TRÍCH LY HOẠT CHẤT AZADIRACHTIN TỪ CÂY NEEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SOXHLET VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VIBRIO SPP. GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TRÊN TÔM

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, nhóm tác giả rất biết ơn sự giúp đỡ tận tình của Cha, Mẹ và những người thân trong gia đình. Nhóm tác giả chân thành cảm ơn Cô TS. Huỳnh Ngọc Oanh và Thầy TS. Nguyễn Hữu Hiếu đã giúp đỡ, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm về cách chọn lọc tài liệu, thông tin cũng như cách làm việc hiệu quả cho đề tài. Nhóm tác giả chân thành cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Văn phòng Đào tạo Quốc tế OISP – Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQGHCM, giúp đề tài được thực hiện tốt hơn. Chân thành cảm ơn quý anh chị nghiên cứu viên, các bạn sinh viên tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm ĐHQGHCM Công nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP) đã truyền đạt kinh nghiệm thực tiễn giúp nhóm tác giả hoàn thành các thí nghiệm. Nhóm tác giả chân thành cảm ơn.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

-o0o -ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC OISP 2017

TRÍCH LY HOẠT CHẤT AZADIRACHTIN TỪ CÂY NEEM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SOXHLET

VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VIBRIO SPP

GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TRÊN TÔM

GVHD: TS Huỳnh Ngọc Oanh SVTH: Nguyễn Trịnh Phương Mai

Chung Ngọc Diệp

Lê Bá Khoa

TP.HỒ CHÍ MINH, THÁNG 06 NĂM 2018

Nhóm tác giả chân thành cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Văn phòng Đào tạo Quốc tế OISP – Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM, giúp đề tài được thực hiện tốt hơn Chân thành cảm ơn quý anh chị nghiên cứu viên, các bạn sinh viên tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm ĐHQG-HCM Công nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP) đã truyền đạt kinh nghiệm thực tiễn giúp nhóm tác giả hoàn thành các thí nghiệm

Nhóm tác giả chân thành cảm ơn

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2018

Trưởng nhóm sinh viên Nguyễn Trịnh Phương Mai

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này, hạt cây neem được chọn làm đối tượng nghiên cứu và tiến hành trích ly dầu neem bằng phương pháp trích ly Soxhlet Hiệu quả trích ly được thể hiện qua hiệu suất thu hồi dầu, phân tích hàm lượng azadirachtin bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dầu trích được bằng phương pháp đục

lỗ thạch trên đĩa môi trường thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose

Kết quả nghiên cứu cho thấy dầu neem đạt hiệu suất cao nhất là 23,7% khi được trích trong dung môi metanol, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/25 (g/mL) với 4 giờ trích và được

cô quay chân không ở 60oC

Kết quả phân tích hàm lượng azadirachtin trong dầu neem đạt 518 mg/kg và mẫu dầu

này có khả năng kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus

LỜI CAM ĐOAN

Nhóm tác giả xin cam đoan đề tài nghiên cứu khoa học này là công trình độc lập của nhóm tôi Các số liệu và thông tin tham khảo trong quá trình thực hiện đều có nguồn gốc

rõ ràng và đã được trích dẫn theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu và kết luận trong

đề tài đều là do thành viên trong nhóm tự phân tích một cách trung thực, khách quan, không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kì tài liệu nào khác

Trưởng nhóm sinh viên Nguyễn Trịnh Phương Mai

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về cây neem 3

1.1.1 Phân bố và danh pháp 3

1.1.3 Đặc điểm sinh thái 4

1.2 Hoạt chất sinh học chính trong dầu neem (azadirachtin) 6

1.3 Phương pháp chiết xuất 7

1.3.1 Ngâm chiết 7

1.3.2 Phương pháp trích ly Soxhlet 7

1.4 Hoạt tính kháng khuẩn của dầu neem 8

1.4.1.Chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản 8

1.4.2 Vi khuẩn Vibrio spp 10

1.5 Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 13

1.5.1 Tính cấp thiết 13

1.5.2 Mục tiêu nghiên cứu 13

1.5.3 Nội dung nghiên cứu 13

1.5.3 Phương pháp nghiên cứu 13

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 16

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị và địa điểm thực hiện 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Hóa chất 16

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 17

2.1.4 Địa điểm thực hiện 19

2.2 Quy trình trích ly 19

2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly 19

2.4 Định lượng azadirachtin trong dầu neem 20

2.5 Thử nghiệm tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan trên tôm 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Điều kiện trích ly 23

3.1.1 Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau đến chất lượng dầu neem 23

3.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến chất lượng dầu neem 23

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian trích đến chất lượng dầu neem 24

3.2 Phân tích hàm lượng AZA trong dầu neem bằng HPLC 24

3.3 Thử nghiệm tính kháng khuẩn 25

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

PHỤ LỤC 30

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Bệnh gây ra bởi các vi khuẩn Vibrio trong ngành thủy sản 11

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất và vật liệu 17

Bảng 2.2 Danh sách dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 17

Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi 20

Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liêu/dung môi 20

Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly 20

Bảng 2.6 Điều kiện pha động 20

Bảng 3.1 Kết quả khối lượng dầu neem theo các loại dung môi khác nhau 23

Bảng 3.4 Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn 25

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây neem 6 tuổi 4

Hình 1.2 Các bộ phận của cây neem: (a) Quả và lá, (b) Hoa, (c) Hạt khô 5

Hình 1.3 Cấu trúc 2D và 3D của phân tử azadirachtin 6

Hình 1.4 Mô hình thiết bị tẩm trích có cánh khuấy 7

Hình 1.5 Nguyên lý hoạt động của thiết bị trích ly Soxhlet 8

Hình 1.6 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 12

Hình 1.7 So sánh tôm khoẻ và tôm nhiễm bệnh EMS 12

Hình 1.8 Sơ đồ hoạt động của hệ thống phân tích HPLC 15

Hình 2.1 Hạt neem sau khi được sấy khô 16

Hình 2.2 Hệ thống trích Soxhlet 18

Hình 2.3 Thiết bị cô quay chân không Buchi 18

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình trích ly 19

Hình 3.1 Đường chuẩn của azadirachtin 25

Hình 3.2 Kết quả thử nghiệm tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus 26

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chất kháng sinh là thuốc hoặc hóa chất có thể tiêu diệt các vi khuẩn có hại trong cơ thể hoặc hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Gần đây, thực trạng lạm dụng chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản trở nên phổ biến, dẫn đến phát sinh dịch bệnh nghiêm trọng do

sự kháng thuốc của các loại vi khuẩn gây bệnh ở tôm cá, đặc biệt là vi khuẩn Vibrio spp

làm thu hẹp nhiều diện tích nuôi trồng thủy sản

Nghiêm trọng hơn, con người tiêu thụ các loại thực phẩm này có thể dẫn đến các phản ứng như: chân tay run rẩy, co giật, thay đổi vi sinh ruột, thay đổi sự tổng hợp vitamin hoặc thậm chí tử vong nếu tiêu thụ quá nhiều Bên cạnh đó, điều này còn có thể dẫn đến kháng thuốc và gây khó khăn cho người điều trị nhiễm trùng

Các nghiên cứu trích ly các hợp chất của cây neem trước đó hầu hết không đề cập chuyên sâu về tính chất kháng khuẩn hoặc chỉ khảo sát tính kháng khuẩn của azadirachtin

đối với nhiều loại chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến như Pseudomonas aeruginosa,

Pseudomonas mirabilis, Staphylococcus aureus [2] Cho đến nay, chưa có một công bố

trong và ngoài nước nào nghiên cứu tính kháng khuẩn của dầu neem và azadirachtin đối

với giống vi khuẩn Vibrio spp., đặc biệt là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại

tử gan trên tôm

Vì vậy, đề tài nghiên cứu khoa học này bước đầu thực hiện trích ly hoạt chất azadirachtin, một hợp chất có tính chất kháng khuẩn cao, từ nguyên liệu ban đầu là hạt

neem, đồng thời khảo sát sơ bộ tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

gây bệnh hoại tử gan trên tôm Với kết quả khảo sát này có thể đóng góp thêm cho việc

nghiên cứu ứng dụng tạo ra các sản phẩm như thuốc kháng sinh sinh học phục vụ ngành nông nghiệp, thuỷ sản, công nghệ sinh học, và một số lĩnh vực khác

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây neem

1.1.1 Phân bố và danh pháp

1.1.1.1 Danh pháp khoa học

Cây neem có tên khoa học là Azdirachta indica A Juss thuộc họ xoan (Meliaceae), do

khả năng chịu hạn, cây neem còn có tên tiếng Việt là “xoan chịu hạn”

- Họ: Meliaceae – Họ cây dái ngựa;

- Chi: Azadirachta A Juss – Azadirachta;

- Loài: Azadirachta indica A Juss., neem

và trải rộng ra các đảo khác ở nam Thái Bình Dương Ở Trung Đông, cây neem được tìm thấy ở Yemen và Saudi Arabia Tại Châu Phi, cây neem tồn tại ở Ghana, Nigeria, Sudan và các nước Đông Phi Ở Châu Mỹ, cây neem được tìm thấy ở các đảo vùng Caribe

và vùng Trung Mỹ

1.1.3 Đặc điểm sinh thái

Cây neem chịu hạn phát triển tốt trên đất cát pha thịt nhẹ và cát rời, đất có đá lẫn, không chịu ngập úng, đòi hỏi nhiều ánh sáng, chịu hạn tốt, phát triển trên đất có độ pH cao (≥8,5) thậm chí đất có tầng cứng 1,5 đến 2 m thích hợp với khí hậu nhiệt đới, khô nóng có thể lên đến 50˚C, lượng mưa từ 500-1200 mm, độ ẩm 60% nhưng không chịu rét kéo dài, có thể trồng ở nhiệt độ cao từ 1000-1500 m so với mặt biển

Neem là cây thân gỗ, chiều cao có thể lên đến 30 m, tán rộng xoè ra như cây sồi, chu vi tán lá khoảng 2,5 m và có thể vươn xa đến 10 m Bộ rễ của cây rất sâu, phát triển mạnh, rễ cái có thể dài gấp hai lần chiều dài của cây Vỏ cây có chứa khoảng 3,43 % protein; 0,68

% alkaloid; 4,16% chất khoáng và một số axit amin Vỏ cũng chứa nhiều hoạt chất như nimbin, nimbinin, nimbidin, interferon, acid gallic… có tính kháng dịch hại Hình ảnh cây neem 6 tuổi được thể hiện trong hình 1.1

Hình 1.1 Cây neem 6 tuổi [3]

Mặc dù là một cây thường xanh nhưng nó có thể rụng hầu hết lá vào những mùa hạn hán nghiêm trọng Ở độ cao thấp và môi trường khô nóng, cây phát triển chậm Các cuống

lá rất ngắn với các lá non dài 20-40 cm, thường có màu đỏ nhạt hoặc tím

Hoa và quả được sinh ra trong các cụm phễu và khi chín, các hạt tiêu dạng elip mịn biến thành màu vàng lục nhạt với một lớp bột ngọt chứa hạt Vòng hoa neem khá dày có hình tròn hoặc bầu dục và có thể có đường kính 15-20 m đối với những cây lâu năm Các cụm hoa phân nhánh, chứa từ 150 đến 250 hoa Một bông hoa riêng lẻ có chiều dài 5-6 mm và rộng 8-11 mm Hoa có màu trắng và thơm, mọc lên từ mối nối giữa thân và cuống

Quả giống trái ô liu, mịn, có hình dạng từ thuôn dài, hình bầu dục đến gần tròn, và kích thước khi chín là 1,4-2,8 x 1.0-1,5 cm Vỏ mỏng và chuyển sang màu vàng khi chín Vỏ quả bao gồm một, ít khi hai hoặc ba, hạt dài (hạt nhân) có lớp vỏ màu nâu [4] Nhân chỉ chiếm khoảng một phần hai trọng lượng hạt nhưng là nơi tập trung nhiều hoạt chất sinh học

Một năm, cây có hai vụ thu hoạch quả, vào tháng 4-6 và 10-12 Số lượng hạt trong 1 kg quả từ 2000 đến 2500 hạt Cây trưởng thành có thể sản xuất khoảng 2 kg hạt/năm[1] Hình ảnh về hoa, quả và hạt neem được thể hiện trong hình 1.2

Hình 1.2 Các bộ phận của cây neem: (a) Quả và lá, (b) Hoa, (c) Hạt khô [5]

1.2 Hoạt chất sinh học chính trong dầu neem (azadirachtin)

Azadirachtin, một hợp chất limonoid tetranortriterpenoid thuộc nhóm lemonoid có chứa trong dầu hạt cây xoan Ấn Độ (cây neem) với hàm lượng dao động 0,2-0,5% trong lượng hạt tươi Azadirachtin có hoạt tính sinh học rất đa dạng, là thành phần chính tác động tính chống nấm và độc hại đối với côn trùng Các hợp chất limonoid và lưu huỳnh có tính chất chống thấm, sát trùng, chống trầm cảm, hạ sốt và chống giật da được tìm thấy ở những nơi khác trên cây, ví dụ: lá, hoa, vỏ cây, rễ cây [1] Với khối lượng phân tử 720,721 gam/mol, azadirachtin được biết đến với công thức phân tử C35H44O16 Độ hòa tan trong nước của hợp chất này là 0,26 gam/lít và có thể hòa tan nhanh chóng trong etanol, diethyl eter, axeton

và chloroform, nhưng không tan trong n-hexane Azadirachtin bền trong bóng tối ở nhiệt

độ phòng, dễ phân hủy ở nhiệt độ cao, môi trường kiềm và môi trường axit mạnh [6] Azadirachtin đã và đang được nghiên cứu về phương pháp tách chiết ở nhiều nước trên thế giới Cấu trúc 2D và 3D của phân tử azadirachtin được thể hiện trong hình 1.3

Hình 1.3 Cấu trúc 2D và 3D của phân tử azadirachtin [6]

Dầu neem và azadirachtin được nghiên cứu là có khả năng kháng khuẩn Vì vậy, cần nghiên cứu về một phương pháp chiết xuất phù hợp để thu được sản phẩm tối ưu

1.3 Phương pháp chiết xuất

Với sự phong phú và đa dạng của các chủng loại dược liệu tự nhiên ở Việt Nam, hiện nay có một số nghiên cứu trích chiết các hoạt chất phục vụ cho nghiên cứu và công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm Các phương pháp áp dụng để trích ly cũng có nhiều nghiên cứu khác nhau đề cập đến, mỗi phương pháp đều có ưu – nhược điểm khác nhau

Hình 1.4 Mô hình thiết bị tẩm trích có cánh khuấy [7]

Phương pháp thích hợp đối với nhiều loại dược liệu, được ứng dụng nhiều đối với trích

ly tinh dầu và các chất hữu cơ dễ bị phân hủy bởi nhiệt, hạn chế được sự thất thoát dung môi; nhưng thời gian trích ly dài; hiệu suất thấp

1.3.2 Phương pháp trích ly Soxhlet

Nguyên lý: dược liệu được bỏ vào túi xiphong đặt trong ống Soxhlet Bình cầu chứa dung môi thích hợp được gắn ở phía dưới ống trích và được đun nóng cho đến khi bay hơi

Dung môi được ngưng tụ trong ống chiết bằng hệ thống sinh hàn Chu kỳ này lặp lại nhiều lần đến khi trích kiệt hoạt chất Dịch trích thu được trong bình cùng với dung môi Quy trình hoạt động của thiết bị trích ly Soxhlet được thể hiện trong hình 1.5

Hình 1.5 Nguyên lý hoạt động của thiết bị trích ly Soxhlet [8]

Trong đề tài này, phương pháp trích Soxhlet được lựa chọn để trích ly dầu vì những ưu điểm nổi trội như sử dụng lượng dung môi ít, khi trích thu được dịch trích tối ưu và hệ thống dễ lắp ráp, dễ sử dụng

Ngày nay, hiện tượng kháng kháng sinh khá phổ biến trong nuôi trồng thủy sản; dầu neem được biết đến là có khả năng kháng khuẩn Vì vậy, cần mở rộng nghiên cứu chất kháng sinh từ dầu neem

1.4 Hoạt tính kháng khuẩn của dầu neem

1.4.1.Chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

Chất kháng sinh là thuốc hoặc hóa chất có thể tiêu diệt các vi khuẩn có hại trong cơ thể hoặc hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Gần đây, thực trạng lạm dụng chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản trở nên phổ biến

Trên thế giới:

Nuôi trồng thuỷ sản là một ngành sản xuất ngày càng phát triển, đặc biệt là trong việc cung cấp nguồn thực phẩm động vật có hàm lượng protein cao, dễ tiêu hóa và có giá trị sinh học cao Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản ở nhiều nước hiện nay gặp khó khăn

vì sự phát triển của các bệnh dịch do nguồn cung cấp nước sạch hạn chế Phân gia súc không được xử lý và chất thải của con người được sử dụng làm thức ăn cho các ao nuôi tôm, cá rô phi Bên cạnh đó việc xử lý nước thải chưa được triệt để làm vi khuẩn phát triển mạnh Để giải quyết vấn đề này, các sản phẩm kháng sinh được sử dụng Loại và số lượng

sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản phụ thuộc vào thực tiễn canh tác, khu vực và các quy định của quốc gia hoặc khả năng thực thi của chính phủ Từ ngày 01 tháng 10 năm

2006, đến ngày 31 tháng 5 năm 2007, FDA đã kiểm tra mẫu cá da trơn, cá basa, tôm, cá lăng và lươn từ Trung Quốc, phát hiện 25% mẫu chứa dư lượng thuốc Năm 1990, Mỹ có

tỷ lệ sử dụng kháng sinh cao nhất nhưng số lượng này đã giảm do tăng cường sử dụng xin và các hoạt động nông nghiệp mới Hải sản nhập khẩu vào Hoa Kỳ ngày nay cần được kiểm soát chặt chẽ qua các quy định của FDA về việc ngăn chặn thực phẩm có chứa dư lượng kháng sinh

- 19,86 % các cơ sở nuôi trồng thủy sản sử dụng kháng sinh đối với tôm sử dụng thuốc của người (ví dụ: Chloramphenicol 250mg)

- Khoảng 30-40 ha diện tích nuôi trồng thuỷ sản Bắc Giang bị thu hẹp do dịch bệnh trên tôm

Phát sinh dịch bệnh nghiêm trọng là do việc lạm dụng thuốc kháng sinh, dẫn đến kháng

thuốc của các loại vi khuẩn gây bệnh trên tôm, phổ biến nhất là nhóm vi khuẩn Vibrio spp Trong đó, Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn gây ra bệnh hoại tử gan trên tôm

1.4.2 Vi khuẩn Vibrio spp

Vi khuẩn Vibrio spp là một trong những vi khuẩn nguy hiểm vì chúng không những là

tác nhân gây bệnh quan trọng mà còn có thể gây ngộ độc thực phẩm ở người Hiện nay,

bệnh truyền nhiễm do nhóm vi khuẩn Vibrio spp trên thủy sản đặt biệt là trên tôm được

xem là tác nhân gây bệnh đáng được quan tâm, làm ảnh hưởng rất lớn đến sản lượng tôm

nuôi hàng năm Bên cạnh đó, cơ quan đích của vi khuẩn Vibrio spp thường là khối gan tụy

của tôm [9]

Những Vibrio spp như V harveyi, V parahaemolyticus, V alginolyticus, V

anguillarum, V vulnificus, và V splendidus thường liên quan đến toom, cá Bảng 1.1 bên

dưới liệt kê các bệnh gây ra bởi các vi khuẩn Vibrio spp trong ngành thủy sản

Bảng 1.1 Bệnh gây ra bởi các vi khuẩn Vibrio trong ngành thủy sản

Gây chết 85% ở giai đoạn ấu trùng

Viêm dạ dày ruột dẫn đến chết hàng loạt Chết hàng loạt

Cá hồi Đại tây dương,

cá hồi vân, cá tuyết Đại Tây Dương

Vibriosis nước lạnh

Moritella viscose

(V viscosus)

Cá hồi Đại tây dương,

Bệnh hoại tử gan do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra đang gây thiệt hại nghiêm

trọng cho ngành nuôi tôm Hình dạng loài vi khuẩn này được thể hiện ở hình 1.6

Hình 1.6 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus [10]

Một số báo cáo cho rằng các con đường lây nhiễm Vibrio parahaemolyticus ở tôm có thể là thức ăn, vỏ, gan tụy v.v Vibrio parahaemolyticus chiếm lấy các mô tôm sau khi

thâm nhập qua các tế bào biểu mô [11] Hình 1.7 So sánh tôm khỏe và tôm nhiễm bệnh early mortality syndrome (EMS)

Hình 1.7 So sánh tôm khoẻ và tôm nhiễm bệnh EMS [12]