớp, gây tê cứng khớp, đau và sưng và có thể tổn thương cơ

quan khác Theo thống kê, hàng năm ở nước ta có khoảng 750 – 800 người mới

mắc bệnh viêm đa khớp dạng thấp trên một triệu dân từ 15 tuổi trở lên Tỷ lệ

mắc bệnh là 0,5% dân số, trong đó 80% là nữ giới Mặc dù ta không xác định

được nguyên nhân chính xác gây ra bệnh viêm khớp dạng thấp, bệnh được coi là

có tính chất di truyền [18]

tương bào và sản xuất ra các globulin miễn dịch là các thể tự kháng

Tại màng hoạt dịch khớp có tình trạng lắng đọng phức hợp miễn dịch

cùng sự xâm nhập một loạt các tế bào viêm khác hình thành nên màng mạch

thực hiện phản ứng viêm và phá hủy khớp), trong đó lympho T đóng vai trò

and

of

©

trung tâm Dựa trên sự hiểu biết về cơ chế bệnh sinh này, các nhà khoa học đã nghiên cứu ra các thuốc kích hoạt hoặc sửa chữa hệ miễn dịch thông qua ức chế từng loại tế bào, từng loại cytokin để khống chế tình trạng viêm của bệnh.

IL-6 được tìm thấy nhiều ở dịch ổ khớp của bệnh nhân RA và là nguyên

Hình 1.1: Cơ chế bệnh sinh viêm khớp dạng thấp 1.2 Tổng quan về Interleukin-6

1.2.1 Sợ lược về IL-6

IL-6 là một glycopeptide 26 kDa có gen mã hóa được tìm thấy trên nhiễmsắc thể số 7, gồm có 212 axit amin được bố trí trong bốn chuỗi α Nó được tạo rabởi nhiều loại tế bào khác nhau, như tế bào T, tế bào B, bạch cầu đơn nhân,nguyên bào sợi, tế bào nội mô và một số tế bào khối u [27]

nhân chính cho nhiều tác dụng tại chỗ và toàn thân ở bệnh này IL-6 kết hợp trưc

tiếp với phức hợp thụ thể màng IL-6 (membrane-bound Interleukin 6 receptor – MIL-6R) và glycoprotein-130 dẫn tới hoạt hóa tế bào viêm như đại thực bào và

bạch cầu trung tính từ đó kích hoạt các phản ứng viêm, gây hủy hoại sụn khớp,xương IL-6 cũng có khả năng hoạt hóa các tế bào không có thụ thể màng IL-6miễn có chứa phổ biến thụ thể gp-130 Cơ chế này liên quan tới thụ thể dạng hòa

tan của IL-6 (soluble Interleukin-6 receptor – SIL-6R) Sự gia tăng nồng độ IL-6

cũng như nồng độ thụ thể IL-6 dạng hòa tan có liên quan đến mức độ trầm trọng

và sự tiến triển của bệnh [2, 11]

Hình 1.2: Hai con đường kích hoạt phản ứng viêm của IL-6

Hai con đường truyền tín hiệu kích hoạt phản ứng viêm của IL-6: Truyền tín

hiệu cổ điển (classical signalling) qua màng tế bào với vai trò của MIL-6R Truyền tín hiệu chuyển tiếp (trans-signalling) thông qua SIL-6R [27]

Hình 1.3: Cấu trúc 3 chiều (3D) của phức hợp IL-6 với thụ thể của nó Hai IL-6 (xanh tím đậm, hồng), hai IL-6R (xanh dương, xám) tạo phức hợp với vùng màng ngoài của cấu trúc hai protein gp130 (xanh lá,vàng) 1.2.2 Vai trò của IL-6 đối với bệnh viêm khớp dạng thấp.

RA được đặc trưng bởi sự gia tăng yếu tố dạng thấp (kháng thể IgM vàIgG RF) trong cả huyết thanh và khớp Tế bào B có vai trò trong việc tạo ra các

kháng thể này chứng tỏ ức chế tế bào B là một phương hướng điều trị bệnh RA.IL-6 cũng được xác định là một yếu tố biệt hóa của tế bào B, ảnh hưởng đến quátrình phát triển của nó [2].

Trong pha viêm cấp tính trong của bệnh RA, bạch cầu đơn nhân, đại thựcbào và các tế bào nội mô giải phóng IL-6, kèm theo tăng bạch cầu trung tính tạidịch khớp Bạch cầu trung tính có khả năng giải phóng các enzym phân giảiprotein và chất trung gian nên có vai trò quan trọng trong hiện tượng viêm vàphá hủy khớp ở bệnh RA IL-6 tác động trực tiếp trên bạch cầu trung tính quathụ thể của IL-6 tại màng tế bào Đã có bằng chứng ghi nhận, việc ức chế IL-6 sẽngăn chặn sự bám dính của bạch cầu trung tính Khi bệnh tiến triển, sự chuyển từviêm cấp tính sang viêm mạn tính có ảnh hưởng do IL-6 tác động lên bạch cầutrung tính [2]

Nồng độ IL-6 tăng cao trong màng hoạt dịch của bệnh nhân RA có liênquan đến mức độ tăng lên của phản ứng viêm và tình trạng phá hủy khớp.Tổnthương khớp trong RA được đặc trưng bởi tổn thương bào mòn xương tại vị tríbám của màng hoạt dịch và hẹp khe khớp Trong nghiên cứu trên người và độngvật, tổn thương này được xác định là do hủy cốt bào gây ra IL-6 gây tăng sốlượng hủy cốt bào bằng cách tác động vào các tế bào gốc tạo máu từ các bạchcầu hạt, đại thực bào dòng hạt [2]

Các phản ứng ở giai đoạn cấp tính, bao gồm sự phóng thích các cytokinetiền viêm và tăng protein pha viêm cấp tính Protein pha viêm cấp tính được sảnxuất trong gan (ví dụ như CRP) và IL-6 là một yếu tố chính kích thích gan thựchiện quá trình này Ở bệnh nhân RA, nồng độ IL-6 huyết thanh tương quan vớinồng độ CRP và hiện nay IL-6 dễ dàng định lượng được nhờ đánh giá nồng độCRP trong dịch sinh học Nồng độ CRP được sử dụng như một dấu hiệu sinh họccủa tình trạng viêm và đánh giá mức độ bệnh [2]

Từ những dẫn chứng trên, có thể thấy ở bệnh nhân viêm khớp dạng thấp,các triệu chứng toàn thân hay tại chỗ trên các khớp xương có thể được giải thíchbởi tác động của IL-6 Do đó ức chế IL-6 là một mục tiêu hợp lý để điều trị RA[2, 11]

Lựa chọn mục tiêuXác định hợp chất HitXác định và tối ưu hợp chất LeadLựa chọn chất ứng cử làm thuốcThử nghiệm lâm sàng pha I,II,III

1.2.3 Trung tâm hoạt động và cơ chế ức chế Interleukin-6

Khi xuất hiện đột biến mất đoạn với những protein IL-6 thử nghiệm, tất cảcác protein không có hoạt động về mặt sinh học Sau đó tiến hành phản ứng miễndịch với một bộ kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng IL-6, cho thấy chỉ có độtbiến mất đoạn ở các trình tự 177, 178 và 179 là không gây ra sự thay đổi đáng kểtrong cấu trúc nếp gấp Tức là các đột biến mất đoạn này không làm mất đi cấutrúc không gian 3 chiều của protein IL-6 Khi IL-6 có đột biến mất đoạn tại trình

tự 177, 178, 179 thì nó vẫn giữ được hoạt tính sinh học liên quan đến cấu trúc 3chiều của protein Cùng với đó, quan sát thấy rằng protein IL-6 có đột biến mấtđoạn ở bộ 3 trình tự acid amin 177-179 không thể cạnh tranh với protein IL-6(còn đủ trình tự polypeptide) để liên kết với thụ thể hòa tan SIL-6R, điều này gợi

ý rằng có 1,2 hoặc cả 3 acid amin trên có thể tham gia vào vị trí liên kết giữa

IL-6 với thụ thể hòa tan SIL-IL-6R Bằng cách tạo ra nhiều đột biến thay thế acid amin

ở từng vị trí 177, 178 và 179 kết quả cho thấy Arg179 đóng vai trò quan trọngđối với hoạt động ở tế bào chuột Sự thay thế duy nhất mà giữ nguyên hoạt tính ở

vị trí 179 là từ Arg thành Lys chứng tỏ vai trò quan trọng của điện tích dương ở

vị trí 179 cho sự liên kết của IL-6 với thụ thể của nó [12] Từ đây có thể kết luận,Arginine ở vị trí 179 đóng vai trò quan trọng, nhắm vào vị trí đặc biệt này trongcấu trúc chuỗi polypeptide IL-6 sẽ làm suy giảm hoạt động bình thường của IL-6[32]

1.3 Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc.

Quá trình nghiên cứu và phát triển thường được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm hiện nay được minh họa như hình dưới đây:

Hình 1.4: Các quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc

Lựa chọn mục tiêu là chọn một mục tiêu cụ thể, được giả thuyết là có vaitrò quan trọng với mục đích điều trị bệnh đã được nhắm đến cho chương trìnhphát triển thuốc Các mục tiêu phân tử thường là một thụ thể, một enzyme hoặcmột phân tử tương tự như vậy [14].

Xác định hợp chất Hit là việc tìm ra các phân tử có tác dụng mong muốn

trong một hoặc nhiều thử nghiệm ban đầu Những thử nghiệm này sẽ giúp dựđoán được các tác dụng dược lý đang mong đợi Xác định hợp chất Hit thường

được tiến hành bằng sàng lọc thông lượng cao (High Throughput Screening HTS), với các thư viện hợp chất lớn, 105-106 phân tử, được kiểm tra bằng thực nghiệm Các hợp chất Hit có tác dụng ở bước này tiếp tục trở thành hợp chất

-khởi đầu cho các khám phá mở rộng hơn về hóa dược ở giai đoạn xác định và tối

ưu hóa hợp chất dẫn đường (Lead) Khi quá trình này diễn ra, càng có nhiều

thông tin về tính chất dược lực học và dược động học của các hợp chất được pháthiện Việc xác thực giả thuyết dược lý ban đầu, cùng với đặt ra nghi vấn tronggiai đoạn lựa chọn mục tiêu, là hai quá trình tiến hành song song Cuối cùng, ứng

cử viên làm thuốc là hợp chất duy nhất còn lại hội đủ các yêu cầu và được đưa đitiến hành các thử nghiệm lâm sàng [14]

Việc sử dụng mô hình phân tử trong xác định hợp chất Hit được gọi là

sàng lọc ảo Điều này được sử dụng cả cho thiết kế bộ hợp chất để sàng lọc trongHTS và dự đoán các bộ hợp chất nhỏ hơn để kiểm tra với các thử nghiệm vớithông lượng thấp hơn [10]

1.4 Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc

Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc (Structure-Based Virtual Screening - SVBS)

là dự đoán các hợp chất liên kết với protein đích thông qua các phương pháp tínhtoán, sử dụng các hiểu biết về cấu trúc 3D của đích phân tử

Cách tiếp cận cơ bản của SVBS là dự đoán cấu dạng liên kết của từng

phân tử nhỏ trong thư viện dữ liệu (docking), và từ đó dự đoán năng lượng tự do của phân tử đó khi liên kết (scoring) Các hợp chất Hit sau đó được dự đoán bằng cách sắp xếp tất cả các hợp chất trong thư viện bằng cách tính điểm (score),

và quyết định một điểm ngưỡng Hợp chất có điểm tốt hơn điểm ngưỡng được

coi là hợp chất Hit, sau đó sẽ đánh giá thêm [14].

1.5 Phương pháp Docking

1.5.1 Đại cương về phương pháp Protein docking

Docking là một trong những phương pháp phổ biến nhất dùng trong quátrình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc vì có khả năng dự đoán với độ chính xáckhá cao sự hình thành liên kết của cấu tử với thụ thể trong túi liên kết Ra đời từnhững năm 1980 [22], docking phân tử đã trở thành một công cụ thiết yếu trongnghiên cứu và phát triển thuốc Không những chỉ ra các liên kết có ý nghĩa,docking còn có thể định lượng khả năng liên kết bởi các hàm tính điểm, qua đóphân hạng khả năng liên kết mạnh yếu của các cấu tử [22]

Docking trở thành một bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhấtcủa một cơ chất gắn kết lên protein Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu chínhcủa docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ là thấp nhất Đểtìm cấu hình phù hợp nhất, cần liên hệ cấu hình không gian với các trị số đánhgiá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toántìm kiếm [20]

Thuật giải di truyền (Genetic Algorithm - GA) là thuật toán tìm kiếm được

ứng dụng nhiều trong các chương trình docking như Autodock, Autodock Vina,GOLD [24, 30] GA áp dụng các lí thuyết liên quan đến học thuyết tiến hoá vàchọn lọc tự nhiên Đầu tiên, thuật toán sẽ mã hoá tất cả các tham số của cấu trúcban đầu trong “một nhiễm sắc thế” - biểu diễn bằng một véc tơ Từ “nhiễm sắcthể” ban đầu này, tạo ngẫu nhiên một quần thể bao phủ một miền năng lượng.Quần thể này được đánh giá và từ đó các “nhiễm sắc thể” thích nghi nhất (tức là

có giá trị năng lượng thấp nhất) được chọn làm khung để tạo ra quần thể tiếptheo Quy trình này làm giảm năng lượng trung bình của toàn bộ “nhiễm sắc thể”bằng cách truyền các đặc tính cấu trúc thuận lợi từ một quần thể này sang mộtquần thể khác Sau một số chu kỳ tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng ta sẽ tìm đượcmột “nhiễm sắc thể” (cấu dạng) phù hợp với mức năng lượng tối thiểu [21]

Chương trình docking sử dụng các hàm tính điểm (scoring function ) để

ước lượng các năng lượng liên kết của phức hợp cấu tử - receptor Năng lượngnày được cho bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔGL), đơn vị

là kCal/mol Dự đoán về năng lượng liên kết được thực hiện bằng cách đánh giánhững tương tác hóa lý quan trọng bao gồm: các tương tác liên phân tử, các ảnhhưởng solvat và entropy [15] Do đó, số lượng các tham số hoá lý được đánh giácàng lớn thì độ chính xác càng cao Tuy nhiên, nếu số lượng biến càng lớn thìthời gian tính toán sẽ lâu Các hàm tính điểm hiệu quả nên đưa ra sự cân bằnggiữa độ chính xác và tốc độ, đây là một điểm quan trọng khi làm việc với cơ sỡ

dữ liệu lớn

1.5.2 Quy trình Docking

Quá trình docking được thực hiện thông qua ba bước: chuẩn bị cấu tử,chuẩn bị protein, mô phỏng docking

Chuẩn bị cấu tử: cấu trúc các cấu tử có thể được lấy từ hệ thống dữ liệu

có sẵn như Pubchem, Zinc [13, 19] Trong trường hợp không có sẵn, chúng ta cóthể xây dựng cấu trúc cấu tử bởi các phần mềm như ChemDraw, Chemsketch…Sau khi xây dựng được cấu trúc 3D, sử dụng các phần mềm để chuẩn bị cấu tửcho chương trình mô phỏng docking, các bước chuẩn bị thường được tiến hànhgồm: gắn hydro, gắn trường lực, xây dựng file pdbqt

Chuẩn bị protein: Cấu trúc 3D của protein thường có sẵn trên ngân hàng

dữ liệu protein (protein data bank) Trong trường hợp chưa có sẵn, chúng ta cóthể xây dựng cấu trúc 3D theo phương pháp mô phỏng tính tương đồng

(homology modeling ) [31] Sau khi có cấu trúc 3D, sử dùng các phần mềm để

chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking Các bước chuẩn bị thườnggồm: loại nước và các cấu tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực và xây dựngfile pdbqt

Mô phỏng docking: Trước khi phần mềm tiến hành tìm kiếm vị trí và cấu

dạng phù hợp của cấu tử, cần khoanh vùng tìm kiếm (grid box) cho thuật toán.Kích thước của vùng tìm kiếm không nên quá lớn vì như thế sẽ tốn kém thờigian và độ lặp lại không cao, cũng không nên quá nhỏ vì như vậy phần mềm chỉ

tìm kiếm được một vùng rất nhỏ, không có ý nghĩa Vị trí của vùng tìm kiếmthông thường sẽ được đặt ở trung tâm hoạt động của protein Sau khi xác định vịtrí và kích thước của vùng tìm kiếm, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm và đưa racấu dạng phù hợp với năng lượng thấp nhất Cấu dạng này cùng với các tươngtác của nó với protein sẽ được phân tích bởi các phần mềm chuyên dụng như:MOE, Pymol, Discovery studio…

CHƯƠNG 2- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

Cấu trúc protein: Cấu trúc tinh thể tia X của protein IL-6 được lấy từ

ngân hàng dữ liệu Protein châu Âu, có mã là 1ALU (Độ phân giải 1.9Å), lần đầutiên được công bố bởi Somers và cộng sự (https:/www.rcsb.org/structure/1ALU)

Hình 2.1: Phân tích protein 1 ALU về cấu trúc hình học so với IL-6 phản ánh qua màu sắc trên Ngân hàng dữ liệu protein Châu Âu

(https://www.rcsb.org/ )

Mật độ electron ảnh hưởng đến dạng hình học của cấu trúc tinh thể tia X

vì từ mật độ electron có thể xác định tọa độ các nguyên tử Từ đó có thể dựngcấu trúc của protein Theo như hình trên thì màu sắc phản ánh mối quan hệ giữamật độ electron và dạng hình học Màu sắc thể hiện chỉ số tiêu chuẩn chất lượnghình học bao gồm tối thiểu 1 acid amin ngoại lai hay sai lệch về cấu hình: vùngxanh (số acid amin ngoại lai = 0), Vàng (số acid amin ngoại lai = 1), Cam (sốacid amin ngoại lai = 2), Đỏ (số acid amin ngoại lai = 3) Như vậy có thể thấy,theo trình tự chuỗi acid amin, vị trí 177-179 (vùng hoạt động) có chất lượng tốt(màu xanh) và được chọn để nghiên cứu khả năng gắn kết giữa cấu tử và protein

Hình 2.2: Hình ảnh 3D của protein 1ALU

Cơ sở dữ liệu để sàng lọc: Cơ sở dữ liệu các hợp chất thiên nhiên Việt

Nam (Vietnamese natural product Database – VNPD) gồm cấu trúc topo (2

chiều) của 1602 hợp chất có nguồn gốc dược liệu Việt Nam và các thông tin nhưnguồn dược liệu, tác dụng dược lý đã nghiên cứu… Do giới hạn về tài nguyêntính toán), trong nghiên cứu này sử dụng nguồn dữ liệu là 500 chất đầu tiên củaVNPD

Thiết bị sử dụng: Máy tình ACER Aspire V3 – Hệ điều hành Windows 8 Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng được tải hoặc mua từ các

nhà phát triển (trang web) bao gồm:

2.2 Nội dung nghiên cứu:

Bước 1 Sàng lọc ra các hợp chất tự nhiên trong cơ sở dữ liệu VNPD có

tác dụng ức chế IL-6 bằng phương pháp docking phân tử

Bước 2 Nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất tốt nhất, thu

được sau khi đã thông qua sang lọc, bằng cách phân tích các thông số hóa lý củacấu trúc và đặc điểm của cây dược liệu có chứa chất đó

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sàng lọc bằng quy tắc 5 của Lipinski

Quy tắc số 5 của Lipinski chỉ ra rằng dược chất đường uống không viphạm quá một trong 4 tiêu chí dưới đây:

- Trọng lượng phân tử MW < 500 daltons

- Không nhiều hơn 5 hydro có thể tham gia liên kết hydro (Số lượng các nhóm –

NH và –OH), HBD ≤ 5

- Không nhiều hơn 10 nguyên tử có độ âm điện lớn có thể tham gia liên kết hydro(bao gồm nguyên tử Oxy và Nitơ), HBA ≤ 10

- Hệ số phân bố octanol/nước MlogP ≤ 4,15

Sàng lọc bằng công cụ tính toán phát triển bởi Daina và cộng sự, hiện cóthể tiến hành trực tuyến bằng trang web http://www.swissadme.ch/ Tập hợp 500hợp chất tự nhiên đầu tiên trong CSDL VNPD được sàng lọc bằng cách đưacông thức SMILEs vào web để có các cấu trúc và thông số, sau đó tiến hànhphân tích theo quy tắc 5 Mục tiêu nhằm tăng tỷ lệ thành công ở các giai đoạnphát triển tiếp theo cho các hợp chất vượt qua yêu cầu ở quy trình này

2.3.2 Sàng lọc bằng Docking

Chuẩn bị protein: Cấu trúc tinh thể tia X của IL-6 (1ALU) được tải từ

ngân hàng dữ liệu protein (https://www.rcsb.org/structure/1ALU ), sau đó tiếnhành loại bỏ các nước, ligand SO4 và TLA (tartaric acid) Thêm Hydro, gắntrường lực Kollman và xây dựng file pdbqt Tất cả các bước này được tiến hànhtrên phần mềm MGLtools

Chuẩn bị hợp chất: Đưa công thức SMILES các hợp chất tự nhiên vào để

vẽ công thức 2D sau đó xây dựng công thức 3D nhờ phần mềm MarvinSketch.Sau cùng, sử dùng phần mềm MGLtools thêm hydrogen, gắn trường lựcGasteiger và xây dựng file pdbqt

Dữ liệu là protein cũng như các cấu tử ở dạng file pdbqt Dock bằng phầnmềm Autodock với Grid box đặt tâm ở Arg179, kích thước Grid box 15×15×15

Ǻ, vòng lặp là 8, mỗi chất được tiến hành dock 3 lần (n = 3)

Docking phân tử: Phần mềm Autodock được sử dụng để tìm ra cấu hình

liên kết tốt nhất bằng cách sử dụng các đánh giá năng lượng tự do liên kết ΔG và

số lượng tương tác vật lý Autodock tính toán các giá trị năng lượng bằng đặctính năng lượng nội tại của phối tử, năng lượng tự do xoắn và năng lượng giữacác phân tử gồm năng lượng liên kết Van der Walls, năng lượng liên kết hydro,năng lượng từ desolvat và năng lượng tĩnh điện

Phân tích kết quả bằng phần mềm Discovery Studio tìm tương tác của cáchợp chất với cấu trúc tinh thể của IL-6

CSDL VNPD 500 hợp chất tự nhiên đầu tiên

3.2 Sàng lọc docking

Madindoline A được chứng minh có tác dụng ức chế chọn lọc cao IL-6 dovậy chúng tôi sử dụng Mandindoline A làm chất đối chiếu tác dụng.Mandindoline A lấy công thức 3D từ cơ sở dữ liệu Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) Tiến hành dock madindoline A có định

dạng file pdbqt với file protein 1ALU định dạng pdbqt bằng Autodock Vinacho ra năng lượng liên kết ΔG = -7,0kCal/mol Mandindoline A liên kết hydrovới Arg179 (2.01 Å), ngoài ra liên kết hydro với Gln175 (2.19 Å) và các tươngtác kỵ nước khác Do vậy, chúng tôi sử dụng tiêu chí ΔG≤-7,0 kCal/mol và liênkết hydro với Arg179 cho bước tiếp theo.

Hình 3.2: Minh hoạ hai chiều tương tác của Madindoline A trong

trung tâm hoạt động của IL-6

Bước tiến hành thu hẹp lại bộ dữ liệu cấu tử từ 412 hợp chất còn 258 hợpchất đạt tiêu chuẩn có tương tác với ARG179 đồng thời có năng lượng liên kết

ΔG = -5,0 kCal/mol (Loại bỏ được gần 40%).Tiếp tục dock 258 chất thu được ởtrên, sử dụng phần mềm Autodock với Grid box 30×30×30 Ǻ, tọa độ tại vị tríArg179 Phân tích kết quả docking bằng Discovery Studio thu được 10 hợp chất

có ΔG ≤ -7,0 kCal/mol, tạo liên kết hydro với Arg179 và có tương tác với cácacid amin khác