KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (DL và DLS) nghiên cứu tác dụng của tam thất hoang trên sự biểu hiện COX 2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập

Các tế bào này có khả năng sản xuất ra nitric oxid NO, một chấtgiãn mạch quan trọng và có nhiều vai trò trong điều hòa chức năng sinh lý của mạchmáu như trương lực mạch, sự kết tập tiểu

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL HÓA

VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CÔ LẬP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2018

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL

HÓA VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CÔ LẬP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ Ban chủ nhiệm khoa Y - Dược,Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Bộ môn Y - Dượchọc cơ sở đã tạo điều kiện cho em để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Em xinchân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hoàn thành chương trình

Em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Thị Thơm và

PGS TS Dương Thị Ly Hương, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo

Em xin cảm ơn chương trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp

khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ 2 loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-

18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung nghiên cứu này Em cũng xin

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân

đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót,

em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô để khóa luận thêm hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn!

LỜI CẢM ƠN

học tập trong suốt 5 năm qua

điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộmôn Dược lý – Dược lâm sàng, thầy cô Bộ môn Y – Dược học cơ sở đã giúp đỡ emtrong quá trình hoàn thành khóa luận

cảm ơn Bộ môn Sinh lý học, Học viên Quân Y đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Giải thích

vein endothelial cell)

NSAIDs Thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal

anti- inflammatory drugs)

nội mạc

12

tổng hợp NO

26

biểu hiện protein eNOS phosphoryl hóa

27

biểu hiện mARN COX-2

28

biểu hiện protein COX-2

29

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Tổng quan về Tam thất hoang 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Sinh thái và phân bố 2

1.1.3 Thành phần hóa học 3

1.1.4 Tác dụng dược lý 4

1.1.5 Công dụng 4

1.2 Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS 5

1.2.1 Nội mạc mạch máu 5

1.2.2 eNOS 6

1.3 Tổng quan về viêm và COX-2 14

1.3.1 Viêm và prostaglandin trong viêm 14

1.3.2 COX – 2 15

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Dung môi, hóa chất và thiết bị 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cô lập 21

2.3.2 Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa 22

3.1 Kết quả 24

3.1.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập 24

3.1.2 Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa 26

3.1.3 Tác dụng trên sự biểu hiện COX-2 28

3.2 Thảo luận 30

3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập 30

3.2.2 Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa 31

3.2.3 Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang có những tác dụng kể trên hay

không? Để làm sáng tỏ điều đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) trên sự biểu

1 Bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên

cơ trơn cô lập của khí quản, bàng quang và thể hang

2 Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểuhiện của eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp NO

3 Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểuhiện của gen COX-2 và protein COX-2

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nội mạc mạch máu là một lớp tế bào nội mô mỏng nằm lót mặt trong củalòng mạch [1] Các tế bào này có khả năng sản xuất ra nitric oxid (NO), một chấtgiãn mạch quan trọng và có nhiều vai trò trong điều hòa chức năng sinh lý của mạchmáu như trương lực mạch, sự kết tập tiểu cầu, sinh mạch, sự kết dính bạch cầu – nộimô… Tại nội mạc mạch máu, NO được tổng hợp nhờ các enzym nitric oxidesynthase ở nội mạc (eNOS - Endothelial nitric oxide synthase) Hoạt động củaenzym này được điều khiển bởi nhiều cơ chế trong đó có quá trình phosphoryl hóaeNOS [41,69] Viêm là một trong những nguyên nhân gây rối loạn chức năng nộimạc [67] Rối loạn chức năng nội mạc có liên quan đến NO, phosphoryl hóa eNOS

và quá trình viêm đã được báo cáo trong nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa độngmạch, cao huyết áp…[24,37] Trong những năm gần đây, sự điều hòa eNOS thôngqua quá trình phosphoryl hóa đang là một mục tiêu y học triển vọng trong điều trịnhiều bệnh lý [41]

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng ) thuộc chi

Panax L., ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9].

Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ và lá của Tam thấthoang có chứa saponin với hàm lượng cao [6] Đặc biệt, saponin trong các loài

thuộc chi Panax L đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng tổng hợp

NO, tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa [39,73] và chống viêm [32,45,58].Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế Điều này đặt ra câu

hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập” với ba mục tiêu:

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Tam thất hoang

Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên

khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8]

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, có nhiểu vết lõm dovết thân để lại, ít phân nhánh Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá

Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm Lá chét 5,

có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn haiđầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5nhị và bầu 2 ô Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu

đỏ Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1.1) [2]

Hình 1.1 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

[11]

1.1.2 Sinh thái và phân bố

Tam thất hoang (TTH) ưa ẩm và sáng Cây mọc rải rác trên đất có nhiềumùn, dưới tán rừng kín thường xanh, ở độ cao 1600 – 2300 m Tái sinh bằng hạt Rahoa tháng 4 – 5, có quả tháng 5 – 9 Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mớichỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc giaHoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [2,9]

1.1.3 Thành phần hóa học

Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều làsaponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponinkhung dammaran với hàm lượng thấp [19]

Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19]

Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tíchthành phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được mộthàm lượng nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd[43]

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được

11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đó có một chất mới làspinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15] Năm 2013, nhómtiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45] Ngoài ra

3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P stipuleanatus [45]

Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự chỉ ra trongTTH ngoài saponin còn có thành phần khác như: polyacetylen, triterpenoid, tinhdầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic, acid béo, acid amin và các nguyên tố

vi lượng [5,6]

Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân lập từ TTH là stipudiol và stipuol

ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thông qua kíchhoạt quá trình apotosis của tế bào [46]

1.1.4 Tác dụng dược lý

Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 –

11, hình 1.2) nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc

trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người

(HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với

giá trị IC50 lần lượt là 4,44 và 0,63 µM trên 2 dòng tế bào HL-60 và HCT-116 [15]

Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15,

hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất

từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 – 18,9 µM Các chất 8, 10 và 11 ức chế sự

biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2(cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ Điều này đem lại tiềm năng trong điều trịnhư là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45]

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy: CaoTTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ởcác mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/mlg/ml caosaponin toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thànhmalonyl dialdehyd Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống vớiliều LD50 = 8,8 g/kg [5]

Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả

TTH có tác dụng chống đông và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11].

1.1.5 Công dụng

Sách đỏ Việt Nam (2007) có ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có côngdụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinhdục, chống stress Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an

thần” TTH có tác dụng tán ứ, định thống Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma

Panacis Stipuleanati [2].

Tương tự như thành động mạch, thành tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch

mô lát đơn, gồm một hàng tế bào nội mô hình đa giác dẹt, có phần bào tương chứanhân lồi vào trong lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tỏa thành lá mỏng Các tế bào

dòng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hòa cácquá trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa và duy trì sự hằng định nội môi[30] Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52]

Nội mạc mạch máu có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự lưu thông

Nội mạc mạch máu hình thành nên một hàng rào bán thấm kiểm soát sự dichuyển của các chất hòa tan, các đại phân tử và cả các tế bào giữa dòng máu với các

mô xung quanh [27,30] Irie và Tavassoli gọi đó là hàng rào máu – mô [65] Rối

1.2 Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS

1.2.1 Nội mạc mạch máu

1.2.1.1 Đặc điểm cấu trúc

đồng tâm: Lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ, có các sợi thần kinh chi phối; lớp áo giữa gồm

huyết cũng có một lớp tế bào nội mô lợp mặt trong lòng mạch Lớp nội mô thuộc biểu

nội mô liên kết với nhau bằng những dải bịt hoặc liên kết khe [1] Ở người

một diện tích khoảng 1 - 7 m2 hình thành nên một tổ chức nặng khoảng 1 kg [27,52]

1.2.1.2 Chức năng của nội mạc mạch máu

loạn tính thấm nội mạc có thể gây ra nhiều bệnh lý như phù, sốc, xung huyết

P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và

PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor)

Năm 1980, Furchgott và Zawadzki đã chứng minh được rằng sự giãn của

nguyên vẹn và ACh đã kích thích sự giải phóng của một chất được gọi là yếu tốgiãn mạch nguồn gốc nội mạc (Endothelium derived relaxing factor – EDGR) Năm

1987, Palmer và cộng sự đã xác định được yếu tố đó là nitric oxide (NO) [25] Ngàynay, NO được biết đến là một trong những gốc khí tự do đơn giản nhất và đóng vaitrò tín hiệu trung gian quan trọng trong cơ thể [41] NO tham gia điều hòa nhiều quátrình sinh lý như sự dẫn truyền thần kinh, trương lực mạch máu, sự co cơ, kết tậptiểu cầu, chuyển hóa, đáp ứng miễn dịch, phiên mã gen và dịch mã mARN, quátrình biến đổi sau dịch mã của protein [25,69]

Các tế bào nội mô có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các

cực có nguồn gốc nội mô/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất comạch: Endothelin, thromboxan A2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin,

VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin

và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt – đại thựcbào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL-6)

và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin,fractalkin; các yếu tố liên quan đến quá trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hóaplasminogen mô), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen), yếu tốWillebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, TF (yếu tố mô), TFPI (chất ức chế conđường yếu tố mô); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch:VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor),

[17,26,27,38]

Rối loạn về cấu trúc cũng như chức năng nội mạc mạch máu liên quan đếnnhiều quá trình bệnh lý như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh động mạchvành, suy tim mạn, bệnh mạch ngoại vi, tiểu đường, tăng áp lực phổi, nhiễm khuẩn

nguyên tố kim loại chuyển tiếp để hình thành nên nitrosyl kim loại, đây là đặctính quan trọng trong con đường tín hiệu của nó Mặt khác, NO tan kém trongsinh lý Tuy nhiên, chất này không bền có thời gian bán thải (T1/2) ngắn và bị

Trong cơ thể NO được tổng hợp qua hai con đường: thông qua các enzym

Về đặc điểm cấu trúc và tính chất, NO là một gốc khí tự do nhỏ nặng 30Dalton, không màu và nhiệt độ nóng chảy khoảng 163,6 °C, trong cấu trúc của

NO có một electron chưa ghép cặp [25,60] NO có khả năng phản ứng với các

nước, có thể dễ vượt qua được màng tế bào để tham gia điều hòa các quá trìnhchuyển hóa nhanh trong cơ thể [25]

NOS (Nitric oxide synthase) hoặc từ quá trình khử của NO2- NOS là enzym xúc táccho phản ứng hình thành NO và L-citrullin từ L-arginin và O2 [69] Ở động vật có

vú, NOS có ba dạng chính, mã hóa bởi các gen riêng biệt trên nhiễm sắc thể (NST)khác nhau: NOS thần kinh (nNOS) hay NOS loại 1; NOS do cảm ứng (iNOS) hay NOS loại 2 và NOS nội mạc (eNOS) hay NOS loại 3 (Bảng 1.1) Con đường thứ hai

nhiều thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử ti thể Phản ứng khử NO2- đóng vaitrò quan trọng trong trường hợp thiếu oxy khi đó hoạt động của NOS bị giới hạn

-và NO3- Quá trình này có thể tự xảy ra (autooxidation) hoặc được xúc tác Một phần NO bị bất hoạt trong stress oxy hóa, NO kết hợp với superoxid (O2-) để hìnhthành nên peroxynitrit (ONOO-) [25,69]

iNOS(Inducible NOS)

eNOS(Endothelial NOS)

Tế bào

biểu hiện

Neuron thần kinh vàmột số tế bào khác

Nhiều loại tế bào hệthống miễn dịch nhưđại thực bào khi đáp

lipopolysaccharid (LPS), cytokin và cácchất khác

Tế bào nội mô

Đặc điểm Enzym cấu trúc Enzym cảm ứng Enzym cấu trúc

và ghi nhớ; kiểm soáthuyết áp trung ương

Ở hệ thần kinh ngoạivi: Chất dẫn truyềnthần kinh, giãn cơ trơn

và mạch

Tham gia vào sinh lýbệnh của quá trìnhviêm và hệ thốngmiễn dịch

nhiều chức năngtim mạch quantrọng: Giãn mạch,

ức chế các quátrình như kết tậptiểu cầu, kết dínhbạch cầu, tăng sinhcủa tế bào cơ trơnthành mạch

1.2.2.2 eNOS

eNOS (Endothelial nitric oxide synthase) là một trong 3 dạng của NOS NOsản xuất tại nội mô bởi eNOS là một hợp chất vận mạch quan trọng, tham gia điềuhòa nhiều quá trình sinh lý đặc biệt liên quan đến chức năng tim mạch eNOS biểuhiện chủ yếu trong tế bào nội mô, ngoài ra enzym này cũng được phát hiện trong tếbào cơ tim, tiểu cầu, neuron ở não, hợp bào lá nuôi của nhau thai người và trong tếbào biểu mô ống thận LLC-PK1 [69,70]

Hai domain này được gắn kết với nhau bởi một trình tự dài khoảng 30 acidamin chứa vị trí gắn của Camodulin (CaM).

Cấu trúc gen và protein

eNOS được mã hóa bởi một gen nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q35–7q36);

có cấu trúc gồm 26 exon, gen này chiếm một đoạn khoảng 21 – 22 kb [13,66,70]

Về cấu trúc, eNOS là một protein chứa 1203 acid amin, nặng 133 kDa, có dạnghomodimer gồm 2 domain (Hình 1.4) [13,70]:

- Domain reductase nằm ở đầu –COOH, chứa vị trí gắn của NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), FAD (Flavin adeninedinucleotide) và FMN (Flavin mononucleotide)

(Tetrahydrobiopterin), hem và L-arginin

-Hình 1.3 Cấu trúc của eNOS (Ser: Serine; Thr: Threonin) [29]

Phosphoryl hóa eNOS

Hoạt động của eNOS được điều khiển bởi 2 cơ chế đó là cơ chế phụ thuộc

Ca2+ và không phụ thuộc Ca2+:

Cơ chế phụ thuộc Ca 2+ : eNOS là một enzym phụ thuộc Ca2+/CaM Khi nồng

độ Ca2+ nội bào tăng, tạo điều kiện cho CaM gắn được vào vị trí của nó trên eNOS.CaM là protein đầu tiên tương tác với eNOS, sự gắn của CaM làm dịch chuyển điện

tử từ NADPH ở domain reductase đến hem ở domain oxygenase thông qua FAD vàFMN Tại vị trí hem các điện tử được dùng để khử và hoạt hóa O2 từ đó oxi hóa L-arginin thành L-citrullin và NO Các yếu tố thiết yếu cần cho eNOS chức năng bao

Phosphoryl hóa eNOS: Phosphoryl hóa eNOS là một biến đổi sau dịch mã,

được điều khiển bởi hệ thống các kinase, phosphatase và tương tác protein – protein

và đây là một trong những cơ chế tham gia điều khiển eNOS Mặc dù hoạt động của

cho sự điều hòa hoạt động của enzym này Sự gắn của CaM và sự dịch chuyển củadòng các điện tử từ domain reductase đến domain oxygenase của enzyme cũng phụthuộc vào sự phosphoryl hóa và khử phosphoryl hóa eNOS [41] Các nghiên cứuchỉ ra rằng, sự phosphoryl hóa eNOS xảy ra tại Serin (Ser) và ở một mức độ thấphơn trên Tyrosin (Tyr) và Threonin (Thr) Ở người, phosphoryl hóa Ser1177, Ser617

và Ser633 làm kích hoạt eNOS trong khi phosphoryl hóa tại Thr495 và Ser114 làmgiảm chức năng eNOS Sự phosphoryl hóa eNOS có thể được điều hòa bởi nhiềuyếu tố như “shear stress”, yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu (VEGF),bradykinin, insulin, estrogen… làm hoạt hóa các enzym khác nhau như serin/threonin kinase Akt, CaMKII (Ca2+/ calmodulin dependent protein kinase II),AMPK (AMP-activated protein kinase), PKA (protein kinase A) và gây phosphorylhóa eNOS tại các vị trí khác nhau (Hình 1.5) [29,34,41]

Ngoài ra, hoạt động của eNOS còn được điều khiển bởi sự tương tác với cácprotein như Hsp90 hay Caveolin-1 Cav-1 (Caveolin-1) là protein vỏ chính củacaveolae tại tế bào nội mô, cav-1 gắn với eNOS và kết quả là làm bất hoạt eNOS[59] Hsp90 (Protein shock nhiệt 90) làm tăng hoạt động của eNOS theo cơ chế điềuhòa dị lập thể, nghiên cứu cho thấy sự hình thành phức hợp eNOS – Hsp90 ở tế bàonội mô khi bị kích thích bởi histamin, bradykinin, yếu tố tăng trưởng nội mạc và

“shear stress” làm tăng hoạt tính của eNOS lên 3 lần [31] Sự tương tác của eNOSvới

2 protein này đều là những cơ chế điều hòa hoạt tính của eNOS độc lập với Ca2+

density lipoprotein/ lipoprotein trọng lượng phân tử cao; S: Serin; T: Threonin; )

Hình 1.5 Sự điều hòa các vị trí phosphoryl hóa eNOS.

Các vị trí eNOS phosphoryl hóa được đánh số theo thứ tự eNOS người/ bò [41]

(VEGF: Vascular endothelial cell growth factor/ Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu; 8-Br-cAMP: 8-bromoadenosine-3’,5’- monophosphate vòng; S-1-P: sphingosine 1-phosphate; PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate; HDL: high-

1.2.2.3 Chức năng sinh lý của eNOS và NO nội mạc

a Điều hòa trương lực mạch máu

Tại nội mạc NO được tạo ra bởi eNOS làm hoạt hóa guanylyl cyclase hòa tan(sGC/ soluble guanylyl cyclase) kích hoạt con đường truyền tin cGMP (GMPvòng) sGC xúc tác cho phản ứng chuyển GTP (Guanosine-5'-triphosphate) thànhcGMP là một chất truyền tin thứ hai, cGMP hoạt hóa các protein kinase G (PKG),thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa các protein kết quả là làm giảm nồng độ Ca2+ nộibào và giãn mạch (Hình 1.6) [25] Nghiên cứu cho thấy huyết áp tăng ở nhóm chuột

bị xóa bỏ gen eNOS [47]

b Ức chế sự kết dính bạch cầu và viêm mạch máu

NO kiểm soát sự biểu hiện của các gen liên quan đến xơ vữa động mạch NOlàm giảm sự biểu hiện của protein hóa hướng động bạch cầu mono MCP-1(Monocyte chemoattractant protein-1) [56], ức chế sự kết dính của bạch cầu vớithành mạch bằng cách can thiệp vào khả năng gắn của các phân tử kết dính bạchcầu CD11/ CD18 (Cụm biệt hóa/ Cluster of differentiation) với bề mặt tế bào nội

mô hoặc ức chế sự biểu hiện của CD11/ CD18 ở bạch cầu Sự kết dính bạch cầu là

sự kiện sớm của xơ vữa động mạch do vậy NO có thể bảo vệ chống sự hình thành

xơ vữa động mạch [69] Rối loạn tính toàn vẹn của hàng rào nội mô có thể khởiphát các sự kiện của tiền viêm NO ngăn chặn quá trình apotosis của tế bào nội môgây ra bởi các cytokin và các yếu tố tiền xơ vữa như oxygen hoạt tính (ROS -reactive oxygen species) và angiotensin II Điều này có thể góp phần vào tác dụngchống viêm và chống xơ vữa của NO được sản xuất tại nội mạc [64]

c Ức chế sự kết tập tiểu cầu

NO sản xuất trong mạch là một chất ức chế sự kết tập và kết dính tiểu cầuvào thành mạch [68,72]

d Kiểm soát sự tăng sinh của cơ trơn mạch

NO thể hiện hoạt tính ức chế tổng hợp ADN, ức chế sự sinh sản và tăng sinhcủa tế bào cơ trơn thành mạch Tác dụng này có thể thông qua trung gian cGMP[14,51] Bên cạnh đó NO còn ngăn chặn sự giải phóng của yếu tố tăng trưởng cónguồn gốc tiểu cầu (PDGF), là chất kích thích sự tăng sinh của cơ trơn NOS cũngquan trọng đối với sự tái tạo lại mạch máu để thích ứng với sự thay đổi dòng chảytrong bệnh mạn tính [22]

Hình 1.6 Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội mạc [52]

1.2.2.4 Vai trò của eNOS phosphorayl hóa và NO trong một số bệnh lý

a Xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh tim mạch mãntính như bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não và tắc động mạch ngoại vi [16] Quátrình này được đặc trưng bởi giảm hoạt động của eNOS và sinh khả dụng của NOkèm theo đó là tăng sự biểu hiện của các phần tử kết kính như VCAM-1, ICAM-1

Ức chế eNOS đã thể hiện làm tăng tốc độ xơ vữa động mạch cho thấy NO có thể ứcchế một số bước quan trọng trong quá trình xơ vữa động mạch Do vậy, eNOS cóthể là một gen ứng cử viên liên quan đến xơ vữa động mạch và sự điều chỉnh hoạttính của eNOS thông qua thay đổi sự phosphoryl hóa eNOS đang được quan tâmđáng kể vì những vai trò sinh lý bệnh của nó [41]

b Nhồi máu cơ tim

Nghiên cứu cho thấy, trong nhồi máu cơ tim mãn tính kích thước vùng nhồimáu ở chuột bị loại bỏ eNOS không thay đổi nhưng mật độ mao mạch ít hơn, phìđại tăng lên đi kèm với huyết áp tâm thu tăng, rối loạn chức năng tâm trương vàtăng tỷ lệ tử vong ở chuột sau 28 ngày, điều này cho thấy vai trò có lợi của NO vàeNOS trên tâm thất sau nhồi máu cơ tim [55]

c Tăng huyết áp

Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý như xơ vữa độngmạch, suy tim, bệnh động mạch vành, đột quỵ NO và eNOS có vai trò quan trọnggiãn mạch gây hạ áp Sự tăng huyết áp đã được quan sát thấy ở nhóm chuột bị xóa

bỏ gen eNOS [47]

d Stress oxy hóa

Stress oxy hóa là bệnh lý xảy ra do sự mất cân bằng trong sự hình thành vàphá hủy các ROS Stress oxy hóa tham gia vào bệnh sinh của nhiều tình trạng bệnh

lý như dị tật tim mạch, tăng huyết áp, tiểu đường, xơ vữa động mạch, ung thư, dẫnđến rối loạn chức năng nội mô Sự sản xuất ROS liên quan đến sự bất hoạt của phân

tử tín hiệu NO dẫn đến rối loạn chức năng nội mô [41]

Bên cạnh đó, sự rối loạn trong tổng hợp NO và phosphoryl hóa eNOS cònliên quan trong nhiều bệnh lý khác như thiếu máu cục bộ, tiểu đường, rối loạncương dương, Alzheimer Chính vì vậy, trong những năm gần đây eNOSphosphoryl hóa trở thành một mục tiêu tiềm năng trong điều trị nhiều bệnh lý [41]

PG và thromboxan A2 (TXA2) được gọi chung là prostanoid, là các chấtđược hình thành từ acid arachidonic (AA), một acid béo không bão hòa được giải

Có 4 PG hoạt tính sinh học chủ yếu được tạo ra trong in vivo đó là: prostaglandin E2

Sự sản xuất của PG phụ thuộc nhiều vào hoạt tính của enzym COX Enzymnày có 2 dạng chính là COX-1 (cyclooxygenase - 1) và COX-2 (cyclooxygenase –2) COX-1 được biểu hiện cơ định trong nhiều loại tế bào lành của cơ thể, tham giasản xuất các PG cần cho tác dụng sinh lý bình thường của một số cơ quan như tăngtiết chất nhầy ở dạ dày, kết tập tiểu cầu, tăng sức lọc cầu thận thận Ngược lại,COX-2 là một enzym cảm ứng, nó không biểu hiện hoặc chỉ biểu hiện ở mức độ rất

1.3 Tổng quan về viêm và COX-2

1.3.1 Viêm và prostaglandin trong viêm

Viêm vừa là phản ứng mang tính chất bảo vệ của cơ thể chống lại các yếu tốgây bệnh vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm có thể gây ra các tổn thương,hoại tử hay rối loạn chức năng cơ quan [4] Phản ứng viêm được đặc trưng bởi sựtăng tính thấm của thành mạch, giãn mạch và kèm theo sự xuyên mạch của bạchcầu, dẫn đến những dấu hiệu kinh điển là sưng, nóng, đỏ, đau Quá trình này có sựtham gia của nhiều chất trung gian có hoạt tính như histamin, bradykinin,prostaglandin, leucotrien Trong đó, prostaglandin (PG) là một trong những yếu tốđóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng viêm [3]

được oxi hóa bởi cyclooxygenase (COX) hay còn được gọi là prostaglandin G/Hsynthase để hình thành nên PGG2 và sau đó là PGH2 PGH2 không bền bị chuyểnhóa bởi các enzym prostaglandin synthase để tạo nên các PG khác nhau (Hình 1.7)

(PGE2), prostacyclin (PGI2), prostaglandin D2 (PGD2) và prostaglandin F2α (PGF2α)[33,61] Trong đó, PGE2 đóng vai trò quan trọng trong viêm vì nó tham gia vào tất

cả các quá trình dẫn đến các dấu hiệu kinh điển của viêm Cụ thể, PGE2 gây giãnmạch, làm tăng dòng máu đến mô viêm, đồng thời cùng với các chất trung gian củaquá trình viêm như histadin, bradykinin, leucotrien, PGE2 làm tăng tính thấm của

làm tăng nhạy cảm của các sợi thần kinh cảm giác ngoại vị và trung ương ở não và

gian gây sốt Trong viêm, các PG còn làm khuếch đại các phản ứng viêm bằng cáchtăng cường và kéo dài các tín hiệu gây ra bởi các chất tiền viêm [21,36]

thấp trong các mô bình thường; dưới kích thích của các yếu tố tiền viêm, hormon và

(Thromboxan A2, PGD2, PGE2, PGI2, và PGF2α được tạo ra bởi các enzymprostaglandin synthase khác nhau gồm TxAS, PGDS, PGES, PGIS và PGFS)

Hình 1.7 Sinh tổng hợp prostaglandin [33]

yếu tố tăng trưởng sự biểu hiện của COX-2 tăng lên đáp ứng để tạo ra các PG gâyviêm và tham gia vào bệnh lý viêm Chính vì vậy, COX trở thành đích phân tử củacác thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs - Non-steroidal anti-inflammatorydrugs) và các NSAIDs tác dụng chọn lọc trên COX-2 đang là xu hướng nghiên cứuhiện nay [44]

1.3.2 COX – 2

COX-2 là một trong 2 dạng chính của COX Enzym này xúc tác cho haibước đầu tiên trong con đường tổng hợp PG [36] Ở người, gen mã hóa cho COX-2nằm trên NST số 1, kích thước nhỏ khoảng 8 Kb với 10 exon [35,63] COX-2 làenzym cảm ứng, đáp ứng chủ yếu để sản xuất các PG trong viêm Sự tăng biểu hiệncủa COX-2 đã được quan sát thấy trên các mô hình viêm khớp ở động vật cũng nhưtrong hoạt dịch của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp [36,75]

1.3.2.1 COX-2 trong một số bệnh lý

a Xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là sự tích tụ của cholesterol dưới lớp áo trong động mạchgây ra hẹp, loét, xơ cứng lòng mạch Đây là nguyên nhân của một số bệnh lý nhưhội chứng mạch vành cấp, đột quỵ, thiếu máu cục bộ Quá trình viêm xảy ra bêntrong các mảng xơ vữa đóng góp cho bệnh sinh của bệnh [35] Một số nghiên cứucho thấy, enzym COX-1 xuất hiện trong cả động mạch bình thường và động mạch

xơ vữa trong khi COX-2 chỉ được tìm thấy trong các động mạch xơ vữa Trongmảng xơ vữa, COX-2 được biểu hiện bởi nhiều loại tế bào như tế bào đại thực bào,bạch cầu mono, tế bào nội mô Enzym này có thể tham gia vào xơ vữa động mạchtheo nhiều cơ chế liên quan đến một số quá trình như hoạt hóa các chất hóa hướngđộng, sản xuất của các cytokin gây viêm, biến đổi tính thấm của thành mạch [28].Nghiên cứu trên chuột cũng cho thấy, celecoxib một chất ức chế chọn lọc COX-2 cóthể ngăn chặn sự tiến triển của tổn thương mảng xơ vữa [54] Từ đó, có thể thấyđược vai trò của viêm và COX-2 trong xơ vữa động mạch Tuy nhiên, các chất ứcchế chọn lọc COX-2 cũng có thể gây ra bất lợi trong sự ổn định của mảng xơ vữa và

do vậy làm tăng nguy cơ biến cố tim mạch và tử vong [35]

b Sinh mạch và ung thư

Sinh mạch là sự hình thành các mạch máu mới trên nền các mạch máu cũ, xảy

ra trong suốt quá trình phát triển của phôi thai, sinh mạch cũng tham gia vào bệnhsinh nhiều rối loạn đặc biệt là ung thư Các báo cáo chỉ ra rằng, các chất trung giangây viêm (như PGE2, CRP, IL-6, TNFα) tăng trong ung thư [23,35] Sự tăng tổng

quan sát thấy trong mô ung thư đại trực tràng khi so sánh với mô lành [48,71].Ngoài ra, cả hai loại NSAIDs tác dụng không chọn lọc và chọn trên COX-2 đã thểhiện hoạt tính ức chế sự sinh mạch và tăng sinh của khối u trên mô hình động vật[50] Từ đó có thể gợi ý được vai trò quan trọng COX-2 trong sự tiến triển của ungthư [23,35]

c Suy thận

Các PG đặc biệt là PGE2 và PGI2 đóng vai trò quan trọng trong chức năngthận người trưởng thành PG gây giãn mạch thận; ức chế sự tái hấp thu natri ở ốngthận; kiểm soát sự giải phóng renin và phát triển thận ở giai đoạn bào thai Ở thậnvai trò của COX-2 trong tổng hợp PG khá phức tạp, tham gia cho đáp ứng cả chứcnăng sinh lý và bệnh lý Nghiên cứu cho thấy, trong suy thận, nồng độ của mARN

COX-2 và protein COX-2 cũng như hoạt tính của enzyme này tăng lên Sự tăng biểuhiện của COX-2 có liên quan đến sự sản xuất angiotensin II, tăng natri, tăng huyết ápcầu thận và viêm ống thận [62] Bên cạnh đó, các chất ức chế chọn lọc trên COX-2cũng cho thấy tác dụng làm chậm sự xơ hóa cầu thận và protein niệu trên chuột bịcắt bỏ một phần thận gợi ý vai trò có lợi của các chất này trong suy thận [49].

1.3.2.2 Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2

Các thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal anti-inflammatory drugs

- NSAIDs) được sử dụng rộng rãi trong điều trị lâm sàng Tuy nhiên ngoài nhữngtác dụng dược lý mà chúng mang lại như hạ sốt, giảm đau, chống viêm thì cácNSAIDs cũng kèm theo nhiều tác dụng phụ đặc biệt là trên hệ tiêu hóa như viêmloét dạ dày tá tràng gây ra do sự ức chế không chọn lọc của chúng trên enzymCOX-1 là enzym chịu trách nhiệm trong việc tạo ra các PG cần cho tác dụng sinh lýbình thường Chính vì vậy, xu hướng mới là tạo ra các NSAIDs có tác dụng chọnlọc trên enzym COX-2 để giảm các tác dụng phụ mà vẫn duy trì được tác dụngchống viêm của nó Một số thuốc tác dụng chọn lọc trên COX-2 hiện nay nhưrofecoxib, celecoxib, valdecoxib [10,36] Ngoài ra, các nghiên cứu về vai trò củaCOX-2 trong một số bệnh lý cũng tạo ra các hướng mới trong tác dụng có thể cókhác của các thuốc ức chế chọn lọc trên COX-2 như chống ung thư [48] Tuy nhiên,một trong những tác dụng phụ đáng chú ý nhất của các thuốc này là tăng nguy cơtrên các bệnh tim mạch Chính vì vậy, việc sử dụng các thuốc ức chế chọn lọc trênCOX-2 cũng cần đặc biệt thận trọng trên các bệnh nhân tim mạch [10]