KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (DL và DLS) nghiên cứu tác dụng ức chế enzym a glucosidase và enzym PTP1B in vitro của dịch chiết lá cây ổi trồng tại VN

Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều loại thuốc được dùng để điều trịđái tháo đường type 2, nhưng vẫn còn nhiều tác dụng không mong muốn.Theo đó, sử dụng dược liệu hay các sản phẩm đến

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y – DƯỢC

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

α-GLUCOSIDASEGLUCOSIDASE VÀ ENZYM PTP1B IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ỔI (Psidium Guajava L.)

TRỒNG TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y – DƯỢC

Người thục hiện:

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

α-GLUCOSIDASEGLUCOSIDASE VÀ ENZYM PTP1B IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ỔI (Psidium Guajava L.)

TRỒNG TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA:

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN

Khi nhận được đề tài này, tôi đã cảm thấy mình vô cùng may mắn, vìđây là một đề tại rất thiết thực với cuộc sống Sau khi hoàn thành khóa luận,tôi lại cảm thấy mình may mắn hơn nữa khi được đóng góp một phần nhỏ bévào cuộc chiến chống lại căn bệnh đang ngày một gia tăng trên thế giới.Trong thời gian thực hiện khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ nhiệt tình từ thầy cô, người thân và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS TS BùiThanh Tùng – Phó trưởng phòng Quản lý khoa học và hợp tác phát triển -Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Thầy đã giúp đỡ tôi kể từ nhữngngày đầu tiên bước chân vào nghiên cứu khoa học Thầy là một giáo viênhướng dẫn tận tâm luôn sát sao với sinh viên, tận tình chu đáo và luôn sẵnsàng giải đáp mọi thắc mắc trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tiếp theo, tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, các thầy cô bộmôn Dược lý – Dược lâm sàng, cùng toàn thể thầy cô các bộ môn khác đãmang đến những kiến thức bổ ích nhất cho sinh viên chúng tôi trong suốt 5năm học tập và thực hiện khóa luận tại khoa Không có sự dạy dỗ 5 năm này,tôi chắc chắn sẽ không có được một khóa luận như ngày hôm nay

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người

đã luôn sát cánh, luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuậnlợi nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 27 tháng 4 năm 2019

Sinh viên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ĐTĐ type 2 Đái tháo đường type 2

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

IDF Liên đoàn Đái tháo đường Thế giưới

PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase

PTP1B Protein tyrosine phosphatase 1B

TNF alpha Tumor necrosis factor alpha

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase 14

Bảng 3.1 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết toàn 30

phần, các phân đoạn dịch chiết lá ổi và Acarbose

Bảng 3.2 Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao chiết toàn phần, 31

các phân đoạn dịch chiết lá ổi

Bảng 3.3 Tác dụng ức chế enzym PTP1B của axit ursolic 32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của Beta-sitosterol 23

Hình 2.1 Phản ứng thủy phân PNP-G dưới tác dụng của enzym 26

α-glucosidase

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym 32

PTP1B của

Hình3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym 33

PTP1B của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn

dịch chiết lá ổi

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh đái tháo đường 3

1.1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường 3

1.1.2. Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và tại Việt Nam 4

1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của bệnh đái tháo đường type 2 5

1.1.4. Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường type 2 7

1.1.5. Chẩn đoán bệnh đái tháo đường 8

1.1.6. Điều trị đái tháo đường 10

1.2 Tổng quan về enzym α-GLUCOSIDASEglucosidase và PTP1B 11

1.2.1. Tổng quan về enzym 11

1.2.2. Tổng quan về enzym α-GLUCOSIDASEglucosidase 11

1.2.3. Tổng quan về enzym PTP1B (protein tyrosine phosphatase 1B) 14

1.3 Đặc điểm thực vật, phân bố của cây ổi tại Việt Nam 20

1.3.1. Vị trí phân loại thực vật 20

1.3.2. Phân bố 20

1.3.3. Đặc điểm thực vật 21

1.3.4. Thành phần hóa học 21

1.3.5. Tác dụng và công dụng 22

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 24

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2. Chuẩn bị mẫu 24

2.1.3. Hóa chất và thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-GLUCOSIDASEglucosidase in vitro 25

2.2.2. Đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B in vitro 26

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Kết quả chiết xuất và phân đoạn dịch chiết lá ổi 28

3.2 Tác dụng ức chế enzym α-GLUCOSIDASEglucosidase in vitro 29

3.3 Tác dụng ức chế enzym PTP1B in vitro 30

Chương 4: BÀN LUẬN 33

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong vòng 3 thập kỷ gần đây, số người mắc đái tháo đường trên thếgiới đã tăng gấp đôi Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2012 trênthế giới có 346 triệu người mắc đái tháo đường, trong đó có hơn nửa sống ởvùng Tây Thái Bình Dương, Nam Á và Đông Địa Trung Hải [37] Sự bùngphát của bệnh đái tháo đường type 2 hiện nay xảy ra ở những nước đang pháttriển nhiều hơn những nước phát triển Trong 10 nước được dự đoán có sốngười mắc đái tháo đường nhiều nhất trên thế giới vào năm 2030 thì có 5nước ở châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Pa-kít-xtan, In-đô-nê-sia và Băng-la-đét)[3, 38]

Bệnh đái tháo đường là bệnh đặc trưng bằng mức đường trong máucao, nguyên nhân là do thiếu insulin có kèm hoặc không kèm theo khánginsulin với các mức độ khác nhau [37] Bên cạnh đó, bệnh đái tháo đường còngây ra các biến chứng nguy hiểm về tim mạch, tai biến mạch máu não, suythận, … Bệnh đái tháo đường gồm có hai loại, trong đó loại 2 chiếm khoảng

90 % trong tổng số trường hợp bị bệnh [1]

Đái tháo đường type 2 đặc trưng bởi sự đề kháng insulin, dẫn đến tếbào không nhận được lượng glucose nên sẽ làm tăng glucose trong máu Hiệnnay, nhiều nghiên cứu đã cho thấy vai trò của hai enzym α-glucosidase vàprotein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) trong điều trị đái tháo đường type 2[4] Enzym α-glucosidase được biết đến như tác nhân thủy phânoligosaccharid thành glucose; PTP1B lại là tác nhân làm tăng quá trình khửphospho hóa Irβ, dẫn đến giảm tín hiệu insulin và kháng insulin [7, 19, 31]

Vì vậy, ức chế sự hoạt động của hai enzym này sẽ là phương pháp điều trị đáitháo đường type 2

Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều loại thuốc được dùng để điều trịđái tháo đường type 2, nhưng vẫn còn nhiều tác dụng không mong muốn.Theo đó, sử dụng dược liệu hay các sản phẩm đến từ tự nhiên trong chẩn đoán

và điều trị bệnh đang trở thành một xu hướng được nhiều người ưa chuộng,bởi tính an toàn và ít tác dụng phụ Trên thế giới và ngay tại Việt Nam cũng

đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh được tác dụng làm giảm glucose máu

từ các loại thảo dược hay thực vật nói chung Trong đó, nghiên cứu tác dụng

ức chế hai enzym α-glucosidase và PTP1B từ các loại lá, vỏ cây hay các loạiquả đang được quan tâm rất lớn

Ổi hay còn gọi là ủi, phan thạch lựu Tên khoa học là Psidium guajava L., thuộc họ Sim Myrtaceae Cây ổi nguồn gốc miền nhiệt đới châu Mỹ, sau

được phổ biến và trồng khắp ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi [2] Các hợpchất trong lá ổi gồm có: morin flavonoid, morin-3-O-lyxosyde, morin-3-O-arabinoside, quercetin, quercetin-3-O-arabinoside, glycosides, alkaloids,saponins và tritecpenoid [33] Theo y học cổ truyền, lá ổi có vị đắng sáp, tính

ấm, có công dụng tiêu thũng giải độc, thu sáp chỉ huyết Quả ổi vị hơi chuasáp, tính ấm, có công dụng thu liễm, kiện vị cố tràng [2] Các nghiên cứu chothấy, dịch chiết từ các bộ phận của cây ổi đều có tác dụng kháng khuẩn, làmsăn se niêm mạc và cầm đi lỏng [28] Ngoài ra, hiện nay một số quốc gia nhưNhật Bản đã sử dụng lá ổi để làm trà, trà lá ổi được biết đến như một loại đồuống giúp kiểm soát lượng đường trong máu, giảm cholesteron, hỗ trợ giảmbéo và một số tác dụng khác…

Để tìm hiểu rõ hơn, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng

ức chế enzym α-GLUCOSIDASEglucosidae và enzym PTP1B in vitro của dịch chiết lá cây

ổi (Psidium Guajava L.) trồng tại Việt Nam” với mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidae in vitro của các phân đoạn dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.).

2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym PTP1B in vitro của các phân đoạn dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.).

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường

1.1.1 Tổng quan về bệnh đái tháo đường

Theo Tổ chức Y tế Thế giới ( WHO), đái tháo đường là một rối loạnchuyển hóa do rất nhiều nguyên nhân, được mô tả là sự tăng đường huyếtmạn tính cùng với rối loạn chuyển hóa carbohydrat, chất béo và protein, nó làhậu quả của sự suy giảm tiết insulin và giảm hoạt tính insulin [37]

Bệnh đái tháo đường đã được biết đến từ lâu trong lịch sử y học Từnhững năm 1.500 trước công nguyên trong các tài liệu của người Ai Cập cổđại đã mô tả bệnh có triệu chứng liên quan đến bệnh đái tháo đường ngày nay[41] Các tài liệu cổ của người Ấn Độ cổ cũng ghi lại những nệnh nhân có

triệu chứng uống nước nhiều, hiện tượng “ruồi bâu, kiến bậu” vào nước tiểu.

Y học cổ xưa cũng đã có một số phương pháp điều trị như: dùng thuốc lợitiểu, tắm bồn nước nóng, rạch tĩnh mạch, tẩy giun và dùng các loại thảo mộc[37]

Năm 1674 sau công nguyên, Thomas Willis là người đầu tiên so sánh vịngọt của đường trong nước tiểu giống như mật, từ đó thuật ngữ “diabetesmellitus” bắt đầu xuất hiện và được sử dụng cho tới nay [3]

Năm 1869, Paul Langerhans đã phát hiện ra tụy có hại loại tế bào

Năm 1872, Bouchardart nhận thấy đường trong nước tiểu giảm khi cácbệnh nhân nhịn đói lâu ngày hoặc ăn chế độ ăn khắc khổ [41] Từ đó, chế độ

ăn được quan tâm trong việc điều trị bệnh đái tháo đường

Từ những năm 1875 – 1901, các nghiên cứu về các tế bào đảo tụy tiếptục được thực hiện Năm 1901, Eugen Opie phát hiện người bệnh đái tháođường có tổn thương đảo tụy Langerhans Ông cho rằng các tế bào của đảotụy đã tiết ra chất mà khi thiếu các chất này thì gây ra bệnh đái tháo đường[38]

Năm 1906, Geoge Zuelezer đã thử nghiệm điều trị cho người mắc đáitháo đường bằng cách tiêm chất chiết xuất của tụy, tuy nhiên thử nghiêm nàythất bại do người bệnh co giật

Năm 1920, Frederick Banting và các đồng nghiệp đã thành công khidùng chất chiết xuất của tụy để nuôi sống những con chó đã bị cắt tuyến tụy.

Họ đã đặt tên cho chất này là “isletin”

Tiếp sau đó năm 1921 , người ta đã thử nghiệm lần đàu tiên chất isletincho một bệnh nhân 14 tuổi và tháy mức glucose máu của người bệnh đã hạxuống nhanh chóng từ 440 mg/dL xuống 320 mg/dL Cùng thời gian này,giáo sư Macleod tại trường đại học Toronto đã sử dụng huyết thanh này đểđiều trị cho người bệnh và ông đổi tên “isletin” thành “insulin” [37]

Từ những năm 1922 cho tới nay insulin đã được nghiên cứu, sản xuất

và bán trên thị trường Việc sử dụng insulin trở nên dễ dàng thuận tiện hơnnhiều, tuy nhiên giá thành vẫn còn rất đắt đỏ Năm 1979, người ta đã tạo rađược insulin bằng công nghệ AND tái tổ hợp và tới năm 1982, insulin tái tổhợp đã được sản xuất thành công làm giảm giá thành của insulin giúp chohàng triệu bệnh nhân đái tháo đường trên thế giới

Năm 1998, nước Anh công bố nghiên cứu chúng minh vai trò của liệupháp điều trị tích cực đối với người mắc bệnh đái tháo đường type 2 và làmgiảm mức độ các biến chứng mạn tính của bệnh [3]

1.1.2 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và tại Việt Nam

Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF), năm 2015 trên toàn thếgiới có 415 triệu người lớn (độ tuổi 20-79) đang sống với bệnh đái tháođường và dự đoán đến năm 2040, con số này sẽ tăng đến khoảng 642 triệungười Bên cạnh đó, cùng với việc tăng sử dụng thực phẩm không thích hợp,

ít hoặc không hoạt động thể lực ở trẻ em, bệnh đái tháo đường type 2 đang có

xu hướng tăng ở cả trẻ em, trở thành vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng[38]

Bệnh đái tháo đường gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, là nguyênnhân hàng đầu gây bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận, và cắt cụt chi Nhưngmột điều đáng khả quan, có tới 70% trường hợp đái tháo đường type 2 có thể

dự phòng hoặc làm chậm xuất hiện bệnh bằng tuân thủ lối sống lành mạnh,dinh dưỡng hợp lý và tăng cường luyện tập thể lực [38]

Tại Việt Nam, năm 1990 của thế kỷ trước, tỷ lệ bệnh ĐTĐ chỉ là 1,1 %(ở thành phố Hà Nội), 2,25% (ở thành phố Hồ Chí Minh), 0,96% (thành phốHuế), nghiên cứu năm 2012 của Bệnh viện Nội tiết trung ương cho thấy: tỷ lệhiện mắc đái tháo đường trên toàn quốc ở người trưởng thành là 5.42%, tỷ lệđái tháo đường chưa được chẩn đoán trong cộng đồng là 63.6% Tỷ lệ rối loạndung nạp glucose toàn quốc 7,3%, rối loạn glucose máu lúc đói toàn quốc1,9% (năm 2003) Theo kết quả điều tra STEPwise về các yếu tố nguy cơ củabệnh không lây nhiễm do Bộ Y tế thực hiện năm 2015, ở nhóm tuổi từ 18-69,cho thấy tỷ lệ đái tháo đường toàn quốc là 4,1%, tiền đái tháo đường là 3,6%[3].

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh đái tháo đường type 2

Bệnh đái tháo đường type 2 hay còn gọi là đái tháo đường không phụthuộc insulin thường thấy ở người sau tuổi 40 và có thể trạng béo Bệnh đáitháo đường type 2 là một rối loạn mạn tính mà nguyên nhân được cho là do có

sự tương tác giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường [4]

1.1.3.1 Thừa cân và béo phì

Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân (BMI từ 25 – 30 kg/m2) và béophì (BMI > 30 kg/m2) trên thế giới được dự đoán sẽ tăng lên 57,8% vào năm

2030 Thừa cân và béo phì dẫn tới viêm, tăng tiết từ mô mỡ các hoạt chấtnhóm adipocytokine Tất cả nững hiện tượng này đều có vai trò gây khánginsulin ở gan, mô cơ và tăng nguy cơ dẫn tới mắc bệnh đái tháo đường [41].Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, đối với người châu Á, BMI từ23-25 kg/m2 là thừa cân và trên 25 kg/m2 là béo phì [4]

Đặc điểm của đa số bệnh nhân đái tháo đường ở Việt Nam thường cóBMI bình thường nhưng mỡ bụng, phần trăm mỡ cơ thể và mỡ bụng cao, đặcbiệt là ở phụ nữ [23] Nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy những người có BMI

> 23 kg/m2 thì có nguy cơ mắc đái tháo đường type 2 cao gấp 2,89 lần so vớingười bình thường [3]

1.1.3.2 Tuồi

Nguy cơ đái tháo đường tăng cùng với tuổi do tăng tính kháng insulinliên quan tới béo phì và tinhg trạng ít vận động Cùng với thời gian, các tế bào

beta suy yếu do phải tăng tiết insulin để bù đắp cho sự tăng mức độ khánginsulin của cơ thể Ở Châu Á, tỷ này cao ở người trẻ tuổi và trung niên, đâychính là độ tuổi lao động sản xuất chính của xã hội Điều này gây nên gánhnặng lớn cho các nước Châu Á mà trong đó chủ yếu là những nước đang pháttriển và kém phát triển [38].

Tại Việt Nam, nghiên cứu dịch tễ bệnh đái tháo đường tại 4 thành phốlớn năm 2003 cho kết quả tỉ lệ mắc đái tháo đường ở nhóm người dưới 35tuổi là 0,9% còn ở nhóm 45-54 tuổi là 6,5% và ở nhóm 55-64 tuổi là 10,3%.Nghiên cứu này cũng chứng minh tuổi cao là một yếu tố nguy cơ đặc biệt, cóliên quan chặt chẽ đến bệnh đái tháo đường [3]

1.1.3.3 Tiền sử gia đình

Tiền sử gia đình là một yếu tố quan trọng liên quan tới bệnh đái tháođường, điều này một phần thể hiện cho vai trò của yếu tố di truyền đối vớinguy cơ mắc bệnh Những đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao nếu có ít nhất

1 người trong gia đình bị bệnh Theo Tạ Văn Bình và cộng sự, tiền sử giađình có bố mẹ hoặc con ruột, anh, chị, em ruột bị mắc đái tháo đường thì cónguy cơ mắc bệnh cao gấp 3,28 lần so với nhóm bình thường không có ngườithân trong gia đình mắc đái tháo đường [23]

1.1.3.4 Yếu tố gen

Nghiên cứu ở các cặp sinh đôi đã cung cấp những bằng chứng thuyếtphục về ảnh hưởng của yếu tố di truyền đối với bệnh đái tháo đường Các cặpsinh đôi cùng trứng có tỷ lệ tương đồng cao hơn so với các cặp sinh đôi kháctrứng Sự tương đồng về nguy cơ mắc đái tháo đường type 2 ở người sinh đôicùng trứng từ 34-83% và ở người sinh đôi khác trứng là 16-40% [37]

1.1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực

Chế độ dinh dưỡng phù hợp và luyện tập là chìa khóa để chống lại béophì và cao huyết áp, tăng hoạt động của insulin và giảm sự tạo glucose ở gan.Hoạt động thể lực có vai trò đặc biệt quan trọng đối với bệnh đái tháo đườngtype 2 Nhóm đối tượng ít vận động (< 30 phút/ngày) có nguy cơ mắc đái tháođường cao gấp 2,4 lần so với nhóm hoạt động nhiều Nhiều nghiên cứu đã chothấy việc hoạt động thể lực thường xuyên có tác dụng làm giảm nồng độ

glucose máu đồng thời duy trì sự ổn định của lipid máu, huyết áp và giúp cảithiện tâm lý Sự phối hợp hoạt động thể lực thường xuyên và điều chỉnh chế

độ ăn có thể giúp giảm 58% tỷ lệ mắc mới đái tháo đường type 2 [41]

1.1.4 Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường type 2

1.1.4.1 Cơ chế liên quan đến rối loạn tiết insulin

Khi mới bị đái tháo đường type 2, insulin có thể bình thường hoặc tănglên nhưng tốc độ tăng chậm không tương ứng với mức tăng của glucose máu.Khi glucose máu > 13,8mmol/l thì các rối loạn chức năng tế bào beta về bàitiết insulin sẽ rõ rệt Khi nghiên cứu nồng độ insulin lúc đói sau nghiệm phápdung nạp đường huyết giờ thứ hai của người mắc đái tháo đường type 2,Defronzo và cộng sự thấy mỗi tương quan giữa nồng độ glucose máu lúc đói

và nồng độ insulin lúc đói có sự thay đổi đặc biệt [23]:

- Khi glucose máu tăng đến 120mg/dL lượng insulin sẽ tăng gấp đôi

- Khi glucose máu từ 150-160 mg/dL lượng insulin tiết giống như ngườibình thường

- Khi glucose máu trên 160 mg/dL xuất hiện hiện tượng giảm đáp ứng

- Khi glucosse máu 200-220 mg/dL thì đáp ứng giảm rõ rệt

1.1.4.2 Cơ chế bệnh liên quan đến kháng insulin

Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc mất tính nhạy cảm của cơ quanđích với insulin Kháng insulin do nhiều nguyên nhân: tế bào beta tiết insulinbất thường, có chất đối kháng insulin lưu thông trong máu như: glucagon,catecholamine, cortisol, hormon GH, axit béo tự do (FFA), kháng thể khánginsulin, kháng thể kháng thụ thể insulin, resistin, TNF alpha (Tumor Necrosisfactor alpha), IL-6 (Interleukin-6) [4]

Insulin kiểm soát cân bằng đường huyết qua 3 cơ chế, mỗi cơ chế rốiloạn có thể dẫn đến kháng insulin [1]:

- Insulin ức chế sản xuất glucose từ gan

- Insulin kích thích dự trữ glucose ở tổ chức cơ

- Insulin kích thích dự trữ glucose ở các cơ quan

1.1.4.3 Triệu chứng của đái tháo đường

Bệnh đái tháo đường thường không có triệu chứng rõ rệt ở giai đoạnsớm, nhưng gây ra cảm giác như ốm: cảm sốt, đau bụng, đau đầu, ho Sau mộtthời gian dài, các triệu chứng lâm sàng gồm [4]:

- Háo nước, uống nhiều nước, luôn thấy khát

- Đi tiểu nhiều lần trong ngày, kể cả đêm

- Thường xuyên cảm thấy đói và ăn nhiều

- Cơ thể mệt mỏi, khó tập trung vào học hành, công việc, dễ nổi cáu

- Nhìn sự vật mờ đi

- Giảm cân nhiều trong một thời gian ngắn

1.1.4.4 Biến chứng của đái tháo đường

Biến chứng là vấn đề đe dọa sức khỏ lớn nhất đối với người mắc đáitháo đường Các biến chứng thường thấy như: biến chứng thận, tim mạch,mắt, chân, tổn thương ở da, miệng, loãng xương,… Khi xuất hiện biến chứng

ở các cơ quan, người bệnh sẽ thấy nhiều triệu chứng như suy thận, đục thủytinh thể, cao huyết áp, nhiễm trùng dai dẳng Hậu quả để lại nặng nề, gây ragánh nặng cho bệnh nhân và gia đình [3]

1.1.5 Chẩn đoán bệnh đái tháo đường

Theo khuyến cáo của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ và Tổ chức Y tếThế giới, đái tháo đường được chẩn đoán dựa vào 1 trong 4 tiêu chuẩn sau[37]:

- Đường huyết lúc đói ≥ 126mg/dL hoặc ≥ 7,0 mmol/l (đo ở thời điểmnhịn đói ít nhất 8h)

- Đường huyết 2 giờ ≥ 200 mg/dL hoặc ≥ 11,1 mmol/l khi làm xétnghiệm dung nạp glucose

- HbA1c ≥ 6,5%

- Bệnh nhân có triệu chứng của tăng đường huyết hay tăng đườnghuyết trầm trọng (gồm: uống nhiều nước, tiểu nhiều, sụt cân khônggiải thích được) kèm theo xét nghiệm đường huyết ngẫu nhiên ≥ 200mg/dL hoặc ≥ 11,1 mmol/l

Việc phát hiện rối loạn glucose máu lúc đói bằng xét nghiệm dung nạpglucose máu tĩnh mạch có độ nhạy cao hơn so với phương phá xét nghiệmdung nạp glucose bằng máu mao mạch [38].

 Nghiệm pháp dung nạp đường huyết

Phương pháp xét nghiệm bằng dung nạp đường uống (OGTT) đánh giáhiệu quả chuyển hóa glucose của cơ thể được dùng làm “tiêu chuẩn vàng” đểchẩn đoán đái tháo đường trong nhiều năm nay Tăng nồng độ glucose máusau bữa ăn thường xảy ra trước khi tăng glucose lúc đói Do đó glucose máusau bữa ăn là một chỉ báo nhạy của nguy cơ phát hiện bệnh tiểu đường Tuynhiên để thực hiện OGTT, bệnh nhân cần các điều kiện quan trọng gồm có:khẩu phần ăn ít nhất phải có 150g carbohydrat/ngày trong 3 ngày trước khilàm nghiệm pháp, nhịn đói từ 10 đến 16 giờ và bắt đầu làm nghiệm pháptrong khoảng 7 đến 9 giờ sáng [23]

Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nên sử dụng tiêuchuẩn OGTT bởi nếu chỉ xét nghiệm glucose máu lúc đói thì sẽ có 30%trường hợp không phát hiện ra đái tháo đường Ngoài ra các trường hợp rốiloạn đường huyết chỉ được phát hiện bằng xét nghiệm OGTT [41]

 Tiêu chuẩn HbA1c trong chẩn đoán đái tháo đường type 2

HbA1c là nồng độ glucose máu hoặc huyết tương trung bình trong 8 –

12 tuần Chỉ số HbA1c đã được sử dụng để chẩn đoán đái tháo đường type 2

và để dùng đánh giá ca mới mắc và hiện mắc đái tháo đường type 2 Chỉ sốHbA1c có nhiều thuận lợi cho người bệnh: máu được lấy ở bất kỳ chỗ nào,không cần nhịn ăn hoặc ngay cả khi bệnh nhân có dung nạp glucose trước đó.Khác với tiêu chuẩn xét nghiệm đường huyết lúc đói hoặc dung nạp glucosethì HbA1c không bị ảnh hưởng bởi stress, lượng carbohydrat trong chế độ ănuống hoặc hoạt động thể lực và rất ổn định trong mẫu máu bảo quản ở 37°C[38]

Tuy nhiên tiêu chuẩn này vẫn còn những hạn chế như yêu cầu phải thựchiện trong phòng thí nghiệm đạt chuẩn, tin cậy, chi phí xét nghiệm cai hơn sovới phương pháp xét nghiệm đường huyết lúc đói và dung nạp glucose Khibệnh nhân có những vấn đề về máu: thiếu máu, mang thái, suy thận, bệnh lý

@

Bên cạnh việc sử dụng thuốc, xây dựng một lối sống lành mạnh là điều không thể thiếu để giúp người bệnh đái tháo đường type 2 có một cuộc sống ổn định hơn Chế độ lành mạnh là một yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới bệnh đái tháo đường Lựa chọn thực phẩm có nhiều chất xơ, ăn nhiều đạm có nguồn

trọng luộc, hấp, áp chảo, hạn chế đồ rán, xào, sử dụng các loại gia vị và nước sốt ít béo, ít muối và đường Ăn trái cây nguyên quả, không ép nước Tập luyện thường xuyên sẽ cải thiện sức khoẻ nói chung và giúp chống lại bệnh tật, nhất là bệnh tim mạch, xương khớp Tập luyện làm tăng cường sinh lực, giảm cân và giảm đường huyết nên được coi là một biện pháp quan trọng trong điều trị bệnh nhân đái tháo đường []

làm giảm thời gian sống hồng cầu, tăng ure máu, các bệnh lý có liên quan thới

hemoglobin thì không thể đánh giá bằng HbA1c [38]

1.1.6 Điều trị đái tháo đường

1.1.6.1 Điều trị sử dụng thuốc

Hiện nay, cách điều trị đái tháo đường chủ yếu vẫn là sử dụng kết hợp

các loại thuốc cùng với đó là lối sống lành mạnh nhằm duy trì sự ổn định và

hạn chế các biến chứng nặng nề Thuốc sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường

type 2 chủ yếu chia 3 nhóm [3]:

- Nhóm thuốc kích thích tụy tiết insulin như nhóm sufonylurea:

Tolbutamide, Chlorpropamide, Glibenclamid, Gliclazid, Glimepirid,

Glipizide, Glinide; nhóm meglitinide: Prandin, Starlix; nhóm

sitagliptin: Januvia, Onglyza

- Nhóm thuốc giúp tăng độ nhạy của insulin như nhóm biguanide:

metformin (Glucophage, Glucophge XR, Metformin XR); nhóm

thiazolidinedione (TZD) hay glitazone, (Rosiglitazone, pioglitazone )

- Thuốc ức chế men α-glucosidase (làm chậm hấp thu đường glucose

từ ruột vào máu): Acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset)

1.1.6.2 Điều trị không sử dụng thuốc

gốc thực vật, ít chất béo, đặc biệt chất béo bão hoà Chế biến thực phẩm chú

vai trò định hướng tất cả mọi phản ứng xảy ra trong tế bào Khi ở ngoài tế bào nhiều enzym vẫn có khả năng hoạt động tương tự [].

1.2.1.2 Chất ức chế enzymChất ức chế enzym là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt

Enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20) còn có những tên gọi khác như

thuận nghịch với enzym Thường phân biệt hai loại ức chế thuận nghịch, ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh []

Tổng quan về enzym α-GLUCOSIDASEglucosidase

Danh pháp và phân loại

Enzym α-glucosidase là một enzym một thành phần, có hoạt tínhexohydrolysis, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tậncùng không khử của carbohydrate giải phóng các phân tử α-D-glucose Chất

glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidehydrolase, α-1,4-glucosidase, α-D-glucoside glucohydrolase []

biệt của các yếu tố nhiệt độ, áp suất… Enzym có thể được thu nhận từ các cơthể sống khác nhau của động vật, thực vật, vi sinh vật [32]

Enzym trong cơ thể sinh vật với chức năng là xúc tác chọn lọc, đóng

hoàn toàn tác dụng của enzym Các chất ức chế có bản chất hóa học rất khácnhau, có thể là các ion hóa kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ phân tửnhỏ hoặc là protein Chất ức chế có thể có phản ứng thuận nghịch hoặc không

nền đặc trưng của enzym α-glucosidase là các disaccharide, oligosaccharide,các aryl- và akyl-α-glucopyranoside khác [30]

hydrolase Glycoside hydrolase là một lớp các enzym thường tách liên kếtglycoside giữa 2 phân tử carbohydrate, một trong những liên kết mạnh nhấtđược tìm thấy ở các polymer tự nhiên Các enzym này có khả năng bẻ gãy cácliên kết glycoside nhanh hơn 1017 lần so với phản ứng không có enzym xúc

Chúng ta biết rằng carbohydrat chứa trong thức ăn là nguồn cung cấp

tử đường này được tỏa ra nuôi các tế bào cơ thể []

Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy phải tiết ra α-amylase dùng để phá

vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid, màng tế bào ruột non lạitiết ra α-glucosidase để tiếp tục phân hóa các oligosaccharide thành các phân

tử đường đơn rồi mới thẩm thấu vào máu Chức năng chính của enzym này làxúc tác cho việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất để giải phóng ra

Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase, có thể làmgiảm sự thủy phân của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào

Acarbose và miglitol đang được sử dụng rộng rãi như thuốc điều trị đáitháo đường type 2 Cơ chế hoạt động của các thuốc này là ức chế enzymα- glucosidase ở ruột Cụ thể chất ức chế α-glucosidase là các saccharide hoạtđộng như chất ức chế sự cạnh tranh của các enzym cần thiết để tiêuhóa carbohydrate, đặc biệt là enzym α-glucosidase

Enzym α-glucosidase là một trong những enzym thuộc lớp glycoside

Hiện nay, người ta đã tìm ra một số các hợp chất ức chế enzym glucosidasenhư:flavonoid,anthocyanidin,isoflavone,phenolic,

α-curcuminoids, terpinoid… Việc tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc tự nhiênđang rất được quan tâm trên toàn thế giới, khi mà các hợp chất hóa học đang

có một nhược điểm là để lại nhiều tác dụng phụ []

Bảng 1.1 Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase []

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử Acarbose

Apigennin Hesperetin (+)-catechinCyanidin-3-galactoside Cyanidin-3- galactoside2R,3R,4R,5R)2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4-dihydroxypyrrolidine

1-deoxynojirimycin …

2 Alcaloid

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axitAxit 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-α-l-

-d-xylopyranosyl-(1→4)-α-lrhamnopyranosyl- (1→2)-β -d-fucopyranosyl ester,…

3 Saponin-triterpenoid

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axitAxit 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-α-l-

-d-xylopyranosyl-(1→4)-α-lrhamnopyranosyl- (1→2)-β -d-fucopyranosyl ester, …

4 Curcuminoid

Curcumin Demethoxycurcumin Bisdemethoxycurcumin

5 Miscellaneous

Bromophenols2,4,6-tribromophenol2,4- dibromophenol

6 Phenolic

Chebulanin Chebulagic axitChebulinic axit(-)-3- O-galloylepicatechin(-)-3-O-galloylcatechin

1.2.3 Tổng quan về enzym PTP1B (protein tyrosine phosphatase 1B)

1.2.3.1 Danh pháp và phân loại

PTP1B (EC 3.1.3.48) là tên viết tắt của protein tyrosin phosphatase 1B.Đây là một enzym thuộc phân họ pTyr PTP cổ điển - một trong bốn phân họcủa siêu họ enzym Protein Tyrosin Phosphatase [18]

1.2.3.2 Cấu trúc

PTP1B là protein chứa 435 axit amin, trong đó vùng xúc tác từ axitamin 30 đến axit amin 278 Đầu tận C kị nước chính là vị trí để enzym gắnvào bề mặt lưới nội chất Đặc điểm cấu trúc đặc trưng của PTP1B là vòng xúctác gồm đơn phân xúc tác Cys215, vòng WPD (tryptophan, prolin, axitaspartic) và vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp [24]

Trung tâm hoạt động của PTP1B có cấu trúc phổ biến như của các PTPnói chung Vị trí xúc tác cơ bản được xác định từ axit amin 214-221 (His-CysSer-Ala-Gly-Ile-Gly-Arg) - đây là vòng của 8 axit amin có cấu trúc bềnvững, giúp phối hợp với gốc aryl-phosphat của cơ chất Vòng này cũng chứa

vị trí ái nhân Cys215 Bốn vòng khác tạo thành các cạnh của khe xúc tác gópphần vào quá trình xúc tác và nhận diện cơ chất (Asp181, Phe182, Tyr46,Val49, Lys120 và Gln262) Chiều sâu của khe xúc tác là 8-9Å cho cơ chất đặchiệu [29]

Vòng WPD, sự thay đổi hình dạng của PTP1B liên quan đến hoạt độngxúc tác của enzym khi liên kết với cơ chất Vòng WPD (axit amin 79-187) dichuyển tới 12Å để đóng vòng phenyl của cơ chất, làm tăng tương tác kị nước.Asp181 di chuyển tới vị trí mà nó có thể hoạt động giống một axit phổ biến đểchuyển proton cho nhóm tyrosyl rời đi Arg221 cũng thay đổi vị trí để tối ưuhóa tương tác “cầu muối” với cơ chất phosphat Trong quá trình chuyển dạngnày, Cys215 là vị trí liên kết ái nhân vào nguyên từ phospho của cơ chất Vìvậy tác nhân ức chế PTP1B có thể tác động vào cả quá trình chuyển dạng

“mở” và “đóng” của PTP1B [29]

Vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp: đây là vị trí xúc tác không hoạtđộng, tạo ra liên kết yếu hơn so với vị trí hoạt động cơ bản do tiếp xúc vớimôi trường nhiều hơn Tuy nhiên vị trí này quan trọng trong thiết kế tác nhân

Giai đoạn 2: Khi gốc phosphat đã được chuyển đến gốc cystein, cơ chấtrời khỏi enzym và bước cuối cùng là sự thủy phân gốc phosphat Sự liên hợpcủa một phân tử nước và glycin giúp sự thủy phân gốc phosphat xảy ra dễdàng hơn Khi gốc phosphat rời khỏi, vị trí hoạt động sẵn sàng để tiếp tục xúc

tác cho phản ứng tiếp theo Trong quá trình đó, gốc phosphat ở cơ chất đầutiên được chuyển đến tiểu phân cystein ở vị trí xúc tác trước khi bị thủy phânbởi nước để giải phóng anion phosphat [31].

1.2.3.4 Vai trò của enzym PTP1B trong điều trị đái tháo đường

Insulin là hormon do tế bào beta đảo tụy tiết ra, có vai trò quan trọngtrong việc duy trì nồng độ glucose máu và điều hòa quá trình chuyển hóacarbohydrat, lipid và protein Insulin tạo ra được tác dụng sinh học khi gắnvào thụ thể của nó ở các mô đích (mô cơ, mô gan, mô mỡ) và dẫn đến mộtloạt các tín hiệu tế bào [36]

Thụ thể insulin (IR) (KLPT 340.000), được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị(α và β) có bản chất glycoprotein Tiểu đơn vị β có hoạt tính tyrosin kinase.Khi insulin liên kết với IR làm thay đổi hình dạng của IR, hoạt hóa hoạt tínhkinase, gây ra sự tự phosphoryl hóa tiểu đơn vị β Sự hoạt hóa IR làmphosphoryl hóa một số cơ chất protein phía dưới bao gồm cơ chất của insulinreceptor (IRS) và một số protein khác, gây ra tác dụng sinh học của insulin[39]

Một trong những chìa khóa của tín hiệu insulin là phosphatidylinositol3-kinase (PI3K) Hoạt hóa PI3K giúp hoạt hóa PI3K-dependent kinase 1(PDK1), tiếp theo là hoạt hóa protein kinase (Akt) Akt rất cần thiết cho vậnchuyển glucose vào tế bào và tổng hợp glycogen

Nồng độ glucose máu ổn định là kết quả của sự cân bằng giữa quá trìnhphosphoryl hóa tyrosin bởi protein tyrosin kinase và quá trình khử phosphoryltyrosin bởi các protein tyrosin phosphatase (PTP) [40] Một trong những cơchế của đái tháo đường type 2 là tình trạng kháng insulin, ảnh hưởng đến sựvận chuyển và chuyển hóa glucose ở gan, cơ và mô mỡ [43] Ở cấp độ tế bào,kháng insulin biểu hiện ở sự giảm đáp ứng với một số lượng cực đại củainsulin hoặc giảm tính nhạy cảm với sự kích thích vận chuyển glucose vàchuyển hóa Mặc dù khiếm khuyết ở phân tử gây nên sự kháng insulin chưađược biết rõ tuy nhiên hầu hết các bằng chứng cho thấy có thể nó liên quanđến sự truyền tín hiệu ở IR